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一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法

阅读：1013发布：2020-09-08

专利汇可以提供一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一个基于聚合酶链式反应的计数血液或淋巴液样品中的循环肿瘤细胞的方法。本发明使用的细胞样品可以是经过循环肿瘤细胞富集或是不经过富集的。本发明首先将细胞样品分成许多组分，使得每个组分实际上含有不超过一个循环肿瘤细胞，从每个组分的细胞中提取RNA和DNA，并使用逆转录酶将RNA转录物逆转录为cDNA，然后用PCR方法检测每个组分中的肿瘤特异性序列的存在，并以含有肿瘤特异性序列的组分数量作为样品中循环肿瘤细胞的数量。，下面是一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法，包括以下步骤：
a) 把细胞样品平均分级成众多的组分，其中超过50%的组分每个组分包含不超过一个循环肿瘤细胞；
b) 从每个组分的细胞中提取核糖核酸并逆转录成cDNA, 和/或提取脱氧核糖核酸；
c) 使用至少一对肿瘤细胞特异性引物用聚合酶链式反应来扩增肿瘤特异性序列；
d) 检测每个组分中扩增的肿瘤特异性序列；并且
e) 通过计数含有肿瘤特异性序列的组分的数量来决定样品中循环肿瘤细胞的数目。
2.根据权利要求1所述的方法，其中每个组分包含不超过一个循环肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的方法, 其中所述细胞样品经过或者不经过富集循环肿瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中超过50%的组分每个组分包含不超过一个细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中细胞样品是血液或淋巴液样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样品去除了红细胞和白细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性序列是核糖核酸转录物，该转录物在肿瘤细胞中比正常血液细胞或淋巴细胞有更高的表达水平，最好在正常血液细胞或淋巴细胞中检测不到。
8.根据权利要求1所述的方法，其中肿瘤特异性引物设计成扩增在一种或多种癌症类型中特异性表达的癌症基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述癌症类型选择自乳腺癌，肺癌，肝癌，胰腺癌，前列腺癌，胃癌，肾癌，肠癌，结肠癌和黑素瘤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性引物设计为扩增与肿瘤转移相关的癌症基因。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞样品被分成超过10、 100、 100、 10,000 或是 100,000个以上的组分。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性序列可以用定量PCR或数字PCR方法扩增和检测到。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性序列可以用序列特异性报告探针进行检测。
14.根据权利要求1所述的方法，其中不同癌症类型的肿瘤特异性序列可以用不同报告探针进行检测。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性序列是包含肿瘤特异性突变的基因组脱氧核糖核酸序列。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性序列是在肿瘤细胞中有拷贝数增值的癌症相关基因。
17.一种非诊断/治疗用途的对患者癌症治疗进行预后预测的方法，包括以下步骤：
a）使用权利要求1的方法在癌症治疗期间或之后的不同时间对患者的血液样本或淋巴液样本中的循环肿瘤细胞进行计数; 和
b）使用患者样品中循环肿瘤细胞数量的增加和减少分别作为治疗预后差和预后良好的指标。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述循环肿瘤细胞是表达癌症转移相关基因的肿瘤细胞。

说明书全文

一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法

技术领域

[0002] 本发明涉及分子肿瘤学领域的方法和技术，尤其涉及使用高灵敏聚合酶链式反应来检测和计数血液和淋巴样品中的循环肿瘤细胞的方法。

背景技术

[0003] 循环肿瘤细胞是从原发性和转移性肿瘤组织流入血液中的肿瘤细胞。与侵袭性肿瘤组织活检相比，循环肿瘤细胞可以作为非侵入性、易于获得的“实时液体活检”，并且可用于实时监测肿瘤进展，因此，循环肿瘤细胞的分离和分析对于侵袭性癌症的早期检测，癌症治疗的预后预测，耐药性的检测以及晚期癌症的管理都具有很好的前景。尽管循环肿瘤细胞分析在临床应用中具有很大的潜力，但血液样品中循环肿瘤细胞的稀有度(例如每毫升只有1-10个)和循环肿瘤细胞群体的异质性对于循环肿瘤细胞的检测和分析构成了巨大的技术挑战。

[0004] 1ml血液样品中只有1-10个循环肿瘤细胞，却含有约8×109个红细胞和5×106个白细胞，因此，在血液中寻找循环肿瘤细胞就像大海捞针一样困难，更糟糕的是，循环肿瘤细胞的异质性使得很难找到通用的遗传学或细胞学标记用来富集和检测循环肿瘤细胞。用于富集循环肿瘤细胞的最常用标记是叫做上皮细胞粘附分子(EpCam)的一种细胞表面蛋白，它在上皮来源的循环肿瘤细胞中表达，使用基于EpCam的免疫磁珠方法来富集循环肿瘤细胞将导致不表达或低水平表达EpCam的循环肿瘤细胞的丢失，为了避免这个问题，人们使用针对不同肿瘤特异性抗原的多种抗体来选择循环肿瘤细胞。另一种选择循环肿瘤细胞的方法是基于不同细胞类型之间的大小差异，因为肿瘤细胞通常比白细胞和红细胞的尺寸更大，然而，由于不同类型的肿瘤细胞的大小不同，小的肿瘤细胞可能与白血细胞差不多大小，因此，这种基于细胞大小差异的分离方法会导致小肿瘤细胞的丢失。浓缩过程中循环肿瘤细胞的丢失是造成循环肿瘤细胞检测和计数不准确的一个重要因素。

[0005] 目前的循环肿瘤细胞检测方法可以分为两种主要类型：基于核酸的方法和基于细胞计数的方法。基于核酸的检测方法使用聚合酶链式反应(PCR)来检测肿瘤细胞中特异性表达的DNA或RNA序列。通过使用多种肿瘤特异性标记物，这种基于PCR的方法可以有很高的灵敏度，它可以在不富集循环肿瘤细胞的情况下进行，但相应会降低灵敏度。该方法检测从裂解细胞制备的核酸，因此不能观察细胞形状及进行细胞计数。这类方法的另一个缺点是很难使不同实验室的技术标准化，因此很难在临床环境中可靠地使用。基于细胞计数的检测方法使用免疫组织化学和免疫荧光来显现细胞形状并计数循环肿瘤细胞。这类方法首先对来自血液样品的细胞进行预处理以富集肿瘤细胞，然后通过用抗体染色使富集的细胞可视化，染色抗体一般包括针对多种肿瘤特异性标记物的抗体和一种针对白细胞特异性标记物的抗体，肿瘤细胞具有至少一种肿瘤特异性标记物显示阳性同时白细胞特异性标志物显示为阴性，这种方法在检测循环肿瘤细胞时具有很高的特异性。但是，这种方法取决于肿瘤细胞中肿瘤特异性标记物的表达水平和所用抗体的特异性，由于没有标记物对肿瘤细胞是纯粹特异的，并且标记物表达水平在不同的肿瘤细胞中有所不同，所以可能导致假阳性和假阴性检测的结果。该方法的灵敏度很大程度上取决于抗体对肿瘤特异性标记物的特异性和结合强度，与基于核酸的方法相比较，这种方法通常有更高的特异性，但更低的灵敏度。

[0006] 因此，迫切需要开发具有高灵敏度和高特异性的循环肿瘤细胞检测技术，并且这种技术在不同实验室之间使用可以产生可比较的结果，好的检测方法还应是可以应用于所需处理较少或甚至未富集的血液样品以使循环肿瘤细胞损失最小化。本发明具备了这样的优点，并且还提供了其他益处。发明概述

[0007] 目前基于PCR的循环肿瘤细胞检测方法提供了一种灵敏的方法来检测逃逸到循环血液或淋巴中的肿瘤细胞。现有的基于PCR的检测方法的一个缺点是它需要在进行PCR分析之前裂解细胞，以致无法对循环肿瘤细胞进行计数。本发明提供了一种基于PCR的用于循环肿瘤细胞计数的方法，它的特点是在核酸提取和PCR分析之前首先将细胞样品划分成许多组分，将含有循环肿瘤细胞的样品分级至使得超过50％的组分中每个组分含有不超过一个循环肿瘤细胞的程度。许多组分不包含任何循环肿瘤细胞，对于含有循环肿瘤细胞的组分，其中大多数组分只包含一个,然后从每个组分的细胞中提取DNA和RNA，最后进行PCR扩增来识别出具有表达高于背景水平的肿瘤特异性基因的细胞的组分,这样的细胞被鉴定为循环肿瘤细胞。

[0008] 本发明提供了一种对样品中的循环肿瘤细胞进行计数的方法，包括以下步骤：a)将样品平均分级成多个的组分，其中超过50％的组分每个组分含有不超过一个循环肿瘤细胞；b)从每个组分的细胞中提取RNA和/或DNA，并从提取的RNA逆转录产生cDNA；c)在各组分中使用至少一对肿瘤特异性引物用于扩增肿瘤特异性序列；d)检测每个组分中扩增的肿瘤特异性序列；和e)对扩增的肿瘤特异性序列的组分进行计数，以确定样品中循环肿瘤细胞的数量。在一些实施例中，每个组分包含不多于一个循环肿瘤细胞。

[0009] 本方法可用于从任何怀疑含有肿瘤细胞的细胞样品(例如患者的血液样品和患者的淋巴液样品)中检测循环肿瘤细胞。通过去除非肿瘤细胞(例如红血细胞和白血细胞)，样品可以富集循环肿瘤细胞，或者也可以使用不富集循环肿瘤细胞的样品。可以对细胞样品进行预处理以解离细胞团，确保细胞在样品中分离成单个细胞。样品被分成许多同体积的组分，直到没有单个组分可能含有多于一个循环肿瘤细胞。每个组分含有不超过一个循环肿瘤细胞，但可能含有许多非肿瘤细胞(例如白细胞)。例如，样品可以分成多于10、100、1000、10,000和100,000个组分。将细胞分成许多组分的方法有很多，例如，直接将它们添加到多孔PCR板中，使用微流控芯片(例如数字PCR芯片)将它们分配到成千上万个隔室中，或者使用液滴将它们封装到成千上万个微液滴中。

[0010] 在一些实施方案中，本方法通过除去非肿瘤细胞如红细胞，白血细胞和淋巴细胞，来富集样品中的循环肿瘤细胞。根据肿瘤细胞和血液细胞之间的大小差异可以富集循环肿瘤细胞。具体来说，体积大的循环肿瘤细胞被选择并富集，同时体积小的白细胞被去除。另外一种富集循环肿瘤细胞的方法，可以通过选择与特异性细胞表面抗原(如EpCam)的抗体相结合的细胞。富集后的样品可以被稀释到这样的程度，使得每个组分包含不超过一个单个细胞。在这种情况下，一个组分可能不包含任何细胞，含有一个循环肿瘤细胞，或是含有一个非肿瘤细胞。将循环肿瘤细胞和非肿瘤细胞进行肿瘤基因表达的进行一对一的比较，这样能够检测到基因表达的较小差异。找到的单个循环肿瘤细胞可被提取出来，并用于进一步的基因型和表达谱的分析。

[0011] 选择正确的肿瘤特异性标记基因对于成功检测和鉴定样品中的循环肿瘤细胞是很关键的。如果样品是从已知癌症类型的患者收集的，则肿瘤特异性基因可被选择为该癌症特异性的癌症基因。最好选择仅在癌细胞中表达，而不在正常血液细胞中表达的癌基因。使用这些仅在癌细胞中表达的标记基因，即使在最低限度处理的或未富集的细胞样品中，也能够非常灵敏的从成千上万个非肿瘤细胞中检测到循环肿瘤细胞。只在癌细胞中表达的标记基因可以通过比较癌细胞与正常血细胞的基因表达图谱而找到，而且可以针对特定癌症类型(例如乳腺癌，肺癌，肝癌，胰腺癌，前列腺癌，胃癌，肾癌，肠癌，结肠癌和黑素瘤)选择一组癌症特异性标记基因，针对一种或多种癌症的特异性标记基因群可用于检测源自单一或多种癌症类型的循环肿瘤细胞。为了检测来自未知癌症来源的循环肿瘤细胞，可以使用来自不同癌症类型或泛癌症标志物基因的一系列癌症标志物基因。在一些实施方案中，肿瘤特异性标记基因选自与癌症转移相关的癌症基因，检测表达与癌症转移相关基因的循环肿瘤细胞具有重要的临床意义，因为该循环肿瘤细胞亚群可能是可以生长出更多转移性肿瘤的种子细胞。

[0012] 如上所述的方法，将富集循环肿瘤细胞的细胞制备物，RT-PCR 试剂和报告探针混合在一起并分配到许多组分。用于分析的细胞可以是活细胞或固定的细胞，其中DNA和RNA要保持在细胞内。RT-PCR试剂包括PCR缓冲液，dNTP，热稳定DNA聚合酶，肿瘤特异性引物，热稳定逆转录酶和RNA酶抑制剂。将每个组分中的细胞在PCR缓冲液中加热裂解，并使用逆转录酶将释放的RNA转成cDNA分子。然后使用肿瘤特异性引物对循环肿瘤细胞中的肿瘤特异性DNA序列进行PCR扩增。在一些实施方案中，肿瘤特异性DNA序列是指从RNA逆转录产生的肿瘤特异性cDNA。在另外一些实施方案中，肿瘤特异性DNA序列是指基因组DNA，例如与癌症相关的基因融合和肿瘤细胞中进行拷贝数增殖的癌症相关基因。本方法可用于检测含有肿瘤特异性RNA转录物，肿瘤特异性基因组DNA或二者兼而有之的循环肿瘤细胞。

[0013] 扩增的肿瘤特异性序列可以通过用于任何常规的检测PCR产物的方法来检测，PCR产物可以在PCR结束时或在PCR循环过程中检测到。在一些实施方案中，本方法使用非特异性双链DNA结合染料或序列特异性报告探针来检测实时定量PCR扩增的肿瘤特异性序列。由于其特异性高，优先选择序列特异性报告探针的检测方法。另外，可以通过使用不同的报告探针来检测不同的癌症基因或者与特定癌症类型相关的癌症基因。在一些实施方案中，扩增的肿瘤特异性序列是通过数字PCR检测的。

[0014] 在一些实施方案中，本发明提供了检测受试者是否有癌症的方法，其包括a)使用本发明的方法确定来自受试者的血液样品或淋巴液样品中是否有循环肿瘤细胞的存在；和b)以循环肿瘤细胞的存在与否作为受试者是否患癌的标志。

[0015] 在一些实施方案中，本发明提供了对患者的癌症治疗进行预后预测的方法，包括a)使用本发明的方法在癌症治疗期间或之后的不同时间对患者的血液样品或淋巴液样品中的循环肿瘤细胞进行计数；和b)使用患者样品中循环肿瘤细胞数量的增加和减少趋势分别指示预后差和预后良好。在一些实施方案中，所述循环肿瘤细胞是表达与癌症转移相关癌症基因的肿瘤细胞。

[0016] 在一些实施方案中，本发明提供了检测患者癌症转移的方法，其包括a)使用本发明所述方法在患者的血液样品或淋巴液样品中检测表达与癌症转移相关的癌症基因的循环肿瘤细胞的存在；和b)使用表达与癌症转移相关癌症基因的循环肿瘤细胞的存在与否作为患者癌症是否转移的标志。发明详细内容
定义

[0017] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

[0018] 用来描述本发明的术语“一个”和“一种和“所述”应当被解释为同时包括单数和复数，除非另有说明或者上下文中清楚地指出。类似地，用于描述本发明的复数术语(例如核酸、核苷酸和DNA)，也应当被解释成同时包括单数和复数，除非另有说明或者上下文中清楚地指出。

[0019] 本文使用的术语“肿瘤特异性序列”是指与正常细胞，尤其是正常血液细胞或淋巴细胞相比，在癌性细胞中有过量表达的RNA或DNA序列的核酸序列。肿瘤特异性RNA序列可以是在一种或多种类型的癌细胞中表达的RNA转录物，但在正常血液或淋巴细胞中具有表达量非常低或无表达。仅在肿瘤细胞中表达的肿瘤特异性基因，而在正常血液或淋巴细胞中没有可检测到的表达被称为“仅在癌症中表达的标志物基因”。肿瘤特异性DNA序列是指仅仅在癌细胞中存在的或是在癌细胞中过度表达的DNA序列，例如与癌症相关的基因融合序列或是在肿瘤细胞中具有多拷贝数的基因序列。肿瘤特异性序列可能在特定的癌症类型或是在许多不同的癌症类型中过表达。可以选择与特定癌症类型(例如乳腺癌)相关的肿瘤特异性序列作为癌症类型特异性的标志物组，并且用于检测与该特定癌症类型相关的肿瘤细胞。在许多不同的癌症类型中表达的肿瘤特异性序列可以用作检测癌症发生的泛癌症标志物。

[0020] 本文使用的术语“肿瘤特异性引物”是指用于在聚合酶链式反应中扩增肿瘤特异性序列的PCR引物。肿瘤特异性引物被设计为特异性地扩增各自的肿瘤特异性序列，但不扩增正常细胞中的其他序列。例如，用于扩增肿瘤特异性RNA转录物的肿瘤特异性引物被设计为将特异性地扩增mRNA而产生跨越多个外显子的扩增子，使得它们不会扩增相同基因的基因组序列。又例如，设计用于扩增基因融合序列的肿瘤特异性引物以跨融合接头区域产生扩增子，使得待扩增的基因序列仅存在于癌细胞中。

[0021] 本文所使用的术语“循环肿瘤细胞”是指与原始肿瘤解离，进入血液系统或淋巴系统并在身体各处循环流动的肿瘤细胞。这些细胞携带肿瘤细胞特异性基因表达和肿瘤特异性基因型，并可成为种子细胞成长成转移性肿瘤。循环肿瘤细胞可以通过其肿瘤特异性基因的表达以及缺乏血液细胞特异性标志物(如CD45)的表达而鉴定出来。

[0022] 本文所用的术语“序列特异性报告探针”是指具有特征性核苷酸序列和可报告性结构的分子探针，其在与互补序列相结合时会发出可检测的信号。优选的可检测信号是荧光信号。通过偶联不同的荧光团，可以在相同的反应体系中使用不同的序列特异性报告探针来多重检测多个靶序列，另一方面，具有不同标记核苷酸序列和相同荧光团的报告探针可用于确定多个靶序列的总量。有许多可用于本发明的序列特异性报告探针，其中包括但不限于5'-核酸酶Taqman探针，Scorpion探针和分子灯塔探针，点亮探针和相邻探针(Marras SAE，Clinica Chimica Acta 2006,363：48-60)。详细内容

[0023] 本发明提供了一种使用高度灵敏的基于聚合酶链式反应的检测方法来计数血液或淋巴样品中的循环肿瘤细胞的方法。现有的循环肿瘤细胞检测方法一般分为两类：第一类是基于聚合酶链式反应的方法，灵敏度高，但缺乏直接计数循环肿瘤细胞的能力；第二类基于细胞计数的方法可以计数循环肿瘤细胞，但具有相对较低灵的敏度。这两种方法通常都需要循环肿瘤细胞的大幅度富集，这个过程本身可能会导致循环肿瘤细胞的损失。本发明首先将可能含有循环肿瘤细胞的细胞样品分成许多组分，使得每个组分不大可能具有多于一个的循环肿瘤细胞，然后将循环肿瘤细胞鉴定为表达至少一种肿瘤特异性标记基因的细胞，而且该表达水平高于其他非肿瘤细胞的基线水平。本发明结合了基于聚合酶链式反应检测方法的高灵敏度的优点和直接计数单个循环肿瘤细胞的能力。这种方法的灵敏度来自聚合酶链式反应的使用，它可以极大地放大来自循环肿瘤细胞的肿瘤特异性信号。通过使用一系列的肿瘤特异性标记基因，本发明比仅使用一种或几种生物标记的其他方法，可能检测出更多的具有异质性的循环肿瘤细胞。肿瘤特异性标记基因可以根据癌症类型或癌症阶段进行选择，从而提供关于个体循环肿瘤细胞的更丰富的信息。通过比较单个循环肿瘤细胞与非肿瘤细胞的基因表达，本发明能够鉴别出其他检测方法识别不了的循环肿瘤细胞。本发明的另一方面优点是，可以收集所鉴定的个体循环肿瘤细胞并进行进一步的基因型和基因表达图谱分析。本发明的另一个益处是，当使用仅在癌细胞中表达的标志物基因检测循环肿瘤细胞时，它可应用于最低限度处理或非富集的细胞样品而不损害检测灵敏度。

[0024] 本发明用于检测样品中循环肿瘤细胞的方法包括以下步骤：a)将样品分成多个组分，其中多于50％的组分每个组分含有不超过一个循环肿瘤细胞；b)从每个组分的细胞中提取RNA和DNA，并用提取的RNA逆转录成cDNA；c)使用至少一对用于扩增肿瘤特异性序列的肿瘤特异性引物在各组分中进行扩增反应；d)检测每个组分中扩增的肿瘤特异性序列；和e)对含有的肿瘤特异性序列的组分进行计数，以确定样品中循环肿瘤细胞的数量。

[0025] 本发明通过检测单个肿瘤细胞中的肿瘤特异性基因表达或基因型来检测体液例如血液或淋巴中的肿瘤细胞。用于本发明的细胞样品可以是从受试者收集的血液或淋巴样品。在检测之前，通常先从原始血液样品中富集循环肿瘤细胞。例如，红细胞可以很容易地从样品中裂解并除去，使用与上皮细胞表面标记EpCam抗体偶联的磁珠来富含循环肿瘤细胞，或者可以使用抗CD45和/或抗CD66磁珠从样品中去除白细胞以达到富集循环肿瘤细胞的目的，还可以根据循环肿瘤细胞和白细胞之间的细胞大小差异使用过滤方法来选择循环肿瘤细胞。能够从血液样品中去除红细胞，血小板和白细胞的微流控CTC-iCh ip也可以用于本发明，用来富集EpCam阳性和EpCam阴性的循环肿瘤细胞(Emre Ozkumur et al.Science Translational Medicine 5,179ra47(2013))。CTC-iChip方法首先从包括循环肿瘤细胞和白细胞的有核细胞中去除红细胞和血小板，然后通过去除标记有抗CD45和抗CD15抗体的白细胞来富集循环肿瘤细胞。这种负选择方法是优选的，因为用它捕获的循环肿瘤细胞不依赖于它们的细胞大小和表面抗原的表达。类似的方法也可以用于从淋巴样品中纯化循环肿瘤细胞以获得富含循环肿瘤细胞的细胞制剂。

[0026] 将富含循环肿瘤细胞的细胞制备物分成许多微小的间隔部分，使得超过50％的部分每个部分不包含多于一个的循环肿瘤细胞。在细胞分离之前，细胞制备可能需要使用温和的酶消化解离成单个细胞，或者可能需要固定以防止在处理过程期间由于细胞损伤或细胞溶解导致RNA和DNA损失。固定剂可以是乙醇，多聚甲醛，福尔马林或甲酰胺。在将样品中的细胞分到细小的分隔部分之前，保持细胞内的RNA和DNA非常重要。样品中细胞的划分有两种操作方式。第一种方式是将细胞样品分级成多个部分以至每个部分含有不超过一个细胞，第二种方式是将细胞样品被分级，使得每个部分不超过一个循环肿瘤细胞，但可能具有多于一个的非肿瘤细胞。细胞制剂可以分成10、100、1000、10,000、100,000或1,000,000以上的多个部分。将细胞分配到许多相对独立的小隔室的方法在本领域中是众所周知的。例如，可以将细胞直接加入多孔PCR板(例如96孔板或384孔板)中。使用微流控芯片(例如数字PCR芯片)，细胞可以分配到数千个微小隔室中。也可以使用液滴生成器将细胞分级分离并封装入微液滴中。在分配过程中，将富含循环肿瘤细胞的细胞，RT-PCR试剂和报告探针混合在一起并均等地加入到每个部分中。RT-PCR试剂包括PCR缓冲液，ATP，dNTP，热稳定DNA聚合酶，肿瘤特异性引物，热稳定逆转录酶和RNA酶抑制剂。

[0027] 每个部分中的细胞在PCR缓冲液中通过加热进行裂解。例如，细胞可以在95-99℃加热10-20分钟以破坏细胞膜并释放细胞中的核酸，也可添加表面活性剂如NP-40，Tween-20，TritonX-100以帮助破坏细胞膜并完全释放DNA和RNA。从裂解细胞释放的DNA和RNA可以直接用于下游逆转录和PCR扩增。在一些实施方案中，使用肿瘤特异性引物仅将肿瘤特异性RNA逆转录为cDNA，然后可以在随后的PCR中使用相同的引物扩增并检测肿瘤特异性cDNA，或者可以使用随机引物将所有RNA逆转录成cDNA。

[0028] 本发明利用肿瘤特异性RNA或DNA标记序列来鉴定被许多非肿瘤细胞如血液细胞或淋巴细胞包围的少量循环肿瘤细胞。选择在背景非肿瘤细胞中具有低表达或无表达的肿瘤特异性序列对于成功检测循环肿瘤细胞是必不可少的。优选的肿瘤特异性序列是在非肿瘤细胞中不表达/存在的，而仅在癌细胞中表达/存在的DNA或RNA序列，例如仅在肿瘤细胞中积累但不存在于正常细胞中的体细胞基因突变或是在正常血液细胞中不表达的RNA转录物。Harber等人报道了对特定癌症类型具有特异性或具有泛癌表达的仅在癌细胞中表达的RNA转录物。(WO/US2016/154600)。Harber等人首先通过比较癌细胞表达谱与正常血细胞的表达谱来搜索肿瘤特异性基因候选者，然后通过PCR扩增实验确定肿瘤特异性候选基因在癌细胞和正常血细胞中的表达，确实在血细胞中没有表达的肿瘤特异性基因被选作癌症标记序列。肿瘤特异性引物被设计其产生的扩增子跨越多个外显子，这样可以防止相应基因的基因组序列的扩增。通过检测这些仅在癌症中表达的标记基因，可以在有数百，数千甚至数百万个血细胞的情况下检测到单个循环肿瘤细胞。在一个实施方案中，将含有循环肿瘤细胞的细胞分级以使得每个级分实际上含有不多于一个循环肿瘤细胞，但可以含有多于一个的非肿瘤细胞。含有仅在癌细胞中表达的标记序列为阳性的部分被鉴定为含有循环肿瘤细胞，通过计算有阳性结果的细胞组分的数量，可以确定样品中的循环肿瘤细胞数量。如果需要，可以使用泊松统计模型(Lievens A等，PLoS One。2016；11(5)：e0153317)进一步计算样品中CTC的实际数量。由于来自周围血细胞的背景信号很低，本方法使得在存在数千个血细胞的情况下可以检测到单个循环肿瘤细胞，可用于检测最低限度处理或非富集血细胞样品中的循环肿瘤细胞。在另一个实施方案中，富集循环肿瘤细胞的细胞被分级以使得每个组分实际上包含不超过一个细胞。例如，将1000个细胞分配到20000孔的dPCR微型芯片，使得大部分的芯片孔将包含不超过一个单细胞，或者以一定的方式将细胞包封入微滴中，使得大多数微滴最多只包含一个细胞。每个组分包含一个循环肿瘤细胞，一个非肿瘤细胞或是没有任何细胞，因为直接在一个循环肿瘤细胞和一个非肿瘤细胞之间进行比较，因此这个方法可以区分基因表达中较小的差异(例如2倍的基因表达差异)。由于没有来自其他细胞的干扰，本方法可用于检测单个循环肿瘤细胞内的基因数目变异。

[0029] 可以使用本领域已知的任何常规方法来检测每个组分中的PCR产物。用于检测核酸的方法包括使用非特异性双链DNA结合染料(例如SYBR Green)或序列特异性报告探针(例如Taqman探针),PCR产物可以在反应结束时或在PCR循环过程中检测到。可以通过在PCR循环结束时检测PCR产物的数字PCR来检测肿瘤特异性序列，肿瘤特异性序列也可以通过实时定量PCR来检测，该实时定量PCR可以在PCR循环期间进行实时监测以产生扩增曲线，PCR扩增曲线可以提供额外的信息来帮助评估PCR中的真阳性和假阳性。在一个优选实施方案中，本发明使用序列特异性报告探针通过实时定量PCR或数字PCR来检测扩增的肿瘤特异性序列。序列特异性报告探针被设计为包含与肿瘤特异性序列的扩增子上的序列互补的特征序列。不同的序列特异性报告探针可以结合到相同的荧光团并用于检测一组肿瘤特异性序列中的任何序列的存在。另一方面，不同的序列特异性报告探针可以与不同的荧光团结合，例如，与不同癌症类型相关的癌症基因可以通过不同的荧光团检测，从而可以确定循环肿瘤细胞的癌症谱系。与RNA转录物有关的肿瘤特异性序列和与基因组DNA突变有关的肿瘤特异性序列也可以通过使用不同的荧光团来区分。为了计算样品中循环肿瘤细胞的数量，要计算每个部分中肿瘤特异性序列的量。这些组分可分为三组，无信号组，有背景信号的非肿瘤细胞组和信号显著高于背景信号的循环肿瘤细胞组。循环肿瘤细胞的数量是含有循环肿瘤细胞的组分的数量。

[0030] 尽管此处描述的方法是对血液或淋巴细胞样品中的循环肿瘤细胞进行计数，但是本方法可以类似地应用于计数在其他背景细胞的情况下存在的少量特定类型的细胞，只要该特定类型的细胞有独特的标记基因。例如，它可以用于通过检测病毒基因的存在来对细胞群中的病毒感染细胞进行计数。

[0031] 据报道，循环肿瘤细胞可以在癌症的早期阶段被检测到。作为一种非侵入性和灵敏的检测癌症的方法，计数外周血中的循环肿瘤细胞可以代替用于癌症诊断的组织活检。在一些实施方案中，本发明提供了检测受试者中癌症存在的方法，其包括：a)使用本文所述的方法确定来自受试者的血液样品或淋巴液样品中循环肿瘤细胞的存在；和b)使用循环肿瘤细胞的存在作为受试者中癌症存在的指示。在一定量的血液样品中存在至少1、2、3、4或5个循环肿瘤细胞可以用作诊断癌症的标准。泛癌特异性标记序列可以用于确定癌症的存在，或者可以使用一组特定癌症类型的标记序列来确定受试者是否具有特定类型的癌症。
为了提高临床样品中循环肿瘤细胞检测的特异性，可以使用多于一个标记序列作为阳性检测的标准。例如，可以用多个泛癌特异性标记序列的存在来检测阳性循环肿瘤细胞。对于可能感染有特定类型癌症的受试者，可选择特定癌症类型的标记序列加上一种或多种泛癌特异性标记序列来检测该受试者的循环肿瘤细胞。

[0032] 在一些实施方案中，本发明提供了一种为癌症患者的癌症治疗进行预后预测的方法，其包括a)使用本文所述的方法在癌症治疗期间或之后的不同时间点对患者的血液样品或淋巴液样品中的循环肿瘤细胞进行计数；和b)使用患者样本中循环肿瘤细胞数量的增加和减少来分别表征预后差和预后良好。在一些实施方案中，所检测的循环肿瘤细胞是表达癌症转移相关癌症基因的肿瘤细胞。

[0033] 在一些实施方案中，本发明提供了检测患者是否有癌症转移的方法，包括a)使用本文所述的方法检测患者的血液样品或淋巴液样品中表达与癌症转移相关基因的循环肿瘤细胞；和b)用表达癌症转移相关癌症基因的循环肿瘤细胞的存在作为患者有癌症转移的指标。

[0034] 尽管为了清楚理解的目的，本发明已经做了详细的描述，但是本领域技术人员应认识到，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可以进行形式和细节上的各种改动。上面提到的所有图，表格，附录，专利，专利申请和出版物都在此通过引用并入。

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