一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒
阅读：1019发布：2020-06-19
专利汇可以提供一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种精子 活性 氧 含量的测定方法，包括步骤如下：配置反应液，将稀释液与氯化硝基四氮唑蓝冻干粉混合，充分混匀，室温放置；取 液化 精液与反应液充分混匀，置于 水 浴箱，放置；离心，弃上清液，加入稀释液，混匀；取步骤三中 试剂 涂片，滴加 染色 液，室温反应，滴加染色缓冲液与所述染色液混匀，室温反应，洗去染液，干燥；观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。观察精子，分别计数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，计算活性氧阳性精子百分比；本发明观察结果完全不受精液中白细胞的影响，可以真实反映出待测精子活性氧含量。，下面是一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，包括步骤如下：
步骤一：配置反应液，将0.2-2.0ml稀释液与氯化硝基四氮唑蓝含量为20.0-300.0mg的冻干粉混合，充分混匀，室温放置10-30min；
步骤二：取液化精液0.1-2.0ml与所述反应液充分混匀，置于37℃水浴箱，放置10-
40min；
步骤三：200-1000g离心5-30min，弃上清液，加入稀释液0.1-2.0ml，混匀；
步骤四：取步骤三中试剂涂片，滴加染色液0.5-5.0ml，室温反应1-2min，滴加染色缓冲液0.5-5.0ml与所述染色液混匀，室温反应5-30min，洗去染液，干燥；
步骤五：观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。观察不少于100个精子，分别计数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，按以下公式计算活性氧阳性精子百分比，
如：
2.根据权利要求1所述的一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉的组成成分为：包括，含氯化硝基四氮唑蓝0.02-0.3mg/瓶、冻干保护剂、赋形剂；其中所述冻干保护剂包括海藻糖10.0-50.0mg/瓶、牛血清白蛋白1.0-20.0mg/瓶，甘氨酸0.5-3.0mg/瓶，所述赋形剂包括甘露醇5.0-100.0mg/瓶。
3.根据权利要求1所述的一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，容置所述氯化硝基四氮唑蓝的瓶容量为1.0-5.0ml。
4.根据权利要求2所述一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉通过以下步骤进行配置：称取氯化硝基四氮唑蓝100.0mg，海藻糖20.0g，牛血清白蛋白10.0g，甘氨酸1.0g，甘露醇50g，加PBS缓冲液1000ml，搅拌至完全溶解，0.2μm孔径滤纸过滤，冻干，2-8℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，所述稀释液为pH值为6.5-8.5，0.1-0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，所述0.1mmol/L的稀释液通过以下步骤进行配置：称取NaCl 8.5g，Na2HPO42.2g,NaH2PO40.3g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.2，加水定容至1L，0.1-1.0μm孔径滤纸过滤，2-8℃保存。
7.根据权利要求1所述的一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，所述染色液通过以下步骤进行配置：称取瑞氏染料0.1-1.0g加入甲醇100.0-600.0ml，充分混匀至完全溶解。
8.根据权利要求1所述的一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，所述染色缓冲液为pH值为5.0-7.0，0.1-0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求8所述的一种精子活性氧含量的测定方法，其特征在于，所述0.1mmol/L的染色缓冲液通过以下步骤进行配置：称取NaH2PO42.12克，和Na2HPO414.5克，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至6.5，加水定容至1L，孔径为0.1-1.0μm的滤纸过滤，2-8℃保存备用。
10.一种精子活性氧含量的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括，氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、稀释液、染色液以及染色缓冲液；其中，所述稀释液为pH＝6.5-8.5的0.1-
0.5mmol/L磷酸盐缓冲液，所述染色液为甲醇与瑞氏染料的混合液，所述染色缓冲液为pH＝
5.0-7.0的0.1-0.5mmol/L磷酸盐缓冲液。
11.根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括规格为0.5-
5.0ml离心管，所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、稀释液、染色液以及染色缓冲液分别独立装于瓶中。
一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于精子生化指标体外检测的技术领域，涉及一种精子活性氧含量 的测定方法及试剂盒。
背景技术
[0002] 精液活性氧(reactive oxygen species,简称ROS)类物质主要由精子自身和 精液中的白细胞产生，在生殖系统内，抗氧化酶系统和非酶性抗氧化物成分使 ROS的产生和清除保持动态平衡。适量的活性氧在精子功能上扮演着多种角色， 维持精子细胞的正常功能，是精子获能和顶体反应所必需的，但当ROS过量存 在时，会导致细胞氧化应激反应，损伤机体的氧化防御系统，使精子运动功能 改变、活力下降、死亡率升高，并影响精子的顶体反应及受精功能等。
[0003] 现有技术中，在实验室对精子活性氧类物质(ROS)进行定量测量的方法有硫 代巴比妥酸(TBA)法、鲁米诺化学发光法、辣根过氧化物酶法等。硫代巴比妥酸 (TBA)法检测不够严谨，结果不精确，此法不便于评价活性氧的情况；鲁米诺化 学发光法为世界卫生组织推荐的方法学，但操作过程中需使用到强酸性质的鲁 米诺，对操作者、环境产生危害；辣根过氧化物酶法需使用到酸性腐蚀品三氯 乙酸，也会对操作者、环境产生危害，且需要在0℃超声处理，临床使用不方便。
[0004] 为了解决上述问题，申请号为CN201711269951.9的专利精子活性氧类物质 定量测定试剂盒及其用途和使用方法，该专利中采用比色法测定精子活性氧含 量，虽然可以进行测定，但是白细胞中过氧化物酶可对活性氧测定结果产生影 响，该专利又不能排除白细胞对活性氧含量测定结果的影响。
发明内容
[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种一种精子活性氧含 量的测定方法，通过以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒 的精子作为活性氧阳性精子，计算活性氧阳性精子百分比，可以准确评估精子 活性氧含量。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 一种精子活性氧含量的测定方法，包括步骤如下：
[0008] 步骤一：配置反应液，将0.2-2.0ml稀释液与氯化硝基四氮唑蓝含量为 20.0-300.0mg的冻干粉混合，充分混匀，室温放置10-30min；
[0010] 步骤三：200-1000g离心5-30min，弃上清液，加入稀释液0.1-2.0ml，混 匀；
[0011] 步骤四：取步骤三中试剂涂片，滴加染色液0.5-5.0ml，室温反应1-2min， 滴加染色缓冲液0.5-5.0ml与所述染色液混匀，室温反应5-30min，洗去染液， 干燥；
[0012] 步骤五：观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精 子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。观察不少于100个精子，分别计 数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，按以下公式计算活性氧阳性精子百分 比。
[0013]
[0014] 进一步，所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉的组成成分为：包括，含氯化硝基 四氮唑蓝0.02-0.3mg/瓶、冻干保护剂、赋形剂；其中所述冻干保护剂包括海 藻糖10.0-50.0mg/瓶、牛血清白蛋白1.0-20.0mg/瓶，甘氨酸0.5-3.0mg/瓶， 所述赋形剂包括甘露醇5.0-100.0mg/瓶。
[0015] 进一步，容置所述氯化硝基四氮唑蓝瓶容量为1.0-5.0ml。
[0016] 进一步，所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉通过以下步骤进行配置：称取氯化 硝基四氮唑蓝100.0mg，海藻糖20.0g，牛血清白蛋白10.0g，甘氨酸1.0g，甘 露醇50g，加PBS缓冲液1000ml，搅拌至完全溶解，0.2μm孔径滤纸过滤，冻干， 2-8℃保存。
[0017] 进一步，所述稀释液为pH值为6.5-8.5，0.1-0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液。
[0018] 进一步，所述0.1mmol/L磷酸盐缓冲液通过以下步骤进行配置：称取NaCl 8.5g，Na2HPO42.2g,NaH2PO40.3g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值 至7.2，加水定容至1L，0.1-1.0μm孔径滤纸过滤，2-8℃保存。
[0019] 进一步，所述染色液通过以下步骤进行配置：称取瑞氏染料0.1-1.0g加入 甲醇100.0-600.0ml，充分混匀至完全溶解。
[0020] 进一步，所述染色缓冲液为pH值为5.0-7.0，0.1-0.5mmol/L的磷酸盐缓 冲液。
[0021] 进一步，所述染色缓冲液为0.1mmol/L磷酸盐缓冲液，通过以下步骤进行 配置：称取NaH2PO42.12g，和Na2HPO414.5g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH 值至6.5，加水定容至1L，孔径为0.1-1.0μm的滤纸过滤，2-8℃保存备用。
[0022] 本发明还提供了一种精子活性氧含量的检测试剂盒，技术方案如下：
[0023] 一种精子活性氧含量检测试剂盒，包括，氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、稀释 液、染色液以及染色缓冲液；其中，所述稀释液为pH＝6.5-8.5的0.1-0.5mmol/L 磷酸盐缓冲液，所述染色液为甲醇与瑞氏染料的混合液，所述染色缓冲液为 pH＝5.0-7.0的0.1-0.5mmol/L磷酸盐缓冲液。
[0024] 进一步，所述试剂盒中包括规格为0.5-5.0ml的离心管，所述氯化硝基四 氮唑蓝冻干粉、稀释液、染色液以及染色缓冲液分别独立装于瓶中。
[0025] 本发明一种精子活性氧含量的测定方法，采用显微镜观察精子中甲臜颗粒 的形成进而评估精子活性氧含量，观察结果完全不受精液中白细胞的影响，可 以真实反映出待测精子活性氧含量；其中，活性氧阴性精子头部顶体区染成淡 蓝色，顶体后区域染成蓝色，颈部及尾部染成淡红色。活性氧阳性精子头部顶 体区染成淡蓝色，顶体后区域染成深蓝色，顶体区或顶体后区可见粗大紫色甲 瓒颗粒，颈部及尾部染成淡红色，以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精子， 含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。
[0026] 同时，现有技术中采用比色法测定精子活性氧含量需要酶标仪等比色仪器， 对于设备的要求较高，相应的，检测精子活性氧含量的成本就较高，不利于在 广大基层医院进行推广。而本发明仅需要显微镜，对于设备要求很低，适于推 广。
具体实施方式
[0027] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的方案，下面结合本发明示例 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的示例仅 仅是本发明的一部分示例，而不是全部的示例。基于本发明中的示例，本领域 的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施方式 都应当属于本发明保护的范围。
[0028] 在本实施方式的描述中，术语“内”、“外”、“前”、“后”、“左”、“右” 等指示的方位或位置关系仅仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示 或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因 此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于区别类似 的对象，而不能理解为特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情 况想可以互换。
[0029] 为清楚地说明本发明的设计思想，下面结合实施例对本发明进行说明。
[0030] 实施例1：
[0031] 一种精子活性氧含量的测定方法，步骤包括：
[0032] 步骤一：配置反应液，量取1ml稀释液加入到盛有氯化硝基四氮唑蓝含量 为100mg的冻干粉瓶中，充分混匀，室温放置15min；
[0033] 步骤二：将步骤一配置的反应液取100μl，置于2ml离心管中，取100μl 液化精液置于上述离心管中与反应液充分混匀，置于37℃水浴箱，放置30min；
[0034] 步骤三：将上述离心管中试剂在250g离心5min，弃去上清液，加入100μl 稀释液，混匀；
[0035] 步骤四：取步骤三中反应液10.0μl涂片，室温放置至完全干燥，然后将涂 片水平放置，在涂片表面滴加染色液2ml，室温反应1min，再向涂片滴加染色 缓冲液2ml与染色液混匀，室温反应15min，用蒸馏水洗去染液，自然干燥；
[0036] 步骤五：在显微镜油镜下观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作 为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。其中，活性氧阴 性精子头部顶体区染成淡蓝色，顶体后区域染成蓝色，颈部及尾部染成淡红色。 活性氧阳性精子头部顶体区染成淡蓝色，顶体后区域染成深蓝色，顶体区或顶 体后区可见粗大紫色甲瓒颗粒，颈部及尾部染成淡红色。观察不少于100个精 子，分别计数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，计算活性氧阳性精子百分 比。
[0037] 本实施例中，
[0038] 上述示例中，本发明采用显微镜观察精子中甲臜颗粒的形成进而评估精子 活性氧含量，观察结果完全不受精液中白细胞的影响，可以真实反映出待测精 子活性氧含量。
[0039] 同时，现有技术中采用比色法测定精子活性氧含量需要酶标仪等比色仪器， 对于设备的要求较高，相应的，检测精子活性氧含量的成本就较高，不利于在 广大基层医院进行推广。而本发明仅需要显微镜，对于设备要求很低，适于推 广。
[0040] 上述示例中，每瓶氯化硝基四氮唑蓝冻干粉的组成成分为：包括，含氯化 硝基四氮唑蓝0.1mg/瓶、冻干保护剂、赋形剂；其中所述冻干保护剂包括海藻 糖20mg/瓶、白蛋白10mg/瓶，甘氨酸1mg/瓶，所述赋形剂包括甘露醇50mg/瓶， 其中，容量瓶的容量为2ml。
[0041] 氯化硝基四氮唑蓝冻干粉通过以下步骤进行配置：称取氯化硝基四氮唑蓝 100mg，海藻糖20g，牛血清白蛋白10g，甘氨酸1g，甘露醇50g，加PBS缓冲 液1000ml，搅拌至完全溶解，0.2μm孔径滤纸过滤，将上述溶液分装到容量为 3ml的冻干瓶中，每瓶1ml。将分装好的溶液置入冷冻干燥机内冻干。
[0042] 冻干步骤为：-50℃预冷冻3h，冻干机减压抽真空至20Pa以下，-50℃、20pa 以下冷维持24小时，升温至0℃维持4h，升温至30度维持5h，封盖，放气至 常压，取出，即得氯化硝基四氮唑蓝冻干粉。4℃冰箱保存。
[0043] 其中，pH＝7.4的PBS缓冲液的配制步骤为：称取NaCl 8.5g，Na2HPO42.2g, NaH2PO40.3g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L， 0.2μm孔径滤纸过滤，4℃保存备用。
[0044] 稀释液为pH值为6.5-8.5，0.1-0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液，如果该磷酸 盐缓冲液的浓度低于0.1mmol/L或者高于0.5mmol/L，则染色效果很差，影响观 察测定。其中，在本实施例中该稀释液为pH＝7.2，0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液， 配置步骤为：称取NaCl 8.5g，Na2HPO42.2g,NaH2PO40.3g，溶于900ml双蒸水 中，用盐酸调pH值至7.2，加水定容至1L，0.1-1.0μm孔径滤纸均可过滤，在 本实施例中采用0.2μm孔径滤纸，4℃保存备用。
[0045] 染色液为瑞氏染料和甲醇的混合物，配制步骤为：称取瑞氏染料0.5g加入 甲醇300ml，充分混匀至完全溶解。
[0046] 染色缓冲液为pH值为5.0-7.0，0.1-0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液，如果该 磷酸盐缓冲液的浓度低于0.1mmol/L或者高于0.5mmol/L，则染色效果很差，影 响观察测定。其中，在本实施例中，该染色缓冲液为pH＝6.5，0.1mmol/L的磷 酸盐缓冲液，配制步骤为：称取NaH2PO42.12克，和Na2HPO414.5克，溶于900ml 双蒸水中，用盐酸调pH值至6.5，加水定容至1L，0.1-1.0μm孔径滤纸均可过 滤，在本实施例中采用0.2μm孔径滤纸，4℃保存备用。
[0047] 为了证明本发明测定活性氧可排除标本白细胞对检测结果的影响，特将不 同数量外周血中分离的中性粒细胞加入到同一精浆标本中，分别采用本专利方 法与专利CN201711269951.9授权的比色法测定精子活性氧含量，具体方法如下：
[0050] 三、另取一支5ml玻璃试管，加入比重为1.085的粒细胞分离液2ml，一次 性吸管吸取上述稀释后白细胞层细胞，加于粒细胞分离液上，2000rpm水平离心 20min。一次性吸管吸取位于白细胞分离液界面上的粒细胞层带,置于另一5ml 玻璃试管内，加入适量生理盐水调整粒细胞浓度为10×106/ml。
[0051] 四、取新鲜完全液化的正常人混合精液10ml，生理盐水调整精子密度为30 ×106/ml。
[0052] 五、按下述操作配制成不同白细胞浓度标本。
[0053]
[0054] 六、将上述1-6号标本分别按用本专利显微镜计数法与专利 CN201711269951.9授权的比色法测定精子活性氧含量，结果如下。
[0055]
[0056]
[0057] 上述结果说明，比色法测定活性氧结果受精液标本中白细胞数量影响较大， 不能客观反映精子活性氧水平；本专利技术采用的显微镜计数法不受精液标本 中白细胞数量影响，结果可信度高。
[0058] 实施例二
[0059] 一种精子活性氧含量的测定方法，步骤包括：
[0060] 步骤一：配置反应液，量取2ml稀释液加入到盛有氯化硝基四氮唑蓝含量 为300mg的冻干粉瓶中，充分混匀，室温放置30min；
[0061] 步骤二：将步骤一配置的反应液取100μl，置于5ml离心管中，取2ml液化 精液置于上述离心管中与反应液充分混匀，置于37℃水浴箱，放置40min；
[0062] 步骤三：将上述离心管中试剂在1000g离心5min，弃去上清液，加入2ml 稀释液，混匀；
[0063] 步骤四：取步骤三中反应液100μl涂片，室温放置至完全干燥，然后将涂 片水平放置，在涂片表面滴加染色液5ml，室温反应2min，再向涂片滴加染色 缓冲液2ml与染色液混匀，室温反应30min，用蒸馏水洗去染液，自然干燥；
[0064] 步骤五：在显微镜油镜下观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作 为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。其中，活性氧阴 性精子头部顶体区染成淡蓝色，顶体后区域染成蓝色，颈部及尾部染成淡红色。 活性氧阳性精子头部顶体区染成淡蓝色，顶体后区域染成深蓝色，顶体区或顶 体后区可见粗大紫色甲瓒颗粒，颈部及尾部染成淡红色。观察不少于100个精 子，分别计数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，计算活性氧阳性精子百分 比。
[0065] 本实施例中，
[0066] 氯化硝基四氮唑蓝冻干粉通过以下步骤进行配置：称取氯化硝基四氮唑蓝 300mg，海藻糖50g，牛血清白蛋白20g，甘氨酸3g，甘露醇100g，加PBS缓冲 液1000ml，搅拌至完全溶解，0.1μm孔径滤纸过滤，将上述溶液分装到容量为 3ml的冻干瓶中，每瓶1ml。将分装好的溶液置入冷冻干燥机内冻干。
[0067] 冻干步骤为：-50℃预冷冻3h，冻干机减压抽真空至20Pa以下，-50℃、20pa 以下冷维持24小时，升温至0℃维持4h，升温至30度维持5h，封盖，放气至 常压，取出，即得氯化硝基四氮唑蓝冻干粉。8℃冰箱保存。
[0068] 其中染色液为瑞氏染料和甲醇的混合物，配制步骤为：称取瑞氏染料1.0g 加入甲醇600ml，充分混匀至完全溶解。
[0069] 其余部分与实施例一保持一致。
[0070] 实施例三
[0071] 一种精子活性氧含量的测定方法，步骤包括：
[0072] 步骤一：配置反应液，量取0.2ml稀释液加入到盛有氯化硝基四氮唑蓝含 量为20.0mg的冻干粉瓶中，充分混匀，室温放置10min；
[0073] 步骤二：将步骤一配置的反应液取100μl，置于5ml离心管中，取0.1ml 液化精液置于上述离心管中与反应液充分混匀，置于37℃水浴箱，放置10min；
[0074] 步骤三：将上述离心管中试剂在200g离心30min，弃去上清液，加入0.1ml 稀释液，混匀；
[0075] 步骤四：取步骤三中反应液100μl涂片，室温放置至完全干燥，然后将涂 片水平放置，在涂片表面滴加染色液0.5ml，室温反应1min，再向涂片滴加染 色缓冲液0.5ml与染色液混匀，室温反应5min，用蒸馏水洗去染液，自然干燥；
[0076] 步骤五：在显微镜油镜下观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作 为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。其中，活性氧阴 性精子头部顶体区染成淡蓝色，顶体后区域染成蓝色，颈部及尾部染成淡红色。 活性氧阳性精子头部顶体区染成淡蓝色，顶体后区域染成深蓝色，顶体区或顶 体后区可见粗大紫色甲瓒颗粒，颈部及尾部染成淡红色。观察不少于100个精 子，分别计数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，计算活性氧阳性精子百分 比。
[0077] 本实施例中，
[0078] 氯化硝基四氮唑蓝冻干粉通过以下步骤进行配置：称取氯化硝基四氮唑蓝 20mg，海藻糖10g，牛血清白蛋白1.0g，甘氨酸0.5g，甘露醇5.0g，加PBS缓 冲液1000ml，搅拌至完全溶解，1.0μm孔径滤纸过滤，将上述溶液分装到容量 为3ml的冻干瓶中，每瓶1ml。将分装好的溶液置入冷冻干燥机内冻干。
[0079] 冻干步骤为：-50℃预冷冻3h，冻干机减压抽真空至20Pa以下，-50℃、20pa 以下冷维持24小时，升温至0℃维持4h，升温至30度维持5h，封盖，放气至 常压，取出，即得氯化硝基四氮唑蓝冻干粉。8℃冰箱保存。
[0080] 其中染色液为瑞氏染料和甲醇的混合物，配制步骤为：称取瑞氏染料0.1g 加入甲醇100ml，充分混匀至完全溶解。
[0081] 其余部分与实施例一保持一致。
[0082] 实施例四
[0083] 一种精子活性氧含量的检测试剂盒，包括，氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、稀 释液、染色液以及染色缓冲液；其中，所述稀释液为pH＝7.2的0.1mmol/L磷酸 盐缓冲液，所述染色液为甲醇与瑞氏染料的混合液，所述染色缓冲液为pH＝6.5 的0.1mmol/L磷酸盐缓冲液。试剂盒中还包括0.5-5.0ml离心管。
[0084] 上述示例中，每瓶氯化硝基四氮唑蓝冻干粉的组成成分为：包括，含氯化 硝基四氮唑蓝0.1mg/瓶、冻干保护剂、赋形剂；其中所述冻干保护剂包括海藻 糖0.02g/瓶、白蛋白0.01g/瓶，甘氨酸0.001g/瓶，所述赋形剂包括甘露醇 0.05g/瓶。
[0085] 氯化硝基四氮唑蓝冻干粉通过以下步骤进行配置：称取氯化硝基四氮唑蓝 100mg，海藻糖20g，牛血清白蛋白10g，甘氨酸1g，甘露醇50g，加PBS缓冲 液1000ml，搅拌至完全溶解，0.2μm孔径滤纸过滤，将上述溶液分装到3ml的 冻干瓶中，每瓶1ml。将分装好的溶液置入冷冻干燥机内冻干。
[0086] 冻干步骤为：-50℃预冷冻3h，冻干机减压抽真空至20Pa以下，-50℃20pa 以下冷维持24小时，升温至0℃维持4h，升温至30度维持5h，封盖，放气至 常压，取出，即得氯化硝基四氮唑蓝冻干粉。2-8℃冰箱保存。
[0087] 其中，pH＝7.4的PBS缓冲液的配制步骤为：称取NaCl 8.5g，Na2HPO42.2g, NaH2PO40.3g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L， 0.2μm孔径滤纸过滤，4℃保存备用。
[0088] pH＝7.2的稀释液为0.1mmol/L磷酸盐缓冲液，称取NaCl 8.5g，Na2HPO42.2g, NaH2PO40.3g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L， 0.2μm孔径滤纸过滤，4℃保存备用。
[0089] 染色液为瑞氏染料和甲醇的混合物，配制步骤为：称取瑞氏染料0.5g加入 甲醇300ml，充分混匀至完全溶解。
[0090] pH＝6.5的染色缓冲液为0.1mmol/L磷酸盐缓冲液，配制步骤为：称取 NaH2PO42.12克，和Na2HPO414.5克，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至 6.5，加水定容至
1L，0.2μm孔径滤纸过滤，4℃保存备用。
1L，0.2μm孔径滤纸过滤，4℃保存备用。
[0091] 需要说明的是，除了上述给出的具体示例之外，其中的一些部分可有不同 选择。而这些都是本领域技术人员在理解本发明思想的基础上基于其基本技能 即可做出的，故在此不再一一例举。
[0092] 最后，可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用 的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域普通技术人员而言， 在不脱离本发明的原理和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型 和改进也视为本发明的保护范围。
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