技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体涉及一种用于白细胞分类计数的方法以及试剂盒。
背景技术
[0002] 白细胞亦称白血球，血液细胞成分之一，为无色圆形细胞，比红细胞略大，有细胞核。可分为嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜
碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞五种。在
机体发生
炎症或
疾病时，白细胞数往往发生变化，故为疾病检查诊断方法之一。比如嗜中性粒细胞增多见于急性感染、尿毒症、严重烧伤急性出血、组织损伤等；其减少见于伤寒及副伤寒、再生障碍性贫血、急性粒细胞缺乏症、脾功能亢进等。嗜酸性粒细胞增多见于变态反应；减少见于伤寒、副伤寒、使用肾上腺皮质
激素后。嗜碱性粒细胞增多见于慢性粒细胞白血病、何杰金氏病、癌转移、铅铋中毒等。淋巴细胞增多见于百日咳、传染性单核细胞增多症、慢性淋巴细胞性白血病、麻疹、腮腺炎、结核、传染性
肝炎等；减少多见于传染急性期、细胞免疫
缺陷等。单核细胞增高见于疟疾等。
[0003] 采用瑞士试剂对样品
染色并进行人工镜检是白细胞五分类计数的“金标准”，但是随着人们对临床检测要求的不断提高，这种耗时、繁琐的标准方法越来越不适应如今的临床检测。随着医学血液学的发展,各种类型的
血细胞分析仪配合专用试剂（如溶血剂等）的检测方法在国内得到了广泛的应用,这些全自动的仪器先通过专用试剂处理红细胞（RBC），然后采用流式技术或
电阻抗的计数原理，通过获取白细胞不同细胞器发射出的
荧光信息和散射光信息将白细胞分成不同种类。
[0004] 但是人们研究发现，血细胞分析仪只能将白细胞分为大细胞、中间细胞和小细胞三种，其中大细胞是以嗜中性粒细胞为主，小细胞则以淋巴细胞为主，中间细胞为（嗜酸+嗜碱+单核），而无法知道嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及单核细胞分类结果。同时，当重度贫血等疾病，血中出现有核红细胞增多时，会被仪器误认为是白细胞，而分类于白细胞中。对于白血病病人，大量的出现幼稚细胞存在于外周血液中时，会被仪器误认为是成熟的白细胞而被分类于成熟的白细胞中,对于异常细胞不具有识别能
力，容易造成此类病人的漏诊。因此，在使用血细胞分析仪进行白细胞五分类计数检测时，仍需要进行人工镜检加以矫正结果，检测过程仍是比较繁琐。
[0005]
现有技术中公开了多种专用试剂和染色液，如CN200980116627，一种基于荧光信息和散射光信息，对测定样品中的白细胞进行5分类的溶血剂。其在白细胞分析上主要采用两个通道进行细胞计数和分类，两个通道均采用激光和鞘流进样的方式测定。DIFF通道：STROMATOLYSER-4DL试剂中的
表面活性剂可以溶解掉标本中的红细胞和血小板，并在白细胞膜上打出小孔；然后第二种试剂STROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染料通过这个小孔进入白细胞中，与细胞核的核酸和细胞器结合，在经过
波长633nm的激光照射，产生的荧光强度与细胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER-4DL试剂还具有与嗜酸性颗粒特异性结合的能力，可根据侧向散射光
信号强度，将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分离出来。这样可以将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞清楚的分离开。在DIFF散射图当中可以得到白细胞的四个分群（LMNE）。
[0006] CN2011100744709涉及一种用于白细胞五分类计数的溶血剂及用途。所述溶血剂由溶血剂A与溶血剂B组成。溶血剂A含有聚
氧乙烯型非离子表明活性剂、
有机酸、季按盐阳离子表面活性剂助
溶剂、稳定剂和渗透压调节剂。
[0007] CN2010102787102涉及一种对白细胞进行分类的试剂，其公开了一种对白细胞进行分类的试剂，能将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞相对应的五个基团。所述试剂包括缓冲剂和溶血剂，其特征是溶血剂由至少两种甜菜碱型兼性离子表面活性剂组成。
[0008] 但是上述专用试剂破坏RBC后会留下红细胞碎片，这些碎片不影响基于流式技术或电阻抗的计数原理的血细胞分析仪的检测，但却会干扰基于
机器视觉原理的细胞形态学分析技术的白细胞分类计数，而且这些试剂的染色方法也不适应普通光学
显微镜下人工识别。为此，急需要提供一种适用于基于机器视觉原理的细胞形态学分析技术的分析仪的白细胞分类计数专用试剂，以便利于白细胞的临床检测。
发明内容
[0009] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于白细胞分类计数的方法以及试剂盒，使其能够适用于基于机器视觉原理、以细胞形态学分析技术对样品中有形成分进行自动识别与分类计数的样本有形成分镜检分析仪进行白细胞五分类的检测，保证检测结果的准确性。
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0011] 一种用于白细胞分类计数的试剂盒，包括试剂A和试剂B；
[0012] 其中，试剂A组成成分和浓度为：
[0013] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0014] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4、NaH2PO4中的一种酸性盐;
[0015] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成或由Na2HPO4、KH2PO4组成的缓冲剂；
[0016] 浓度为2-10ml/L选自烷基酚与环氧乙烷的缩合物或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0017] 浓度为0.1-0.5g/L选自亚甲基蓝的染料；
[0018] 浓度为0.1-0.5ml/L选自甲
醛或戊二醛的稳定剂；
[0019] 试剂B组成成分和浓度为：
[0020] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0021] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4、NaH2PO4中的一种酸性盐;
[0022] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成或由Na2HPO4、KH2PO4组成的缓冲剂；
[0023] 浓度为2-10ml/L选自烷基酚与环氧乙烷的缩合物或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0024] 浓度为0.3-0.8g/L选自曙红Y的染料；
[0025] 浓度为0.1-0.5ml/L选自甲醛或戊二醛的稳定剂。
[0026] 本发明所述烷基酚与环氧乙烷的缩合物优选为OP系列乳化剂，更优选为乳化剂OP-10。
[0027] 作为优选，所述试剂A组成成分和浓度为：
[0028] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0029] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4的酸性盐;
[0030] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂；
[0031] 浓度为4-10ml/L选自OP-10乳化剂或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0032] 浓度为0.1-0.5g/L选自亚甲基蓝的染料；
[0033] 浓度为0.1-0.5ml/L选自戊二醛的稳定剂。
[0034] 作为优选，试剂B组成成分和浓度为：
[0035] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0036] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4、NaH2PO4中的一种酸性盐;
[0037] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂；
[0038] 浓度为4-10ml/L选自OP-10乳化剂或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0039] 浓度为0.36-0.8g/L选自曙红Y的染料；
[0040] 浓度为0.1-0.5ml/L选自戊二醛的稳定剂。
[0041] 本发明包含试剂A和试剂B，每种试剂成分中都包含有染料、缓冲剂、溶血剂、无机盐、酸性盐、稳定剂。各成分作用具体如下：
[0042] 曙红Y（又名伊红）和亚甲基兰（又名美兰）都是人工合成染料，前者为酸性染料，后者为碱性染料，二者在
水溶液中混合生成的紫色或紫褐色的化合物在溶液中析出，故二者不宜混合使用，临床上一般不用做细胞染色。本发明先后将二者分别加入溶血剂中，利用溶血剂破坏红细胞的同时在白细胞膜上打孔，使染料在液体状态下迅速进入白细胞（混合时染料的量少，短时间不会出现沉淀，但试剂长期储存需分开保存，否则会产生沉淀，故本发明设为A、B两种试剂，检测时需临时混合），二者分别与白细胞中的嗜酸性和嗜碱性物质结合而使其着不同
颜色，从而能够区别五种白细胞。
[0043] 溶血剂，采用非离子表面活性剂辛基苯基聚氧乙烯醚作为溶血剂：目前临床上三分类、五分类血球仪主要用十六烷基三
氯化铵等阳离子表面活性剂作为溶血剂，其优点在于溶血速度快，细胞碎片少，但其对细胞的损害大，可能导致细胞的形态发生改变。本研究使用非离子表面活性剂辛基苯基聚氧乙烯醚作为溶血剂，其优点在于不但溶血速度快，而且能彻底溶解细胞碎片，对细胞损害也很小，同时加入稳定剂保护白细胞膜的完整性。研究中本发明通过加入3-8g/L的无机盐成分提高辛基苯基聚氧乙烯醚胶束浓度，使其结合稳定剂后能保护白细胞形态基本不发生改变，而且能充分溶解红细胞和红细胞碎片。另外，缓冲剂的作用是增强溶血剂对红细胞的破坏作用和保持白细胞的完整性。
[0044] 本发明所述试剂A的pH值优选为5.5-7.5，所述试剂B的pH值优选为5.0-7.0，可通过调节缓冲剂的浓度来调节。
[0045] 此外，本发明还提供一种用于白细胞分类计数的方法，将试剂A和试剂B混合后加入待测血液样品，摇匀后即送入基于机器视觉原理、以细胞形态学分析技术对样品中有形成分进行自动识别与分类计数的样本有形成分镜检分析仪中，检测获得白细胞五分类计数结果；
[0046] 其中，试剂A组成成分和浓度为：
[0047] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0048] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4、NaH2PO4中的一种酸性盐;
[0049] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成或由Na2HPO4、KH2PO4组成的缓冲剂；
[0050] 浓度为2-10ml/L选自烷基酚与环氧乙烷的缩合物或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0051] 浓度为0.1-0.5g/L选自亚甲基蓝的染料；
[0052] 浓度为0.1-0.5ml/L选自甲醛或戊二醛的稳定剂；
[0053] 试剂B组成成分和浓度为：
[0054] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0055] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4、NaH2PO4中的一种酸性盐;
[0056] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成或由Na2HPO4、KH2PO4组成的缓冲剂；
[0057] 浓度为2-10ml/L选自烷基酚与环氧乙烷的缩合物或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0058] 浓度为0.3-0.8g/L选自曙红Y的染料；
[0059] 浓度为0.1-0.5ml/L选自甲醛或戊二醛的稳定剂。
[0060] 作为优选，所述试剂A和试剂B、待测血液样品的体积比为1:1:0.02。
[0061] 同样地，作为优选，本发明方法中所述试剂A组成成分和浓度为：
[0062] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0063] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4的酸性盐;
[0064] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂；
[0065] 浓度为4-10ml/L选自OP-10乳化剂或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0066] 浓度为0.1-0.5g/L选自亚甲基蓝的染料；
[0067] 浓度为0.1-0.5ml/L选自戊二醛的稳定剂。
[0068] 作为优选，试剂B组成成分和浓度为：
[0069] 浓度为3-8g/L选自NaCl、KCl中的一种无机盐；
[0070] 浓度为0.1-0.3g/L选自KH2PO4、NaH2PO4中的一种酸性盐;
[0071] 浓度为0.02M选自由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂；
[0072] 浓度为4-10ml/L选自OP-10乳化剂或辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂；
[0073] 浓度为0.36-0.8g/L选自曙红Y的染料；
[0074] 浓度为0.1-0.5ml/L选自戊二醛的稳定剂。
[0075] 按照本发明所述方法和以瑞士试剂人工镜检（白细胞五分类技术标准方法）对同一正常血液样品进行检测，结果显示本发明检测结果和人工镜检结果无明显差异，结果准确，同时和正常人血液细胞中各类白细胞的分类对比也符合标准。此外，本发明还分别采用瑞氏试剂、CN200980116627、CN2011100744709和CN2010102787102公开的试剂采用样本有形成分镜检分析仪进行检测，结果是无法识别。这表明本发明试剂盒适用于基于机器视觉原理、以细胞形态学分析技术对样品中有形成分进行自动识别与分类计数的样本有形成分镜检分析仪进行白细胞五分类的检测，并且保证检测结果的准确性。
[0076] 由以上技术方案可知，本发明包含试剂A和试剂B，每种试剂成分中选择合适的染料、缓冲剂、溶血剂、无机盐以及稳定剂，A、B试剂和血液样品混合后，能快速、彻底地破坏红细胞，有效地溶解红细胞碎片，同时在白细胞膜上打孔使染料快速进入白细胞胞浆内，与白细胞胞浆内不同颗粒结合呈现不同颜色，同时其他试剂协同保护白细胞膜而保持白细胞的完整性，仪器以此区分不同种类的白细胞效果好，特别适合于采用机器视觉原理对白细胞进行自动分类。
具体实施方式
[0077] 本发明公开了一种用于白细胞分类计数的方法以及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述制备方法及产品已经通过较佳
实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0078] 按照本发明所述方法检测，试剂A、B不宜大量混合，最好每个样本检测前临时混合试剂A和试剂B，否则易出现沉淀物而降低染色效果并影响仪器识别，试剂A、B均不超过5mL，最好取试剂A1mL和试剂B1mL临时混合。
[0079] 染色后白细胞的具体形态特征如下：
[0080] 嗜中性粒细胞颗粒染成紫红色，细胞核着蓝色，颗粒之间间隙清晰可见；
[0081] 嗜酸性粒细胞颗粒虽染成紫红色，比嗜中性粒细胞颗粒颜色艳丽，且颗粒之间几乎没有间隙，细胞核着蓝色，几乎被嗜酸性紫红色颗粒遮盖；
[0082] 嗜碱性粒细胞胞浆、颗粒及细胞核均染成紫色，但有明显的深浅差异，即胞浆着色浅，各形态清晰可见；
[0083] 淋巴细胞和单核细胞胞核、胞浆均染成蓝色，但淋巴细胞个体小，核染色均匀，而且稍深；
[0084] 原始粒细胞着色深，个体大，胞核、胞浆均染成蓝色而易与正常细胞区别（本发明除了能够检测常规五分类白细胞数量外，还能针对特殊疾病中的细胞进行技术检测，其中原始粒细胞是粒细胞发育的始祖细胞或幼稚细胞，只在白血病病人的血液中出现，不归为常规分类细胞，其成分嗜碱性染成蓝色）。
[0085] 此外，本发明试剂A、B成酸性环境，曙红Y和亚甲基兰二者能够更好地解离其着色基团，也使染色
加速，几乎在红细胞破坏的同时使白细胞各嗜酸性和嗜碱性成分分别着色。
[0086] 本发明所述A、B试剂配制方法：
[0087] 先配制亚甲基蓝母液（浓度为10-50g/L），按量称取亚甲基蓝溶于由纯水溶解的酸性盐溶液中；同样配制曙红Y母液，浓度为20-50g/L，备用；
[0088] 按量称取无机盐、缓冲剂成分配制成0.02M近似等渗缓冲溶液，再按量加入溶血剂，溶解，然后按量加入备用的曙红Y母液或亚甲基蓝母液，最后加入稳定剂，定容即得。
[0089] 以下就本发明所提供的一种用于
白细胞计数的方法以及试剂盒做进一步说明。
[0090] 实施例1：本发明所述试剂盒
[0091] 试剂A组成成分和浓度：
[0092] 5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、4mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.1g/L KH2PO4、0.15g/L亚甲基蓝染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂；
[0093] 试剂B组成成分和浓度：
[0094] 5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、4mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.1g/L KH2PO4、0.5g/L曙红Y染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂。
[0095] 实施例2：本发明所述试剂盒
[0096] 试剂A组成成分和浓度：
[0097] 3g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、5mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.14g/L KH2PO4、0.1g/L亚甲基蓝染料、0.2mL/L戊二醛的稳定剂；
[0098] 试剂B组成成分和浓度：
[0099] 3g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、5mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.14g/L KH2PO4、0.4g/L曙红Y染料、0.2mL/L戊二醛的稳定剂。
[0100] 实施例3：本发明所述试剂盒
[0101] 试剂A组成成分和浓度：
[0102] 6.5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、5mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.14g/L KH2PO4、0.1g/L亚甲基蓝染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂；
[0103] 试剂B组成成分和浓度：
[0104] 6.5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、5mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.14g/L KH2PO4、0.36g/L曙红Y染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂。
[0105] 实施例4：本发明所述试剂盒
[0106] 试剂A组成成分和浓度：
[0107] 7.0g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、6mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.2g/L KH2PO4、0.15g/L亚甲基蓝染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂；
[0108] 试剂B组成成分和浓度：
[0109] 7.0g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、6mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.2g/L KH2PO4、0.5g/L曙红Y染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂。
[0110] 实施例5：本发明所述试剂盒
[0111] 试剂A组成成分和浓度：
[0112] 7.5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、8mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.3g/L KH2PO4、0.5g/L亚甲基蓝染料、0.5mL/L戊二醛的稳定剂；
[0113] 试剂B组成成分和浓度：
[0114] 7.5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、8mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.3g/L KH2PO4、0.8g/L曙红Y染料、0.5mL/L戊二醛的稳定剂。
[0115] 实施例6：本发明所述试剂盒
[0116] 试剂A组成成分和浓度：
[0117] 8.0g/L KCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、6mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.14g/L KH2PO4、0.2g/L亚甲基蓝染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂；
[0118] 试剂B组成成分和浓度：
[0119] 8.0g/L KCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、6mL/L辛基苯基聚氧乙烯醚的溶血剂、0.14g/L KH2PO4、0.6g/L曙红Y染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂。
[0120] 实施例7：本发明所述试剂盒
[0121] 试剂A组成成分和浓度：
[0122] 6.0g/L KCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、6mL/L烷基酚与环氧乙烷的缩合物（OP-10乳化剂）的溶血剂、0.1g/L KH2PO4、0.1g/L亚甲基蓝染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂；
[0123] 试剂B组成成分和浓度：
[0124] 6.0g/L KCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、6mL/L烷基酚与环氧乙烷的缩合物（OP-10乳化剂）的溶血剂、0.1g/L KH2PO4、0.4g/L曙红Y染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂。
[0125] 实施例8：本发明所述试剂盒
[0126] 试剂A组成成分和浓度：
[0127] 6.5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、10mL/L烷基酚与环氧乙烷的缩合物（OP-10乳化剂）的溶血剂、0.14g/L KH2PO4、0.1g/L亚甲基蓝染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂；
[0128] 试剂B组成成分和浓度：
[0129] 6.5g/L NaCl的无机盐、0.02M由Na2HPO4、NaH2PO4组成的缓冲剂、10mL/L烷基酚与环氧乙烷的缩合物（OP-10乳化剂）的溶血剂、0.14g/LKH2PO4、0.36g/L曙红Y染料、0.1mL/L戊二醛的稳定剂。
[0130] 实施例9：准确性对比试验
[0131] 分别采用实施例1-4的试剂盒中的试剂A和试剂B，混合后加入待测健康血液样品（1mL试剂A和1mL试剂B和20μL血液样品），摇匀后即送入样本有形成分镜检分析仪中检测获得白细胞五分类计数结果。同时取相同健康血液样品采用瑞士染色进行人工镜检进行对比，结果见表1。
[0132] 表1检测结果
[0133]
[0134] 由上表可知，采用本发明试剂盒进行白细胞分类计数的结果和本领域的金标准-人工镜检的结果没有明显差异，各类细胞比例处于同等水平，准确性较高。同时，本发明各检测结果和正常人血液细胞中各类白细胞的比例（见表2）进行对比，本发明的技术结果均处于其范围内，由于试验同样采用的是健康血液样品，则充分说明本发明的方法具有高度准确性。
[0135] 表2正常人血液细胞中各类白细胞的比例
[0136]
