皮肤角质干细胞增殖用组合物
阅读：692发布：2020-05-13
专利汇可以提供皮肤角质干细胞增殖用组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了一种含有选自4’,7,8-三羟基异黄 酮 、4’,6,7-三羟基异黄酮、及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍 生物 作为有效成分的用于提高 皮肤 再生能 力 或改善皮肤弹性的组合物。上述组合物能诱导皮肤 角 质干 细胞增殖 ，具有提高皮肤再生能力或改善皮肤弹性的效果，借此可多样化地灵活运用于 化妆品 或医药领域。，下面是皮肤角质干细胞增殖用组合物专利的具体信息内容。
1.3’,4’,7-三羟基异黄酮在制备用于提高皮肤再生能力或改善皮肤弹性的组合物中的用途，其中所述3’,4’,7-三羟基异黄酮能够增加FZD1（Frizzled homolog 1）的表达。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还含有选自4’,7,8-三羟基异黄酮及4’,6,7-三羟基异黄酮的至少一种o-二羟基异黄酮衍生物作为有效成分。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，以组合物全体的重量为基准时，所述
3’,4’,7-三羟基异黄酮占0.001～30重量％。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述3’,4’,7-三羟基异黄酮通过增殖皮肤角质干细胞，来提高皮肤再生能力或改善皮肤弹性。
5.根据权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于：所述组合物是皮肤外用剂组合物。
6.根据权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于：所述组合物是化妆品组合物。
7.根据权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于：所述组合物是药学组合物。
皮肤角质干细胞增殖用组合物
技术领域
背景技术
[0002] 皮肤最重要的作用是在外部损伤以及细菌侵入时扮演保护人体的防御屏障（defense barrier）的角色，与此同时还能防止内部的热和水分等的损失。从大的来说，皮肤的结构包括表皮（epidermis）和真皮（dermis），表皮可分为由平面六角形的死细胞构成的角质层（Stratum Corneum）和活的表皮。
[0003] 活的表皮包含基底层（Stratum Basale）、有棘层（Stratum Spinosum）、颗粒层（Stratum Granulosum）和透明层（Stratum Lucidum）4个层。其中，皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem cells，KSC）位于基底层上，皮肤角质干细胞持续分裂将形成过渡扩增细胞（Transit Amplifying Cells，TA cells）。此类细胞再进行数次分裂，在皮肤产生过程的中/后期形成在皮肤屏障机能中扮演重要角色的角质细胞（Keratinocyte cells）。角质细胞进行分化（differentiation），借此在皮肤产生过程的最后期上升成皮肤表面。在这个过程中，角质细胞的分化和角质化（Keratinazation）是不断地形成角质层的来源，最后，角质细胞从角质层剥落出。
[0004] 人随着年龄的增长，这种皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）和过渡扩增细胞（Transit Amplifying Cells，TA cells）的增殖能力将降低。一旦形成角质细胞的能力降低，将出现皮肤再生能力减退、皮肤弹性降低等老化现象加剧的结果（Fuchs E. Nature, 2007 Feb 22；445(7130)：834~42）。
发明内容
[0005] 发明要解决的课题
[0006] 本发明的一个实施例的目的是提供一种能提高皮肤再生能力或改善皮肤弹性的组合物。
[0007] 本发明的另一个实施例的目的是提供一种可用于提高皮肤再生能力或改善皮肤弹性的化妆品或药学组合物。
[0008] 解决课题的方案
[0009] 为了实现上述目的，依据本发明的组合物含有选自4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍生物作为有效成分。
[0010] 发明效果
[0012] 图1~图4是示出α6整联蛋白（FL1-H）和CD71（FL3-H）分别的表达量的差（荧光强度）的细胞分布图。图2~图4中，虚线图（用绿色示出）示出的是从图1获得的细胞分布图（阴性对照组），用于与图2~图4中使用的各实验组得到的结果进行比较。
[0013] 图5例举性示出了流式细胞仪的测定结果。
[0014] 图6是示出各实验组的FDZ1（Frizzled homolog 1）基因的表达量的图。
具体实施方式
[0015] 本发明涉及可用于提高皮肤再生能力和/或改善皮肤弹性的组合物，其特征在于含有o-二羟基异黄酮衍生物作为有效成分。在一个实施例中，上述o-二羟基异黄酮衍生物例如优选是选自4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的成分。
[0016] 上述o-二羟基异黄酮衍生物被认为具备通过增殖皮肤角质干细胞，提高皮肤再生能力、改善皮肤弹性的功效。更具体地，皮肤角质干细胞持续分裂能形成过渡扩增细胞（Transit Amplifying Cells，TA cells）。这种过渡扩增细胞能进行十余次以上的分裂，形成皮肤主要细胞之一的角质细胞（Keratinocyte cells），通过分化（differentiation）上升到皮肤表面。因此，皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）的增殖最终起到了再生表皮的作用（Fuchs E. Nature，2007 Feb 22；445（7130）：834~42）。
[0017] 在一个实施例中，上述4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮及3’,4’,7-三羟基异黄酮可分别如以下通式1~3表示。
[0018] 【化1】
[0019]
[0020] 【化2】
[0021]
[0022] 【化3】 。
[0023] 作为依据本发明的o-二羟基异黄酮衍生物的4’,6,7-三羟基异黄酮、4’,7,8-三羟基异黄酮及3’,4’,7-三羟基异黄酮可利用本行业已知的公知方法制造。上述o-二羟基异黄酮衍生物例如可由大豆苷元（daidzein）转换而制得，方法也不仅限于此。
[0024] 在一个实施例中，以组合物全体重量为基准时上述o-二羟基异黄酮衍生物的含量优选是0.001~30重量%。上述衍生物的含量未达0.001重量%时，无法充分获得通过皮肤角质干细胞增殖实现的皮肤再生及弹性改善的效果；一旦超过30重量%，由于效果没有大幅度增加而导致效率较低，也出现了剂型稳定性方面的问题。
[0025] 此外，同时确定针对皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）与过渡扩增细胞（Transit Amplifying Cells，TA cells）的标识物（蛋白质）。结果是确认CD71和α6整联蛋白（alpha 6 integrin）作为标识物。
[0026] CD71蛋白质（或Transferrin受体）是存在于细胞膜的蛋白质，可与能结合附着细胞血流流动的铁分的转铁蛋白（transferrin）蛋白质相互作用，以受体为媒介使转铁蛋白蛋白质发生凹陷（receptor mediated transferrin endocytosis），经此过程起到将铁分供给至细胞内的作用。由于铁分通常具有毒性，因而必须借助CD71蛋白质的表达量等来充分调节细胞内铁分的量。
[0027] 已知α6整联蛋白（alpha 6 integrin）为另一种标识物，而在不表达上述标识物蛋白质的基因敲除小鼠（Knockout mice）中，其出现了严重的皮肤水泡，出生后立即死亡。α6整联蛋白（alpha 6 integrin）在皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）中，主要处于与β4整联蛋白（β4 integrin）相结合的状态，是称为半桥粒（hemidesmosome）的细胞结构复合体的重要要素。已知α6整联蛋白对细胞的相互转达（cellular communication）、细胞移动、增殖以及分化等各种领域的细胞机能具有一定影响。
[0028] 通常，皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）与过渡扩增细胞（Transit Amplifying Cells，TA cells）在皮肤形成的初级阶段发挥了重要的作用。皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）的特征是α6整联蛋白（alpha 6 integrin）的表达很强，CD71蛋白质（或Transferrin受体）的表达很弱（Li A, Kaur P. Methods Mol Biol 2005; 289: 87~96）。此外，过渡扩增细胞（Transit Amplifying Cells，TA cells）的特征是α6整联蛋白（alpha 6 integrin和CD71蛋白质（或Transferrin受体）均示出较强表达。
[0029] 此外，虽然FZD1（Frizzled homolog 1）也已知可作为皮肤角质干细胞的标识物，但是，此类蛋白质在这种细胞中具有何种机能尚未明确。
[0030] 在本发明的实验例等中，通过测定上述α6整联蛋白（alpha 6 integrin）、CD71蛋白质以及FZD1（Frizzled homolog 1）基因等的表达水平，确认了o-二羟基异黄酮的特定衍生物对皮肤角质干细胞具有增殖功效。
[0031] 此外，本发明提供了一种含有o-二羟基异黄酮衍生物的皮肤外用剂组合物。在一个实施例中，提供了一种含有o-二羟基异黄酮衍生物的可用于提高皮肤再生能力和/或改善皮肤弹性的化妆品组合物及药学组合物。
[0032] 依据本发明的皮肤外用剂组合物可以剂型化为油性或水性媒介的溶液、悬浮液或乳化液的形态，或使用前用无菌、除过热源的水溶解后再使用的干燥粉末的形态。油包水型乳化液可以用橄榄油等植物油或液状石蜡等矿物油作为油相，大豆磷脂等天然磷脂、以及去水山梨醇单油酸酯等来自无水己糖醇与脂肪酸的酯的成分、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯等无水己糖醇与来自脂肪酸的部分酯化环氧乙烷缩合的化合物作为乳化剂，乳化活性成分而制得。
[0033] 当本发明的组合物剂型化为化妆品形态时，可用于通过提高皮肤再生能力以及改善皮肤弹性等防止老化的目的。上述化妆品的剂型没有特别限定，可以是例如柔肤水、收敛水、营养水、按摩膏、眼霜、营养霜、洁面乳、卸妆泡沫、洁面水、香粉、精华、面膜、凝胶或皮肤粘着类化妆品的剂型，也可以是乳液、软膏、凝胶、乳霜、贴或喷雾这种经皮给予型的剂型。此外，在各种剂型中，本行业人员可根据其余化妆品组合物的种类或使用目的等毫无困难且适宜地选择其他成分配合使用。
[0034] 本发明还提供了包含上述组合物的药学组合物。依据本发明的药学组合物可以是可用于提高皮肤再生能力和/或改善皮肤弹性的组合物。更具体地，上述药学组合物具有通过增殖皮肤角质干细胞而提高皮肤的再生能力、改善皮肤弹性的功效。
[0036] 上述经口给药的剂型可举出锭剂、丸剂、颗粒剂、软·硬胶囊剂、散剂、细粒剂、粉剂、乳浊剂、糖浆剂、丹剂等。此外，上述非经口给药的剂型可举出注射剂、点滴剂、软膏、洗剂、喷雾、悬浮剂、乳剂、栓剂等。为了使本发明的有效成分剂型化，可适当地使用表面活性剂、赋形剂、着色剂、香辛料、储存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、其他常用的辅料。
[0037] 依据本发明的上述药学组合物可以经口、不经口、直肠、局部、经皮、静脉内、筋肉内、腹腔内、皮下等方式进行给药。
[0038] 此外，上述活性成分的给药量可根据接受治疗的对象的年龄、性别、体重、治疗的特定疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、给药方式以及处方人员的判断而不同。基于这些因素的给药量的确定是本行业人员技能水平内的。常规给药量是0.001mg/kg/日~2000 mg/kg/日，更具体地，可以0.5 mg/kg/日~1500 mg/kg/日。
[0039] 以下将通过实施例及实验例等更详细地描述本发明，但本发明的范围并不受到这些内容的限定。
[0040] 【制造例】大豆提取物的制造
[0041] 向大豆2kg中加入己烷6L，常温下搅拌提取3次以脱脂。随后，向脱脂大豆1kg中加入80%甲醇4L回流提取3次，15℃下浸渍1日。接着，通过滤布过滤及离心分离，分离残渣和滤液，减压浓缩分离出的滤液。将得到的提取物用水悬浮后，用乙醚1L提取5次除去色素，用1-丁醇500ml提取水层3次。减压浓缩1-丁醇层，得到1-丁醇提取物，将其溶于少量甲醇后，再加入大量乙酸乙酯。干燥加入乙酸乙酯后生成的沉淀物，得到大豆提取物300g。
[0042] 【实 施 例 1】利 用 大 豆 提 取 物 制 造 4',6,7-三 羟 基 异 黄 酮（4',6,7-trihydroxyisoflavone）
[0043] 将上述制造例1获得的大豆提取物10g溶于100ml离子水中，121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的黑曲霉（Aspergillus niger）KCCM 11885。37℃下培养7天后，用薄层色谱图确认基质的消除率，待基质完全消失后结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到4',6,7-三羟基异黄酮0.23g。
[0044] 【实施例2】利用大豆苷（daidzin）制造4',6,7-三羟基异黄酮
[0045] 在100ml离子水中溶解大豆苷5g（Sigma Cat. No.D7802），121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的黑曲霉（Aspergillus niger）KCCM 11885。37℃下培养7天后，用薄层色谱图确认基质的消除率，待基质完全消失后结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到4',6,7-三羟基异黄酮0.34g。
[0046] 【实施例3】利用大豆苷元（daidzein）制造4',6,7-三羟基异黄酮
[0047] 在100ml离子水中溶解大豆苷元3g（Sigma Cat. No.D7802），121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的黑曲霉（Aspergillus niger）KCCM 11885。接着在37℃下培养7天后，结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，对沉淀物用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到4',6,7-三羟基异黄酮0.45g。
[0048] 【实 施 例 4】 利 用 大 豆 提 取 物 制 造 3',4',7- 三 羟 基 异 黄 酮（3',4',7-trihydroxyisoflavone）
[0049] 将上述制造例1获得的大豆提取物10g溶于100ml离子水中，121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的枯草杆菌（Bacillus subtilis）KCCM 11732。30℃下培养7天后，用薄层色谱图确认基质的消除率，待基质完全消失后结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，对收沉淀物用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到3',4',7-三羟基异黄酮0.23g。
[0050] 【实施例5】利用大豆苷（daidzin）制造3',4',7-三羟基异黄酮
[0051] 在100ml离子水中溶解大豆苷5g（Sigma Cat. No.30408），121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的枯草杆菌（Bacillus subtilis）KCCM 11732。37℃下培养7天后，用薄层色谱图确认基质的消除率，待基质完全消失后结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，对收沉淀物用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到3',4',7-三羟基异黄酮0.44g。
[0052] 【实施例6】利用大豆苷元（daidzein）制造3',4',7-三羟基异黄酮
[0053] 在100ml离子水中溶解大豆苷元3g，121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的枯草杆菌（Bacillus subtilis）KCCM 11732。37℃下培养7天后，结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，对沉淀物用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到3',4',7-三羟基异黄酮
0.45g。
0.45g。
[0054] 【实 施 例 7】 利 用 大 豆 提 取 物 制 造 4',7,8- 三 羟 基 异 黄 酮（4',7,8-trihydroxyisoflavone）
[0055] 将上述制造例1获得的大豆提取物10g溶于100ml离子水中，121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的枯草杆菌（Bacillus subtilis）KCCM 11732。30℃下培养7天后，用薄层色谱图确认基质的消除率，待基质完全消失后结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm进行离心分离，回收沉淀物，对沉淀物用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到4',7,8-三羟基异黄酮0.16g。
[0056] 【实施例8】利用大豆苷（daidzin）制造4',7,8-三羟基异黄酮
[0057] 在100ml离子水中溶解大豆苷5g，121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的枯草杆菌（Bacillus subtilis）KCCM 11732。37℃下培养7天后，用薄层色谱图确认基质的消除率，待基质完全消失后结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，对沉淀物用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到4',7,8-三羟基异黄酮0.55g。
[0058] 【实施例9】利用大豆苷元（daidzein）制造4',7,8-三羟基异黄酮
[0059] 在100ml离子水中溶解大豆苷3g，121℃下灭菌30分钟后，冷却至30℃。冷却后，按照液体量比5～10%接种预先培养的枯草杆菌（Bacillus subtilis）KCCM 11732。37℃下培养7天后，结束反应。将培养液按5,000～10,000rpm离心分离，回收沉淀物，对沉淀物用蒸馏水洗涤3次，再次离心分离，得到沉淀物。向沉淀物中加入乙醇（200ml）搅拌（3次），将沉淀出的盐滤出并弃去后，减压浓缩经过滤的滤液，得到粗产物。用二氧化硅凝胶柱色谱图（氯仿:甲醇＝8：1～4：1）分离得到的粗产物，得到4',7,8-三羟基异黄酮0.42g。
[0060] 【实验例1】用流式细胞术解析测定角质细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）[0061] 从ロンザ社（Lonza，Cat. No. C2507A）购入人皮肤角质细胞（Human neonatal2
keratinocyte cells），在25cm T型烧瓶中进行继代培养，培养条件是：CO2培养箱（CO2 Incubator）、37℃、5％CO2。在细胞2～3代的继代培养（passage）后进行实验。
keratinocyte cells），在25cm T型烧瓶中进行继代培养，培养条件是：CO2培养箱（CO2 Incubator）、37℃、5％CO2。在细胞2～3代的继代培养（passage）后进行实验。
[0062] [P12 L倒数3]根据ロンザ社（Lonza、Inc. Walkersville，MD，USA）的方法在500ml KBM-2（Clonetics CC-3103）培养基中利用KGM-2 Bullet Kit、牛脑下垂体提取物（Bovine pituitary extract）（2ml）、人表皮成长因子（0.5ml）、胰岛素（0.5ml）、氢化可的松（0.5ml）、转铁蛋白（0.5ml）、肾上腺素（0.5ml）、庆大霉素硫酸盐＋两性霉素-B（GA-1000，0.5ml）制作细胞培养液。
[0063] 继代培养细胞后，大约2日后，如果见到的是50%左右的细胞密度（confluency），则使其血清饥饿（serum starvation），24小时后，分别用10μM的浓度处理以上分别制得的4',7,8-三羟基异黄酮、4',6,7-三羟基异黄酮或3',4',7-三羟基异黄酮3种24小2
时。用0.25％胰酶（Trypsin-EDTA）分离25cm T型烧瓶中的人皮肤角质细胞，1,500rpm处理5分钟，将细胞沉淀，去掉培养液后，将细胞悬浮在3ml封闭缓冲液（Blocking Buffer）、
2％牛血清蛋白质（Bovine Serum Albumin（BSA）KGM-2）中。4℃下使细胞（约106个细胞）适应15分钟后，分别加入附着了FITC（Fluorescein isothiocyanate）的α6整联蛋白（alpha6 integrin）抗体（BD Pharmingen，CA，US，Cat. No.555735）和附着了PE-Cy（phycoerythrin-cyanine）的CD71抗体（BD Pharmingen，CA，US，Cat. No.551143）各10μl（1μg/μl），4℃下反应45分钟。另一方面，在作为阴性对照组使用的细胞中也分别加入FITC Rat IgG2a，K Isotype（Cat. No.555843）和PE-Cy5、小鼠IgG1 K Isotype（Cat. No.555750）各10μl（1μg/μl），4℃下反应45分钟。
时。用0.25％胰酶（Trypsin-EDTA）分离25cm T型烧瓶中的人皮肤角质细胞，1,500rpm处理5分钟，将细胞沉淀，去掉培养液后，将细胞悬浮在3ml封闭缓冲液（Blocking Buffer）、
2％牛血清蛋白质（Bovine Serum Albumin（BSA）KGM-2）中。4℃下使细胞（约106个细胞）适应15分钟后，分别加入附着了FITC（Fluorescein isothiocyanate）的α6整联蛋白（alpha6 integrin）抗体（BD Pharmingen，CA，US，Cat. No.555735）和附着了PE-Cy（phycoerythrin-cyanine）的CD71抗体（BD Pharmingen，CA，US，Cat. No.551143）各10μl（1μg/μl），4℃下反应45分钟。另一方面，在作为阴性对照组使用的细胞中也分别加入FITC Rat IgG2a，K Isotype（Cat. No.555843）和PE-Cy5、小鼠IgG1 K Isotype（Cat. No.555750）各10μl（1μg/μl），4℃下反应45分钟。
[0064] 反应结束后，用3ml洗涤缓冲液（Washing Buffer：2％牛血清蛋白质（BSA）KGM-2）洗涤2次后，悬浮细胞。其后，用流式细胞仪（FACS，BD Bioscience，San Jose，CA，US）分析。更具体地，将上述反应得到的细胞装入流式细胞仪中，在电脑成像（FACS Imaging Program）中设定象限（Li A，Kaur P. Methods Mol Biol 2005；289:87-96），以CD71蛋白质表达弱、且α6整联蛋白（alpha 6 integrin）表达强为特征的皮肤角质干细胞数目的变化，发生分离。例如，图5示出了流式细胞仪的测定结果。参看图5，以右上的1象限为基准，按反时针方向为2、3、4象限。1象限是CD71和α6整联蛋白出现强表达的领域，2象限是CD71强表达、α6整联蛋白弱表达的领域，3象限是CD71和α6整联蛋白均为弱表达的领域，而4象限为CD71为弱表达、α6整联蛋白强表达的领域。
[0065] 下表1中整理了具体的流式细胞仪的测定结果。
[0066] 【表1】
[0067]
[0068] 此外，下表2示出的是分别对10μM阴性对照组（大豆苷元；Daidzein）和10μM4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮、及び10μM3’,4’,7-三羟基异黄酮进行处理后，CD71表达弱、α6整联蛋白表达强的领域，即符合4象限的角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）的数目与阴性对照组的对比%的结果。
[0069] 【表2】
[0070]
[0071] 从表2的结果可以确认，分别对10μM的4’,6,7-三羟基异黄酮、10μM的3’,4’,7-三羟基异黄酮、10μM的4’,7,8-三羟基异黄酮进行处理时，与阴性对照组（大豆苷元、Daidzein）相比，CD71蛋白质弱表达、α6整联蛋白（alpha 6 integrin）强表达的皮肤角质干细胞（Keratinocyte Stem Cells，KSC）的数目分别增加了25.8％、66.2％、140％。
[0072] 【实验例2】测定o-二羟基异黄酮衍生物对皮肤干细胞FZD1（Frizzled homolog1）基因表达水平的效果
[0073] 根据与实施例1记载的方法相同的方法培养人皮肤角质细胞（Human neonatal Keratinocyte cells）后，分离角质干细胞，经血清饥饿后（Serum Starvation），经24小时，分别用10μM浓度的、4’,6,7-三羟基异黄酮、3’,4’,7-三羟基异黄酮及4’,7,8-三羟基异黄酮处理24小时。随后，用TRIZOL试剂（Trizol reagent, Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离细胞内的RNA。将分离出的RNA用QIAGEN公司的RNA试剂（QIAGEN RNeasy kt，QIAGEN，Valencia，CA）精制后，用Agilent公司的生化分析仪2100機器（Agilent2100 Bioanalyzer，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）确定RNA的品质（quality）。用Invitrogen公司的逆转录试剂（Superscript Reverse Transcriptase（RT）Kit，Invitrogen，Carlsbad，CA），从上述RNA合成cDNA，通过实时逆转录聚合酶连锁反应（real time-reverse transcription polymerase chain reaction，Q-RT-PCR）对其进行定量分析。利用AppliedBiosystems公司的TaqMan基因表达系统（TaqMan®gene expression assay Kit，AppliedBiosystems，FosterCity，CA）（Frizzled homolog 1（FZD1）-HS00268943＿s1（TagMan primer catalog name））确认皮肤角质干细胞中各基因的表达模式的变化的表达量。下图6示出了实验结果。
[0074] 参照图6可以确认，与阴性对照组相比，分别对10μM的4’,6,7-三羟基异黄酮10μM的3’,4’,7-三羟基异黄酮、及10μM的的4’,7,8-三羟基异黄酮进行处理后，FZD1（Frizzled homolog 1）的表达分别增加了约1.9倍、1.4倍、2.6倍的程度。
[0075] 虽然下面示出了上述组合物的剂型例，但本发明并不限于此，而是单纯地出于详细说明的目的。
[0076] 【剂型例1】营养水
[0077] 根据下表3记载的组成，按照常规方法制造营养水。
[0078] 【表3】
[0079]
[0080] 【剂型例2】营养霜
[0081] 根据下表4记载的组成，按照常规方法制造营养霜。
[0082] 【表4】
[0083]
[0084] 【剂型例3】按摩膏
[0085] 根据下表5记载的组成，按照常规方法制造按摩膏。
[0086] 【表5】
[0087]
[0088] 【剂型例4】面膜
[0089] 根据下表6记载的组成，按照常规方法制造面膜。
[0090] 【表6】
[0091]
[0092] 【剂型例5】软膏
[0093] 根据下表7记载的组成，按照常规方法制造软膏。
[0094] 【表7】
[0095]
[0096] 只要具备本领域所属领域常规知识的人员，基于上述内容，均可能在本发明范围内进行各种应用及变形。
[0097] 工业实用性
[0098] 依据本发明的组合物由于可诱导皮肤角质干细胞的增殖，因此具有提高皮肤再生能力和/或改善皮肤弹性的效果，借此可多样化地灵活运用于化妆品或医药领域。
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