[0001] 本
申请是中国
发明专利申请(申请日：2011年10月14日；申请号：201180049813.4(
国际申请号：PCT/US2011/056457)；
发明名称：抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法)的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明涉及用于抑制细胞增殖和
治疗一些癌症的药物组合物和方法。
[0004] 促使癌细胞增殖的特定基因损伤(例如引起某些酪
氨酸激酶激活的那些损伤)使一些癌症对于抑制激酶的治疗剂高度敏感。然而，这类制剂的疗效往往受限于靶激酶结构域的突变的发展，该突变通过减少
抑制剂结合来赋予抗性。
[0005] 例如，ABL激酶抑制剂伊
马替尼已经彻底改变了慢性粒细胞白血病(CML)患者的治疗，所述患者的
疾病由激活的BCR-ABL融合癌蛋白所导致。然而，随着时间的推移，ABL激酶结构域的突变的发展在相当比例的患者中赋予抗性。第二代ABL抑制剂达沙替尼和尼罗替尼由于是更有效的ABL抑制剂，因而表现出卓越的疗效，并能够克服大部分伊马替尼所表现出的基于突变的抗性。
[0006] 已确认出更多的表皮生长因子受体(EGFR)的近期基因损伤，显示出对第一代抑制剂的敏感性和对基于突变的抗性的易感性的相似模式。EGFR的激活突变已在10％-20％的NSCLC患者中确认，并且EGFR激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼在这些患者中已证明具有活性。
[0007] EGFR的激活突变可表现为激酶结构域的小缺失或点突变的形式，已在科学文献中详尽地分类和描述。参见例如，Sharma,Nat.Rev.Cancer 7:169(2007)(以氨基酸747的框内缺失为特征的外显子19的突变，占突变的45％，外显子21的突变导致L858R置换，占突变的40％-45％，余下的10％的突变涉及外显子18和20)；Sordella等人,Science305:1163(2004)；和Mulloy等人,Cancer Res.67:2325(2007)。
[0008] 然而，吉非替尼和厄洛替尼的临床疗效最终受限于抗性的发展，例如EGFR激酶结构域
门卫残基(gatekeeper residue)(T790M)的突变，其发生在50％的患者中。
[0009] 明确需要抑制具有EGFR突变(如T790M)的细胞的新方法，所述突变对当前的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(“TKI”)产品赋予抗性。治疗与这种突变相关的癌症的新疗法将具有深远的利益。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明的特征在于一类具有下式(I)结构的化合物：
[0012]
[0013] 其中
[0014] Rd为H、C1-4烷基、C1-4烷
氧基或卤素；且Re为H或NH2；或Rd和Re与它们所连接的嘧啶环
原子一起，形成含1、2或3个独立地选自N、S和O的杂原子的5-或6-元环，其中所h述5-或6-元环被R取代；
[0015] Rh为H、C1-4烷基或卤素；
[0016] Ra2为H、C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基或C3-6环烷基氧基；
[0017] Rg为-P(O)(R3A)(R3B)、-S(O)N(R3C)(R3D)、-S(O)2R3E、-OC(O)N(R3F)(R3G)、-NR3HC(O)3I g2
OR 、含1、2、3或4个N原子的5或6元杂环，或与R 结合形成5-至7-元杂环，其中每个
3A 3B 3C 3D 3E 3F 3G 3H 3I
R 、R 、R 、R 、R 、R 、R 、R 和R 独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔
3A 3B 3C 3D 3F 3G
基和杂烷基，或R 和R ，或R 和R ，或R 和R ，与它们所连接的原子一起，结合形成未取代的或取代的5-或6-元杂环；
[0018] Rg2为H、F、C1-4烷基，或Rg2和Rg与它们所连接的原子一起形成含1-3个独立地选自P、N、O和S的杂原子的5-至7-元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；
[0019] Rg1为H、F或者含1或2个N原子的5或6元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；
[0020] Rb2为H、F或者含1、2或3个N或O原子的5或6元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；
[0021] Rb4为H、F、C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基或C3-6环烷 基 氧基、-OC(O)N(R 5A)5B 5C 5D
(R )、-NR C(O)OR ；含1、2或3个N或O原子的5或6元杂环，所述杂环为未取代的或取b4 a1
代的，或R 和R 与它们所连接的原子一起形成含1、2或3个N或O原子的6元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；
[0022] 每个R5A、R5B、R5C和R5D独立地选自H、烷基、烯基、炔基和杂烷基，或R5A和R5B与它们所连接的原子一起，结合形成5-或6-元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；
[0023] Ra1与Rb4结合形成6元杂环，或者Ra1为H、卤素、-CN、-NO2、-R1、-OR2、-O-NR1R2、-NR1R2 1 1 2 1 2 2 2 1 2 2 1 2
、-NR-NRR、-NR-OR、-C(O)YR、-OC(O)YR、-NRC(O)YR、-SC(O)YR、-NRC(＝S)YR、-OC(＝
2 2 1 2 1 2 1 2 2
S)YR、-C(＝S)YR、-YC(＝NR)YR、-YC(＝N-OR)YR、-YC(＝N-NRR)YR、-YP(＝O)
1 2 1 2 2 1 2 1 1 2
(YR)(YR)、-NRSO2R、-S(O)rR、-SO2NRR、-NRSO2NRR或
[0024]1
[0025] 每个Y独立地为键、-O-、-S-或-NR-；
[0026] 每次出现时，R1和R2独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂烷基、杂环基和杂芳基；
[0027] 每个X1和X2独立地选自CH和N；和
[0028] R4选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂烷基、杂环基和杂芳基。4
在具体的实施方案中，R部分携带一个或多个如下面进一步讨论的取代基。
[0029] 在具体的实施方案中，Rd还可以是环丙基。
[0030] 当前特别感兴趣的用于实施本发明方法的化合物的一个亚类为式(I)的那些化a2 g 3A 3B合物，其中R 为C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基或C3-6环烷基氧基，且R 为-P(O)(R )(R )、-S(O)
3C 3D 3E
N(R )(R )、-S(O)2R ，以及这类化合物的药学上可接受的盐。
[0031] 式(I)的化合物、它的亚类和它的各种实施方案(如下面进一步详细讨论)为EGFR突变株的有效抑制剂，包括(a)带有活性突变如L858R或delE746_A750、(b)带有赋予抗性的突变如T790M和(c)带有两种类型的突变的EGFR蛋白。这是重要的，因为虽然以EGFR活性突变为特征的癌症可以使用厄洛替尼或吉非替尼治疗，但如果EGFR具有抗性突变，不论是单独的或与(另外的)激活突变结合，则情况却不同。现有的EGFR抑制剂如厄洛替尼和吉非替尼无法有效地抑制耐药的EGFR突变株或与它们相关的癌症，使得病人极度缺乏治疗选择。因为本文所公开的化合物可抑制以前的TKI不能抑制的类型，故有兴趣将它们作为新的治疗选择。
[0032] 此外，特别有意义的是，与野生型EGFR相比，式(I)化合物可优先抑制突变型EGFR，特别是当该优先性为至少10倍，甚至100倍，并且在500倍或更多倍时最有意义。这一优先抑制可用常规方法容易地测定，如用于测定化合物对野生型和突变型EGFR的相对IC50值的生化方法，其通过测量用各种EGFR形式转化的细胞的相对生长抑制效果，等等。相比于野生型EGFR，对突变型EGFR的优先抑制有助于降低
风险。
[0033] 因此，本发明提供了通过给予受试者
治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐在所述受试者中治疗EGFR导致的癌症的方法。所述方法对于以下受试者尤其重要，其具有厄洛替尼或吉非替尼难治的癌症，或具有以存在T790M EGFR突变或其他与厄洛替尼或吉非替尼抵抗有关的突变(单独或与激活突变相结合)为特征的癌症。
[0034] 本发明还提供了在受试者中治疗EGFR导致的癌症的方法，包括以下步骤：(a)提供具有特征在于存在表皮生长因子受体激酶(EGFR)突变的癌症的受试者，和(b)给予所述受试者治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。例如，EGFR导致的癌症可以以存在一个或多个突变为特征，选自：(i)L858R、(ii)T790M、(iii)L858R和T790M二者、(iv)delE746_A750、(v)elE746_A750和T790M二者，以及本文所述的任何其他EGFR突变。
[0035] 在上述方法中，EGFR导致的癌症可以是非小细胞
肺癌(NSCLS)；胶质母细胞瘤；胰腺癌；头颈癌(例如，鳞状细胞癌)；
乳腺癌；结肠直肠癌；上皮癌；卵巢癌；
前列腺癌；腺癌，或任何EGFR导致的癌症。
[0036] 在一个相关的方面中，本发明的特征在于抑制表达EGFR突变株的细胞增殖的方法，所述方法包括：使式(I)化合物或其药学上可接受的盐以足以抑制增殖的量
接触所述细胞。例如，所述细胞可以以存在一个或多个EGFR突变为特征，选自：(i)L858R、(ii)T790M、(iii)L858R和T790M二者、(iv)delE746_A750、(v)elE746_A750和T790M二者，以及本文所述的任何其他EGFR突变。在具体的实施方案中，所述细胞为癌症细胞(例如，来源于非小细胞肺癌(NSCLS)；胶质母细胞瘤；胰腺癌；头颈癌(例如，鳞状细胞癌)；乳腺癌；结肠直肠癌；上皮癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌，或本文所述的任何其他表达EGFR的癌症的细胞)。
[0037] 本发明的特征还在于通过给予受试者足以治疗癌症的量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐在受试者中治疗第一激酶(选自厄洛替尼、吉非替尼及其药学上可接受的盐)抑制剂难治的EGFR导致的癌症的方法。
[0038] 在上述任何抑制细胞增殖或治疗具有EGFR导致的癌症的患者的方法中，式(I)化合物用下式描述：
[0039]
[0040] 在式(I)中，Rd为H、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤素；且Re为H或NH2；或Rd和Re与它们所连接的嘧啶环原子一起，形成含1、2或3个独立地选自N、S和O的杂原子的5-或6-元环，其中所述5-或6-元环被Rh取代；Rh为H、C1-4烷基或卤素；Ra2为H、C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基或C3-6环烷基氧基；Rg为-P(O)(R3A)(R3B)、-S(O)N(R3C)(R3D)、-S(O)2R3E、-OC(O)N(R3F)(R3G)、-NR3HC(O)OR3I、含1、2、3或4个N原子的5或6元杂环，或与Rg2结合形成5-至
7-元杂环；每个R3A、R3B、R3C、R3D、R3E、R3F、R3G、R3H和R3I独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基和杂烷基，或者R3A和R3B，或R3C和R3D，或R3F和R3G，与它们所连接的原子一起，结合形成未取代的或取代的5-或6-元杂环；Rg2为H、F、C1-4烷基，或者Rg2和Rg与它们所连接的原子一起形成含1-3个独立地选自P、N、O和S的杂原子的5-至7-元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；Rg1为H、F或者含1或2个N原子的5或6元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；Rb2为H、F，或者为含1、2或3个N或O原子的5或6元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；Rb4为H、F、C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基、或C3-6环烷基氧基、-OC(O)N(R5A)(R5B)、或-NR5CC(O)OR5D；含1、2或3个N或O原子的5或6元杂环，所述杂环为未取代的或取代的，或者Rb4和Ra1与它们所连接的原子一起形成含1、2或3个N或O原子的6元杂环，所述杂环为未取代的或取代的；每个R5A、R5B、R5C和R5D独立地选自H、烷基、烯基、炔基和杂烷基，或R5A和R5B与它们所连接的原子一起，结合形成未取代的或取代的5-或6-元杂环；Ra1与Rb4结合形成6元杂环，或Ra1为H、卤素、-CN、-NO2、-R1、-OR2、-O-NR1R2、-NR1R2、-NR1-NR1R2、-NR1-OR2、-C(O)YR2、-OC(O)YR2、-NR1C(O)YR2、-SC(O)YR2、-NR1C(＝S)YR2、-OC(＝S)YR2、-C(＝S)YR2、-YC(＝NR1)YR2、-YC(＝N-OR1)YR2、-YC(＝N-NR1R2)YR2、-YP(＝O)(YR1)(YR2)、-NR1SO2R2、-S(O)rR2、-SO2NR1R2、-NR1SO2NR1R2或
[0041]
[0042] 每个Y独立地为键、-O-、-S-或-NR1-；每次出现时，R1和R2独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂烷基、杂环基和杂芳基；每个X1和X2独立地选4
自CH和N；且R选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂烷基、杂环基和杂芳基。
[0043] 在式(I)中，对于选自C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基、C3-6环烷基氧基、烷基、烯基、炔a2 d h 1 2 4 3A基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂烷基、杂环基和杂芳基的任何R 、R、R、R、R、R、R 、
3B 3C 3D 3E 3F 3G 3H 3I
R 、R 、R 、R 、R 、R 、R 和R ，所述取代基为取代的或未取代的。
[0044] 在具体的实施方案中，用于实施本发明方法的式(I)化合物进一步用式(IIa)或式(IIb)描述：
[0045]a1 a2 b2 b4 g g1 g2 d h
[0046] 在式(IIa)和(IIb)中，R ；R ；R ；R ；R ；R ；R ；R ；和R 如上文所定义。
[0047] 在具体的实施方案中，用于实施本发明方法的化合物为式(I)、(IIa)或(IIb)化g1 g2 b2 b4合物，其中R 、R 、R 和R 为H或F。
d
[0048] 在另一个实施方案中，所使用的化合物为式(IIa)化合物，其中R为Cl、F或CF3。a1
[0049] 在另一个实施方案中，所使用的化合物为式(I)、(IIa)或(IIb)化合物，其中Ra1 1 2 1 2 2 1 2为-OMe。在其他实施方案中，R 为YP(＝O)(YR )(YR)、-NRSO2R、-S(O)rR、-SO2NRR
1 1 2
或-NRSO2NRR。
a2
[0050] 在另一个实施方案中，所使用的化合物为式(I)、(IIa)或(IIb)化合物，其中Ra2为C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基或C3-6环烷基氧基；并且在其具体的实施方案中，R 为甲氧基。
g
[0051] 在另一个实施方案中，所述化合物为式(I)、(IIa)或(IIb)化合物，且R为-P(O)3A 3B 3E a2
(R )(R )或-S(O)2R 。在那些化合物的一个实施方案中，R 为C1-6烷氧基、C3-6烯基氧基或C3-6环烷基氧基。
a1
[0052] 在另一个实施方案中，所述化合物为式(I)、(IIa)或(IIb)化合物，且R 为含一个或两个选自N和O的杂原子的5-或6-元杂环，所述环为未取代的或被烷基基团取代的。
[0053] 在具体的实施方案中，所述方法使用可进一步用式(III)描述的式(I)化合物：
[0054]
[0055] 在式(III)中，Ra2为烷氧基；Rg为-P(O)(R3A)(R3B)、-S(O)N(R3C)(R3D)或-S(O)2R3E；3A 3B 3C 3D 3E 3A 3B 3C 3D
每个R 、R 、R 、R 和R 独立地为H或C1-7烷基，或R 和R ，或R 和R ，与它们所连接d
的原子一起，结合形成未取代的或取代的5-或6-元杂环；R为H、C1-4烷基、C1-4烷氧基或e d e
卤素；且R为H或NH2；或R 和R 与它们所连接的嘧啶环原子一起，形成含一个或两个独立h h
地选自N、S或O的杂原子的5-或6-元环，并且所述5-或6-元环被R取代；R 为H、C1-4a1 1 2 1 2 1 2 1 1 2 1 2
烷基或卤素；R 为卤素、-CN、-NO2、-R、-OR、-O-NRR、-NRR、-NR-NRR、-NR-OR、-C(O)
2 2 1 2 2 1 2 2 2
YR、-OC(O)YR、-NRC(O)YR、-SC(O)YR、-NRC(＝S)YR、-OC(＝S)YR、-C(＝S)YR、-YC(＝
1 2 1 2 1 2 2 1 2 1 2
NR)YR、-YC(＝N-OR)YR、-YC(＝N-NRR)YR、-YP(＝O)(YR)(YR)、-NRSO2R、-S(O)
2 1 2 1 1 2
rR、-SO2NRR、-NRSO2NRR或
[0056]
[0057] 每个Y独立地为键、-O-、-S-或-NR1-；每次出现时，R1和R2独立地为H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂烷基、杂环基或杂芳基；每个X1和X2独立地为CH或N；且R4为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂烷基、杂环基或杂芳基。
[0058] 具体的实施方案使用可进一步用式(IVa)或式(IVb)描述的式(III)化合物：
[0059]
[0060] 在式(IVa)和(IVb)中，Ra2；Rg；Rd；Rh；和Ra1如上文中式(III)所定义。
[0061] 在具体的实施方案中，所使用的化合物为任一式(III)、(IVa)和(IVb)的化合物，a2并且R 为甲氧基、乙氧基或丙氧基基团。
[0062] 在具体的实施方案中，所使用的化合物为式(III)和(IVa)的化合物，并且Rd选自Cl、F、CF3和环丙基；
[0063] 在其他实施方案中，式(III)化合物用任一式(Va)-(Vd)描述：
[0064]
[0065] 在式(Va)-(Vd)中，Rg；Rd；Rh；和Ra1如上文中式(III)所定义。
[0066] 在具体的实施方案中，所使用的化合物为任一上述式的化合物，并且Rg为-P(O)(CH3)2、-P(O)(CH2CH3)2或-S(O)2(CH(CH3)2)。
[0067] 在具体的实施方案中，任一上述式的化合物具有Ra1部分：
[0068]4 a1
[0069] 其中X1、X2和R 如上文中式(III)所定义。例如，R 可选自任一下述基团：
[0070]
[0071] Ra1也可选自带有更多取代或更少取代的基团，如下列其他示例性Ra1选择：
[0072]
[0073] 以及本文中例示了更广泛的Ra1选择的大量其他实例所例示。
[0074] 在具体的实施方案中，式(I)化合物进一步用式(VIa)-(VIf)之一描述：
[0075]
[0076]
[0077] 在式(VIa)-(VIf)中，Ra2为甲氧基、乙氧基或丙氧基基团；Rg为-P(O)(CH3)2、-P(O)T(CH2CH3)2或-S(O)2(CH(CH3)2)；并且，在具体的实施方案中，R为甲基。在式(VIa)-(VIf)T
的其他这类实施方案中，R为H、酰基或C1-C4烷基，例如-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2OH，所述烷基可以是取代的或未取代的。
[0078] 在任一上述式中，所述化合物可以是游离
碱或其药学上可接受的盐的形式。
[0079] 式(I)化合物包括描述于PCT公开号WO2009/143389、WO 2006/021454、WO2006/021457和WO2009/126515中的那些，其中将每篇引入本文作为参考。
[0080] 定义
[0081] 对本发明方法的临床响应可根据实体瘤(RECIST)指导方针中的响应评价标准(参见Eur.J.Cancer 45:228(2009))进行分级，其定义癌症患者在治疗过程中改善(“响应”)、保持不变(“稳定”)或恶化(“进展”)的情况。完全响应的特征在于：(i)所有目标病变消失；和(ii)任一病理淋巴结(无论是目标或非目标)在短轴上必须减少到<10mm。部分响应的特征在于：(i)以基线总直径为参考，目标病灶的直径总和至少减少了30％。渐进性疾病的特征在于：(i)以研究中的最小总和为参考(这包括基线总和，如果其在研究中是最小的)，目标病变的直径总和至少增加5％、10％或20％；或(ii)出现一个或多个新的病变。
[0082] 术语“
给药”是指给予
哺乳动物一定剂量的药物组合物的方法，其中所述方法是例如口服、静脉内、腹膜内、动脉内或肌内。优选的给药方法可以有所不同，取决于各种因素，例如，药物组合物的成分、潜在或实际疾病的
位置和疾病的严重程度。虽然式I化合物通常可口服给药，但其他的给药途径在进行本发明的方法时也是适用的。
[0083] “EGFR导致的癌症”是指以改变EGFR核酸分子或多肽的
生物活性的EGFR基因突变(包括本文提到的具体突变)为特征的癌症。EGFR导致的癌症可出现在任何组织，包括脑、血液、结缔组织、肝、口、肌肉、脾、胃、睾丸和气管。EGFR导致的癌症包括非小细胞肺癌(NSCLS)，包括一个或多个鳞状细胞癌、腺癌、腺癌、细支气管肺泡癌(BAC)、局灶侵入性BAC，具有BAC特征的腺癌，以及大细胞癌；神经
肿瘤，如胶质母细胞瘤；胰腺癌；头颈癌症(例如，鳞状细胞癌)；乳腺癌；结肠直肠癌；上皮癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；以及包括EGFR介导的癌症。
[0084] “EGFR突变株”或“突变株”包括EGFR蛋白或EGFR编码序列的氨基酸或核苷酸序列中一个或多个缺失、置换或添加。EGFR突变株还可以包括一个或多个缺失、置换或添加，或其
片段，只要该突变株相对于野生型EGFR保留或增加了酪氨酸激酶活性。在具体的EGFR突变中，激酶或磷
酸化活性相对于野生型EGFR可以增加(例如，至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％)。具体的EGFR突变株如本文所述，其中在相对于人EGFR中氨基酸的位置提供了突变，如NCBI GenBank Reference Sequence:NP_005219.2中提供的序列所述。
[0085] 本文使用的术语“抑制表达EGFR突变株的细胞增殖”是指适度地减缓、停止或逆转表达EGFR的细胞在体外或在体内的生长速率。理想的是，当使用合适的测定细胞生长速率的方法进行测定时(例如，本文所述的细胞生长测定法)，生长速率至少减慢10％、20％、30％、50％或甚至70％。EGFR突变株可以是本文所述的任何EGFR突变株。
[0086] 本文使用的术语“难治的”指的是尽管使用了具体的治疗但仍为渐进性的癌症。所述癌症可以是从初次给药治疗为难治的，或随着时间的推移在响应治疗时发展为难治的。对药物“抵抗”是指根据任何科学有效的比较分析所确定的对该药物的敏感性降低。
[0087] 术语“序列同一性”是指两个或多个核酸序列或者或两个或多个氨基酸序列之间共享同一性，以序列之间的同一性形式表达。序列同一性可以以同一性百分比的方式来测量；百分比越高，序列越相同。当使用标准方法进行对比时，核酸或氨基酸序列的同系物或直系同源物具有相对高程度的序列同一性。用于比较的序列对比方法是本领域熟知的。各种程序(programs)和对比
算法如下所述：Smith and Watermann,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)；Corpet 等 人 ,Nuc.Acid Res.16:10881(1988)；Huang 等 人 ,Computer Appls.in the Biosciences
8:155(1992)；和Pearson等人,Meth.Mol.Biol.24:307(1994)。Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403(1990))提供了详细考虑的序列对比方法和同源性计算。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990))可从几个来源获得，包括National Center for Biological Information (NCBI)
网站，用于连接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。额外的信息可以在NCBI网站上找到。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两个核酸序列，选项可以按如下设置：-i设置为包含要比较的第一个核酸序列的文件；-j设置为包含要比较的第二个核酸序列的文件；-p设置为blastn；-o设置为任何所需的文件名；-q设置为-1；-r设置为2；和所有其他选项保留它们的默认设置。一旦对比，匹配的数目根据计数两个序列中存在的相同的核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定。序列同一性百分比通过所标识序列中设置的序列长度或联接的长度(如源于所标识序列中设置的30、35、40、45、50、
60、70、80、90、100、150、200、250、300、350或400个连续的核苷酸或氨基酸残基)除以匹配数，随后将所得的值乘以100。两个核酸分子密切相关的一个
指征是，这两个分子在严格的条件下相互杂交。严格的条件是序列依赖的，且在不同的环境参数下是不相同的。在严格的条件下杂交至EGFR基因序列的核酸分子通常在上述条件下，基于整个EGFR基因或所述基因的
选定部分(例如，包含本文所述的突变密码子的基因的激酶结构域或片段)杂交至探针。
[0088] 本文使用的术语“治疗”是指为了
预防和/或治疗目的给予药物组合物。“预防疾病”是指预防性处理尚未患病但容易患有特定疾病或处于特定疾病的风险的受试者。“治疗疾病”或用于“治疗性处理”是指向已经患有疾病的受试者给予治疗，以改善或稳定所述受试者的病症。因此，在
权利要求书和实施方案中，治疗是以治疗或预防目的给药于受试者。
[0089] 术语“烷基”是指直链、支链、环状或多环非芳香
烃基，其可以是取代的或未取代的。除非另有说明，“烷基”基团包含1-8个，且优选1-6个
碳原子。低级烷基是指含1-6个碳原子的烷基基团。烷基的实例包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和正庚基。示例性的取代烷基基团包括，但不限于，卤代烷基基团(例如，氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、3-氟丙基)、羟基甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、苄基、取代的苄基和苯乙基。
[0090] 术语“烷氧基”是指烷基的亚类，其中烷基基团如上述定义，且通过氧桥-O-烷基连接所示数量的碳，其中所述烷基基团含有1-8个碳原子并且是取代的或未取代的。示例性的烷氧基基团包括，但不限于，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、正丁氧基、仲戊氧基、-OCF3和-O-环丙基。
[0091] 术语“卤代烷基”是指烷基的亚类，其中烷基基团如上述定义，且烷基的一个或多个氢原子被卤素原子取代。示例性的卤代烷基基团包括，但不限于，三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基等。
[0092] 术语“烯基”是指含一个或多个双键且具有2-8个碳原子的支链或直链烃基。烯基可任选包括单环或多环状环，其中每个环为3-6元。烯基基团可以是取代的或未取代的。烯基基团包括，但不限于，乙烯基、烯丙基、2-环丙基-1-乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基和2-甲基-2-丙烯基。
[0093] 术语“炔基”是指含一个或多个叁键且具有2-8个碳原子的支链或直链烃基。炔基基团可以是取代的或未取代的。炔基包括，但不限于，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基和3-丁炔基。
[0094] 术语“环烷基”是指3-13个碳原子的环状或多环状烃基，其任何碳原子都是饱和的。环烷基基团可以是取代的或未取代的。示例性的环烷基基团包括，但不限于，环丙基、降
冰片基、[2.2.2]二环辛烷和[4.4.0]二环癸烷等，当作为其它烷基基团时可以任选被取代。
[0095] 术语“环烯基”是指含有一个或多个双键的3-13个碳原子，优选5-8个碳原子的环状或多环状烃基。环烯基基团可以是取代的或未取代的。示例性的环烯基基团包括，但不限于，环戊烯基、环己烯基和环辛烯基。
[0096] 术语“环炔基”是指含有一个或多个叁键的5-13个碳原子的环状或多环状烃基。环炔基基团可以是取代的或未取代的。
[0097] 术语“杂烷基”是指具有1-14个碳原子的支链或直链烷基、烯基或炔基基团，还具有1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子。杂烷基包括，但不限于，叔胺、仲胺、醚、硫醚、酰胺、硫酰胺(thioamides)、氨基
甲酸酯、硫代氨基甲酸酯(thiocarbamates)、腙、亚胺、
磷酸二酯(phosphodiesters)、氨基膦酸酯(phosphoramidates)、磺酰胺和二硫化物(disulfides)。杂烷基可任选包括单环、双环或三环状环，其中每个环为3-6元。杂烷基基团可以是取代的或未取代的。杂烷基的实例包括，但不限于，聚醚，如甲氧基甲基和乙氧基乙基。
[0098] 本文使用的“杂环”和“杂环基”是指具有5-14个环原子的非芳香环体系，其中一个或多个环碳，优选1-4个，各自被杂原子如N、O、S或P替换，其可单独使用或在“杂环基-烷基”(杂环基取代的C1-6烷基)、“杂环基-烷氧基”(杂环基取代的C1-6烷氧基)或“杂环氧基-烷基”(杂环氧基取代的C1-6烷基)中作为较大基团的一部分，并且包括芳烷基、芳烷氧基和芳氧基烷基基团。杂环可以是取代的或未取代的并可包含1、2或3个稠合的或非稠合的环体系。理想的是，所述杂环为由2-6个碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子组成的5-至7-元单环或7-至14-元双环杂环，并包括任一上述定义的杂环稠合到苯环上的任何双环基团。示例性的杂环包括，但不限于，3-1H-苯并咪唑-2-
酮、(1-取代的)-2-氧代-苯并咪唑-3-基、2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉基、3-吗啉基、4-吗啉基、2-硫吗啉基、3-硫吗啉基、4-硫吗啉基、
1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、4-噻唑烷基、二唑酮基(diazolonyl)、N-取代的二唑酮基、1-苯并吡咯烷酮(1-phthalimidinyl)、苯并 烷基(benzoxanyl)、苯并吡咯烷基、苯并哌啶基、苯并氧杂环戊基、苯并硫杂环戊烷基(benzothiolanyl)和苯并噻烷基(benzothianyl)。杂环基团可包含两个或多个上面所列的环。杂环包括下述基团，其中非芳香含杂原子的环稠合到一个或多个芳香或非芳香环上，如在二氢吲哚基、色满基、菲啶基或四氢喹啉基中，其中连接基团或连接点在非芳香含杂原子的环上。
[0099] 单独使用或作为较大基团(如“芳烷基”(芳基取代的C1-6烷基)、“芳烷氧基”(芳基取代的C1-6烷氧基)或“芳氧基-烷基”(芳氧基取代的C1-6烷基)中)的一部分使用的术语“芳基”是指具有6-14个环原子的芳香单环或多环基团，如苯基、1-
萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基并且包括芳烷基、芳烷氧基和芳氧基烷基基团。“芳基”环可以是取代的或未取代的。术语“芳基”包括稠合的多环芳香环体系，其中芳香环稠合到一个或多个环上。芳基基团的非限制性实例包括苯基、羟基苯基、卤代苯基、烷氧基苯基、二烷氧基苯基、三烷氧基苯基、亚烷基二氧基苯基、萘基、菲基、蒽基、菲并(phenanthro)、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基。本文使用的术语“芳基”的范围内也包括下述基团，其中芳香环稠合到一个或多个非芳香环上，如在茚满基、菲啶基或四氢萘基中，其中连接基团或连接点在芳香环上。
[0100] 本文使用的术语“杂芳基”是指稳定的杂环基，和具有5-14个环原子的多杂环芳香基团。杂芳基基团可以是取代的或未取代的并且可以包含单环或多环状环体系。典型的杂芳环的实例包括5-元单环，如噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、异噻唑基、呋咱基、异 唑基和噻唑基；6-元单环，如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基；和多环杂环，如苯并[b]噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、苯并氧硫杂环己烯基(phenoxathienyl)、吲嗪基、异吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、苯并噻唑、苯并咪唑、四氢喹啉、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮苯基(perimidinyl)、菲咯啉基(phenanthrolinyl)、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基和吩 嗪基(参见，例如Katritzky，Handbook of Heterocyclic Chemistry)。示例性的杂芳基环包括，但不限于，2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异 唑基、4-异 唑基、5-异唑基、2- 二唑基、5- 二唑基、2- 唑基、4- 唑基、5- 唑基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、3-哒嗪基、
2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、5-四唑基、2-三唑基、5-三唑基、2-噻吩基、3-噻吩基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并 唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、吲哚基、异吲哚基、吖啶基和苯并异 唑基。杂芳基基团还包括下述基团，其中杂芳香环稠合到一个或多个芳香或非芳香环上，其中连接基团或连接点在杂芳香环上，如四氢喹啉、四氢异喹啉和吡啶并[3,4-d]嘧啶基、咪唑并[1,2-a]嘧啶基、咪唑并[1,2-a]吡嗪基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[1,2-c]嘧啶基、吡唑并[1,5-a][1,3,5]三嗪基、吡唑并[1,5-c]嘧啶基、咪唑并[1,2-b]哒嗪基、咪唑并[1,5-a]嘧啶基、吡唑并[1,5-b][1,2,4]三嗪、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、咪唑并三嗪基、吡咯并[2,3-d]嘧啶基、三唑并嘧啶基和吡啶并吡嗪基。
[0101] 芳基基团或杂芳基基团可包含一个或多个取代基。芳基或杂芳基基团的示例性取A B B代基包括卤素(F、Cl、Br或I)、烷基、烯基、炔基、杂烷基、-NO2、-CN、-R、-OR、-S(O)rR(其A B A B A B A A B B B A
中r为0、1或2)、-SO2NRR、-NRR、-O-NRR、-NR-NRR、-(CO)YR、-O(CO)YR、-NR(CO)B B A B B B A B
YR、-S(CO)YR、-NRC( ＝S)YR、-OC(＝ S)YR、-C( ＝S)YR、-YC(＝ NR)YR、-YC( ＝A B A B B B B
N-OR)YR、-YC(＝N-NRR)YR、-COCOR、-COMCOR(其中M为C1-6烷基基团)、-YP(O)
C C C C A B A A B
(YR)(YR)、-P(O)(R)2、-Si(R)3、-NRSO2R和-NR SO2NRR，其中每次出现时，Y独立地A B B B
为-O-、-S-、-NR-或化学键(即，-(CO)YR因此包括-C(＝O)R 、-C(＝O)OR和-C(＝O)A B
NRR)。
[0102] RC选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基。在每次A B出现时，每个R和R 独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基。
[0103] 每个RA、RB和RC任选具有一个或多个取代基选自氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基羰基、卤素、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、碳环、杂环、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、硝基、氰基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷氧基、卤代烷氧基基团、羟基、受保护的羟基基团(例如，-O-X，其中X为酰基、苯基、取代的苯B基、苄基、取代的苄基、苯乙基或取代的苯乙基)、-M-杂芳基、-M-杂环、-M-芳基、-M-OR、B A B A B B A B A B C
-M-SR、-M-NRR、-M-OC(O)NRR、-M-C(＝NR)NRR、-M-C(＝NR)OR、-M-P(＝O)(R)2、C A B A B B B A B
Si(R)3、-M-NRC(O)R、-M-NRC(O)OR、-M-C(O)R、-M-C(＝S)R、-M-C(＝S)NRR、-M-C(O)A B B A B B A A B A A B A
NRR,、-M-C(O)NR-M-NRR、-M-NRC(NR)NRR、-M-NRC(S)NRR、-M-S(O)2R、-M-C(O)
A A B A B B B
R、-M-OC(O)R 、-MC(O)SR、-M-S(O)2NR R、-C(O)-M-C(O)R 、-MCO2R 、-MC( ＝ O)A B A B A B A B
NRR、-M-C(＝NH)NRR和-M-OC(＝NH)NR R，其中M为C1-6烷基基团。取代的R 、R或C
R基团的非限制性示例包括卤代烷基和三卤代烷基、烷氧基烷基、卤代苯基、氯甲基、三氯甲基、三氟甲基、甲氧基乙基、烷氧基苯基、卤代苯基、-CH2-芳基、-CH2-杂环、-CH2C(O)NH2、-C(O)CH2N(CH3)2、-CH2CH2OH、-CH2OC(O)NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NEt2、-CH2OCH3、-C(O)NH2、-CH2CH2-杂环、-C(＝S)CH3、-C(＝S)NH2、-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)OEt、-C(O)NH-环丙基、-C(O)NHCH2CH2-杂环、-C(O)NHCH2CH2OCH3、-C(O)CH2CH2NHCH3、-CH2CH2F、-C(O)CH2-杂环、-CH2C(O)NHCH3、-CH2CH2P(＝O)(CH3)2和-Si(CH3)3。
[0104] 烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基或杂环基团可包含一个或多个选自对于芳基或杂芳基基团的上面所列的那些取代基，以及＝O、＝S、A B B B B A B＝NH、＝NNRR、＝NNHC(O)R、＝NNHCO2R或＝NNHSO2R，其中R和R 如上文所定义。氮(例如在杂环基或其他基团内)上的取代基的非限制性实例包括烷基(取代的或未取代的)、酰基、氨基酰基和磺酰基基团。
[0105] 从以下详细说明和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
[0106] 发明详述
[0107] 本发明的特征在于通过给予患者式(I)化合物治疗具有EGFR导致的癌症的患者的方法，所述癌症是或已成为厄洛替尼或吉非替尼难治的，或者所述癌症具有本文鉴定的EGFR突变。
[0108] EGFR突变株
[0109] EGFR突变株包括EGFR或其片段的氨基酸或核苷酸序列中一个或多个缺失、置换或添加。
[0110] EGFR突变可以发生在EGFR序列的任何部位。通常，EGFR突变株源自激酶结构域(即EGFR序列中的外显子18-24)或胞外结构域(即EGFR序列中的外显子2-16)的突变。例如，突变通常发生在激酶结构域，包括外显子18中的一个或多个点突变(例如，L688P、V689M、P694L/S、N700D、L703V、E709K/Q/A/G/V、I715S、L718P、G719C/A/S/R或S720P/F)、可包括或可不包括插入的外显子19中的缺失(例如，delG719、delE746_E749、delE746_A750、delE746_A750insRP、delE746_A750insQP、delE746_T751、delE746_T751insA/I/V、delE746_T751insVA、delE746_S752、delE746_S752insA/V/D、delE746_P53insLS、delL747_E749、delL747_A750、delL747_A750insP、delL747_T751、delL747_T751insP/S/Q、delL747_T751insPI、delL747_S752、delL747_S752insQ、delL747_P753、delL747_P753insS/Q、delL747_L754insSR、delE749_A750、delE749_A750insRP、delE749_T751、delT751_I759、delT751_I759insS/N或delS752_I759)、外显子19中的复制(例如，K739_I44dupKIPVAI)、外显子19中的点突变(例如，L730F、W731Stop、P733L、G735S、V742A、E746V/K、A750P、T751I、S752Y、P753S、A754P或D761Y)、外显子20中的框内插入(例如，D761_E762insEAFQ、A767_S768insTLA、V769_D770insY、V769_D770insCV、V769_D770insASV、D770_N771insD/G、D770_N771insNPG、D770_N771insSVQ、P772_H773insN/V、P772_H773insYNP 或 V774_C775insHV)、可包括或可不包括插入的外显子20中的缺失(例如，delM766_A767、delM766_A767insAI、delA767_V769、delD770或delP772_H773insNP)、外显子20中的复制(例如，S768_D770dupSVD、A767_V769dupASV或H773dupH)、外显子20中的点突变(例如，D761N、A763V、V765A/M、S768I、V769L/M、S768I、P772R、N771T、H773R/Y/L、V774M、R776G/H/C、G779S/F、T783A、T784F、L792P、L798H/F、T790M、R803W、K806E或L814P)或外显子21中的点突变(例如，G810S、N826S、L833V、H835L、L838V、A839T、K846R、T847I、H850N、V851I/A、I853T、L858M/R、A859T、L861Q/R、G863D、A864T、E866K或G873E)。在肺癌中，活化的突变株是典型的，而且746-750(ELREA)和L858R的90％缺失导致EGFR在无配体刺激的情况下持续磷酸化。据说50％肺癌的耐药性源自T790M点突变。
[0111] 例如，在胶质母细胞瘤中，突变典型地但非唯一地发生在胞外结构域，包括缺乏胞外结构域的EGFR变异株I(EGFRvI)和类似的v-ERBB癌蛋白；缺乏来自结构域IV的83个氨基酸的EGFRvII；和缺乏来自结构域I和II的氨基酸30-297的EGFRvIII，其是最常见的扩增，且在30-50％的胶质母细胞瘤和5％的鳞状细胞癌中有报道。胶质母细胞瘤的其他突变包括以下外显子的一个或多个点突变：外显子2(例如，D46N或G63R)、外显子3(例如，结构域I的R108K)、外显子7(例如，结构域II的T263P或A289D/T/V)、外显子8(例如，R324L或E330K)、外显子15(例如，结构域IV的P596L或G598V)或外显子21(激酶结构域的L861Q)。
[0112] EGFR突变株也包括那些如本文所述的两个或多个突变的组合。典型的组合包括S768I和G719A；S768I与V769L；H773R和W731Stop；R776G和L858R；R776H和L861Q；T790M和L858R；T790M和delE746_A750；R803W和delE746_T751insVA；delL747_E749和A750P；delL747_S752和E746V；delL747_S752和P753S；P772_H773insYNP和H773Y；P772_H773insNP和H773Y；以及D770_N771insG和N771T。目前特别感兴趣的组合包括T790M与另一个突变的组合(例如，T790M和L858R或T790M和delE746_A750)。
[0113] 某些突变编码突变株EGFR蛋白，其在缺少EGF配体的情况下主动
信号传导，但其特征在于对EGFR抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼具有敏感性。G719C/S/A、delE746_A750和L858R是此类突变的例子。其他EGFR突变赋予对此类药物的抗性，即使与前面提到的激活突变之一组合存在时。T790M是赋予对这些药物的抗性的突变的实例。
[0114] EGFR导致的癌症可能被野生型EGFR或本文所述的任何突变株EGFR所导致。例如，EGFRvIII常发现于胶质母细胞瘤，并在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌中也有报道。示例性的EGFR导致的癌症为：胶质母细胞瘤、肺癌(如鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、腺癌、细支气管肺泡癌(BAC)、局灶性浸润BAC、具有BAC特征的腺癌和大细胞癌)、胰腺癌、头颈癌(例如，鳞状细胞癌)、乳腺癌、结肠直肠癌、上皮癌(例如，鳞状细胞癌)、卵巢癌和前列腺癌。
[0115] 尤其是，本文所述的发明将会对具有或有较高风险的TKI抵抗型EGFR突变的病人具有意义。每年约8,000至16,000个新发病例可基于以下进行估计：非小细胞肺癌的发病率(在美国约160,000个新发病例)、一般群体中对厄洛替尼的响应(约10％，产生16,000个敏感人群)、激活突变的存在(白种人中10-20％和亚洲人中30-40％，产生16,000-32,000个敏感人群)、继发抗药性的获得(大多数(如果不是所有)患者，产生16,000-32,000个敏感人群)和携带T790M点突变的患者百分比(约50％，产生8,000-16,000个敏感人群)。带TKI抗性突变的患者包括那些对厄洛替尼、吉非替尼、CL-387,785、BIBW2992(CAS登记号439081-18-2)、CI-1033，来那替尼(HKI-272)、MP-412(AV-412)、PF-299804、AEE78和XL64中的一个或多个抵抗的癌症患者。
[0116] 尤其是，本发明涉及治疗具有T790M点突变的EGFR导致的癌症。通常，可逆性抑制剂(例如，CI-1033、来那替尼(HKI-272)和PF-299804)在具有T790M突变的细胞系中效
力较低，且在临床可达到的浓度下不能抑制T790M。由于T790M与WT的ATP Km类似，抑制突变株的浓度将会抑制WT，并导致胃肠道和
皮肤事件。
[0117] EGFR突变株也包括EGFR的其他氨基酸和核苷酸序列的一个或多个缺失、置换或添加，例如点突变，其保留或增加酪氨酸激酶或磷酸化活性。突变株是蛋白或多肽时，优选的置换是保守置换，其为性质(如结构、电性、极性或疏
水性)相似的氨基酸之间的置换。例如，置换可以发生在碱性氨基酸之间(例如，Lys、Arg和His)、或酸性氨基酸之间(例如，Asp和Glu)、或具有不带电荷的极性
侧链的氨基酸之间(例如，Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)、或具有疏水性侧链的氨基酸之间(例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe和Met)、或具有分支侧链的氨基酸之间(例如，Thr、Val、Leu和Ile)、或具有芳香侧链的氨基酸之间(例如，Tyr、Trp、Phe和His)。
[0118] 若该突变株为核酸，则编码EGFR突变蛋白的DNA可以包括如本文所定义的在严格条件下能够杂交至编码EGFR突变株的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列。本文使用的严格条件包括低度、中度或高度严格的条件。严格条件的实例包括在约42-55℃、约2-6x SSC中杂交，然后在约50-65℃、含约0.1-0.2％SDS的约0.1-1x SSC中洗涤，其中1x SSC为含有0.15M NaCl和0.015M
柠檬酸钠的溶液，pH值为7.0。洗涤可以进行一次或多次。通常，严格条件可被设置为在限定的离子强度和pH下，低于特定核苷酸序列的
熔化温度(Tm)约5℃的温度。
[0119] EGFR和编码它们的DNA的氨基酸和核苷酸序列可从熟知的
数据库获得，例如NCBI GenBank(美国)、EMBL(欧洲)等。例如，EGFR的GenBank登录号[Homo sapiens]包括MIM131550、AAI28420、NM_005228、NP_005219.2和GeneID:1956。
[0120] EGFR导致的癌症的表征
[0121] EGFR突变株的表达或过表达可在诊断或
预后分析中通过评估生物样品中的或细胞分泌的EGFR突变株的水平来确定(例如，通过使用抗EGFR
抗体或抗-p-EGFR抗体进行的免疫组织化学分析；FACS分析等)。可选择地，或额外地，可以测量细胞中编码EGFR突变株的核酸或mRNA的水平，例如，通过使用基于对应于编码EGFR突变株的核酸或其补体的探针的核酸进行的
荧光原位杂交技术；(FISH；参见WO98/45479，1998年10月公开)，Southern印迹法，Northern印迹法或
聚合酶链反应(PCR)技术，如实时荧光定量PCR(RT-PCR)。也可以通过测量生物样品如血清中的脱落的
抗原来研究EGFR突变株的表达，例如，使用基于抗体的分析方法(也参见，例如，美国专利号4,933,294，1990年6月12日提交；WO91/05264，1991年4月18日公开；美国专利5,401,638，1995年3月28日提交；和Sias等人,J.
Immunol.Methods 132:73(1990))。除上述分析方法外，可向熟练的专业人员提供多种体内分析方法。例如，可以将哺乳动物体内的细胞暴露于任选用可检测的标示物例如
放射性同位素标记的抗体，并且抗体与哺乳动物细胞的结合可例如通过放射性外部扫描或通过分析取自先前暴露于抗体的哺乳动物的活检进行评估。
[0122] 可在分离细胞中测量的生物学特性的实例包括mRNA的表达、蛋白表达和DNA定量。此外，通过本发明方法分离的细胞的DNA可被测序，或可以使用标准技术例如FISH或PCR确定某些序列特征(例如，多态性和
染色体异常)。细胞的化学成分和其他分析物也可以在分离后测定。细胞也可以在不裂解的情况下测定，例如，使用细胞外或细胞内染料或通过其他观察，例如，在各种介质中的形态或生长特性。
[0123] 虽然任何杂交技术均可用于检测基因重排，但一个优选的技术是荧光原位杂交(FISH)。FISH技术是一种细胞遗传学技术，它可用来检测和
定位染色体上特定的DNA或RNA序列的存在或缺失。FISH结合使用荧
光标记的核酸探针，该探针只结合到染色体中与其显示高度序列相似性的那些部分。荧光
显微镜可用于找出结合到染色体上的荧光探针的位置。FISH的基本步骤如下所述。示例性的FISH探针包括Vysis EGFR SpectrumOrange/CEP SpectrumGreen探针(Abbott，Downers Grove，IL)，其杂交至带7p12；和ZytoLight SPEC EGFR/CEN 7Dual Color探针(ZytoVision)，其杂交至7号染色体的着丝粒的α-卫星序列。
[0124] 对于FISH，探针的构造应足够长以特异性地杂交到其目标上(而不是基因组中的相似序列上)，但不应太大以致于阻碍杂交过程。探针通常用荧光团、用抗体的靶标、用生物素或其任意组合来标记。这可通过多种方式，例如使用随机引物法、缺口平移和使用标记的核苷酸的PCR来完成。
[0125] 通常，细胞群体的样品或等分用于FISH分析。例如，在一个制备方法中，将细胞用胰蛋白酶消化以分散成单细胞，通过细胞离心涂片法(cytospun)涂片于
载玻片上，用多聚甲
醛固定，然后储存于70％
乙醇中。为制备用于FISH的染色体，染色体被牢固地连接到基底(通常是玻璃)上。制备后，将探针施加到染色体RNA并开始杂交。在几个洗涤步骤中，所有未杂交或部分杂交的探针被冲走。如果信号放大以超过显微镜的检测阈是必要的(这依赖于许多因素，如探针标记效率、探针种类和
荧光染料)，则将荧光标记的抗体或链亲和素结合到标记分子上，从而放大荧光。
[0126] 落射荧光显微镜可用于观察杂交的序列。
光源灯(source lamp)的白光被过滤使得只有用于荧光分子激发的相关
波长到达样品上。荧光染料通常在较大的波长下发射，这允许人们通过另一滤光器区分激发光和发射光。用更复杂的
过滤器组，可能区分几种激发和发射频带从而区分几种荧光染料，这允许在同一束(strand)上观察多种不同的探针。
[0127] 根据使用的探针，FISH可拥有从庞大的染色体或小(～100千碱基(kilobase))序列变化的
分辨率。探针可通过计算点或比色进行简单定量。
[0128] 等位基因特异性定量实时PCR也可用于识别编码突变株EGFR蛋白的核酸(参见，例如，Diagnostic Innovations DxS BCR-ABL T3151Mutation Test Kit和Singer等人,Methods in Molec.Biol.181:145(2001))。该技术采用Taq DNA聚合酶，其非常有效地区分3'-端引物的匹配和不匹配(当3'-基不匹配时，无有效扩增发生)。使用这种技术，3'-端引物可被设计为特异性杂交的核酸序列，该序列与如本文所述的编码EGFR突变株中的突变氨基酸的密码子相对应。采用这种方法，特定的突变序列可在患者样本中选择性扩增。这种技术还利用Scorpion探针分子，其是含PCR引物、荧光团和淬灭剂的双官能团的分子。探针中的荧光团与降低荧光的淬灭剂相互作用。在PCR反应中，当Scorpion探针与
扩增子结合时，Scorpion探针中的荧光团和淬灭剂分离，这导致反应管的荧光增加。本文描述的任何引物均可用于等位基因特异性定量实时PCR。
[0129] 可利用本领域中已知的方法分析生物样品以检测EGFR基因中的突变或EGFR基因的表达水平。方法如直接核酸测序、变化杂交(altered hybridization)、异常的凝胶
电泳迁移(aberrant electrophoretic gel migration)、错配结合蛋白(mismatch binding proteins)介导的结合或裂解、单链构象多态性(SSCP)分析或来自患者样本的PCR产物的限制性片段长度多态性(RFLP)分析可用于检测EGFR基因中的突变；ELISA可用于测量EGFR多肽的水平；以及PCR可用于测量EGFR核酸分子的水平。
[0130] 可使用任何这些技术均以便于在候选基因中检测突变，并且每个在本领域中都是熟知的；特殊技术的实例描述但不限于Orita等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2766(1989))和Sheffield等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232(1989))。此外，生物样品(例如，活检)中候选基因的表达可通过标准的Northern印迹分析来监测或可以借助PCR(参见，例如，Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,NY(1995)；PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Ehrlich,Ed.,Stockton Press,NY；Yap 等 人 ,Nucl.Acids.Res.19:4294(1991))。
[0131] 本领域技术人员可使用若干序列对比
软件程序(例如，NCBI BLAST网站)识别核酸或蛋白序列中的残基(例如，氨基酸或核苷酸)或与残基对应的密码子或野生型EGFR或EGFR突变株中的密码子。这种软件程序可允许被比较序列在对比中存在缺口。使用这种软件，本领域技术人员可识别核苷酸、氨基酸或与特定的核苷酸、氨基酸相对应的氨基酸，或野生型EGFR或EGFR突变株中的密码子。
[0132] 生物样品中的EGFR表达水平(例如，DNA、mRNA或蛋白)可通过使用本领域熟知的或本文所述的任何若干标准技术确定。示例性生物样品包括
血浆、血液、痰液、胸腔积液、
支气管肺泡灌洗或活检，如肺活检和淋巴结活检。例如，患者中生物样品(例如，血液或组织样品)中的EGFR表达可以通过标准的Northern印迹分析或通过定量PCR来监测(参见，例如，Ausubel等人,supra；PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification,H.A.Ehrlich,Ed.,Stockton Press,NY；Yap 等 人 ,Nucl.Acids.Res.19:4294(1991))。
[0133] 化合物的合成
[0134] 式(I)化合物可使
用例如国际专利申请WO 2004/080980、WO2005/016894、WO2006/021454、WO 2006/021457、WO 2009/143389和WO2009/126515中详细公开的已知方法e d
和原料来制备。例如，其中R为H且R 为H、Cl、CF3或CH3的式(I)化合物可分别从2,4-二氯嘧啶、2,4,5-三氯嘧啶、2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶或2,4-二氯-5-甲基嘧啶合成，如PCT公开号WO/2009/143389(参见，例如，下面的方案1A和1B)中所述。
[0135] 方案1A
[0136]
[0137] 方案1B
[0138]d e
[0139] 其中R和R 与它们所连接的嘧啶环原子一起形成含一个或两个杂原子的5-或6-元环的式(I)化合物可以按PCT公开号WO2009/126515中描述的方法来合成。参见，例如方案2，其描述了起始原料的合成，从该起始原料可以合成式(I)化合物。在方案2中，X为CH3或H。
[0140] 方案2
[0141]
[0142] 制剂
[0143] 式(I)化合物可配制用于在本发明方法中有效的任何给药途径(例如，口服、直肠、胃肠外、脑池内、
阴道内、腹膜内、局部(如通过
透皮贴剂、粉剂、
软膏剂或滴剂)、舌下、口含(bucally)、作为口用或鼻用喷雾剂)。为了用于本发明的方法中，式(I)化合物优选以剂量单位形式配制以便于给药和剂量均匀。例如，式(I)化合物可配制用作口服给药的胶囊，含标示量为10mg、50mg、100mg、150mg、250mg、500mg或本文所述的任何剂量的游离碱或所述化合物的
酸加成盐(例如，
盐酸盐)。本发明的单位剂量形式根据需要可以包括与填充剂、流动增强剂、
润滑剂和/或崩解剂一起配制的化合物或其盐。例如，单位剂量形式可以包括胶体
二氧化硅(流动增强剂)、无水乳糖(填充剂)、
硬脂酸镁(润滑剂)、微晶
纤维素(填充剂)和/或
淀粉羟乙酸钠(崩解剂)。所述化合物和非活性成分可利用例如常规的混合和封装方法进行配制。或者，式(I)化合物按PCT公开号WO2009/143389和WO2009/126515中描述的方法进行配制。
[0144] 治疗
[0145] 式(I)化合物可用于治疗EGFR导致的癌症。尤其是，所述化合物可用于治疗表达EGFR突变株的EGFR导致的癌症和用于治疗TKI疗法(例如，厄洛替尼或吉非替尼)难治的EGFR导致的癌症。
[0146] 这类癌症可包括非小细胞肺癌(NSCLS)，包括一个或多个鳞状细胞癌、腺癌、腺癌、细支气管肺泡癌(BAC)、局灶侵入性BAC，具有BAC特征的腺癌，以及大细胞癌；神经肿瘤，如胶质母细胞瘤；胰腺癌；头颈癌(例如，鳞状细胞癌)；乳腺癌；结肠直肠癌；上皮癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；以及包括EGFR介导的癌症。
[0147] 本发明基于以下发现：式(I)化合物可用于治疗EGFR导致的癌症，表达EGFR突变株的EGFR导致的癌症，和用于治疗TKI疗法如厄洛替尼或吉非替尼难治的EGFR导致的癌症。式(I)化合物也可用于需要此类治疗的患者中起到预防癌症复发的维持作用。
[0148] 式(I)化合物的治疗有效量通常在5mg至2,000mg化合物的平均每日剂量的范围内，以单剂量或多剂量形式给予成年患者，优选口服。典型的平均每日剂量范围包括10-500mg、20-550mg、30-600mg、40-650mg、50-700mg。
[0149] 可每天、每周(或间隔数天)或以间歇时间表，给药一次或多次。例如，可在每周的
基础上(例如每周一)，每天给予所述化合物一次或多次，不定地或持续几周，例如4-10周。或者，可每天给药持续几天(例如2-10天)，然后几天(例如1-30天)不给药所述化合物，不定地重复该循环或重复给定的次数，例如4-10个循环。例如，本发明的化合物可每天给药持续5天，然后间断2天，然后再每天给药持续5天，然后间断2天，以此类推，不定地重复该循环或共重复4-10次。
[0150] 提供以下
实施例以便为本领域技术人员提供如何进行、制备和评估本文
请求保护的方法和化合物的完整公开和说明，旨在仅仅示例本发明而非限制
发明人认为的发明的范围。
[0151]
试剂：合成或购买了以下化合物用于筛选：WZ4003(Zhou 等人,Nature,462:1070(2009))、HKI-272和Cl-387,785。
[0152] 实施例1.激酶分析
[0153] 对具有WT EGFR、L858R、T790M和L858R/T790M的体外激酶组(kinase panel)进行分析。可对进一步包括delE746_A750和delE746_A750/T790M的组进行额外的分析。分析条件包括具有3μM的最高浓度(单份)和10μM ATP的10点曲线。
[0154] 式(I)化合物包括激酶分析中EGFR突变株的有效抑制剂。例如，在具有L858R和T790M突变的H1975细胞系中，先前已知的抑制剂吉非替尼、CL-387,785和HKI-272的IC50值介于153nM至>3.3μM之间，而许多式(I)化合物显示出的IC50值范围为0.5至9nM。因此，式(I)化合物可为EGFR导致的癌症提供必要的抑制剂。
[0155] 实施例2.细胞和体内分析
[0156] NSCLC细胞系以及工程化的Ba/F3和NIH3T3细胞系用于检测式(I)化合物对以下3种常规形式的EGFR的活性：天然的EGFR(天然存在的形式)、具有激活突变的EGFR(delE746_A750[Del]或L858R；这种形式对第一代EGFR抑制剂敏感)以及具有激活突变和T790M抗性突变的EGFR(L858R/T790M或Del/T790M；所述T790M突变的加入使这种形式对第一代EGFR抑制剂具有抗性)。通过测量磷酸化的EGFR的水平来评估测试化合物对EGFR信号传导的影响，通过生长和生存分析来测量对体外增殖的影响，和在小鼠中每天口服给药后测量对体内肿瘤生长的影响。
[0157] 最感兴趣的测试化合物在细胞分析中对天然的EGFR基本上无活性，即，在EGFR中缺乏激活突变的NSCLC细胞系和天然的EGFR转导的NIH3T3细胞中抑制磷酸化的IC50>1000nM。
[0158] 相反，测试化合物在体外和体内细胞分析中均表现出对EGFR的激活型具有强效活性。EGFR磷酸化在以下3个细胞系中被抑制，一些情况下IC50低于～65nM：表达EGFR-Del的NSCLC系和表达EGFR-Del或EGFR-L858R的NIH3T3细胞。在NSCLC细胞[Del]中，细胞生长被抑制，且GI50低于～200nM。该NSCLC细胞系[Del]的异种移植实验显示，在一些情况下，25mg/kg或更大的剂量诱发肿瘤消退了>33％并在给药后10和24小时分别使EGFR信号传导抑制了>85％和>40％。
[0159] 感兴趣的测试化合物在体外细胞分析中也表现出对EGFR的T790M突变型具有强效活性。在一组研究中，EGFR信号传导在以下6个细胞系中被抑制，且IC50低于～65nM：表达EGFR-L858R/T790M(H1975)或EGFR-Del/T790M的NSCLC系(工程化的HCC827细胞)，以及表达EGFR-Del/T790M或EGFR-L858R/T790M的NIH3T3细胞和Ba/F3细胞对。两种Ba/F3细胞系的生存力被抑制，IC50为141和502nM。工程化用于表达EGFR-Del/T790M的HCC827细胞[Del]的生长被抑制，其GI50(245nM)与表达EGFR-Del的亲系HCC827细胞的GI50相似。相反，厄洛替尼在表达EGFR-Del的细胞中的效力是表达EGFR-Del/T790M的细胞中的>100倍。
[0160] 最后，一种示例性的测试化合物在体内分析中也表现出对EGFR的T790M突变型具有强效活性。在使用表达EGFR-Del/T790M的Ba/F3细胞的肿瘤模型中，每日口服给药50mg/kg AP26113抑制>90％生长并且给药75mg/kg诱发肿瘤消退。给药后24小时，50mg/kg的单次剂量显示抑制肿瘤中>80％磷酸化的EGFR水平。在使用表达EGFR-Del/T790M的NIH3T3细胞的肿瘤模型中，也见到了抗肿瘤和抗EGFR活性。
[0161] 实施例3.细胞抑制分析
[0162] 通过测定多种蛋白的磷酸化和表达水平来分析肺癌细胞系。对于具有不同EGFR突变株的肺癌细胞系，进行肺癌细胞中EGFR和其它蛋白的磷酸化和表达水平的免疫印记分析。H358表达WT EGFR，HCC827具有delE746_A750突变，H820具有delE746_E749/T790M突变，H1975具有L858R/T790M突变。
[0163] 对多种化合物进行免疫印记分析，包括厄洛替尼、吉非替尼、BIBW2992、WZ4003和若干式(I)化合物。
[0164] 该免疫印记显示，试验的式(I)化合物有效地抑制具有EGFR突变的癌细胞系。尤其是，这些化合物对通常与耐药性相关的突变，如T790M以及L858R和T790M的组合有效。
[0165] 实施例4.示例性的式(I)化合物
[0166] 通过体外激酶分析对下面描述的化合物进行了测试，以确定对天然的EGFR、具有激活L858R突变的EGFR、具有(赋予抗性)T790M突变的EGFR以及具有L858R和T790M突变的EGFR的相对抑制活性。所观察到的IC50值如下：
[0167]
[0168] 在一些情况下，所述化合物表现出对L858R突变株的效力比对天然EGFR的效力强100倍，和对双重突变株的效力比对天然EGFR的效力强10倍。
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176] 实施例5：EGFR-T790M的NSCLC模型
[0177] 式(I)化合物可使用细胞系HCC827(EGFR Del E746_A750)或H1975(EGFR L858R/T790M)的NSCLC模型进一步测试。这些细胞系在第二代EGFR-I研发中被用作模型。药代动力学/药效学(PK/PD)和有效性研究也可使用例如BIBW 2992作为参考化合物来进行。
[0178] 实施例6：临床给药
[0179] 式(I)化合物可使用常规方法和原料配制用于口服给药，包括使用或不使用常规
