仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法
专利汇可以提供仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法，包括步骤：以吸空气大鼠血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、 腹腔 巨噬细胞及血液作为正常对照组，经鼻连续抽吸 卷烟 大鼠血清脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为吸烟组；检测各组淋巴 细胞增殖 能 力 、腹腔巨噬细胞吞噬情况、IL-6、TNF-α、Ig、IgG、IgE含量和白细胞分类计数；最终筛选出淋巴细胞增殖的刺激指数、IL-6、IgG、IgE含量、白细胞分类计数五个指标作为敏感稳定的评价指标反应吸烟大鼠免疫功能的变化。该方法科学全面，筛选出的评价指标具有良好的敏感 稳定性 。，下面是仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法专利的具体信息内容。
1.一种拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以吸空气大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为正常对照组，经鼻连续抽吸卷烟的大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为吸烟组；
(2)利用MTT增殖法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞增殖能力，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(3)利用鸡红细胞吞噬实验法检测步骤(1)中各组腹腔巨噬细胞吞噬百分比和吞噬指数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(4)利用ELISA法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞培养上清液和血清中IL-6及TNF-α细胞因子浓度，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(5)检测步骤(1)中各组血清中总Ig含量、IgG含量及IgE含量，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(6)利用瑞氏染液染色法检测步骤(1)中各组血液中白细胞分类计数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)具体步骤包括：将步骤(1)
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中各组脾淋巴细胞1×10 个/ml加入培养板，每孔0.1ml，再加入刺激细胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，作为加刺激细胞组，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，每孔加入
10μl MTT溶液，放回培养箱孵育后加入MTT溶媒100μl/孔，在570nm波长处测OD值，淋巴细胞的增值能力以刺激指数表示，刺激指数＝加刺激细胞组OD值/阴性对照组OD值，比较各组刺激指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该刺激指数作为评价指标，反之，放弃。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)具体步骤包括：将步骤(1)
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中各组纯化的腹腔巨噬细胞用RPMI-1640培养液配制成10 个/ml，加入5％的鸡红细胞悬
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液0.04ml，其中鸡红细胞10 个/ml，置于37℃水浴中孵育15-30min，离心，弃上清，将沉淀的鸡红细胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，显微镜下观察100个巨噬细胞，计数吞噬百分比和吞噬指数，吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数×100/100个巨噬细胞，吞噬指数＝100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数×100/100个巨噬细胞，比较各组吞噬百分比和吞噬指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该吞噬百分比和吞噬指数作为评价指标，反之，放弃。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)具体步骤包括：将步骤(1)
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中各组脾淋巴细胞1×10 个/ml加入培养板，每孔1ml，再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，离心收集上清液即脾淋巴细胞培养上清液，收集的上清液与步骤(1)中各组大鼠血清中IL-6与TNF-α采用大鼠细胞因子检测试剂盒进行ELISA法检测，细胞因子浓度依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算，比较各组细胞因子浓度，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该IL-6和/或TNF-α细胞因子作为评价指标，反之，放弃。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)具体步骤包括：培养板每孔加入步骤(1)中各组大鼠血清稀释液100μl，复孔，血清样本用磷酸盐缓冲液进行稀释，用HRP--羊抗大鼠Ig、HRP-羊抗大鼠IgG、HRP--羊抗大鼠IgE抗体作为二抗，四甲基联苯胺作为底物，在450nm波长处测光吸收值；血清中总Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算；比较各组总Ig含量、IgG含量及IgE含量，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该Ig、IgG、IgE中的一种或几种作为评价指标，反之，放弃。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(6)具体步骤包括：将步骤(1)中各组大鼠血液加入适量肝素钠，制备血涂片，待血涂片干透后用瑞氏染液染色，自然温度下染色10分钟-15分钟后用流水冲去染液，待干燥后镜检，记录各类白细胞所占的百分数；
比较各组各类白细胞所占的百分数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该各类白细胞所占的百分数作为评价指标，反之，放弃。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，经鼻连续抽吸卷烟的时间为30天、60天、90天以及经鼻连续抽吸卷烟90天停止吸烟42天后的恢复期。
8.根据权利要求1或7所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卷烟包括焦油含量为8mg/支的低焦油卷烟和/或焦油含量为12mg/支或13mg/支的普通卷烟。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的大鼠为SD大鼠。
仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法
技术领域
背景技术
其中，IL-6是由激活的T(Th2)细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、纤维母细胞、内皮细胞以及某些肿瘤细胞所分泌的致炎因子，在炎症和急相性反应中起重要作用。
发明内容
1×10 个/ml加入培养板，每孔0.1ml，再加入刺激细胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，作为加刺激细胞组，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，每孔加入10μlMTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液，放回培养箱孵育后加入MTT溶媒100μl/孔，在570nm波长处测OD值，淋巴细胞的增值能力以刺激指数表示，刺激指数＝加刺激细胞组OD值/阴性对照组OD值，比较各组刺激指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该刺激指数作为评价指标，反之，放弃。
养液配制成10 个/ml，加入5％的鸡红细胞悬液0.04ml，其中鸡红细胞10 个/ml，置于
37℃水浴中孵育15-30min，离心，弃上清，将沉淀的鸡红细胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，显微镜下观察100个巨噬细胞，计数吞噬百分比和吞噬指数，吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数×100/100个巨噬细胞，吞噬指数＝100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数×100/100个巨噬细胞，比较各组吞噬百分比和吞噬指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该吞噬百分比和吞噬指数作为评价指标，反之，放弃。
具体实施方式
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成10 个/ml，加入5％(体积百分比)的鸡红细胞悬液0.04ml(鸡红细胞10 个/ml)，置于37℃水浴中孵育15-30min，期间每2-3min轻轻摇晃试管1次。500g离心5min，弃上清。
将试管底部的鸡红细胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色。显微镜下(油镜)观察100个巨噬细胞，计数吞噬百分比和吞噬指数。吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数×100/100个巨噬细胞；吞噬指数＝100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数×100/100个巨噬细胞。
浓度至1×10 个/ml加入24孔培养板，每孔1ml。再加入ConA，使其终浓度为10μg/ml，并设不加ConA的阴性对照，以及不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照。将细胞置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，14000rpm离心10min，收集上清液，-80℃冻存待检。收集的上清液与血清中IL-6与TNF-α采用大鼠细胞因子检测试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)进行ELISA法检测，细胞因子浓度依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算。
正常对照组 2.09±0.65 2.03±0.43 2.01±0.45 2.18±0.76
低焦油卷烟组 2.72±0.96a 1.48±0.35a 0.88±0.09a 0.97±0.12a
普通卷烟组 1.16±0.24a，b 1.22±0.26a 0.93±0.19a 1.37±0.48a[0057] 注：SI为ConA刺激指数，各组n＝36。SI≥2，认为细胞具有增殖功能。a表示与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)；b表示与低焦油卷烟组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
正常对照组 63.0±17.1 5.75±0.88
低焦油卷烟组 64.44±17.4a 4.65±0.55a
普通卷烟组 101.1±15.9a，b 8.20±1.91a，b
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