具有重组的基因表达调控序列的肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体
阅读：895发布：2023-01-24
专利汇可以提供具有重组的基因表达调控序列的肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及由缺 氧 反应元件、E2F及端粒逆转录酶组成的基因表达 调控序列 ，以及大幅改善选择性 肿瘤 细胞杀伤能 力 的利用上述基因表达调控序列的基因运载体，尤其，涉及重组腺病毒。并且，本发明涉及包含上述重组腺病毒的药剂学抗肿瘤组合物。本发明的重组腺病毒通过本发明特有的基因表达调控序列来以肿瘤特异性方式调控复制，从而发挥改善选择性肿瘤细胞的杀伤能力或细胞凋亡的效果，尤其，呈现在低氧条件下大幅提高的 抗肿瘤效果 。并且，通过癌细胞内的重组腺病毒的特异性表达来增加在体内的 稳定性 ，并能够诱导更加改善的抗肿瘤效果。，下面是具有重组的基因表达调控序列的肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体专利的具体信息内容。
1.一种基因表达调控序列，其特征在于，包含：
(i)缺氧反应元件增强子序列，
(ii)由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的E2F启动子序列，和
(iii)端粒逆转录酶启动子序列；
其中所述基因表达调控序列从5’向3’方向包含[HRE]6-[E2F]n-[TERT]1，由此所述缺氧反应元件增强子序列、E2F启动子序列和端粒逆转录酶启动子序列协同促进基因的表达，其中
[HRE]是缺氧反应元件增强子序列，
[E2F]是E2F启动子序列，
[TERT]是端粒逆转录酶启动子序列，且
n是1或2。
2.根据权利要求1所述的基因表达调控序列，其特征在于，所述E2F启动子序列重复2次。
3.一种肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体，其特征在于，包含：
(a)权利要求1或2所述的基因表达调控序列；以及
(b)靶基因，其与上述基因表达调控序列有效地连接，该靶基因是用来表达的。
4.根据权利要求3所述的肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体，其特征在于，上述基因运载体是质粒、重组腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、聚合物、脂质体或类脂囊泡。
5.根据权利要求4所述的肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体，其特征在于，上述基因运载体是重组腺病毒载体。
6.一种癌细胞特异性杀伤能力得到改善的重组腺病毒，其特征在于，包含：
(a)腺病毒的反向末端重复序列；
(b)基因表达调控序列，其包含：
(i)缺氧反应元件增强子序列，
(ii)E2F启动子序列，和
(iii)端粒逆转录酶启动子序列，
其中所述基因表达调控序列插入到重组腺病毒载体的E1区域并且从5’向3’方向包含[HRE]6-[E2F]n-[TERT]1，由此所述缺氧反应元件增强子序列、E2F启动子序列和端粒逆转录酶启动子序列协同促进基因的表达，其中
[HRE]是缺氧反应元件增强子序列，
[E2F]是E2F启动子序列，
[TERT]是端粒逆转录酶启动子序列，且
n是1或2，以及
(c)治疗学转基因，其选自与上述基因表达调控序列有效地连接的肿瘤抑制因子基因、抗原基因、细胞毒性基因、细胞增殖抑制基因、细胞凋亡基因及抗新生血管生成基因。
7.根据权利要求6所述的重组腺病毒，其特征在于，所述E2F启动子序列重复2次。
8.根据权利要求6所述的重组腺病毒，其特征在于，上述治疗学转基因是选自载脂蛋白激酶8基因、胞嘧啶激酶基因、胸苷激酶基因及饰胶蛋白聚糖基因的一种或两种以上的基因。
9.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包含：
(a)治疗学有效量的权利要求6至8中任一项所述的重组腺病毒；以及
(b)药剂学上接受的载体。
10.根据权利要求9所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，上述组合物还包含更昔洛韦作为有效成分。
具有重组的基因表达调控序列的肿瘤特异性表达得到改善
的基因运载体
【技术领域】
[0003] 通常，由于癌细胞的急速生长，肿瘤的中心部容易出现缺氧现象（hypoxia）。癌细胞的生长过程中所出现的缺氧现象在治疗癌症和癌症发展成为非常重要的因素。实体肿瘤内的缺氧区域通过促进用于癌细胞的生存和转移的运动性及血管形成，从而起到有利于癌症发展的作用。而且，根据最近的研究报告，在癌细胞经历缺氧现象时，增加抗细胞凋亡物质的表达，来抑制细胞凋亡，并且癌细胞会具有针对放射治疗法和抗癌化学治疗法的抗性。为了克服因癌细胞所具有的这些特性而导致的抗癌治疗的局限性，开发新的抗癌治疗法是当务之急。因此，作为治疗癌症的有效的治疗法，目前开发出利用病毒的一些方法。代表性的是目前积极进行利用能够增殖的腺病毒的一些临床试验。重组腺病毒与细胞是否分裂的状态无关地显示对多种细胞的优秀的基因传递效率，能够容易地生产高滴度的病毒，并能够容易地进行浓缩，还能够在生物体内容易地传递基因。并且，在用基因疗法治疗癌症的情况下，无需长期或持续地表达治疗基因，被治疗用病毒本身诱导的宿主的免疫反应也不大成问题，反而可以成为优点，因此，腺病毒作为治疗癌症用基因运载体而受人瞩目。基于这些优点，最近持续增加在以癌症为对象的基因治疗中利用重组腺病毒的频率。尤其，进行仅在癌细胞内选择性的增殖来杀伤癌细胞的肿瘤细胞特异性增殖及细胞杀伤重组腺病毒的多项相关研究。仅在癌细胞内特异性增殖来杀灭癌细胞的肿瘤杀伤腺病毒，通过病毒的增殖，不仅能一次感染细胞，还可以二次感染周边的肿瘤细胞，从而能够显著增加治疗效果，而且，在周边的正常细胞中抑制肿瘤杀伤腺病毒的增殖，从而具有减少因腺病毒而产生的毒性的优点。并且，还开发将癌症特异性基因调控部位插入到E1基因部位，来使仅在癌组织内更加选择性地增殖的重组腺病毒。由此预计肿瘤特异性杀伤腺病毒的临床应用可能性将逐渐增加。在癌细胞中所出现的缺氧环境下，缺氧诱导因子-1αcip1（HIF-1α，hypoxia-inducible factor-1α）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21 ，Cyclin-dependent kinase inhibitor1A）实现活化，并增加其表达，来抑制细胞周期，从而会出现将自身的所有生活史依赖于宿主细胞而生存的病毒的增殖被抑制的现象。这就是利用病毒来持续治疗癌症的局限性。但是，将计就计，如果利用因缺氧而被调控的基因的启动子或增强子，也许可以更增加针对癌细胞的特异性。
[0004] 作为通过基因治疗的抗癌治疗方案，包括：利用通过癌细胞特异性启动子来调控病毒的复制，并能够选择性地仅杀灭癌细胞的肿瘤选择性杀伤病毒的方案，以及向癌细胞内传递能够诱导细胞凋亡的治疗基因的方案。
[0005] 在多种癌细胞中表达较高的E2F是癌基因（oncogene）之一，通过与视网膜母细胞瘤蛋白（pRb，retinoblastoma protein）相结合来抑制该E2F的活性。从视网膜母细胞瘤蛋白分离的E2F是转录因子，既促进腺病毒的E2启动子的活化，还促进主管细胞周期的进行的多个基因的转录。另一方面，在大部分的实体肿瘤内存在低氧部位，这些低氧血症会导致相应的如糖酵解酶（glycolytic enzyme）或促血管新生因子（proangiogenic factor）等生存因子的生产，由此低氧状态的较多肿瘤具有对放射治疗或化学抗癌治疗的抵抗性。尤其，低氧血症状态的肿瘤对低氧血症起反应，生产出缺氧诱导因子，缺氧诱导因子通过与缺氧反应元件（HRE，hypoxia-response elements）相结合来对存在于下游的如血管内皮生长因子（VEGF）的血管生成基因的转录进行活化。基于这些情况，本实验室为了制备通过E2F启动子和缺氧反应元件增强子来调控腺病毒的E1的表达的肿瘤选择性杀伤腺病毒，制备了已在本实验室开发并验证了癌细胞杀伤效果的E-Rd19肿瘤选择性杀伤腺病毒以及作为具有变形的E2F启动子的肿瘤选择性杀伤腺病毒的EE-Rd19和HE-Rd19。
[0006] 本说明书的整个内容中参照了多篇论文及专利文献，并标注了其引用。所引用的论文及专利文献的揭示内容作为参考插入到本说明书中，来更加明确地说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。【发明内容】
[0007] 【发明要解决的技术课题】
[0008] 本发明的发明者为了开发通过优秀的肿瘤选择性基因传递效率来更加提高肿瘤特异性杀伤能力的基因治疗剂而进行了锐意努力研究。其结果，在利用包含由缺氧反应元件增强子、E2F启动子及端粒逆转录酶启动子组成的表达调控序列的腺病毒的情况下，发现肿瘤特异性杀伤能力大幅提高，从而完成本发明。
[0009] 因此，本发明的目的在于提供肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体。
[0010] 本发明的再一目的在于提供癌细胞特异性杀伤能力得到改善的重组腺病毒。
[0011] 本发明的另一目的在于提供本发明的包含重组腺病毒的治疗有效量的抗肿瘤组合物。
[0013] 【解决课题的技术方案】
[0014] 根据本发明的一实施方式，本发明提供一种基因表达调控序列，其特征在于，包含：（i）缺氧反应元件增强子序列，以及（ii）E2F启动子序列；上述E2F启动子位于上述缺氧反应元件增强子序列的下游，上述缺氧反应元件强子序列及E2F启动子协同促进相同基因的表达。
[0015] 本发明的发明者为了开发通过优秀的肿瘤选择性基因传递效率来更加提高肿瘤特异性杀伤能力的基因治疗剂而进行了锐意努力研究。其结果，在利用包含由缺氧反应元件增强子、E2F启动子及端粒逆转录酶启动子组成的表达调控序列的腺病毒的情况下，发现肿瘤选择性杀伤能力大幅提高。
[0016] 本说明书中的术语“E2F启动子序列”是指E2F基因的启动子，该E2F基因是促进腺病毒的E2启动子的活化，同时还促进主管细胞周期的进行的多个基因转录的转录因子。E2作为癌基因，通过与视网膜母细胞瘤蛋白相结合来抑制该E2的活性。
[0017] 根据本发明的优选的实例，本发明中所利用的E2F启动子序列包含序列目录第一序列的核苷酸序列。更优选地，为了提高基于E2F启动子序列的肿瘤选择性表达，利用E2F启动子重复序列。本发明的重复序列可以连续重复相同的序列，或者还可以在不影响启动子或增强子的活性的范围内隔着适当长度的连接肽核苷酸不连续重复。
[0018] 进而优选地，本发明中所利用的E2F序列具有序列目录第一序列的核苷酸序列重复2次-10次的序列，更优选地具有重复2次-7次的序列，最优选地具有重复2次的序列。
[0019] 说明书中的术语“缺氧反应元件增强子序列”是指低氧-反应性增强子序列。在低氧条件下调控细胞的特定基因的表达（Bunn and Poyton Physiol.Rev.76:839-885（1996）；Dachs and Stratford Br.J.Cancer74:5126-5132（1996）；Guillemin and Krasnow Cell89:9-12（1997））。大部分的肿瘤细胞会接收不充分的血液供应，这是因为肿瘤细胞通常比形成血管的内皮细胞更快地生长，这在肿瘤中会引起低氧状态。在大部分的实体肿瘤内导致的这些低氧状态会导致相应的如糖酵解酶或促血管生成因子的生存因子的生产，从而会具有针对放射治疗或化学抗癌治疗的抵抗性。据此，本发明人开发了通过E2F启动子和缺氧反应元件增强子来调控腺病毒的E1的表达的肿瘤选择性杀伤腺病毒。
[0020] 低氧反应的主要介质是转录复合体缺氧诱导因子-1α，其与位于多种基因的调控部位的缺氧反应元件进行相互作用，上述基因包含例如血管内皮生长因子基因以及如烯醇化酶-1（enolase-1）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）等一些糖酵解酶-编码基因。本发明利用作为在低氧条件下调控基因的表达，并与缺氧诱导因子-1α进行相互作用的序列的缺氧反应元件。缺氧反应元件起到大幅提高基因运载体，尤其是重组腺病毒的肿瘤细胞选择性的作用。
[0021] 根据本发明的优选的实例，本发明中所利用的缺氧反应元件序列包含序列目录第二序列的核苷酸序列。更优选地，为了提高基于缺氧反应元件序列的转录活性，利用缺氧反应元件重复序列。进而优选地，本发明中所利用的缺氧反应元件序列具有序列目录第二序列的核苷酸序列重复2次-20次的序列，更优选地，具有重复3次-8次的序列，最优选地，具有重复6次的序列。
[0022] 根据本发明的优选的实例，本发明的基因表达调控序列还包含端粒逆转录酶（TERT，telomere reverse transcriptase）启动子序列。
[0023] 端粒逆转录酶作为在染色体复制期间参与保持规定的端粒长度的端粒酶的结构部分，已知参与细胞老化、癌症及细胞永生化（Counter,C.M.et al.EMBO J.11,1921-29（1992）,Kim.N.W.et al.Science,21:2011-5（1994）,Harley,C.B.et al.Nature,345:458-60（1990））。
[0024] 就人而言，在卵巢和睾丸的生殖细胞及淋巴细胞中可观察到端粒酶的活性，但是在其余正常体细胞中观察不到端粒酶的活性（Wright,W.E.et al.Dev.Genet.18:173-9（1996））。因此，正常体细胞在限定次数的细胞分裂后，由于端粒长度减少到规定长度以下，不能再进行分裂而被凋亡（Yasumoto,S.et al.致癌基因.3:433-9（1996））。相反，作为癌症发展前阶段的良性肿瘤细胞及癌细胞中端粒酶的活性会增加（Broccoli,D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:9082-6（1995）。据最初报告，在卵巢癌中发生端粒酶的活性增加后，在血癌、胃癌、肺癌、肝癌、大肠癌、脑癌、前列腺癌、头颈癌及乳房癌等几乎所有人体癌中可观察到端粒酶的活性增加（Counter,C.M.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:2900-4（1994））。对端粒酶的功能起到必要作用的端粒逆转录酶的表达与端粒酶的活性相关联，最近被证实端粒酶的表达根据端粒逆转录酶启动子的活性，即根据端粒逆转录酶的mRNA量而被调控，用于调控端粒逆转录酶的活性的启动子的最小大小是181bp。在本发明的基因运载体中，端粒逆转录酶起到提高针对肿瘤细胞的特异性的作用。优选地，本发明中所利用的缺氧反应元件序列是序列目录第三序列的核苷酸序列。
[0025] 根据本发明的更优选的实例，本发明的基因表达调控序列插入到重组腺病毒载体的E1区域，并从5’向3’方向包含缺氧反应元件序列、E2F启动子序列及端粒逆转录酶启动子序列。
[0026] 最优选地，上述缺氧反应元件序列重复6次，上述E2F序列重复2次。
[0027] 根据本发明的再一实施方式，本发明提供一种肿瘤特异性表达得到改善的基因运载体，其特征在于，包含：（a）本发明的基因表达调控序列；以及（b）靶基因，其与上述基因表达调控序列有效地连接（operatively linked），该靶基因是用来表达的。
[0028] 本发明的基因表达调控序列与上述的基因表达调控序列相同，因此为了避免过度的重复，省略其记载。
[0029] 本说明书的术语“有效地连接”是指核酸表达调控序列（例：启动子、信号序列或转录调控因子结合位点的阵列）和其它核酸序列之间的功能性的结合，据此，上述调控序列调控上述其它核酸序列的转录（transcription）和/或翻译（translation）。与本发明的基因表达调控序列有效地连接的表达对象的基因不受特别的限制。例如，要表达的基因包含来源于基因运载体的基因组的基因（例如，腺病毒的ElA基因）或治疗学转基因（transgene）。下面有治疗学转基因的详细说明。
[0030] 根据本发明的优选的实例，本发明的基因运载体是质粒、重组腺病毒、腺相关病毒（AAV，Adeno-associated viruses）、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、聚合物、脂质体或类脂囊泡。
[0031] 本发明的基因表达调控序列和与上述基因表达调控序列有效地连接的要传递的基因序列可适用于通常用于基因治疗的所有基因运载体，优选地，可适用于质粒、腺病毒（Lockett LJ,et al.,Clin.Cancer Res.3:2075-2080（1997））、腺相关病毒（Lashford LS.,et al.,Gene Therapy Technologies,Applications and Regulations Ed.A.Meager（1999））、逆转录病毒（Gunzburg WH,et al.,Gene Therapy Technologies,Applications and Regulations Ed.A.Meager,（1999））、慢病毒（Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104（11）:R55-62（1999））、单 纯 疱 疹 病 毒（Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA92:1411-1415（1995））、痘苗病毒（Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy10:649-657（1999））、痘病毒（GCE,NJL,Krupa M,Esteban M.,The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther8（2）:97-120（2008））、聚合物（Hwang et al.,In vitro and In vivo Transfection Efficiency of Human Osteoprotegerin Gene using Non-Viral Polymer Carriers.,Korean J.Bone Metab.13（2）:119-128（2006））、脂质体（Methods in Molecular Biology,Vol199,S.C.Basu and M.Basu（Eds.）,Human Press2002）或类脂囊泡。最优选地，本发明的基因运载体适用于重组腺病毒而制备。
[0032] 【i.腺病毒】
[0033] 腺病毒因中等的基因组大小、操作的方便性、高的滴度、广泛的靶细胞及优秀的感染性，广泛利用为基因传递载体。基因组的两个末端包含100～200bp的末端反向重复（inverted terminal repeat），这是DNA复制及包装所需的顺式元件（CIS-element）。基因组的E1区域（E1A及E1B）编码用于调控转录及宿主细胞基因的转录的蛋白质。E2区域（E2A及E2B）编码参与病毒DNA复制的蛋白质。目前已开发的腺病毒载体中，利用较多的是缺少E1区域的不能复制的腺病毒。另一方面，从通常的腺病毒载体中除去E3区域，以提供插入外源基因的位点（Thimmappaya,B.et al.,Cell,31:543-551（1982）；及Riordan,J.R.et al.,Science,245:1066-1073（1989））。因此，本发明的基因表达调控序列能够插入到E1A基因的启动子序列位点，来调控E1A基因的表达。并且，本发明的基因表达调控序列-表达基因盒优选地插入到缺失的E1区域（E1A区域和/或E1B区域，优选为E1B区域）或E3区域，更优选地，插入到缺失的E1区域。并且，本发明的基因表达调控序列-表达基因盒还可以插入到缺失的E4区域。本说明书中有关病毒基因组序列所使用的术语“缺失”不仅指相关序列完全缺失，还包括部分缺失的意思。
[0034] 并且，由于腺病毒可以包装野生型基因组约至105%，因而可以追加包装约2kb（Ghosh-Choudhury et al.,EMBO J.,6:1733-1739（1987））。因此，插入到腺病毒的上述外源序列还可以追加地与腺病毒的基因组相结合。
[0035] 通过腺病毒来运输的外源基因以与附加体（episome）相同的方式被复制，因此对宿主细胞的遗传毒性很低。因此，判断利用本发明的腺病毒基因传递系统的基因治疗会很安全。
[0036] 【ii.逆转录病毒】
[0037] 逆转录病毒能够将自身的基因插入到宿主的基因组，并运输大量的外源遗传物质，而且，由于可感染的细胞的范围较广，因此，广泛利用为基因传递载体。
[0038] 为了构建逆转录病毒载体，要运输的靶核苷酸序列代替逆转录病毒的序列插入到逆转录病毒基因组，来生产不可复制的病毒。为了生产重子（baryon），构建虽包含gag、pol及env基因，但没有长末端重复序列（LTR，long terminal repeat）和Ψ序列的包装细胞株（Mann et al.,Cell,33:153-159（1983））。将包含要运输的靶核苷酸序列、长末端重复序列及Ψ序列的重组质粒移入上述细胞株时，Ψ序列能够生产出重组质粒的RNA转录体，该转录体包装为病毒，病毒被排放到培养基（Nicolas and Rubinstein“Retroviral vectors,”In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez and Denhardt（eds.）,Stoneham:Butterworth,494-513（1988））。收集含有重组逆转录病毒的培养基并进行浓缩，来用作基因传递系统。
[0039] 已发表了利用第二代逆转录病毒载体的基因传递。Kasaharaetal.Science,266:1373-1376（1994）制备了莫洛尼鼠白血病病毒的变异体，在这里，通过将促红细胞生成素（EPO，erythropoietin）序列插入到囊膜（envelope）部位，来制备出具有新的结合特性的嵌合蛋白（chimeric protein）。通过这样的第二代逆转录病毒载体的构建策略还可以制备出本发明的基因传递系统。
[0040] 【iii.腺相关病毒载体】
[0041] 由于腺相关病毒能够感染非分裂细胞，并具有能够被多种细胞感染的能力，因此，适合作为本发明的基因传递系统。美国专利第5,139,941号及第4,797,368号详细揭示了腺相关病毒载体的制备及用途的详细说明。LaFace et al,Viology,162:483486（1988）,Zhou et al.,Exp.Hematol.（NY）,21:928-933（1993）,Walsh et al,J.Clin.Invest.,94:1440-1448（1994）及Flotte et al.,Gene Therapy,2:29-37（1995）揭示了有关作为基因传递系统的腺相关病毒的研究。最近，腺相关病毒载体作为囊肿性纤维化（Cystic fibrosis）的治疗剂实施临床I。
[0042] 典型地，通过将在旁边有两个腺相关病毒末端重复序列的靶基因序列（包含松弛素基因及要运输的靶核苷酸序列的质粒（McLaughlin et al.,J.Virol.,62:1963-1973（1988）；及Samulski et al.,J.Virol.,63:3822-3828（1989））及包含没有末端重复序列的野生型腺相关病毒编码序列的表达质粒（McCarty et al.,J.Virol.,65:2936-2945（1991））同时进行转化（transformation）来制备腺相关病毒。
[0043] 【iv.其它病毒载体】
[0044] 其它病毒载体也可以利用为本发明的基因传递系统。还可以将来源于痘苗病毒（Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy10:649-657（1999）；Ridgeway,“Mammalian expression vectors,”In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses.Rodriguez and Denhardt,eds.Stoneham:Butterworth,467-492（1988）；Baichwal and Sugden,“Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses:Transient and stable expression of transferred genes,”In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:Plenum Press,117-148（1986） 及 Coupar et al.,Gene,68:1-10（1988））、慢病毒（Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104（11）:R55-62（1999））或单纯疱疹病毒（Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA92:1411-1415（1995））及痘病毒（GCE,NJL,Krupa M,Esteban M.,The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther8（2）:97-120（2008））的载体利用为可以向细胞内运输靶核苷酸序列的运输系统。
[0045] 【v.聚合物】
[0046] 作为非病毒性基因运载体广泛使用的聚合物类运载体有明胶、壳聚糖（Carreno GB,Duncan R.Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres.Int J Pharm148:231-240（1997））PLL（poly-LLysine）（Maruyama A,Ishihara T,Kim JS,Kim SW,Akaike T.Nanoparticle DNA carrier with poly （L-lysine）grafted polysaccharide copolymer and poly（D,Llactide）.Bioconjugate Chem8:735-742（1997））及聚乙烯胺（PEI，polyethyleneamine）（Abdallah B,Hassan A,Benoist C,Goula D,Behr JP,Demeneix BA.A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain:Polyethyleneimine.Human Gene Ther7:1947-1954（1996））等。聚合物类基因运载体的优点是免疫反应和急性毒性的表达率低，制备方法简单，可以批量生产。
[0047] 【vi.脂质体及类脂囊泡】
[0048] 脂质体通过水中分散的磷脂来自动形成。Nicolau及Sene、Biochim.Biophys.Acta,721:185-190（1982）及Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176（1987）揭示了通过脂质体向细胞内成功运输外源DNA的例。另一方面，最多用于利用脂质体的动物细胞的转化的试剂有Lipofectamine（Gibco BRL）。包含要运输的靶核苷酸序列的脂质体通过内吞作用（endocytosis）、吸附到细胞表面或与等离子细胞膜的融合等机制来与细胞进行相互作用，来运输要向细胞内运输的靶核苷酸序列。
[0049] 利用磷脂来形成脂质体，与之相反，类脂囊泡（niosome）能够通过由非离子表面活性剂（non-ionic surfactant）及胆固醇（cholesterol）的混合组成的双膜转运体来封入极性及非极性物质，并具有渗透压活性，与作为通过磷脂等的脂质颗粒的运输体的脂质体相比，更具稳定性，而且具有制备时使用的表面活性剂的保管及处理不需要特别条件的优点。
[0050] 另一方面，可以通过本发明所属技术领域中公知的多种方法来实施向细胞内引入上述的本发明的基因传递系统的方法。
[0051] 本发明中，在基于病毒载体来制备基因传递系统的情况下，通过本发明所属技术领域中公知的病毒感染方法来实施。上述的引用文献记载了利用病毒载体的宿主细胞的感染。
[0052] 本发明中，在基因传递系统为裸露的（naked）重组DNA分子或质粒的情况下，可以通过显微注射法（Capecchi,M.R.,Cell,22:479（1980）；及Harland和Weintraub,J.Cell Biol.101:1094-1099（1985））、磷酸钙沉淀法（Graham,F.L.et al.,Virology,52:456（1973）；及Chen和Okayama,Mol.Cell.Biol.7:2745-2752（1987））、电穿孔法（Neumann,E.et al.,EMBO J.,1:841（1982）；及Tur-Kaspa et al.,Mol.Cell Biol.,6:716-718（1986））,脂质体-介导转染法（Wong,T.K.et al.,Gene,10:87（1980）；Nicolau及Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190（1982）；及Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176（1987））、二乙氨乙基-葡聚糖处理法（Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190（1985））及基因枪（Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572（1990））方法来向细胞内移入基因。
[0053] 根据本发明另一实施方式，本发明提供一种癌细胞特异性杀伤能力得到改善的重组腺病毒，其特征在于，包含：
[0054] （a）腺病毒的末端反向重复（ITR，inverted terminal repeat）序列；
[0055] （b）基因表达调控序列，其包含（i）缺氧反应元件（hypoxia-response elements）增强子序列及（ii）E2F启动子序列，上述E2F启动子位于上述缺氧反应元件增强子序列的下游，上述缺氧反应元件增强子序列及E2F启动子协同促进相同基因的表达；以及[0056] （c）治疗学转基因，其选自由与上述基因表达调控序列有效地连接的肿瘤抑制因子基因、抗原基因、细胞毒性基因、细胞增殖抑制基因、细胞凋亡基因及抗新生血管生成基因组成的组中。
[0057] 本发明的基因表达调控序列与上述的基因运载体所利用的基因表达调控序列相同，因此为了避免过度的重复，省略其记载。
[0058] 本发明的基因表达调控序列均可以位于重组腺病毒的E1A基因的上游、缺失的E3基因区域或E1A基因的上游和缺失的E3基因区域。
[0059] 在本发明的基因表达调控序列位于E1A基因的上游的情况下，即，在本发明的基因表达调控序列与E1A基因有效地连接的情况下（缺氧反应元件-E2F-端粒逆转录酶-E1A），通过本发明的基因表达调控序列来调控重组腺病毒的复制。在本发明的基因表达调控序列位于缺失的E3基因区域的情况下，能够以“基因表达调控序列-转基因-多聚A”表达盒形态插入到缺失的E3基因区域。
[0060] 本发明的说明书中的术语“治疗学转基因（therapeutic transgene）”是指在癌细胞内表达，并呈现治疗学效果的核苷酸序列。
[0061] 本发明的说明书中的术语“肿瘤抑制因子基因（tumor suppressor gene）”是指在靶细胞内表达，并能够抑制肿瘤表现型或诱导细胞凋亡的核苷酸序列。有助于本发明的实施的肿瘤抑制因子基因有p53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、视网膜母细胞瘤基因（Lee et al.,Nature,1987,329,642）、MMAC-1基因、腺瘤性结肠息肉病蛋白（adenomatouspolyposis coil protein）（美国专利公报5,783,666号）、结直肠癌缺失（DCC，deleted-in-colorectal-cancer）基因、MMSC-2基因、NF-1基因、位于染色体3p21.3的耳鼻喉肿瘤抑制因子基因（Cheng et al.Proc.Nat.Acad.Sci,95:3042-3047（1998））、MTS1基因、CDK4基因、NF-1基因、NF-2基因及希佩尔林道（VHL，von hippel lindau）基因。
[0062] 本发明的说明书中的术语“抗原基因（antigenic gene）”是指在靶细胞内表达，并生产能够在免疫系统识别的细胞表面抗原蛋白质的核苷酸序列。这种抗原基因的例有癌胚抗原（CEA，carcinoembryonic antigen）、人表皮生长因子受体-2（HER-2，human epidermalgrowth factor receptor-2）、前列腺特异性抗原（PSA，prostate specific antigen）及p53（Levine,A.,国际专利申请公开WO 94/02167号）。为了容易识别出免疫系统，可以将上述抗原基因与主要组织相容性复合体（MHC，major histocompatibility complex）第I型抗原相结合。
[0063] 本发明的说明书中的术语“细胞毒性基因（cytotoxic gene）”是指在细胞内表达，并呈现毒性效果的核苷酸序列。这种细胞毒性基因的例有对假单胞菌外毒素（pseudomonas exotoxin）、蓖麻毒素、白喉毒素、胞嘧啶脱氨酶（CD，cytosine deaminase）以及胸苷激酶（TK，thymidine kinase）等进行编码的核苷酸序列。
[0064] 本发明的说明书中的术语“细胞增殖抑制基因（cytostatic gene）”是指在细胞内表达，并在细胞周期途中停止细胞周期的核苷酸序列。这种细胞增殖抑制基因的例有p21、视网膜母细胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白质基因、对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子进行编码的基因（例如，p16、p15、p18及p19）以及生长终止特异性同源盒（GAX，growth arrest specific homeobox）基因（国际专利申请公开WO97/16459号及WO 96/30385号）等，但不局限于此。
[0065] 本发明的说明书中的术语“细胞凋亡基因（apoptotic gene）”是指表达后诱导程序化的细胞凋亡的核苷酸序列。这种亲-细胞凋亡基因的例有p53、腺病毒E3-11.6K（来源于Ad2及Ad5）或腺病毒E3-10.5K（来源于Ad）、腺病毒E4基因、p53途径基因以及对半胱天冬酶进行编码的基因。
[0066] 本发明的说明书中的术语“抗新生血管生成基因（anti-angiogenic gene）”是指表达后向细胞外放出抗新生血管生成因子的核苷酸序列。抗新生血管生成因子有血管生成抑制蛋白（angiostatin）、如Tie2（PNAS,95:8795-800（1998））的血管内皮生长因子（VEGF，vascular endothelial growth factor）的抑制因子以及内皮抑素（endostatin）等。
[0067] 插入到重组腺病毒的转基因优选地插入到启动子-转基因-多聚A序列的表达盒。在这种情况下，作为上述启动子可以利用本发明的基因表达调控序列（缺氧反应元件-端粒逆转录酶、缺氧反应元件-E2F、缺氧反应元件-端粒逆转录酶E2F或缺氧反应元件-E2F-端粒逆转录酶）或普通的启动子。与转基因相结合的普通的启动子优选地对动物细胞，更优选地对哺乳动物细胞起到作用来调控转基因的转录，上述启动子包含来源于哺乳动物病毒的启动子及来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子，例如，包含U6启动子、H1启动子、巨细胞病毒（CMV，cytomegalo virus）启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、疱疹单纯病毒（HSV，Herpes simplex virus）的胸苷激酶启动子、呼吸道合胞病毒（RSV，Respiratory Syncytial Virus）启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人白细胞介素-2（IL-2，interleukin-2）基因的启动子、人干扰素（IFN，Interferon）基因的启动子、人白细胞介素-4基因的启动子、人淋巴毒素基因的启动子、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF，granulocyte-macrophage colony stimulating factor）基因的启动子、诱导型启动子、癌细胞特异性启动子（例如，端粒逆转录酶启动子、前列腺特异性抗原启动子、前列腺特异性膜抗原（PSMA，prostate-specific membrane antigen）启动子、癌胚抗原启动子、E2F启动子及甲胎蛋白（AFP，alpha fetoprotein）启动子）以及组织特异性启动子（例如，白蛋白启动子），但不局限于此。
[0068] 优选地，在用于表达转基因的表达构建中，在转基因的下游结合有多腺苷酸化序列。上述多腺苷酸化序列包含牛生长激素终止子（Gimmi,E.R.,et al.,Nucleic Acids Res.17:6983-6998（1989））、SV40来源多腺苷酸化序列（Schek,N,et al.,Mol.Cell Biol.12:5386-5393（1992））、人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1，Human Immunodeficiency Virus）多聚腺苷酸（polyA）（Klasens,B.I.F.,et al.,Nucleic Acids Res.26:1870-1876（1998））、β-珠蛋白多聚腺苷酸（Gil,A.,et al,Cell49:399-406（1987））、疱疹单纯病毒胸苷激酶（HSV TK）多聚腺苷酸（Cole,C.N.and T.P.Stacy,Mol.Cell.Biol.5:2104-2113（1985））或 多 形瘤 病 毒 多 聚 腺 苷 酸（Batt,D.B and G.G.Carmichael,Mol.Cell.Biol.15:4783-4790（1995）），但不局限于此。
[0069] 最优选地，本发明的治疗学转基因选自由LK8（Apolipoprotein Klingle8）基因、胞嘧啶激酶基因、胸苷激酶基因、松弛素（relaxin）及饰胶蛋白聚糖基因组成的组中的一种或两种以上的基因。
[0070] 饰胶蛋白聚糖通过抑制肿瘤生长因子（TGF，tumor growth factor）-β的活性来阻止胶原蛋白的纤维化，参与细胞外基质的结构（matrix assembly），抑制肿瘤细胞生长，对肿瘤的形成和生长起拮抗剂的作用。
[0071] 已知载脂蛋白激酶（LK8，Apolipoprotein Klingle8）通过抑制血管内皮细胞的增殖来抑制肿瘤的生长及增殖。
[0072] 胸苷激酶既能够对胸苷进行磷酸化，还能够对作为核苷酸的类似物并用作抗病毒制剂的更昔洛韦（GCV，ganciclovir）进行磷酸化，被磷酸化的更昔洛韦-三磷酸盐在DNA合成时插入到DNA链，来中断DNA链的形成，结果，抑制DNA合成。更昔洛韦-三磷酸盐还进入未移入胸苷激酶的癌细胞中，引起细胞凋亡，由此可以诱导旁观者效应（bystander effect），还可以通过诱导因癌细胞杀伤引起的癌细胞特异性免疫反应来诱导旁观者效应。
[0073] 已报告，胞嘧啶脱氨酶将没有毒性的5-氟胞嘧啶（5-FC，5-fluorocytosine）转换为具有强力细胞毒性的5-氟尿嘧啶（5-FU，5-fluorouracil），来具有癌细胞杀伤效果。
[0074] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包含：（a）上述本发明的重组腺病毒的治疗学有效量；以及（b）药剂学上接受的载体。
[0075] 根据本发明的还一实施方式，本发明提供一种癌症治疗方法，其特征在于，包括将上述本发明的重组腺病毒的治疗学有效量的抗肿瘤组合物给药到哺乳动物对象（mammalian subject）的步骤。
[0076] 如上所述，本发明的组合物中所包含的重组腺病毒对多种肿瘤细胞呈现出杀伤功效，从而本发明的药剂学组合物可以利用于与肿瘤相关的多种疾病或疾患，比如，胃癌、肺癌、乳房癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌及子宫颈癌等的治疗。本说明书中的术语“治疗”是指（i）预防肿瘤细胞形成；（ii）通过除去肿瘤细胞来抑制与肿瘤相关的疾病或疾患；以及（iii）通过除去肿瘤细胞来减轻与肿瘤相关的疾病或疾患。因此，本说明书中的术语“治疗学有效量”是指用于达到上述药理学效果的充分的量。
[0077] 本发明的组合物中所包含的药剂学上接受的载体是进行制剂化时通常被利用的，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及防腐剂等。
[0078] 本发明的药剂学组合物优选地采用非口服给药，例如，可以利用静脉内给药、腹腔内给药、肌肉内给药、皮下给药或局部给药方式进行给药。在治疗卵巢癌时向腹腔内给药的情况及治疗肝癌时向门静脉给药的情况下，可以通过注入方法来给药；在乳房癌的情况下，可以通过直接向肿瘤块注射的方法来给药；在结肠癌的情况下，可以通过直接灌肠注射的方法来给药；在膀胱癌的情况下，可以通过直接向导管内注射的方法来给药。
[0079] 本发明的药剂学组合物的适当的给药量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及如反应灵敏性等因素而不同，一般熟练的医生容易地决定和处方对目标治疗有效的给药量。通常，本发明的药剂5 15 10
学组合物包含1×10-1×10 pfu/ml的重组腺病毒，通常将1×10 pfu隔两天注射一次的方式注射2周。
学组合物包含1×10-1×10 pfu/ml的重组腺病毒，通常将1×10 pfu隔两天注射一次的方式注射2周。
[0080] 本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普遍技术人员能够容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来实现制剂化，从而能够制备成单位剂量形态，或装入到多剂量容器内而制备。这时，剂型可以是油性介质或水性介质中的溶液及悬浮液或乳液的形态，还可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态，而且还可包含分散剂或稳定剂。
[0081] 本发明的药剂学组合物可以按单独的疗法来利用，还可以与其它常规的化学疗法或放射疗法一起利用，在实施这些同步疗法的情况下，能够更加有效地治疗癌症。可与本发明的组合物一起利用的化学治疗剂有顺铂（cisplatin）、卡铂（carboplatin）、甲基苄肼（procarbazine）、二氯甲基二乙胺（mechlorethamine）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、异环磷酰胺（ifosfamide）、左旋苯丙氨酸氮芥（melphalan）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、白消安（bisulfan）、亚硝基脲（nitrosourea）、更生霉素（dactinomycin）、柔红霉素（daunorubicin）、阿霉素（doxorubicin）、争光霉素（bleomycin）、普卡霉素（plicomycin）、丝裂霉素（mitomycin）、依托泊苷（etoposide）、他莫昔芬（tamoxifen）、紫杉醇（taxol）、反铂（transplatinum）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）、长春新碱（vincristin）、长春碱（vinblastin）及甲氨蝶呤（methotrexate）等。可与本发明的组合物一起利用的放射疗法有X-射线照射及γ-射线照射等。
[0082] 根据本发明的优选的实例，本发明的组合物还包含更昔洛韦作为有效成分。
[0083] 更昔洛韦是作为用于预防和治疗巨细胞病毒（cytomegalovirus）感染的抗病毒剂来使用的嘌呤类化合物，通过被疱疹单纯病毒-胸苷激酶磷酸化，从而转换为活性化的更昔洛韦三磷酸盐形态。这种被磷酸化的更昔洛韦作为核苷酸类似物来起作用，在DNA合成时，通过插入到DNA链来抑制DNA合成。因此，在将本发明的组合物与更昔洛韦一起同步给药的情况下，仅在被表达疱疹单纯病毒-胸苷激酶的肿瘤特异性病毒感染的癌细胞上诱导更昔洛韦的磷酸化，从而将会凋亡癌细胞。并且，被磷酸化的更昔洛韦通过细胞之间的间隙连接（gap junction）还进入未移入疱疹单纯病毒-胸苷激酶的癌细胞中，并可通过引起细胞凋亡的旁观者效应来诱导极大化的细胞杀伤，从而能够作为具有非常极大化的抗肿瘤活性的抗癌组合物来有效利用。
[0084] 本发明的组合物可以同时包含上述的基因运载体和更昔洛韦来组成一个制剂，并且，还可以将基因运载体组合物和更昔洛韦分别作为单独制剂来同步给药。
[0085] 【发明效果】
[0086] 概括本发明的特征及优点如下：
[0087] （a）本发明提供一种由缺氧反应元件、E2F及端粒逆转录酶组合而成的基因表达调控序列及选择性肿瘤细胞的杀伤能力得到大幅改善的基因运载体。
[0088] （b）本发明尤其在低氧条件下呈现更加提高的抗肿瘤效果，并通过胸苷激酶基因的插入及更昔洛韦的同步给药来大幅改善目前癌症的基因治疗疗法中受到最大限制的不能向所有癌细胞移入治疗基因的缺点。【附图说明】
[0089] 图1是表示作为通过合并缺氧反应元件6复制体和E2F启动子的转录调控区域来调控复制的肿瘤选择性杀伤腺病毒的E-Rd19、EE-Rd19、HE-Rd19、HEE-Rd19的示意图。
[0090] 图2a-图2b是表示由E2F启动子重组而成的腺病毒的癌细胞选择性杀伤能力的比较结果的图。
[0091] 图3是表示通过噻唑蓝比色分析来比较由E2F启动子重组而成的腺病毒的癌细胞选择性杀伤能力的结果的图。
[0092] 图4是表示由E2F启动子重组，并表达LK8的肿瘤选择性杀伤腺病毒HEE-Rd19-K35/LK的示意图。
[0093] 图5是表示由启动子重组，并表达LK8的肿瘤选择性杀伤腺病毒HEE-Rd19-K35/LK的癌细胞杀伤效果的图。
[0094] 图6是通过噻唑蓝比色分析来表示作为由E2F启动子重组，并表达LK8的肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK的癌细胞杀伤能力的验证结果的图。
[0095] 图7是表示为了验证HEE-Rd19-K35/LK肿瘤选择性可复制腺病毒的生物体内抗肿10
瘤效果，向裸鼠的腹部皮下注射作为人体肺癌细胞株的A549细胞株，并将1x10 VP的Rd19或HEE-Rd19-K35/LK腺病毒与作为阴性对照组的磷酸盐缓冲液（PBS，Phosphate Buffered Saline）一起隔两天共三次向肿瘤内给药后，观察肿瘤的生长的结果的图。
瘤效果，向裸鼠的腹部皮下注射作为人体肺癌细胞株的A549细胞株，并将1x10 VP的Rd19或HEE-Rd19-K35/LK腺病毒与作为阴性对照组的磷酸盐缓冲液（PBS，Phosphate Buffered Saline）一起隔两天共三次向肿瘤内给药后，观察肿瘤的生长的结果的图。
[0096] 图8是表示作为通过由缺氧反应元件6、E2F以及端粒逆转录酶重组而成的启动子来调控GFP表达的不可复制腺病毒的dE1-HmTE-k35/GFP和dE1-HEmT-k35/GFP的示意图。
[0097] 图9a-图9b是表示在多种癌细胞株中的dE1-HmTE-k35/GFP和dE1-HEmT-k35/GFP腺病毒的基因传递效率的比较结果的图（方框里的数字是平均荧光强度）。
[0098] 图10是表示通过巨细胞病毒启动子或HEmT重组启动子的GFP表达能力的比较结果的图。
[0099] 图11是表示作为通过由缺氧反应元件6复制体、E2F以及端粒逆转录酶重组而成的启动子来调控复制的肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEmT-Rd19-k35和HmTE-Rd19-k35的示意图。
[0100] 图12是表示作为通过HEmT启动子来调控复制，并表达饰胶蛋白聚糖的肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEmT-Rd19-k35/DCN的示意图。
[0101] 图13是表示表达饰胶蛋白聚糖和CDTK的肿瘤选择性杀伤腺病毒的示意图。
[0102] 图14是表示基于HEmT-Rd19-k35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的饰胶蛋白聚糖的表达验证结果的图。
[0103] 图15是表示HEmT-Rd19-K35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的癌细胞选择性杀伤能力的比较验证结果的图。a是被腺病毒感染的脑癌细胞株，b是被腺病毒感染的头颈部肿瘤细胞株，c是被腺病毒感染的其它多种癌细胞株，d是被腺病毒感染的正常细胞株。
[0104] 图16a-图16b是表示比较验证作为表达饰胶蛋白聚糖的肿瘤选择性杀伤腺病毒的Rd19-k35/DCN和HEmT-Rd19-k35/DCN的癌细胞杀伤能力的结果的图。
[0105] 【实施方式】
[0106] 以下，通过实施例来更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更详细地说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对本发明所属技术领域的普遍技术人员而言是显而易见的。【实施例】
[0107] 【E-Rd19、EE-Rd19、HE-Rd19及HEE-Rd19载体的制备】
[0108] 为了制备通过E2F启动子2复制体来更加提高腺病毒的肿瘤选择性杀伤能力的腺病毒，通过在pSP72-E2F克隆载体中用SalI/NheI切割E2F启动子DNA后插入到p△E1sp1B-E2F克隆载体的XhoI/BamHI位点来制备p△E1sp1B-E2F-E2F载体，并用该载体的EcoRI/BglII部位亚克隆用EcoRI/BamHI切割的Rb7△19DNA，由此制备了具有E2F启动子2复制体的p△E1sp1B-E2F-E2F-Rb7△19腺病毒E1穿梭载体。将制备出的p△E1sp1B-E2F-E2F-Rb7△19穿梭载体与作为腺病毒总载体的dl324Bst的E1部分进行同源重组，由此制备了作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的EE-Rd19。
[0109] 并且，为了开发在低氧血症肿瘤中更具有活性的肿瘤选择性杀伤腺病毒，合并缺氧反应元件6复制体和E2F启动子，并制备了通过合并的启动子来调控复制的肿瘤选择性杀伤腺病毒。首先，为了制备合并缺氧反应元件6复制体和E2F启动子的E1腺病毒穿梭载体，在作为E1穿梭载体的p△E1sp1A的XhoI部位插入将pSP72-缺氧反应元件6用SalI/XhoI切断得到的缺氧反应元件6复制体DNA，由此制备了p△E1sp1A-缺氧反应元件6腺病毒E1穿梭载体。在制备出的p△E1sp1A-缺氧反应元件6腺病毒E1穿梭载体的EcoRI/BglII部位插入用EcoRI/BamHI切割的Rb7△19DNA，由此制备了p△E1sp1A-缺氧反应元件6-Rb7△19。最后，在p△E1sp1A-缺氧反应元件6-Rb7△19的XbaI/EcoRV部位亚克隆用NheI-EcoRV切割的E2F DNA，由此制备了作为具有合并了缺氧反应元件6复制体和E2F启动子的启动子的E1穿梭载体的p△E1sp1A-缺氧反应元件6-E2F-Rb7△19。将制备出的p△E1sp1A-缺氧反应元件6-E2F-Rb7△19腺病毒E1穿梭载体与作为腺病毒总载体的dl324Bst的E1部分进行同源重组，由此完成了作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HE-Rd19的制备。
[0110] 并且，为了制备通过同时合并E2F启动子2复制体的启动子和缺氧反应元件6，由E2F启动子2复制体来更加提高肿瘤选择性杀伤能力，同时，更加增加在低氧血症肿瘤中的活性的更加改善的肿瘤选择性杀伤腺病毒，在pSP72-E2F克隆载体中用SalI/NheI切割E2F启动子后插入到p△E1sp1B-E2F克隆载体的XhoI/BamHI位点，由此制备p△E1sp1B-E2F-E2F载体，并用EcoRI-XbaI限制酶切割p△E1sp1A-缺氧反应元件6，用EcoRI-NheI限制酶切割p△E1sp1B-E2FE2F后进行连接（ligation），由此制备了p△E1sp1B-缺氧反应元件6-E2F-E2F。将如此制备出的E1穿梭载体与作为腺病毒总载体的dl324Bst的E1部分进行同源重组，由此制备了作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19。
[0111] 【具有E-Rd19,EE-Rd19,HE-Rd19及HEE-Rd19亲HXJ的肿瘤选择性杀伤腺病毒的癌细胞杀伤能力验证-噻唑蓝比色分析】
[0112] 为了验证上述制备出的E-Rd19、EE-Rd19及HEE-Rd19肿瘤选择性杀伤腺病毒的癌细胞特异性杀伤能力，将各个病毒以多种浓度的滴度分别感染到多种癌细胞和如BJ和MRC5的正常细胞后，比较观察了细胞杀伤程度。如图2所示，确认了通过缺氧反应元件-E2F-E2F启动子来调控复制的肿瘤选择性杀伤腺病毒（HEE-Rd19）的癌细胞杀伤能力比通过E2F、缺氧反应元件-E2F或E2F-E2F来调控复制的肿瘤选择性杀伤腺病毒（E-Rd19、HE-Rd19、EE-Rd19）呈现优秀的癌细胞杀伤能力，尤其，可以确认在本发明所使用的所有癌细胞株中，通过重组的缺氧反应元件E2F-E2F启动子来调控复制的肿瘤选择性杀伤腺病毒（HEERd19）的癌细胞杀伤能力与作为对照组的Rd19或野生型腺病毒（XC）相比，类似或更加提高，与之相反，在正常细胞株中与野生型腺病毒相比细胞杀伤力减少，从而确认了癌细胞特异性也优秀。为了进一步定量化癌细胞杀伤能力的噻唑蓝比色分析结果中也确认了通过重组的缺氧反应元件-E2F-E2F启动子来调控复制的肿瘤选择性杀伤腺病毒（HEE-Rd19）的癌细胞杀伤能力与作为对照组的Ad-Rb7△19或野生型腺病毒相比，类似或得到进一步提高，并确认了HEE-Rd19的癌细胞杀伤能力通过缺氧反应元件在低氧条件下相比正常条件下更增加癌细胞杀伤能力（图3）。与此类似地，可以确认与E-Rd19相比在低氧血症状态下增加重组缺氧反应元件6的HE-Rd19的癌细胞杀伤能力，由此可以知道在低氧血症状态下，缺氧反应元件6作为增强子来起作用。
[0113] 【由E2F启动子重组，并表达LK8的肿瘤选择性杀伤腺病毒的制备】
[0114] 为了制备插入用于抑制血管内皮细胞的增殖的LK8的E1穿梭载体，用NheI/XhoI切割插入到pcDNA的LK8基因后，插入到用NheI/SalI来处理的p△E1sp1A-缺氧反应元件-E2F-E2F-Rb7△19，由此制备了E1腺病毒穿梭载体p△E1sp1A-LK8-缺氧反应元件-E2F-E2F-Rb7△19，用BstBI限制酶切割作为腺病毒总载体的dl324-35K的E1部分后，同源重组用于表达用XmnI切断的LK8的E1穿梭载体p△E1sp1A-LK8-缺氧反应元件-E2F-E2F-Rb7△19，由此制备了作为向E1表达LK8的肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK（图4）。制备出的腺病毒在A549细胞株中进行增殖，并计算出通过限制滴定分析（limiting titeration assay）生成的腺病毒的滴度（噬斑形成单位：plaque forming unit，PFU）（图4）。
[0115] 【作为由E2F启动子重组，并表达LK8的肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK的癌细胞杀伤能力验证】
[0116] 为了验证作为通过表达LK8的重组E2F启动子来调控复制的腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK的癌细胞杀伤能力，将各个病毒以多种浓度的滴度感染到癌细胞后，比较观察了癌细胞杀伤程度（图5）。如图5所示，可以观察到HEE-Rd19-K35/LK的癌细胞杀伤能力与作为对照组的Rd19或作为野生型腺病毒的XC相比，得到了大大提高。并且，为了进一步定量化HEE-Rd19-K35/LK的癌细胞杀伤效果而进行噻唑蓝比色分析的结果，对多种人体肺癌细胞株（A549、H358、H2009、H596、H2172及HCC827）按0.1～0.5感染复数（MOI，multiplicity of infection）滴度感染作为阴性对照组的不可复制腺病毒的dE1，未置换纤维的作为对照组的可复制腺病毒的Rd19，以及通过变形的E2F启动子来调控复制，并置换为腺病毒型35的纤维的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK病毒后，通过噻唑蓝比色分析来测定了不同时间段存活的细胞的生存率（图6）。如图6所示，在本实验所利用的所有肺癌细胞株中可以观察到与作为对照组病毒的Rd19相比，HEE-Rd19-K35/LK的细胞杀伤能力得到了增加。尤其，在H322细胞株中确认了作为未置换纤维的对照组病毒的Rd19与置换为腺病毒型35的纤维的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK类似的病毒复制能力和癌细胞杀伤能力，这种结果与H322的作为腺病毒细胞受体的柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR，Coxsackie and Adenovirus Receptor）的表达较高，作为腺病毒型
35的纤维的受体的CD46的表达较低的现象一致。概括上述的结果，本研究所制备的通过变形的E2F启动子来调控复制，并置换为腺病毒型35纤维的作为得到改善的肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK，通过启动子的重组和纤维的置换来增加癌细胞感染能力，并能够由此来验证诱导有效的癌细胞杀伤能力。
35的纤维的受体的CD46的表达较低的现象一致。概括上述的结果，本研究所制备的通过变形的E2F启动子来调控复制，并置换为腺病毒型35纤维的作为得到改善的肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK，通过启动子的重组和纤维的置换来增加癌细胞感染能力，并能够由此来验证诱导有效的癌细胞杀伤能力。
[0117] 【由E2F启动子重组，并表达LK8的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEE-Rd19-K35/LK的抗肿瘤效果验证】
[0118] 为了验证HEE-Rd19-K35/LK肿瘤选择性可复制腺病毒的活体内抗肿瘤效果，10
向裸鼠的腹部皮下注射作为人体肺癌细胞株的A549细胞株，并将1x10 VP的Rd19或HEE-Rd19-K35/LK腺病毒与作为阴性对照组的磷酸盐缓冲溶液一起隔两天共三次向肿瘤内给药后，观察了肿瘤的生长（图7）。在将作为对照组的磷酸盐缓冲溶液给药到白老鼠的
3
情况下，确认了投用病毒后第25日左右时肿瘤的体积急剧生长至约500mm，但是，在将作为肿瘤特异性杀伤腺病毒的Rd19或HEE-Rd19-K35/LK投用到白老鼠的情况下，大大延迟肿瘤的生长。即，在将Rd19或HEE-Rd19-K35/LK腺病毒投用到白老鼠的情况下，投用病毒
3 3
后第25日时肿瘤的体积为约300mm或100mm ，与对照组相比分别为60%和20%，由此确认大幅减少了。并且，在将目前已商品化的作为基因治疗剂的重组人p53腺病毒注射液
3
（Gendicine）给药到白老鼠的情况下，投用病毒后第25日时肿瘤的体积为约350mm，由此可以确认HEE-Rd19-K35/LK与重组人p53腺病毒注射液相比诱导出更超卓优秀的抗肿瘤效果。
向裸鼠的腹部皮下注射作为人体肺癌细胞株的A549细胞株，并将1x10 VP的Rd19或HEE-Rd19-K35/LK腺病毒与作为阴性对照组的磷酸盐缓冲溶液一起隔两天共三次向肿瘤内给药后，观察了肿瘤的生长（图7）。在将作为对照组的磷酸盐缓冲溶液给药到白老鼠的
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情况下，确认了投用病毒后第25日左右时肿瘤的体积急剧生长至约500mm，但是，在将作为肿瘤特异性杀伤腺病毒的Rd19或HEE-Rd19-K35/LK投用到白老鼠的情况下，大大延迟肿瘤的生长。即，在将Rd19或HEE-Rd19-K35/LK腺病毒投用到白老鼠的情况下，投用病毒
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后第25日时肿瘤的体积为约300mm或100mm ，与对照组相比分别为60%和20%，由此确认大幅减少了。并且，在将目前已商品化的作为基因治疗剂的重组人p53腺病毒注射液
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（Gendicine）给药到白老鼠的情况下，投用病毒后第25日时肿瘤的体积为约350mm，由此可以确认HEE-Rd19-K35/LK与重组人p53腺病毒注射液相比诱导出更超卓优秀的抗肿瘤效果。
[0119] 【由E2F和端粒逆转录酶启动子重组而成的不可复制腺病毒（缺氧反应元件6-端粒逆转录酶-E2F或缺氧反应元件6-E2F-端粒逆转录酶）的制备】
[0120] 为了确认基于由缺氧反应元件6复制体、变形的端粒逆转录酶启动子及E2F启动子合并而成的启动子的腺病毒的复制能力的差异，首先，制备了通过按缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F顺序对缺氧反应元件6复制体、变形的端粒逆转录酶启动子及E2F启动子进行重组的启动子来调控GFP的表达的不可复制腺病毒。首先在本研究室所制备的pSP72-m端粒逆转录酶的SfuI、SalI部位克隆用ClaI、SalI限制酶从pSP72-E2F载体切割出的E2F启动子，由此制备了pSP72-端粒逆转录酶-E2F，并在ClaI部位克隆用ClaI限制酶从pGL3-缺氧反应元件6-APF载体切割出的缺氧反应元件6复制体，由此制备了pSP72-缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F。其次，制备了对用XhoI、EcoRI切割作为腺病毒E1穿梭载体的pΔE1sp1B（Ψ），并用SalI、EcoRI切割pSP72-缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F的重组启动子缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F进行克隆的pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/E2F/端粒逆转录酶，用EcoRI、XbaI切断该pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/E2F/端粒逆转录酶，并对用EcoRI、NheI切割pCDNA3.1/zeo-增强型绿色荧光蛋白（EGFP，enhanced green fluorescent protein）而得到的EGFP进行克隆，由此完成了pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F-EGFP穿梭载体。
[0121] 并且，为了制备通过按缺氧反应元件6//E2F/端粒逆转录酶的顺序由缺氧反应元件6复制体、E2F启动子及变形的端粒逆转录酶启动子重组而成的启动子来调控GFP的表达的不可复制腺病毒，将通过用EcoRI、ClaI切断本研究室所制备的pΔE1sp1B（Ψ）-E2F端粒逆转录酶-Rb7Δ19来得到的E2F-端粒逆转录酶插入到作为E1穿梭载体的pΔE1sp1B（Ψ）的EcoRI、ClaI部位，由此制备了pΔE1sp1B（Ψ）-E2F-端粒逆转录酶，并在pΔE1sp1B（Ψ）-E2F-端粒逆转录酶的ClaI部位克隆用ClaI限制酶从pGL3-缺氧反应元件6-APF载体切割出的缺氧反应元件6，由此制备了pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/E2F/端粒逆转录酶。其次，用EcoRI、XbaI切断pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/E2F/端粒逆转录酶，并插入用EcoRI、NheI切割pCDNA3.1/zeo-EGFP来得到的EGFP，由此完成了pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/E2F/端粒逆转录酶-EGFP穿梭载体。将如此制备而成的pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F-EGFP或pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/E2F/端粒逆转录酶-EGFP腺病毒E1穿梭载体与作为腺病毒总载体的dE1-k35的E1部分进行同源重组，由此制备了dE1-HmTE-k35/GFP和dE1-HEmTk35/GFP腺病毒（图8）。
[0122] 【比较dE1-HmTE-k35/GFP和dE1-HEmT-k35/GFP腺病毒的基因传递效率】[0123] 为了比较制备出的重组启动子的活度，将制备出的不可复制腺病毒感染到多种癌细胞，经过36小时后利用荧光激活细胞分类器（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）来确认了绿色荧光蛋白（GFP，Green Fluorecence Protein）的表达（图9）。如图9所示，通过在启动子插入有缺氧反应元件增强子的两种的dE1-HEmT-k35/绿色荧光蛋白和dE1-HmTE-k35/绿色荧光蛋白病毒，确认了在低氧条件下的绿色荧光蛋白表达与正常条件下相比得到了大幅增加，这意味着在低氧条件下缺氧反应元件作为增强子来起作用，从而能够增加病毒（dE1-HEmT-k35/绿色荧光蛋白、dE1-HmTE-k35/绿色荧光蛋白）的基因传递效率。并且，确认了在作为脑癌细胞株的U343和其它癌细胞株（Hep1、MDA MB231）中的通过dE1-HEmTk35/绿色荧光蛋白和dE1-HmTE-k35绿色荧光蛋白的基因传递效率优秀，尤其，感染dE1-HEmT-k35/绿色荧光蛋白的细胞的绿色荧光蛋白表达与感染dE1-HmTE-k35/绿色荧光蛋白的细胞相比得到显著的增加。通过这些结果，确认了在癌细胞中的HEmT重组启动子的活性与HmTE重组启动子的活性相比，得到了大幅增加。如图10所示，在作为癌细胞株的U373MG和作为正常细胞的BJ、CBHEL及IMR90中通过巨细胞病毒启动子来调控绿色荧光蛋白表达的dE1-CMV-k35/绿色荧光蛋白的绿色荧光蛋白表达均较高，与之相反，在作为癌细胞株的U373MG中通过dE1-HEmT-k35/绿色荧光蛋白的绿色荧光蛋白表达与通过dE1-CMV-k35/绿色荧光蛋白的绿色荧光蛋白表达类似，由此确认启动子的活性非常高，但是，在正常细胞中与未做任何处理的阴性对照组类似，由此确认HEmT启动子的癌细胞特异性非常高。
[0124] 【通过由缺氧反应元件6复制体、E2F启动子及变形的端粒逆转录酶启动子重组而成的启动子来调控复制的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEmTRd19-k35和HmTE-Rd19-k35的制备】
[0125] 为了制备通过按缺氧反应元件6复制体、E2F启动子及变形的端粒逆转录酶启动子的顺序合并而成的重组启动子来调控复制的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEmT-Rd19-k35，首先，用ClaI、SalI切断本研究室所制备的作为腺病毒E1穿梭载体的pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19，并在pSP72-E2F插入通过用ClaI,SalI切断来得到的E2F启动子，由此制备了pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-E2F，再用EcoRI,XhoI部位切断该pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-E2F后，与通过用EcoRI,XhoI限制酶切断pcDNA3.1-m端粒逆转录酶来得到的变形的端粒逆转录酶启动子进行克隆，并克隆从pSP72-E2F载体用ClaI,SalI限制酶切割的E2F启动子，由此制备了pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-E2F-端粒逆转录酶。最后，在pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-E2F-端粒逆转录酶的ClaI部位克隆从pGL3-缺氧反应元件6-APF载体用ClaI限制酶切割的缺氧反应元件6，由此制备了作为腺病毒E1穿梭载体的pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-缺氧反应元件6/E2F/m端粒逆转录酶。
[0126] 另一方面，为了制备通过按缺氧反应元件6复制体、变形的端粒逆转录酶启动子及E2F启动子的顺序重组而成的启动子来调控复制的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HmTE-Rd19-k35，首先，用EcoRV、HindIII切断作为腺病毒E1穿梭载体的pΔE1sp1A（Ψ），并插入通过用EcoRV、HindIII切断pSP72-E2F来得到的E2F启动子，由此制备了pΔE1sp1A（Ψ）-E2F。另一方面，用EcoRI、XhoI部位切断作为E1穿梭载体的pΔE1sp1B（Ψ）后，与通过用EcoRI、XhoI限制酶切断pcDNA3.1-m端粒逆转录酶来得到的端粒逆转录酶启动子进行克隆，由此制备了pΔE1sp1B（Ψ）-端粒逆转录酶，在pΔE1sp1A（Ψ）-E2F的ClaI、EcoRV部位插入通过用ClaI、EcoRV切断ΔE1sp1B（Ψ）-端粒逆转录酶来得到的变形的端粒逆转录酶，由此制备了pΔE1sp1A（Ψ）-端粒逆转录酶-E2F。用ClaI、SalI切断如此制备出的pΔE1sp1A（Ψ）-端粒逆转录酶-E2F，制备了插入到作为本研究室所制备的E1穿梭载体的pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19的ClaI,SalI部位的pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-端粒逆转录酶-E2F。最后，在pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-端粒逆转录酶-E2F的ClaI部位克隆从pGL3-缺氧反应元件6-APF载体用ClaI限制酶切割出的缺氧反应元件6，由此制备了作为腺病毒E1穿梭载体的ΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F。在作为腺病毒总载体的dl324-35K的E1部分，对如此制备的作为腺病毒E1穿梭载体的pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F和pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-缺氧反应元件6/端粒逆转录酶/E2F进行同源重组，由此完成了通过重组的启动子来调控病毒的复制的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEmTRd19-k35和HmTE-Rd19-k35的制备。
[0127] 【通过HEmT启动子来调控复制，并表达能够分解细胞外基质的饰胶蛋白聚糖基因的HEmT-Rd19-k35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的制备】
[0128] 饰胶蛋白聚糖是属于小的富含亮氨酸重复蛋白聚糖（SLRP，small leucin rich proteoglycan）类型的蛋白质，由富含10-12个亮氨酸的重复序列（leucin rich repeat）组成，由于中心部位是拱（arch）状，从而形成容易与在细胞外基质存在的多种生长因子或饰胶蛋白聚糖受体相结合的结构。已知饰胶蛋白聚糖通过抑制肿瘤生长因子-β的活性来阻止胶原蛋白的纤维化，参与细胞外基质的结构，并抑制肿瘤细胞的生长，从而对肿瘤的形成和生长起到天然拮抗剂（natural antagonist）的作用。并且，饰胶蛋白聚糖通过与如生长因子或金属离子的细胞外基质的结构成分进行反应来促进如MMP-1的多种MMP等的表达，从而分解细胞外基质。根据最近的研究结果，报告了饰胶蛋白聚糖作为表皮生长因子受体（EGFR，epidermal growth factor receptor）的新生物学配体，在对多种癌细胞处理饰胶蛋白聚糖时，通过与表皮生长因子受体的结合，在灭活表皮生长因子受体的作用的同时WAF1促进内源性细胞周期蛋白依赖性（endogenous cyclin dependent）p21 的表达，从而诱导根据细胞周期G1的停滞诱导的细胞杀伤。因此，表达饰胶蛋白聚糖的腺病毒通过增加病毒的扩散，不但可以提高利用腺病毒的治疗基因的传递效率，还可以诱导由于饰胶蛋白聚糖自身引起的癌细胞的杀伤效果。
[0129] 基于这样的情况，为了制备在腺病毒的E1部位表达饰胶蛋白聚糖的病毒，通过在pCA14克隆载体的BamHI部位亚克隆被切断的饰胶蛋白聚糖DNA来制备了pCA14-饰胶蛋白聚糖。通过对pCA14/DCNG质粒处理BglII限制酶来获得DCN的表达盒，并通过对本研究室所制备的pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19用BamHI限制酶进行克隆来制备了pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7△19-DCN。
[0130] 另一方面，为了克隆启动子，将pΔE1sp1B（Ψ）-E2F-端粒逆转录酶通过处理ClaI和EcoRI限制酶来获得E2F-端粒逆转录酶后，通过对pΔE1sp1B（Ψ）-Rb7Δ19-DCNG穿梭载体进行克隆来制备了pΔE1sp1B（Ψ）-E2F-m端粒逆转录酶-Rb7Δ19-DCN，并在PGL3-缺氧反应元件6-AFP质粒通过处理限制酶ClaI来获得缺氧反应元件6复制体后，通过对pΔE1sp1B（Ψ）-E2F-m端粒逆转录酶-Rb7Δ19-DCN质粒用ClaI限制酶进行克隆来制备了pΔE1sp1B（Ψ）-缺氧反应元件6/E2F/端粒逆转录酶-Rb7Δ19-DCN腺病毒穿梭载体。通过利用XmnI来对所制备的腺病毒穿梭载体进行线性化后，与作为总载体的dE1-k35进行同源重组来制备了HEmT-Rd19-k35/DCN病毒。然后，所制备的腺病毒在A549细胞株通过增殖来进行批量生产，并通过限制滴度分析来算出所生产的病毒的滴度（图12）。
[0131] 【插入HEmT重组启动子，并在E1部位表达饰胶蛋白聚糖基因，在E3部位表达CDTK的作为肿瘤选择性杀伤腺病毒的HEmT-Rd19-k35/CDTK（E3）和HEmT-Rd19-k35/DCN/CDTK的制备】
[0132] 疱疹单纯病毒-胸苷激酶是目前使用频率最多的药物敏感性基因，通过对作为没有毒性的前体药物的（prodrug）的更昔洛韦（ganciclovir,GCV）进行磷酸化来抑制被感染的细胞的DNA合成，从而能够选择性地杀伤进行分裂的细胞的治疗癌症基因。胸苷激酶是合成DNA时利用于补救途径（salvage pathway）的酶，疱疹单纯病毒-胸苷激酶不仅可以对胸苷（Thymidine）进行磷酸化，还可以对作为核苷酸类似物的同时利用为抗病毒制剂的更昔洛韦进行磷酸化。被磷酸化的更昔洛韦-三磷酸腺苷在DNA合成时插入到DNA链中，终止DNA链的形成，结果，抑制DNA合成。并且，通过活着的癌细胞对相邻的凋亡癌细胞的凋亡小泡（apoptotic vesicle）进行噬菌作用（phagocytosis），更昔洛韦-三磷酸腺苷还进入未移入疱疹单纯病毒-胸苷激酶的癌细胞中，造成细胞凋亡，从而能够诱导旁观者效应，还通过引导由于癌细胞杀伤的癌细胞特异性免疫反应来诱导旁观者效应。并且，胞嘧啶脱氨酶起将没有毒性的5-氟胞嘧啶转换为具有强大的细胞毒性和辐射敏感度的5-氟尿嘧啶的作用。最近在移入这种胞嘧啶脱氨酶基因的基因治疗中报告了通过胞嘧啶脱氨酶基因表达的癌细胞杀伤效果。基于这样的情况，制备了在通过癌细胞特异性活性优秀的HEmT重组启动子来调控复制的腺病毒的E1部位表达饰胶蛋白基因，并在E3部位同时表达胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶的肿瘤选择性杀伤腺病毒。为了制备表达胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶的腺病毒的E3穿梭载体，将pCKhTK-IRES-hCD质粒利用BamHI限制酶来获得人型（human type）的CD-IRES-TK后，插入到pSP72/E3/CMV-PolA载体，由此制备了pSP72-E3/CMV-CD-IRES-TK-PolA腺病毒E3穿梭载体。用PvuI对所制备的载体进行线性化后，与上述所制备的HEmT-Rd19-k35,HEmT-Rd19-k35/DCN总载体在E3部位进行同源重组，由此分别制备了HEmT-Rd19-k35/CDTK（E3）和HEmT-Rd19-k35/DCN/CDTK腺病毒（图13）。
[0133] 【HEmT-Rd19-k35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的饰胶蛋白聚糖表达（western blot assay）验证】
[0134] 为了确认根据上述方法来制备的HEmT-Rd19-k35/DCN肿瘤选择性腺病毒是否充分表达饰胶蛋白，进行了西式吸印杂交试验（western blot assay）（图14）。如图14所示，确认了通过本研究所使用的Rd19-k35/DCN、HEmTRd19-k35/DCN腺病毒，正常进行饰胶蛋白聚糖的表达。
[0135] 【通过HEmT重组启动子来调控复制，并表达饰胶蛋白的肿瘤选择性杀伤腺病毒的细胞杀伤能力验证（CPE assay，cytopathic effect assay：细胞病变效应分析）】[0136] 为了验证上述制备出的HEmT-Rd19-K35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的细胞杀伤能力，将各个病毒以多种浓度的滴度分别感染到脑癌细胞株（U373MG、U87MG、T98G及U343）、头颈部肿瘤细胞株（CAL27、IMR90及SJSA）、其它多种癌细胞株（H460、H358、C33A及Hep1）以及正常细胞株（IMR90、BJ及CBHEL）后，比较观察了细胞杀伤程度（图15）。如图15所示，可以观察到表达饰胶蛋白聚糖的Rd19-K35/DCN或HEmT-Rd19-K35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的癌细胞杀伤能力与作为对照组的Rd19-K35或HEmT-Rd19-K35相比分别取得了增加，从而确认了根据饰胶蛋白聚糖表达的癌细胞杀伤能力的增大效果。
[0137] 【HEmT-Rd19-K35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的细胞杀伤能力验证（MTT assay：噻唑蓝比色分析）】
[0138] 为了更加定量地验证表达饰胶蛋白聚糖的HEmT-Rd19-k35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的细胞杀伤能力，对脑癌细胞株（U343、U87MG）和其它多种癌细胞株（Huh7、C33A）分别感染Rd19-k35、HEmT-Rd19-k35、Rd19-k35/DCN及HEmT-Rd19-k35/DCN后，比较观察了细胞杀伤程度（图16）。如图16所示，确认了本研究所使用的所有癌细胞株中通过HEmT启动子来调控复制的HEmT-Rd19-k35肿瘤选择性杀伤腺病毒的癌细胞杀伤能力比作为对照组的Rd19-k35优秀，并且，可以确认表达饰胶蛋白聚糖的Rd19-k35/DCN或HEmT-Rd19-k35/DCN肿瘤选择性杀伤腺病毒的癌细胞杀伤能力与作为各个病毒的对照组的Rd19-k35、HEmT-Rd19-k35相比，得到了大幅增加。
[0139] 以上详细记述了本发明的特定的部分，这些具体的记述只是优选的实例，本发明的范围并不局限于此，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。因此，本发明的实质性的范围会根据所附的权利要求书及其等同替代来定义。
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