用于白细胞分类计数的组合物和方法
阅读：352发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于白细胞分类计数的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于利用 荧光 检测将白细胞群中的白细胞分类的组合物和方法。该方法包括使具有一种或多种白细胞类型的样品中的白细胞群与诊断组合物 接触 、用 光源 激发白细胞群；并且测量来自一种或多种白细胞类型的每一种的发射光以将白细胞群分类。，下面是用于白细胞分类计数的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种诊断组合物，所述诊断组合物包括：
具有阳离子电荷的第一染料；
相比所述第一染料具有较少阳离子电荷的第二染料；以及
具有对蛋白质的反应性、具有对蛋白质的亲和力或具有阴离子电荷的第三染料。
2.如权利要求1所述的诊断组合物，其中所述第一染料具有至少两个阳离子电荷。
3.如权利要求1所述的诊断组合物，其中所述第二染料具有一个阳离子电荷。
4.如权利要求2所述的诊断组合物，其中所述第一染料是碘化丙啶。
5.如权利要求3所述的诊断组合物，其中所述第二染料是碱性橙21。
6.如权利要求1所述的诊断组合物，其中所述第三染料是异硫氰酸荧光素。
7.一种用于通过荧光检测将白细胞群中的白细胞分类的方法，所述方法包括：
使具有一种或多种白细胞类型的样品中的白细胞群与诊断组合物接触，所述诊断组合物包括：
具有阳离子电荷的第一染料；
相比所述第一染料具有较少阳离子电荷的第二染料；以及
具有对蛋白质的反应性、具有对蛋白质的亲和力或具有阴离子电荷的第三染料，以染色所述白细胞群来形成染色的白细胞群；
用光源激发所述染色的白细胞群；以及
测量来自一种或多种白细胞类型的每一种的发射光以将所述白细胞群分类。
8.如权利要求7所述的用于分类的方法，其中所述白细胞群中白细胞类型的数目是选自由以下组成的组的成员：2、3、4或5种白细胞类型。
9.如权利要求8所述的用于分类的方法，其中从所述白细胞类型的每一种发射的荧光与从所述群中的其他类型的每一种发射的荧光是可区分的。
10.如权利要求7所述的用于分类的方法，其中所述群中的所述白细胞包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
11.如权利要求7所述的用于分类的方法，其中所述第一染料主要染色所述一种或多种白细胞类型的细胞核。
12.如权利要求7所述的用于分类的方法，其中所述第二染料主要染色所述一种或多种白细胞类型的细胞质。
13.如权利要求7所述的用于分类的方法，其中所述第三染料主要染色所述一种或多种白细胞类型的蛋白质内含物。
14.如权利要求7所述的用于分类的方法，其中所述激发光从选自由以下组成的组的光源发射：二极管激光器、发光二极管(LED)、离子激光器、染料激光器、和照射器。
15.如权利要求14所述的用于分类的方法，其中在第一波长和在第二波长处测量所述发射光以实现两种颜色的荧光测量。
16.如权利要求15所述的用于分类的方法，其中所述第一波长在约510nm至约560nm处。
17.如权利要求15所述的用于分类的方法，其中所述第二激发光在约590nm至约
650nm处发射。
18.如权利要求15所述的用于分类的方法，其中在所述第一波长和所述第二波长处测量所述发射光。
19.如权利要求18所述的用于分类的方法，其中通过两个光电倍增管同时测量所述发射光。
20.如权利要求7所述的用于分类的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：全血、血浆、和血清。
21.如权利要求20所述的用于分类的方法，其中所述样品被所述诊断组合物染色并且流经流式细胞仪。
22.如权利要求21所述的用于分类的方法，其中将所述一种或多种白细胞类型暴露于所述光源，并记录所述荧光的强度。
23.如权利要求20所述的用于分类的方法，其中所述样品被所述诊断组合物染色并且流经微流控细胞仪。
24.如权利要求23所述的用于分类的方法，其中样品流经检测通道。
25.如权利要求23所述的用于分类的方法，其中将所述一种或多种白细胞类型逐个暴露于所述光源，并记录来自每个单个白细胞类型的两种颜色的荧光发射。
26.如权利要求23所述的用于分类的方法，其中计数所述白细胞群并且将所述一种或多种白细胞类型分类以实现白细胞分类计数。
27.一种微流控细胞仪，所述微流控细胞仪包括：
激发激光器；
位于所述激发激光器下游、具有用于流通样品的流体通道的微流控芯片，其中所述样品被所述激发激光器激发；以及
测量发射的荧光的至少两个光电倍增管。
28.如权利要求27所述的微流控细胞仪，还包括所述微流控芯片上游的第一聚光器。
29.如权利要求28所述的微流控细胞仪，还包括所述微流控芯片下游的第二聚光器。
30.如权利要求27所述的微流控细胞仪，还包括所述至少两个光电倍增管中的每一个的上游的光滤波器。
31.如权利要求27所述的微流控细胞仪，还包括分色镜。
32.诊断组合物用于通过荧光检测将白细胞群中的白细胞分类的用途，其中所述诊断组合物包括：
具有阳离子电荷的第一染料；
相比所述第一染料具有较少阳离子电荷的第二染料；以及
具有对蛋白质的反应性、具有对蛋白质的亲和力或具有阴离子电荷的第三染料，以染色所述白细胞群。
用于白细胞分类计数的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年11月28日提交的美国临时专利申请号61/564,120和2011年12月28日提交的美国临时专利申请号61/580,761的优先权，其教导在此通过引用以其整体被并入用于所有目的。
[0003] 发明背景
[0004] 白细胞(White blood cell，WBC)分类计数(differential count)是一种临床分析，其计数每体积血液样品中的白细胞(leukocyte)总数，并将白细胞群(leukocyte population)分成不同的类型或亚群(subpopulation)，诸如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。该分析对于疾病诸如白血病、感染和过敏反应的诊断是有用的。
[0005] 目前，自动化白细胞分类计数通过利用细胞形态学或细胞内含物的差异在血液分析仪或流式细胞仪中进行。细胞形态学分析使用诸如单个细胞的光散射和电阻抗的检测方法。可选地，白细胞可基于它们的细胞内含物被分析，所述细胞内含物可被荧光染料选择性地染色并通过相应的荧光发射被检测，诸如通过美国专利号6,197,593、美国专利号6,004,816、美国专利号5,296,378和美国专利号5,434,081、美国专利号3,916,205的公开内容中所描述的试剂和方法被检测。
[0006] 近年来，存在微型化白细胞分类计数用于新兴应用诸如NASA航天和床边保健的逐渐增加的兴趣。前面提到的用于白细胞分析的试剂和方法均被开发用于大尺寸的血液分析仪或流式细胞仪，而未被优化用于微型化应用。例如，前面提到的用于白细胞分类的试剂和方法需要光散射检测和荧光检测相结合，或使用多步曝光和荧光检测，其增加了系统的复杂性并且难以被用于微型化仪器。因此，本领域对用于白细胞分类计数特别是用于微型化目的的白细胞分类计数的组合物和方法仍存在需求。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明通过提供诊断组合物满足本领域中用于白细胞分类计数的新方法的需求，该诊断组合物是荧光染料混合物。本公开内容涉及白细胞(WBC)分类组合物及其使用方法，并且更特别地涉及，用于使用合适的设备诸如具有光学和电子技术的流式细胞术系统或全自动血液分析仪或微流控装置将样品(例如，血液)中的白细胞的不同亚组(subgroup)自动分类的试剂和方法。有利地，该诊断组合物可用于使用荧光检测作为检测手段将至少五种不同的白细胞类型或亚群(例如，淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)分类。本发明还提供了利用诊断组合物通过荧光检测进行白细胞分析，特别是在用于医疗点诊断(point-of-care diagnostic)的微流控细胞仪(microfluidic cytometer)上进行白细胞分析的方法。
[0009] 如此，在一个实施方案中，本发明提供了一种诊断组合物，所述诊断组合物包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：
[0010] 具有阳离子电荷的第一染料；
[0011] 相比第一染料具有较少阳离子电荷的第二染料；以及
[0013] 第三染料。
[0014] 在某些方面，第一染料具有至少两个阳离子电荷，而第二染料具有一个阳离子电荷。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于通过荧光检测对白细胞群中的白细胞进行分类的方法，该方法包括：
[0016] 使具有一种或多种白细胞类型的样品中的白细胞群与诊断组合物接
[0017] 触以形成染色的白细胞群；
[0019] 测量来自群中的一种或多种白细胞类型的每一种的发射光以对白细
[0020] 胞群进行分类。
[0021] 在又另一个实施方案中，本发明提供了诊断组合物用于通过荧光检测将白细胞群中的白细胞分类的用途，其中该诊断组合物包括：
[0022] 具有阳离子电荷的第一染料；
[0023] 相比第一染料具有较少阳离子电荷的第二染料；以及
[0024] 具有对蛋白质的反应性、具有对蛋白质的亲和力或具有阴离子电荷的
[0025] 第三染料，以染色白细胞群。
[0027] 附图简述
[0028] 图1显示本发明的光学配置(optical configuration)的实施方案。
[0029] 图2显示本发明的微流控细胞仪的一个实施方案。
[0031] 图4显示用两种颜色的荧光将不同类型的白细胞分类的散点图。
[0032] 图5显示使用本方法计数每体积血液中白细胞总数的柱状图。
[0033] 图6显示比较本方法与其他可得方法的图。
[0034] 发明详述
[0035] I.实施方案
[0036] 本发明提供了诊断组合物，所述诊断组合物在用于使用荧光检测作为检测手段在微流控细胞仪上的白细胞分类计数的方法中是有用的。通过用本染料组合物染色样品并使染色的样品流经微流控细胞仪，可单独测量群中的每种白细胞类型的荧光发射。用这种方法，白细胞总数可被计数并且不同类型的白细胞或亚群可被分类以实现白细胞分类计数。
[0037] 图1显示了本发明的微流控细胞仪10的光学配置的实例。如其中显示的，微流控细胞仪具有激发激光器12和该激发激光器下游的微流控芯片11。该芯片具有用于流通待被分类并计数为亚群或类型的具有白细胞(例如，白细胞群)的样品的流体通道(fluidic channel)。在操作过程中，样品被激发激光器激发。至少两个光电倍增管15a、15b测量发射的荧光。微流控细胞仪10还包括在微流控芯片上游的第一聚光器13a以聚焦激光。此外，微流控细胞仪10还包括在微流控芯片下游的第二聚光器13b以扩展(expand)光并将光聚焦在分色镜18上。微流控细胞仪10优选地在两个光电倍增管中的每一个的上游具有光滤波器17a、17b。
[0038] 图2显示使用本发明的光学配置的微流控细胞仪20的一个实例。在某些方面，微流控细胞仪具有可更换的微流控芯片21，其中样品由蠕动泵24驱动。在某些方面，微流控细胞仪20可具有用与图1中所示的相同或相似的光学配置执行的荧光检测。检测流体通道(例如，28μm高、32μm宽和40μm长)是微流芯片，其优选地是可更换的。
[0039] 在一个方面，488nm20mW激光被用作激发光源。然而，光源是非限制性的。绿色荧光(例如，波长510nm-560nm)和红色荧光(波长>590nm)通过具有光学滤波器以选择光波长范围的两个光电倍增管被同时测量。样品(例如，全血)用诊断组合物染色并流经流式细胞仪，其中将染色的细胞暴露于激发光源，并且记录来自白细胞的两种颜色的荧光强度。
[0040] 在一个实施方案中，本发明提供了诊断组合物，所述诊断组合物包括以下、基本上由以下组成或者由以下组成：
[0041] 具有阳离子电荷的第一染料；
[0042] 相比第一染料具有较少阳离子电荷的第二染料；以及，对蛋白质具有
[0043] 反应性、对蛋白质具有亲和力或具有阴离子电荷的第三染料。
[0044] 在某些方面，第一染料具有至少两个阳离子电荷，而第二染料具有一个阳离子电荷。例如，第一染料可以是碘化丙啶并且第二染料可以是碱性橙21。在某些方面，第三染料是异硫氰酸荧光素。
[0045] 例如，碘化丙啶的化学结构如下：
[0046]
[0047] 该化合物具有两个四价氮原子，并且在pH约6-8例如7.0时，该分子具有两个阳离子电荷。碘化丙啶是一种嵌入剂(intercalating agent)和荧光分子，并且当连接到核酸上时，最大荧光激发为535nm且最大发射为617nm。
[0048] 第二染料具有少于第一染料的阳离子特征。例如，第二染料可以是碱性橙21，其具有以下结构：
[0049]
[0050] 碱性橙21具有一个四价氮并因此在某些方面，相比第一染料仅具有一个电荷。
[0051] 在某些方面，第三染料是阴离子染料，诸如异硫氰酸荧光素，其在生理pH下是阴离子型的并且对蛋白质的氨基基团(例如，N-末端、精氨酸、组氨酸或赖氨酸)具有反应性。异硫氰酸荧光素具有以下结构：
[0052]
[0054] 在某些方面，本发明提供了三种荧光染料的混合物，第一阳离子染料携带两个或多个正电荷，诸如碘化丙啶，第二阳离子染料携带少于第一染料的正电荷(例如，1个正电荷)，诸如碱性橙21，且阴离子染料或阴离子染料的衍生物或对蛋白质具有反应性的染料，诸如异硫氰酸荧光素，其是阴离子型的。诊断组合物可被用于选择性地白细胞的细胞核诸如核酸、酸性细胞质和蛋白质内含物分别进行染料1、染料2和染料3染色，并将不同类型的白细胞分类。人们认为，组合物中的染料通过离子吸附与白细胞中的细胞成分(核酸、细胞质和蛋白质)结合。结合到细胞内核酸诸如DNA和RNA的荧光染料化合物发射荧光。荧光属性是反映血液样品中的细胞内的荧光染料的量的参数。由于不同亚组的细胞的代谢活性的差异导致核酸含量或其他细胞成分的不同，不同亚组的白细胞的荧光属性在某些方面不同。
[0055] 在某些方面，染料的电荷利用本领域已知的技术被评价。例如，通过使用在标准pH(例如pH5.0到8.0，即pH＝5、6、7或8)下的电泳技术，评价染料的电荷是可能的。在一方面，第一染料具有最大阳离子特征且第三染料具有最小阳离子特征。第二染料在两者之间。在其他方面，第三染料具有最大阴离子特征且第一染料具有最小阴离子特征。第二染料在两者之间。
[0056] 可用于第一阳离子染料的其他红色荧光染料包括，例如，来自Molecular Probes的 染料。这些染料包括，例如，红色荧光 染料( 17以及59、60、61、62、63和64)，每一种都作为二甲基亚砜(DMSO)中的溶液被提供。在另一方面，第一染料是二脒基苯基吲哚(diamidinophenylindole，DAPI)。在某些其他方面，第二阳离子染料可以是，例如，溴化乙锭或 橙色荧光核酸染料( Orange Fluorescent
Nucleic Acid Stain)例如 80、81、82、83、84或85染料。绿色阳离子染料包括，例如， 9、11、12、13、14、16、18、21、24或 25。本发明提供了适于本发明的其他阴离子蛋白染料例如异硫氰酸荧光素(FITC)的异构体。例如，硫氰酸基团可以在FITC的苯基部分的4-碳或FITC的苯基部分的5-碳上。本领域技术人员将知晓FITC的其他异构体。
Nucleic Acid Stain)例如 80、81、82、83、84或85染料。绿色阳离子染料包括，例如， 9、11、12、13、14、16、18、21、24或 25。本发明提供了适于本发明的其他阴离子蛋白染料例如异硫氰酸荧光素(FITC)的异构体。例如，硫氰酸基团可以在FITC的苯基部分的4-碳或FITC的苯基部分的5-碳上。本领域技术人员将知晓FITC的其他异构体。
[0057] 在某些其他方面，类似于FITC的、具有对蛋白质的亲和力或反应性的染料，包括但不限于[i]荧光素衍生物，例如，荧光胺(FC)，[ii]罗丹明及其衍生物，例如，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)，四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(RHS)和异硫氰酸罗丹明(XRITC)，以及[iii]曙红及其衍生物(例如，异硫氰酸酯(EITC))。在某些其他方面，第三染料包括与蛋白质以离子键方式结合的染料，例如磺酰罗丹明101。
[0058] 在另一方面，本发明提供了用于通过荧光检测将白细胞分类的方法。当白细胞被本组合物染色时，测量白细胞的荧光强度。典型地，第一染料染色细胞核例如其中的核酸。具有少于第一染料的阳离子特征的第二染料，染色细胞质。蛋白内含物被第三染料诸如阴离子染料或阴离子染料的衍生物诸如异硫氰酸荧光素染色。测量荧光以将不同类型的白细胞包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞分类。在其他方面，WBC的亚群或类型包括，例如淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、幼稚粒细胞、异常淋巴细胞、母细胞、杆状核粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和晚幼粒细胞。
[0059] 在另一方面，第一染料优选为红色荧光染料且第二染料优选为绿色或橙色荧光染料。重要的是，第一阳离子染料携带比第二阳离子染料多的正电荷。用这种方法，第一阳离子染料染色细胞核诸如DNA和RNA且第二阳离子染料染色酸性细胞质内含物。阴离子染料或阴离子染料的衍生物优选为绿色荧光染料。第三染料以高亲和力染色白细胞的蛋白质内含物，以及嗜酸性粒细胞颗粒。在一个特定实施方案中，第二阳离子染料优选为碱性橙21，其具有结合嗜碱性粒细胞颗粒中的肝素内含物的高亲和力。嗜碱性粒细胞颗粒的选择性染色可被用于改善嗜碱性粒细胞的分类。因此，在一个方面，本发明提供了用于通过荧光细胞术将白细胞群分类的改进的方法。更具体地，在一个实施方案中，该方法允许基于核酸、细胞质和蛋白质染色连同在两个或多个波长下的荧光测量，计数并区分生物样品中不同的白细胞(WBC)亚群或类型。
[0060] 在本方法中，白细胞用染料试剂染色并被暴露于光激发源例如蓝色或蓝绿色光激发源用于荧光检测。测量两种颜色的荧光包括绿色荧光和红色荧光用于白细胞分析。在不同类型的白细胞中，嗜酸性粒细胞具有最高的绿色荧光，嗜中性粒细胞具有中等绿色荧光，淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞具有相对低的绿色荧光，这是由于酸性细胞质和蛋白质内含物的量的差异。在淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞中，嗜碱性粒细胞具有相对低的红色荧光，淋巴细胞具有中等红色荧光且单核细胞具有最高的红色荧光，这是由于细胞核中核酸的量的差异。以这种方式，至少五种不同类型的白细胞包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，可被彼此分类。在一个特定实施方案中，第三颜色的荧光例如橙红色荧光可被用于测量并改进嗜碱性粒细胞分类，由于嗜碱性粒细胞包含一定量的肝素，其被选择性地染色并在蓝绿色激发下发射橙红色荧光。
[0061] 在另一个实施方案中，单个白细胞的两种颜色的荧光在微流控通道中被测量，其尺寸与血细胞的尺寸是“兼容的”。用这种方法，血液样品中的白细胞被逐个测量，白细胞的总数被计数并且不同类型的白细胞依据它们的荧光强度被分类。术语“兼容的”指的是微流控通道的横截面面积足够大以使血细胞能够流经而不堵塞通道，并且微流控通道的横截面面积足够小以最小化白细胞计数的重合误差(coincidence error)。
[0062] 本发明提供了用于通过荧光检测将白细胞分类的方法。有利地，使用本发明的方法，一种或多种白细胞类型中的每一种与群中其他类型的每一种是可区分的。在某些情况下，白细胞类型包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在某些其他方面，白细胞群中白细胞类型或亚群的数目为1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种白细胞类型或亚群。在某些方面，白细胞类型的数目为5种或更多种、或至少5种、或仅5种。从每一种白细胞类型发射的荧光与从群中其他类型的每一种发射的荧光是可区分的。在某些方面，群中的白细胞包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
[0064] 在优选的方面，发射光在两个或多个波长下被测量，诸如在第一波长和第二波长下被测量以实现两种颜色的荧光测量。第一波长在约480nm至约580nm处，例如在约480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm或580nm处。在另一方面，第一波长在约500nm至约570nm、或约510nm至约560nm处测量。
[0065] 在某些方面，第二激发光发射并在约590nm至约650nm例如590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm或650nm处被测量。在另一方面，第二波长为约590nm至约640nm。发射光在第一和第二波长下被测量。在一个方面，发射光通过两个光电倍增管被同时测量。样品可以是全血、血浆或血清。优选地，样品是全血样品。
[0066] 在某些方面，样品被诊断组合物染色并流经流式细胞仪，其中一种或多种白细胞类型被暴露于光源并且荧光强度被记录。可选地，样品被诊断组合物染色并流经微流控细胞仪。在某些方面，样品流经检测通道。在一方面，一种或多种白细胞类型被逐个暴露于光源，并且记录来自每种单个白细胞类型的两种颜色的荧光发射。
[0067] 在某些方面，白细胞群被计数并且一种或多种白细胞类型被分类以实现白细胞分类计数。
[0068] 在某些实施方案中，本发明提供了用于白细胞分析的组合物和方法，其中样品可以是全血样品、或包含白细胞的另外的液体。其他液体可以是血液成分诸如血浆或血清、骨髓、或其他体液例如尿液或唾液。白细胞类型包括，例如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、幼稚粒细胞、异常淋巴细胞、母细胞、杆状核粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和晚幼粒细胞。其他细胞可以存在于样品中，例如全血样品中的红细胞(red blood cell)和血小板。
[0069] 在某些实施方案中，当使用该组合物和方法计数白细胞并将白细胞类型分类时，混合物的染料浓度，对于第一染料(第一阳离子染料例如碘化丙啶)为在约0.1μM至500μM之间，例如1.0μM至100μM、或10μM至100μM或100μM至500μM；对于第二染料(第二阳离子染料)例如碱性橙21为在1μM至2mM之间，例如1μM至1mM、或10μM至500μM；对于第三染料(阴离子染料或阴离子染料的衍生物)例如异硫氰酸荧光素为在
0.5μM至1mM之间，例如1μM至900μM或10μM至500μM。
0.5μM至1mM之间，例如1μM至900μM或10μM至500μM。
[0070] 例如，第一染料可以在0.1μM至500μM之间。这包括1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、150μM、175μM、200μM、250μM、
275μM、300μM、350μM、375μM、400μM、450μM、475μM或500μM以及其间的所有数值。
第二染料可以在1μM至2mM之间，其包括1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、
9μM、10μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、
1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM以及其间的所有数值。第三染料可以在0.5μM至1mM之间，例如1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、
7μM、8μM、9μM、10μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、
900μM、1mM以及其间的所有数值。
275μM、300μM、350μM、375μM、400μM、450μM、475μM或500μM以及其间的所有数值。
第二染料可以在1μM至2mM之间，其包括1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、
9μM、10μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、
1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM以及其间的所有数值。第三染料可以在0.5μM至1mM之间，例如1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、
7μM、8μM、9μM、10μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、
900μM、1mM以及其间的所有数值。
[0071] 在某些方面，首先用透化缓冲液(permeabilization buffer)预处理白细胞样品以允许非通透性染料进入白细胞膜。孵育温度的范围在18℃至40℃之间且孵育时间的范围在5分钟至30分钟之间，例如1-10分钟。
[0072] 在仍然其他实施方案中，孵育时间的范围可以在约30秒至约20分钟之间，但是约15分钟的时间通常足以用于染色。本发明的另一个期望的方面是，任选地在WBC分析中，可通过标准技术裂解生物样品中的任何红细胞(red cell)。红细胞的裂解并未不利地影响该方法。在样品中的细胞群被充分染色后，样品在两个波长的光下被激发。根据本发明的方法，从一种白细胞(white cell)亚群发射的荧光与从相同样品中其他白细胞亚群发射的荧光是可区分的。
[0073] 在某些实施方案中，染料试剂的使用包括以下步骤。首先将约5μl人全血与5μlTM透化缓冲液诸如Invitrogen Cal-Lyse 溶液混合5分钟。然后，将样品与45μl蒸馏水混合3分钟并且然后用7μl10x浓缩的磷酸盐缓冲盐水缓冲。最后，将10μl染料混合物加入至样品，具有11μM碘化丙啶(Propidium)、46μM碱性橙21、和14μM异硫氰酸荧光素的终浓度，并与样品一起孵育15分钟。在其他方面，组合物可稀释样品或血液样品至10:1、
50:1、100:1、或1000:1或任何上述范围内的任何值的比例，只要稀释液满足实际使用的需求。借助本公开内容，此调整落入本领域技术人员的能力之内。
50:1、100:1、或1000:1或任何上述范围内的任何值的比例，只要稀释液满足实际使用的需求。借助本公开内容，此调整落入本领域技术人员的能力之内。
[0074] 被染料试剂染色的血液样品流经流式细胞仪，其中染色的细胞被暴露于激发光源并且来自白细胞的两种颜色的荧光强度被记录。在散点图中，白细胞形成了涉及不同白细胞类型包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的可区分的聚类(cluster)。当血液样品流经检测通道时，根据以上方法的方式，白细胞被逐个暴露于激发光，并且来自每个单个白细胞的两种颜色的荧光(红色荧光和绿色荧光)被记录，其中白细胞总数被计数并且不同类型的白细胞被分类以实现白细胞分类计数。
[0075] 在某些实施方案中，所有白细胞的测量的强度随后被展示为散点图，如图4中所示，其中每个点都代表一个计数的白细胞。散点图显示了四个不同的聚类。具有最高绿色强度的顶部聚类主要由嗜酸性粒细胞组成，而具有中等绿色荧光的中部聚类，主要由嗜中性粒细胞组成，且底部两个聚类由淋巴细胞和单核细胞形成。嗜酸性粒细胞富含嗜酸性颗粒，其具有与第三染料或阴离子染料(如，FITC)结合的高亲和力并因此显示最高绿色荧光强度。嗜中性粒细胞包含中性颗粒，其具有比嗜酸性颗粒相对低的FITC亲和力，但是仍然提供用于FITC染色的一定量的蛋白质内含物。淋巴细胞和单核细胞具有较少的颗粒并且因此具有最低的FITC染色强度。同时，单核细胞聚类可通过其较高的红色强度和略高的绿色强度与淋巴细胞聚类相区分。这是由于单核细胞趋向具有较大量的被第一染料(例如，PI)染色的核酸，以及较大量的被第二染料(例如，BO2l)染色的酸性细胞质内含物。
[0076] 在某些方面，荧光参数可被用于识别不同亚组的白细胞并获得关于可能的异常淋巴细胞和幼稚粒细胞的信息，以分类并计数聚成不同聚类的点，以及计算不同亚组白细胞的百分比。例如，在一个方面，荧光反映了细胞内颗粒性的程度。不同亚组白细胞的颗粒性程度大致如下：嗜酸性粒细胞具有两个叶状核(foliate nuclei)以及许多可被酸性荧光染料染色的胞质颗粒；嗜中性粒细胞具有叶状或杆状核以及较多的细胞内颗粒；单核细胞具有单个大核以及较少的细胞内颗粒；以及淋巴细胞具有单个大核且基本上没有颗粒。
[0077] 对血液样品中白细胞亚群的分析提供了用于许多疾病的临床诊断的有用信息。例如，疾病的发作可与血液中不同类型白细胞的比例和量的变化、伴随着异常白细胞诸如异常淋巴细胞和幼稚粒细胞等的出现有关。因此，对不同类型的正常和异常白细胞的分类和分析提供了关于疾病的潜伏期、发作期和发展期的信息。
[0078] 在另一方面，本发明提供了可用于样品诸如血液中白细胞类型或亚群的分类和计数、并且同时可用于识别该样品中的异常白细胞(诸如异常淋巴细胞和幼稚粒细胞)的检测试剂盒。检测试剂盒包括如本文公开的白细胞(leukocyte)(白细胞(white blood cell))分类或诊断组合物以及使用说明。裂解缓冲液任选地被包括。白细胞诊断组合物还可包括红细胞裂解剂。在一个实施方案中，诊断组合物中的荧光染料化合物以储备溶液(stock solution)的形式存在并且在单独的容器中保存。在另一个实施方案中，荧光染料化合物与裂解剂一起被配制为单一组分的溶液。检测试剂盒可包括单独的荧光染料原液(stock)，其被适当密封在至少一个容器中。检测试剂盒还可以包括用于样品(例如，血液)中白细胞分类的其他白细胞分类试剂以及关于如何鉴定白细胞的说明。检测试剂盒还可以包括可被检测并与测试样品比较的对照样品或一系列对照样品(例如，阴性和阳性对照)。检测试剂盒的每个单独的组分可被密封在单个容器中，并且这些容器以及使用说明，可全部被包装在单个包装中。此类检测试剂盒用于血液中各种白细胞的分类和/或计数可以是有用的。
[0079] II.实施例
[0080] 实施例1将分类方法的结果制成表格。
[0081] 表1显示了利用本方法将不同类型的白细胞包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞分类的结果。分类计数是指一种特定类型的白细胞诸如淋巴细胞(lypho)、单核细胞(mono)、嗜中性粒细胞(neutron)、嗜酸性粒细胞(eosino)、或嗜碱性粒细胞(baso)在白细胞总数中的百分比。“参考”是指来自商业血液分析仪(Beckman Coulter LH750)的结果。“测量”是指来自本方法的结果。
[0082] 表1
[0083]
[0084] 图3显示了从用本诊断组合物染色的样品测量的两种颜色的荧光信号的实例。绿色荧光信号(上部迹线)和红色荧光信号(底部迹线)被同时测量。红色荧光信号中每个可区分的峰代表一个被计数的白细胞。绿色荧光信号中的相应峰代表来自被染料试剂染色的白细胞的细胞质以及蛋白质内含物的荧光。
[0085] 实施例2将结果显示为2-D散点图
[0086] 来自单个白细胞的红色荧光强度和绿色荧光强度可被记录为二维散点图(红色荧光对比绿色荧光)。图4显示了散点图，其中白细胞类型被显示为涉及不同白细胞包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的可区分的聚类。
[0087] 在散点图中，与其他聚类相比，噬酸性粒细胞聚类呈现稀疏。这可归因于嗜酸性粒细胞通常占正常人血液中所有白细胞的很小的百分比(在本实施例中为全部白细胞的2％)的事实。因此，纯化的嗜酸性粒细胞可被用以证实嗜酸性粒细胞是否确实位于该聚类中。在对照(全血)样品中，嗜酸性粒细胞聚类显示相对低的细胞密度。同时，在将嗜酸性粒细胞掺入全血样品中后，嗜酸性粒细胞聚类显示较高的细胞密度以及增加的嗜酸性粒细胞计数。
[0088] 实施例3显示本发明的方法和血液分析仪的比较结果。
[0089] 图5显示了计数白细胞总数的结果的实例。标记为“便携式μ流式细胞仪(The portable μLow Cytometer)”的结果是用本方法测量的结果，且标记为“商业血液分析仪(Commercial Hematology Analyzer)”的结果是用商业血液分析仪(Beckman Coulter LH750)测量的结果。S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7代表样品1-7。
[0090] 图6显示了将不同类型的白细胞分类的分类结果的实例。百分比是指一种特定类型的白细胞诸如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞在白细胞总数中的百分比。标记为“μ流式细胞仪(μLow Cytometer)”的结果是用本方法测量的结果，且标记为“商业血液分析仪”的结果是用商业血液分析仪(Beckman Coulter LH750)测量的结果。
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