脐带血干细胞增殖和生长因子产生的锂刺激
阅读：1042发布：2020-05-27
专利汇可以提供脐带血干细胞增殖和生长因子产生的锂刺激专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了使用含锂盐的体外细胞培养系统来扩展人脐带血干细胞的方法和刺激脐带血干细胞产生生长因子的方法。本发明还提供了通过在移植前用锂盐处理所述细胞来提高所移植的脐带血干细胞的存活和生长的体内方法。还提供了通过移植后用锂盐 给药 来降低所移植的脐带血干细胞的排斥的体内方法。，下面是脐带血干细胞增殖和生长因子产生的锂刺激专利的具体信息内容。
1. 一种用于刺激人脐带血细胞产生生长因子的方法，所述方法包括在含有锂盐的培养基中培养所述细胞。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生长因子选自由细胞存活因子、抗分化因子、以及它们的组合所构成的组。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生长因子是选自下组的细胞存活因子：神经营养蛋白、细胞因子、表皮生长因子（EGF)、血小板衍生生长因子（PDGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、以及它们的组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞存活因子是选自下组的神经营养蛋白：神经营养蛋白-3 (NT-3)、神经营养蛋白-4 (NT-4)、脑衍生神经营养因子（BDNF)、胶质细胞系衍生神经营养因子（⑶NF)、睫状神经营养因子（CNTF)、神经生长因子（NGF)、以及它们的组合神经营养蛋白。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生长因子是抗分化因子，其中所述抗分化因子是白血病抑制因子（LIF)。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述锂盐选自氯化锂、碳酸锂或硫酸锂。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述锂盐是氯化锂。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述锂盐以约O. 5至约5mM的浓度存在于所述培养基中。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述锂盐以约3mM的浓度存在与所述培养基中。
10. 一种用于扩展人脐带血细胞的体外方法，所述方法包括在含有锂盐的培养基中培养所述细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述锂盐选自氯化锂、碳酸锂或硫酸锂。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述锂盐是氯化锂。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述锂盐以约O. 5至约5mM的浓度存在于所述培养基中。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述锂盐以约3mM的浓度存在与所述培养基中。
15. 一种提高对象中所移植的人脐带血细胞的存活和生长的方法，所述方法包括： (a)在含有锂盐的培养基中培养所述细胞；以及 (b)给予所述对象步骤（a)的细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述锂盐选自氯化锂、碳酸锂或硫酸锂。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述锂盐是氯化锂。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述锂盐以约O. 5至约5mM的浓度存在于所述培养基中。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述锂盐以约3mM的浓度存在与所述培养基中。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述对象已被诊断为脊髓损伤。
22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞以脊柱内方式给予。
23.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：（c)给予所述对象锂盐。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述锂盐是氯化锂。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述锂盐是通过选自口服、鞘内、心室内、皮下、腹膜内、静脉内或肌内的途径给予的。
27.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述锂盐是以约lmg/kg至约150mg/kg的剂量给予的。
28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述锂盐是以约10mg/kg的剂量给予的。
29. 一种用于降低对象中所移植的人脐带血细胞的排斥的方法，所述方法包括在细胞移植后给予所述对象锂盐。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述对象已被诊断为脊髓损伤。
32.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述锂盐选自氯化锂、碳酸锂或硫酸锂。
33.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述锂盐是氯化锂。
34.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述锂盐是通过选自口服、鞘内、心室内、皮下、腹膜内、静脉内或肌内的途径给予的。
35.如权利要求29所述的方法,其特征在于,所述锂盐是以约lmg/kg至约150mg/kg的剂量给予的。
36.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述锂盐是以约10mg/kg的剂量给予的。
脐带血干细胞增殖和生长因子产生的锂刺激
[0001] 本申请是2007. 10. 31提交的CN 200780046542. 0，题为“脐带血干细胞增殖和生长因子产生的锂刺激”的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2006年11月I日提交的美国临时申请No. 60/856，071的优先权，其公开对于所有目的通过引用完整地整合在本申请中。
[0004] 发明背景
[0005] 对于人干细胞的鉴定、分离和产生存在着相当大的兴趣。人干细胞通常是能够自我更新并产生各种成熟的人的细胞系的全能或多能的前体细胞。这一能力是组织和器官发 育所必需的细胞分化和特化的基础。最近在干细胞移植方面的成功已经为由于疾病、接触有毒化学品和/或辐射所引起的骨髓肃清（myeloablation)后的骨髓重建和/或补充提供了新的临床工具。进一步的证据证明，干细胞可以用于重塑许多（如果不是所有）组织并恢复生理和解剖学功能性。
[0006] 已经对许多不同种类的哺乳动物干细胞进行了表征。例如，胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成人干细胞以及其他承认的干细胞或祖细胞是已知的。事实上，对某些干细胞不但进行了分离和表征，而且在允许有限程度分化的条件下对其进行了培养。由于人群中HLA类型的数千万种可能组合，存在着一个基本问题，即非常难以获得充分数量、种群和多样性的能够分化成能与单个患者HLA匹配的所有细胞类型的人干细胞HLA类型。不同HLA类型的干细胞的供给严重短缺。由于其在各种疾病和症状(包括恶性肿瘤、先天性代谢缺陷、血红蛋白病和免疫缺陷)治疗中的重要性，获得各种HLA类型的干细胞的足够来源会是非常有利的。
[0007] 出于几个原因难以获得足够数量的人干细胞。首先，部分是由于在血液和组织中所发现的数量非常有限，在成人组织中分离正常产生的干细胞群在技术上是困难的且昂贵的。其次，从胚胎或胎儿组织(包括流产胎儿)中获得这些细胞引起了伦理问题。因此，不需要使用从胚胎或胎儿组织中获得的细胞的其他来源是进一步发展干细胞临床使用的根本问题。然而，只有很少的干细胞、尤其是人干细胞的可行的其他来源，因此其供给是受到限制的。而且，从其他来源获得用于治疗和研究目的的足够数量干细胞通常是费力的。
[0008] 例如，美国专利No. 5，486，359公开了源自骨髓的人间叶细胞样干细胞（HMSC)组合物。通过对不含与造血细胞或分化的间叶细胞相关标志的粘附骨髓或骨膜细胞的阳性选择获得均一的HMSC组合物。所分离的间叶细胞样细胞群表现出与间叶细胞样干细胞相关的特征、具有在培养基中不分化而再生的能力、并且在体外诱导或体内置于受损组织处时具有分化成特定间叶细胞系的能力。然而，这样的方法的缺点在于，为了随后进行HMSC分离，首先需要从供体中以侵入和疼痛的方式收集骨髓或骨膜细胞。
[0009] 脐带血是另一种已知的间叶细胞样干细胞以及造血干细胞和祖细胞的来源。脐带血干细胞通常冷冻保藏用于重建造血功能，这是骨髓和其他相关移植中使用的一种治疗方法(参见例如美国专利5，004, 681和5，192，553)。用于收集脐带血的常规技术基于使用针或套管，其在重力帮助下将脐带血从胎盘排出（参见例如美国专利5，004，681,5, 192，553、5，372，581和5，415，665)。针或套管通常置于脐带经脉中，并轻轻按摩胎盘以帮助脐带血从胎盘排出。然而，由脐带血获得干细胞的主要限制在于所获得的脐带血体积经常不足，导致细胞数量不足以在移植后有效重建骨髓。
[0010] 干细胞具有在大量各种疾病和损伤的治疗中使用的潜力，这包括神经系统损伤(例如脊髓损伤)、恶性肿瘤、遗传疾病、血红蛋白病和免疫缺陷。然而，由于其收集的限制、通常从脐带血收集的细胞数量不足(尤其是如果用于治疗成年患者)、以及建立大脐带血库的高成本，脐带血干细胞严重短缺。因此，在本领域内，对于在细胞培养体系中能够将干细胞扩展到足以进行移植的数量的脐带血干细胞培养方法存在着强烈需求。在本领域内对于提高所移植的干细胞的生长和存活并降低或延缓受体中的干细胞排斥的方法也存在需求。本发明满足了这些和其他需求。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明提供了使用含锂盐的体外细胞培养体系刺激人脐带血干细胞产生生长因子的方法以及扩展（expanding)脐带血干细胞的方法。本发明也提供了通过移植前用锂盐 处理细胞提高所移植的脐带血干细胞的存活和生长的体内方法。本发明进一步提供了通过移植后给予锂盐降低所移植的脐带血干细胞排斥的体内方法。
[0013] 本发明部分基于锂刺激干细胞产生或表达生长因子这一意外发现上。不局限于任何具体理论，锂对干细胞增殖、存活和免疫排斥的作用是由干细胞对锂盐的应答中产生或表达的生长因子的数量所介导的。
[0014] 因此，在一个方面，本发明提供了用于刺激人脐带血细胞产生生长因子的方法，所述方法包括在含锂盐的培养基中培养所述细胞。
[0015] 锂通常刺激诸如细胞存活因子、抗分化因子及其组合的生长因子的产生和表达。细胞存活因子的例子包括但不限于神经营养蛋白、细胞因子、表皮生长因子（EGF)、血小板衍生生长因子（PDGF)、成纤维生长因子（FGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、肝素结合表皮生长因子（ΗΒ-EGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、色素上皮细胞衍生因子（PEDF)、神经鞘瘤衍生生长因子（SDGF)、肝细胞生长因子（HGF)、转化生长因子a (TGF-α )、转化生长因子-β(TGF-β )、骨形态发生蛋白（例如BMP I-BMP 15)、生长分化因子-9 (⑶F-9)、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、肌肉生长抑制素（myostatin)(⑶F-8)、红细胞生成素（ΕΡ0)、血小板生成素（ΤΡ0)、以及它们的组合。白血病抑制因子(LIF)是一种优选的抗分化因子。
[0016] 神经营养蛋白的例子包括但不限于神经营养蛋白-I (NT-1)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4 (NT-4)、大脑衍生神经营养因子（BDNF)、胶质细胞系衍生神经营养因子（⑶NF)、睫状神经营养因子（CNTF)、神经生长因子（NGF)、以及它们的组合。
[0017]非限制性的细胞因子的例子包括 IL-I a、IL-I β、IL_2、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、TNF-a、IFN-a、IFN-β、IFN-y、CXCL1/GR01/GR0a、CXCL2/GR02、CXCL3/GR03、CXCL4/PF-4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15、CXCL16、CXCL17/DMC、CCLI、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1 a、CCL4/MIP-I β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/CCL10、CCLll/ 嗜伊红粒细胞趋化蛋白（Eotaxin)、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/MIP-5、CCL16/LEC、CCL 17/TARC、CCL 18/MIP-4、CCL 19/MIP-3 β、CCL20/MIP-3 α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF1、CCL24/嗜伊红粒细胞趋化蛋白_2、CCL25/TECK、CCL26/嗜伊红粒细胞趋化蛋白-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CL1、CL2、CX3CLU 以及它们的组合。
[0018] 适用于本发明所述方法的锂盐的例子包括但不限于氯化锂、碳酸锂以及硫酸锂。优选地，所述锂盐是氯化锂。在一些实施方式中，所述锂盐(例如氯化锂）以约O. 5至约5mM的浓度(例如约 O. 5、1、1· 5、2、2· 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、3、3· 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4· 5 或5mM)存在于所述细胞培养基中。在一优选实施方式中，所述锂盐以约3mM的浓度存在于细胞培养基中。
[0019] 在某些情况下，可以用锂模拟化合物（lithium mimetic compound)培养所述胳带血细胞（参见例如 Gould 等，Neuropsychopharmacology, 30:1223-1237 (2005)；以及Gould, Expert Opin. Ther. Targets, 10:377-392 (2006))。在某些其他情况下，可以用类似于锂的精神药物培养所述脐带血细胞，例如丙戍酸(参见例如Hahn等，J. Psychiatr.Res. ,39:355-363(2005) ;Shao 等，Biol. Psychiatry, 58:879-884 (2005);以及 Dokucu 等， Neuropsychopharmacology, 30:2216-2224 (2005))、丙戍酸二钠（参见例如 Calabrese 等，Am. J. Psychiatry, 162:2152-2161 (2005))、以及卡巴咪嗪（参见例如 Bazinet 等，Biol.Psychiatry,59:401-407 (2006))。
[0020] 在一些实施方式中，首先将收集的脐带血单位基本耗尽血浆并随后用锂盐培养存在于耗尽血浆的脐带血单位中的干细胞。在其他实施方式中，首先将收集的脐带血单位基本耗尽红细胞并随后用锂盐培养存在于耗尽红细胞的脐带血单位中的干细胞。可以在含锂盐的培养基中使用精通本领域的人员已知的任何体外培养技术在耗尽血浆或耗尽红细胞的脐带血单位冷冻保藏之前或之后对所述脐带血干细胞进行培养。
[0021] 另一方面，本发明提供了用于扩展人脐带血细胞的方法，该方法包括在含锂盐的培养基中培养所述细胞。
[0022] 适当的锂盐包括但不限于氯化锂、碳酸锂和硫酸锂。优选地，所述锂盐是氯化锂。在一些实施方式中，所述锂盐(例如氯化锂)以约O. 5至约5mM的浓度(例如约O. 5、1、1. 5、2、2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、3、3· 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4· 5 或 5mM)存在于所述细胞培养基中。在一优选实施方式中，所述锂盐以约3mM的浓度存在于所述细胞培养基中。
[0023] 在某些情况下，可以用锂模拟化合物培养所述脐带血细胞。在某些其他情况下，可以用类似于锂的精神药物培养所述脐带血细胞，例如丙戊酸、丙戊酸二钠、卡巴咪嗪、以及它们的组合。
[0024] 如上所述，可以将收集的脐带血单位基本耗尽血浆并随后可以用锂盐培养存在于耗尽血浆的脐带血单位中的干细胞。另外，可以将收集的脐带血单位基本耗尽红细胞并随后可以用锂盐培养存在于耗尽红细胞的脐带血单位中的干细胞。可以在含锂盐的培养基中使用精通本领域的人员已知的任何体外培养技术在耗尽血浆或耗尽红细胞的脐带血单位冷冻保藏之前或之后对所述脐带血干细胞进行培养。
[0025] 另一方面，本发明提供了用于提高对象中所移植的人脐带血细胞的存活和生长的方法，所述方法包括：（a)在含锂盐的培养基中培养所述细胞；以及（b)将步骤（a)的细胞给予对象。
[0026] 适用于本发明所述方法用于提高所移植的脐带血细胞的存活和生长的锂盐的例子包括但不限于氯化锂、碳酸锂和硫酸锂。优选地，所述锂盐是氯化锂。在一些实施方式中，所述锂盐(例如氯化锂）以约O. 5至约5mM的浓度(例如约O. 5、I、I. 5、2、2. 5,2. 6,2. 7,2. 8、2. 9、3、3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4. 5或5mM)存在于所述细胞培养基中。在一优选实施方式中、所述锂盐以约3mM的浓度存在于所述细胞培养基中。
[0027] 在某些情况下，可以用锂模拟化合物培养所述脐带血细胞。另外，可以用类似于锂的精神药物培养所述脐带血细胞，例如丙戊酸、丙戊酸二钠、卡巴咪嗪、以及它们的组合。
[0028] 如上所述，可以将收集的脐带血单位基本耗尽血浆并随后可以用锂盐培养存在于耗尽血浆的脐带血单位中的干细胞。另外，可以将收集的脐带血单位基本耗尽红细胞并随后可以用锂盐培养存在于耗尽红细胞的脐带血单位中的干细胞。可以在含锂盐的培养基中使用精通本领域的人员已知的任何体外培养技术在耗尽血浆或耗尽红细胞的脐带血单位冷冻保藏之前或之后对所述脐带血干细胞进行培养。
[0029] 所述对象通常是一种哺乳动物，如人。在对象已被诊断为诸如脊髓损伤的损伤的情况下，所述培养的细胞优选脊柱内给药。
[0030] 在某些情况下，所述方法进一步包括将锂盐(如氯化锂）给予哺乳动物(如人)。所述锂盐(例如氯化锂）通常通过包括但不限于口服、鞘内、心室内、皮下、腹膜内、静脉内、以及肌内的方式给予。在一些实施方式中，所述锂盐以约lmg/kg至约150mg/kg(例如约1、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75、100、125、或 150mg/kg)的剂量给予所述对象。在一优选实施方式中，所述锂盐以约10mg/kg的剂量给药。
[0031] 本发明所述培养的细胞和锂盐可以单独或与根据给药途径和常规制药实践所选择的制药上允许的载体混合给药。作为非限制性实例，可以将常规缓冲盐溶液(例如约135-150mM NaCl)用作制药上允许的载体。其他适当的载体包括但不限于水、缓冲的水、O. 4%盐溶液、O. 3%甘氨酸等等。在例如《雷明顿制药科学》(REMINGTON S PHARMACEUTICALSCIENCES),宾西法尼亚州费城麦克出版社(Mack Publishing Co.，Philadelphia, PA),第18版，(1995))中描述了其他适用于运送本发明所述培养的细胞和锂盐的载体。
[0032] 另一个方面，本发明提供了用于降低对象中所移植的脐带血细胞排斥的方法，所述方法包括细胞移植后将锂盐给予所述对象。
[0033] 所述对象通常是哺乳动物(如人)。在对象已被诊断为诸如脊髓损伤的损伤的情况下，所述细胞优选通过脊柱内给药移植。
[0034] 适用于本发明所述方法的锂盐的非限制性实例包括氯化锂、碳酸锂、和硫酸锂。优选地，所述锂盐是氯化锂。在某些情况下，可以在细胞移植前使用体外培养技术在含锂盐的培养基中对脐带血干细胞进行扩展。所述脐带血干细胞可以从所收集的基本耗尽血浆和/或红细胞的脐带血单位中获得。
[0035] 所述锂盐(例如氯化锂）通常通过包括但不限于口服、鞘内、心室内、皮下、腹膜内、静脉内、以及肌内等方式给药。在一些实施方式中，所述锂盐以约lmg/kg至约150mg/kg(例如约 1,5,6,7,8,9,10,11, 12，13，14，15，20，25，50，75，100，125，或 150mg/kg)的剂量对所述对象给药。在一优选实施方式中，所述锂盐以约10mg/kg的剂量给药。在某些情况下,可以用锂模拟化合物或类似于锂的精神药物(例如丙戊酸、丙戊酸二钠、和/或卡巴咪嗪)对对象给药以降低所移植的脐带血干细胞的排斥。
[0036] 本发明所述的锂盐可以单独或与根据给药途径和常规制药实践所选择的制药上允许的载体混合给药。作为非限制性实例，可以将常规缓冲盐溶液(例如约135-150mMNaCl)用作制药上允许的载体。其他适当的载体包括但不限于水、缓冲的水、O. 4%盐溶液、O. 3%甘氨酸等等。在例如《雷明顿制药科学》(REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES),宾西法尼亚州费城麦克出版社，第18版，（1995))中描述了其他适用于运送本发明所述锂盐的载体。
[0037] 所述锂盐可以在细胞移植后几分钟、几小时、几天、几周、几个月和/或几年内给予对象。在一些实施方式中，细胞移植后可以用第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多剂量的相同或不同的锂盐对对象进行治疗。在某些情况下，也可以在细胞移植前和/或细胞移植过程中用I个或多个剂量的所述锂盐对对象给药。
[0039] 图I显示了证明锂促进N01. I细胞体外增殖的数据。
[0040] 图2显示了证明锂刺激N01. I细胞体外生成生长因子的数据。
[0041] 图3显示了通过定量实时PCR测定的证明锂促进N01. I细胞体内增殖的数据。
[0042] 图4显示了通过基因组PCR测定的证明锂促进N01. I细胞体内增殖的数据。
[0043] 图5显示了通过组织学分析测定的证明锂促进N01. I细胞体内存活的数据。左：嘴侧部；右：尾侧部。比例尺=lmm。
[0044] 图6显示了证明锂刺激N01. I细胞体内产生生长因子的数据。
[0045] 图7显示了证明脊髓损伤后锂对神经保护的作用的数据。
[0046] 图8显示了证明锂促进人脐带血细胞体外增殖的数据。
[0047] 图9显示了证明锂刺激人脐带血细胞体外产生生长因子的数据。
[0048] 图10显示了证明锂刺激人脐带血细胞体外生成生长因子的其他数据。
[0049] 发明详细描述
[0050] I.导言
[0051] 锂用于治疗双相型障碍和其他神经学症状已有50多年了（参见例如Manji等，Biol. Psychiatry, 46:929-940 (1999))。躁郁症患者经常需要终身摄入锂，其治疗血液浓度为约ImM。尽管如此的高浓度，锂是相对无毒的。锂对细胞具有许多潜在作用机制（Jope，Mol. Psychiatry,4:117-128(1999))。例如，锂调节包括 GSK-3、Akt、cAMP 依赖型激酶和蛋白激酶C在内的多种酶及其对应的第二信使和转录因子的活性。
[0052] 对锂对神经细胞作用的研究显示，锂可以刺激神经再生（Bustuoabad等，Medicina, 40:547-552 (1980))和神经祖细胞增殖（Hashimoto 等，Neuroscience,117:55-61 (2003))、在中风模型中诱导神经元和星形胶质细胞在受伤部位附近的增MCChuang, Crit. Rev. Neurobiol, 16:83-90 (2004))、提高胶质细胞在脑下垂体中的增殖（Levine 等，Cell Prolif.，35:167-172 (2002) ；Levine 等，Cell Prolif.,33:203-207 (2000))、刺激白细胞迁移能力(Azzara等，Haematologica，72:121-127 (1987)；Azzara等· Acta Haematol, 85:100-102 (1991))、提高海马神经祖细胞的神经元分化（Kim等，J. Neurochem.，89:324-336 (2004))、以及增强小鼠海马区中的神经形成（Laeng等，J. Neurochem.，91:238-251 (2004))。然而，这些参考文献都没有考查体内和体外锂对人脐带血干细胞产生生长因子的影响。同样地，这些参考文献没有考查体内和体外锂对人脐带血干细胞增殖和存活的影响。
[0053] 此外，锂对骨髓的作用的研究显示，锂可以提高集落刺激活性产生并加快粒细胞生成和红血球生成(Labedzki 等，Klin. Wochenschr. , 58:211-218 (1980))、降低化疗引起的对粒细胞生成和巨核细胞生成的抑制（Korycka等，Arch. Immunol. Ther. Exp.,39:501-509 (1991))、加快全身福射后的骨髓恢复（Johnke 等，Int. J. Cell Cloning,9:78-88(1991))、逆转由同时使用环戊丙酸雌二醇和乙烯雌酚所引起的骨髓发育不全和血细胞减少（Hall，J. Am. Vet. Med. Assoc, 200:814-816 (1992))、以及恢复氯氮平引起的粒细胞减少患者中的正常血细胞计数（Papetti等，Encephale. ,30:578-582(2004))。然而,这些参考文献都没有考查体内和体外锂对人脐带血干细胞产生生长因子的影响。同样地，这些参考文献没有考查体内和体外锂对人脐带血干细胞增殖和存活的影响。 [0054] 因此，本发明是部分基于在含有诸如氯化锂的锂盐的培养基中培养人脐带血干细胞可以刺激这些干细胞生成生长因子从而促进其增殖和存活这一意外发现上的。事实上，如本发明的方法所述培养脐带血干细胞成倍(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍）地提高了生长因子的表达量和干细胞数量。本发明还基于在移植前用锂盐处理脐带血干细胞提高所移植干细胞的存活和增长、以及脐带血干细胞移植后用锂盐给药降低所移植干细胞的免疫排斥这一意外发现。因此，这里所述的方法不仅允许对脐带血中所发现的有限供给的干细胞的充分扩展，而且通过例如提高所移植干细胞的存活和生长以及/或降低所移植干细胞的免疫排斥，提供了对移植受体临床结果的显著改善。
[0055] II.定义
[0056] 如这里所使用的，除非另有说明，以下术语具有归其所有的含义。
[0057] 术语“干细胞”是指具有在不确定的时间段内分裂并产生专门化细胞的能力的任何细胞。干细胞源于所有胚层（即外胚层、中胚层和内胚层)。典型的干细胞来源包括胚胎、骨髓、外周血、脐带血、胎盘血、肌肉组织和脂肪组织。干细胞可以是全能的，这意味着它们能生长和分化成体内的任何细胞。在哺乳动物中，只有受精卵和早期胚胎细胞是全能性的。另外，干细胞可以是多能的，这意味着它们能产生生物体内的大部分组织。例如，多潜能(pluripotent)干细胞可以产生神经系统、皮肤、肝、血液、肌肉、骨等等的细胞。多能干细胞的例子包括但不限于脐带血干细胞、神经干细胞、造血干细胞、脂肪衍生干细胞、间叶细胞样干细胞、胎盘衍生干细胞、乳牙衍生干细胞以及毛囊干细胞。相反，多能（multipotent)干细胞或成人干细胞通常产生有限种类的细胞。除非另有说明，这里所使用的术语干细胞包括祖细胞。
[0058] 术语“祖细胞”是指品系明确的细胞，即一种祖细胞可以产生限于单一品系的后代。祖细胞的非限制性的例子包括神经元系、肝系、肾组织系、脂肪组织系、成骨细胞系、破骨细胞系、肺泡系、心脏系、肠系或内皮系的前体细胞。
[0059] 这里所使用的术语“培养”是指将干细胞保持在其能增殖并避免衰老的条件下。例如，在本发明中，干细胞在含有锂盐和可选地一种或多种生长因子（即生长因子鸡尾酒）的培养基中培养。
[0060] 术语“刺激生长因子产生”是指使用锂盐提高来自干细胞的一种或多种生长因子的表达(例如mRNA、蛋白质)。通常，生长因子表达的提高是与在无锂盐条件下培养的对照干细胞相比而言的。如实施例I和2中所述，本发明的方法（即当干细胞在含锂盐的培养基中培养时）可以显著刺激干细胞产生生长因子。可以通过用锂盐培养干细胞所刺激的生长因子的例子包括但不限于细胞存活因子(例如神经营养蛋白、细胞因子、表皮生长因子（EGF)、血小板衍生生长因子（PDGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、胰岛素样生长因子（IGF)等等)、抗分化因子(例如白血病抑制因子（LIF)等待)、以及它们的组合。神经营养蛋白的非限制性例子包括神经营养蛋白-I (NT-1)、神经营养蛋白-3 (NT-3)、神经营养蛋白-4 (NT-4)、大脑衍生神经营养因子（BDNF)、胶质细胞系衍生神经营养因子（⑶NF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子（NGF)(例如NGFa、NGFP和NGF Y )、以及它们的组合。细胞因子的例子包括如上所述的属于白细胞介素或干扰素亚家族的那些因子。
[0061] 术语“体外扩展”是指在实验室中培养干细胞。这样的细胞从哺乳动物中提取并通过在适当环境中（例如在含锂盐的培养基中）培养产生额外的细胞量。如果可能，建立稳定的细胞系以进行细胞的连续繁殖。如实施例I和2中所述，本发明的方法(即当干细胞在含锂盐的培养基中培养时）可以显著促进干细胞的体外增殖。
[0062] 术语“提高存活和生长”是指使用锂盐促进所移植的干细胞的活力和增殖。通常， 所移植的干细胞的存活和生长的提高是与在无锂盐条件下培养和移植的对照干细胞相比而言的。如实施例I中所述，本发明的方法（即用锂处理的干细胞对哺乳动物给药）可以显著提高所移植的干细胞的存活和生长。有活力的细胞是活的并通常具有生长和分裂能力的细胞。精通本领域的人员知道确定细胞活力的方法，例如通过其排斥台盼蓝染液的能力。
[0063] 术语“降低排斥”是指使用锂盐以降低、延迟或消除所移植细胞的免疫排斥风险。通常，所移植的干细胞的排斥的降低是与在无锂盐条件下培养和移植的对照干细胞相比而言的。作为非限制性的例子，当用诸如氯化锂的锂盐对干细胞受体给药时，本发明的方法可以显著延迟所移植干细胞的免疫排斥的发作。
[0064] 术语“脐带血”是指从出生后留下的脐带血中获得的多潜能和多能干细胞的来源。在脐带血中发现的干细胞的例子包括但不限于间叶细胞样干细胞、造血干细胞和祖细胞。间叶细胞样干细胞和祖细胞通常能分化成神经细胞、骨髓基质细胞、软骨细胞、造骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、腱细胞和韧带细胞。造血干细胞通常形成淋巴系、髓系和红血球系的细胞。下文提供了用于收集和处理脐带血的方法的详细描述。
[0065] 这里所使用的术语“脐带血单位”是指从单个供体收集的脐带血的体积。本发明的方法中通常使用单个脐带血单位，但也可以使用多个脐带血单位(例如两个脐带血单位）以增加干细胞数。
[0066] 如这里所使用的，术语“基本耗尽血浆的”和“耗尽血浆的”是指其中约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 以上体积的血浆已经耗尽的处理过的脐带血单位。例如，通过离心脐带血并将细胞组分与血浆组分分开可以基本耗尽血浆。基本耗尽后残留的血浆体积通常为约0%至约30%(体积比)，优选约10%至约30%(体积比)。
[0067] 这里所使用的术语“非红细胞耗尽的”和“红细胞未耗尽的”是指其中约30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以下体积的红细胞已经耗尽的处理过的脐带血单位。
[0068] 如这里所使用的，术语“红细胞基本耗尽的”和“耗尽红细胞的”是指其中约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 以上体积的红细胞已经耗尽的处理过的脐带血。
[0069] “有核细胞”是指具有核（即含染色体DNA的细胞器）的细胞。有核细胞包括例如白细胞和干细胞。“无核细胞”包括例如成人红细胞。
[0070] 术语“锂盐”是指任何制药上允许的锂的盐。适用于本发明所述方法的锂盐的例子包括但不限于氯化锂、碳酸锂、以及硫酸锂、柠檬酸锂、羟丁酸锂、乳清酸锂、醋酸锂、铝酸锂、氢化铝锂、氨基化锂、硼酸锂、溴化锂、二异丙氨基锂、氟化锂、氢化锂、氢氧化锂、碘化锂、偏硼酸锂、钥酸锂、铌酸锂、硝酸锂、氮化锂、氧化锂、高氯酸锂、过氧化锂、硫化锂、钽酸锂、Y亚麻酸锂、以及它们的组合。优选地，所述锂盐是氯化锂。[0071 ] 术语“对象”指一种哺乳动物，如人。
[0072] 如这里所使用的，术语“给药”指通过任何包括但不限于口服、鼻内、眼内、静脉内、骨内、腹膜内、脊柱内、肌内、关节内、心室内、颅内、病变内、气管内、鞘内、皮下、皮内、透皮、 或透粘膜给药途径的诸如人脐带血细胞的干细胞或诸如氯化锂的锂盐的递送。所述锂盐通常经口服、鞘内、心室内、皮下、腹膜内、静脉内或肌内途径给药。在某些情况下，所述锂盐通过使用例如Alza公司（Mountain View, CA)提供的DUROSji■植入物植入在对象中的渗透泵给药。在某些其他情况下，所述锂盐通过缓释储库型注射给药。所述干细胞可以通过例如在疾病部位、受伤部位(例如用于治疗脊髓损伤的脊柱内给药）或诸如器官的其他目标部位直接注射或灌注给药。所述干细胞和锂盐可以同时(例如在相同时间）或先后(例如间隔几分钟、几小时或几天）对对象给药。
[0073] III.脐带血干细胞
[0074] A.脐带血的收集
[0075] 脐带血是干细胞的丰富来源，并且可以方便地以对供体无创方式获得。相反，收集用于移植的骨髓细胞是一种有创过程，其根据住院所花费的时间和金钱而言是昂贵的。优选地，通过从脐带直接排出收集脐带血。因此，婴儿分娩之后，可以将脐带双重十字夹紧并在夹钳的挤压部分上方切开，产生的脐带血管中的胎儿血流可以收集在收集容器中。在胎盘分离发生前，通常可以无需挤压脐带完成足够量的收集，并且收集过程在约2分钟内完成。需要注意避免分娩区域中母体血液、尿液或其他流体的污染。也可以通过任何本领域内已知的其他方法获得脐带血。
[0076] 针对本发明目的的供体可以包括母体供体，她们是捐赠确认书所针对的供体，并且是对实际新生供体具有监护权的母亲，其中脐带血的真实供体是新生儿。母体供体是健康状况良好并且年龄在约16至约50岁的个人。脐带血捐赠之前或之后可以收集所述母体供体的某些信息以确定供体的适宜性和不存在输血传播的传染病、遗传病和造血系统癌症。例如，可以要求所述母体供体填写医学问卷。在本发明的一种实施方式中，母体供体在捐赠前应接受医学检查。
[0077] 应当在无菌条件下进行脐带血收集。在一些实施方式中，收集时可以立即将脐带血与抗凝血剂混合。通常，约23mL至约35mL的抗凝血剂与最多约255mL脐带血（即一个脐带血单位）混合。适当的抗凝血剂包括本领域内已知的任何抗凝血剂，例如CPDA (朽1檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺苷)、CPD (柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖)、A⑶(酸-柠檬酸盐-葡萄糖）、Alsever 溶液（Alsever 等，N. Y. St. J. Med.，41:126 (1941) )、De Gowin 溶液（De Gowin等，J. Am. Med. Assoc, 114:850 (1940) )、Edglugate-Mg (Smith 等，J. Thorac. Cardiovasc.Surg.，38:573 (1959) )>Rous-Turner 溶液（Rous 等,J. Exp. Med. , 23:219 (1916))、其他葡萄糖混合物、肝素、双香豆乙酯等等。
[0078] 为了帮助脐带血处理和提高安全性，用于各种血液成分的处理袋可以是无菌血液袋系统的一部分。在一种实施方式中，在所述处理袋中的一个中整合了血浆存储溶液。此夕卜，收集袋和处理袋都可以配备有出入口和插拔式连接器。所述出入口可以用于向袋内添加材料或从袋内抽提材料。插拔式连接器可以用于临时关闭袋的导管或入口。
[0079] 脐带血通常可以在例如约O。C至约42° C之间或约15° C至约26° C之间的温度下储藏不超过约48小时。
[0080] 除了脐带血，胎盘或胎儿血可以用于获得适于培养和/或移植的干细胞。可以使用本领域内已知的任何方法收集胎盘或胎儿血。例如，使用由超声波、胎盘穿刺或胎儿镜检引导的针可以在胎盘根部从胎儿循环中获取胎儿血。通过例如在根部和扩张的静脉处从分娩的胎盘中针吸可以获得胎盘血。·[0081] 在一些实施方式中，要求产后的妇女捐献脐带血和胎盘血。联系医院并要求其参加脐带血/胎盘血收集项目。潜在的供体是通过自然分娩或剖腹产方式分娩中的和准备分娩的妇女。在美国专利No. 5，993，387中描述了一种从产后妇女中获得脐带血和胎盘血的方法，例如通过一个家庭在小孩出生前加入一个库并对出生后所要收集的脐带血干细胞的收集和保存收取费用。
[0082] 在一种实施方式中，分娩后收集并检测了脐带血和/或胎盘血。在一些实施方式中，检测确保脐带血或胎盘血适于进一步处理。检测可以包括检测胎盘以确保其完整并且不含大量胎便或脓性溢液。可以检测脐带以确定其完整地含有2条动脉和I条静脉并且没有打结或其他异常。如上所述，可以收集在可选地含有诸如柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺苷（CPDA)溶液的抗凝血剂的袋中。
[0083] B.耗尽血浆处理
[0084] 在一些实施方式中，可以按照例如美国专利公开No. 20060275271中所述的方法减少所收集的脐带血的体积。作为一个非限制性例子，首先通过在约0° C至约42° C之间、优选约15° C至约26° C之间的温度下对所述混合物加以离心可以降低所收集的脐带血的体积。进行离心从所述混合物中去除大量体积的液体(例如血浆)。优选以约IOOOg至约2500g离心约5至约20分钟，其中离心力和离心时间足以引起大部分细胞沉淀而不会引起细胞破损。离心后，去除大量体积的血浆以降低脐带血混合物体积，从而产生未耗尽红细胞的耗尽血浆的脐带血单位。基本耗尽后残留的血浆体积通常为约原体积的0%至约30%，优选为约原体积的10%至约30%。在某些情况下，耗尽血浆的脐带血单位中留有至少约IOmL的血浆。优选地,正如通过上清液血浆中的细胞计数所显示的,去除上清液时损失少于约5%的有核细胞(例如少于约5%、4%、3%、2%或1%)。
[0085] 在一些实施方式中，将耗尽血浆的单位移至冷冻用容器(例如Cryocyte®袋)，并冷却至约2° C至约8° C，保持约30至约60分钟。通过所使用的具体CryoCyte®袋的容积、冷冻保藏的细胞数量以及冷冻保藏溶液的浓度确定合适的体积。如果耗尽血浆的脐带血单位的体积太大导致该体积大于约60至约75mL，则可以使用更大的CryoCyte®袋或将样本封装在两个或更多的CryoCyte®袋中。
[0086] C.培养脐带血干细胞[0087] 可以在冷冻保藏之前或之后使用体外培养技术在含锂盐的培养基中培养存在于脐带血单位中的干细胞。已经描述了各种用于脐带血干细胞在培养基中生长的方案（参见例如 Smith 等，Br. J. Haematol,63:29-34(1986) ；Dexter 等，J. Cell. Physiol,91:335(1977) ;Witlock 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，79:3608-3612 (1982))。精通本领域的人员应该知道其他用于体外培养脐带血干细胞群的方案。
[0088] 各种因子可以与锂盐联合使用以刺激培养物中脐带血干细胞的增殖。作为非限制性例子，诸如白介素-I (IL-1)、白介素-3 (IL-3)、白介素-4 (IL-4)、白介素-6 (IL-6)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)的各种细胞因子和生长因子可以与锂盐组合使用以刺激存在于脐带血单位中的干细胞的离体扩展。
[0089] 通过本发明所述方法培养的脐带血干细胞可以不经过进一步纯化就使用。另外，通过各种本领域内已知的技术(如免疫亲和色谱、免疫吸附、FACS分选等等）可以分离所培养干细胞的特定群或亚群。作为一个非限制性例子，可以在其表达的诸如CD34、c-kit和/或CXCR-4的细胞表面标记的基础上对脐带血干细胞加以分离。 [0090] 本发明依赖于细胞培养领域内的常规技术。精通本领域的人员通过使用已知的方法学(参见例如Freshney等，《动物细胞培养》（Cimuke Of Animal C—)，第三版（1994))可以确定适当的细胞培养方法和条件。通常，细胞培养环境包括对诸如细胞生长底物、细胞密度和细胞粘着、气相、培养基和温度等因素的考虑。
[0091] 通常在已知对细胞生长最优的条件下进行孵育。这样的条件可以包括例如约37° C的温度和含有约5%C02的潮湿空气。根据所需要的结果，孵育时间可以变化很大。使用3H胸腺嘧啶脱氧核苷结合或BrdU标记可以方便地测定增殖。
[0092] 塑料皿、烧瓶、滚瓶或悬浮液中的微载体可以用于如本发明所述的方法培养脐带血干细胞。适当的培养容器包括例如多孔平板、皮氏平皿、组织培养管、烧瓶、滚瓶等等。脐带血干细胞通常以基于细胞类型的凭经验确定的最优密度生长，并当细胞密度大于最佳密度时进行传代。
[0093] 考虑到温度的地区差异，培养的脐带血干细胞通常在提供适当温度(例如所获得的细胞所属的动物的身体温度)的培养箱内生长。通常，37° C是细胞培养的优选温度。大部分培养箱加湿至近似于大气条件。
[0094] 气相的重要组成是氧和二氧化碳。通常，将大气的氧压用于细胞培养物。培养容器通常将大气排入培养箱，从而通过使用透气盖或通过防止培养容器密封进行气体交换。二氧化碳在稳定PH以及在为细胞培养基提供缓冲方面发挥作用，并通常以约1%至约10%的浓度存在于培养箱中。优选的CO2浓度通常为约5%。
[0095] 可以获得包装的、预先混合的粉末或预先灭菌的溶液形式的确定成分培养基。通常使用的培养基的例子包括但不限于Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM)、DME、RPMI1640、完全Eagle培养基、以及McCoy培养基(参见例如基博科/生命技术公司目录和参考指引(GibcoBRL/Life Technologies Catalog and Reference Guide);西格玛公司目录（Sigma Catalog))。用约 0. 5_5mM(例如约 O. 5、1、1· 5、2、2· 5、2· 6、2· 7、2· 8、2· 9、3、3· I、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、4、4. 5、或5mM)的锂盐(例如氯化锂）补充确定成分细胞培养基。在一些实施方式中，所述锂盐以约3mM的浓度存在。也可以用约5-20%血清(通常是热灭活血清，例如人、马、小牛和胎牛血清)补充确定成分细胞培养基。通常，在本发明的方法中使用10%胎牛血清（FBS)或人血清（HS)。所述细胞培养基通常具有缓冲能力以将细胞保持在pH约7. 2至约7. 4之间。所述培养基的其他补充物包括例如抗生素、氨基酸、糖(例如约5. 5-16. 7mM的葡萄糖）以及生长因子(例如EGF、FGF等等)。
[0096] IV.所培养的干细胞和锂盐的给药
[0097] 可以通过本领域内已知的任何方法将锂盐和如本发明所述方法培养的干细胞对对象给药。适当的给药方法包括例如静脉内或皮下给药、或局部投放(例如直接注射或灌注入疾病部位或其他诸如器官的目标部位)。
[0098] 这里所述的所培养的干细胞和锂盐可以单独或与制药上允许的载体混合给药。制药上允许的载体部分通过给药的具体成分(例如细胞、盐等等）以及用于所述成分给药的具体方法加以确定。因此，对于本发明所培养的细胞和锂盐的给药来说，存在大量各种适当的制药配方。作为一个非限制性例子，普通缓冲盐溶液(例如约135-150mM NaCl)可以用作制药上允许的载体。其他适当的载体包括但不限于水、缓冲的水、O. 4%盐水、O. 3%甘氨酸等等。在例如《雷明顿制药科学》 (Remington, s Pharmaceutical Sciences )，宾西法尼亚州费 城麦克出版社，第18版，(1995)中描述了其他适当的载体。如这里所使用的，术语“载体”包括任何及所有溶剂、散布媒剂、包被、稀释剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等等。短语“制药上允许的”是指当对哺乳动物(如人）给药时不产生过敏或类似的不利反应的分子实体和组合物。
[0099] 本发明的干细胞和锂盐可被制成适于给药的制剂，例如水性的或非水性的、等渗的无菌注射溶液，它可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使得该配方与目标受体的血液等渗的溶质，以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。
[0100] 可以由无菌粉末、颗粒和药片制备注射溶液和悬浮液。在本发明的背景中，对对象给药的剂量应当在对象中随时间推移足以产生有益的治疗反应。对于所培养的干细胞而言，应通过所使用的具体干细胞的功效和对象状况以及所治疗的对象的体重或表面积确定剂量。也应当通过在具体对象中具体细胞类型给药所伴随的任何不利副作用的存在、本质和程度确定所述剂量的大小。对于锂盐而言，应通过所使用的具体锂盐的功效和对象状况以及所治疗的对象的体重或表面积确定剂量。也应当通过在具体对象中具体锂盐给药所伴随的任何不利副作用的存在、本质和程度确定所述剂量的大小。
[0101] 在确定这里所述的疾病或损伤的治疗中给予所培养的干细胞有效量的过程中，医师对细胞毒性、移植反应、疾病进程、以及抗细胞抗体的产生进行评估。对于给药而言，根据对象的体重和整体健康状况，可以将本发明所培养的干细胞以有效减少或减轻与疾病或损伤相关的一种或多种症状的量给药，同时考虑到所述细胞类型在各种浓度下的副作用。可以通过单一剂量或分开的剂量完成给药。
[0102] 在一些实施方式中，本发明提供了一种用于治疗受疾病或残疾(例如脊髓损伤）困扰的对象的方法，该方法包括用如这里所述的方法收集、处理并/或培养的干细胞对对象给药。作为一个非限制性例子，可以用足以补充由于疾病或损伤而损失的细胞的量的锂刺激的干细胞对对象给药。
[0103] 在某些情况下，由于疾病需要替代的细胞是血液细胞。另外，经受针对癌症的化疗或放射治疗的对象的骨髓细胞可能被这样的治疗所破坏，从而导致发生各种传染性疾病的易感性提高。这些对象也可以用源自本发明方法的干细胞进行治疗。在某些其他情况下，所述干细胞可以用于治疗遭受脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森症、阿尔茨海默病、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎、风湿性关节炎等等所困扰的对象。所述干细胞也可以用于治疗遭受诸如白血病、淋巴瘤、贫血、多发性骨髓瘤、遗传性血液异常的疾病、以及导致免疫缺陷(例如AIDS)的疾病或治疗所困扰的对象。
[0104] 所述干细胞可以对对象单独或与其他治疗方案联合给药。在某些情况下，所述的其他治疗方案包括化疗和/或放射治疗。在某些其他情况下，其他资料方案包括至少一种生长因子，例如GM-CSF、G-CSF, M-CSF, IL-3、IL-7、EPO、TPO、IL-5或这里所述的任何其他生长因子。治疗可以是同时或先后给药。
[0105] V.干细胞移植
[0106] 在一些实施方式中，干细胞移植不需要HLA分型。在其他实施方式中，对干细胞进行HLA分型以保证与受体的相容性。HLA标记的匹配数取决于使用者的要求和干细胞的来源。例如，可以使用6个标记中具有4个、5个或6个匹配的从包括脐带血在内的胚胎或胎儿组织分离的干细胞。对于来自成人的干细胞，优选使用6个HLA标记都相容的。在一些免疫障碍的对象中，移植物对宿主反应可能受到削弱并可以使用并不完全匹配的干细胞。
[0107] 通常，在移植治疗性干细胞单位之前，耗尽或减少存在于对象中的正常干细胞群。可以使用化疗、辐射或例如美国专利No. 6，217，867中所述的其他技术使得骨髓达到适于移植物移植的要求。最后，可以使用常规方法将治疗性干细胞单位移植入患者体内。
[0108] 在一些实施方式中，干细胞与制药上允许的载体(优选水性载体）一起移植。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐溶液等等。这些溶液是无菌的并通常不含不需要的物质。治疗性干细胞单位也可以包含适当的生理条件所需的制药上允许的辅助物质，如PH调节和缓冲剂、毒性调节剂等等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、白蛋白、葡聚糖、DMS0、它们的组合等等。辅助物质的浓度可以变化很大，并且应该根据所选择的具体给药模式和对象需求主要在流体体积、粘性、体重等等的基础上加以选择。实施例
[0109] 将通过以下实施例对本发明进行更详细的描述。提供以下实施例是为了举例说明的目的，并不意味着以任何方式对本发明加以限制。精通本领域的人员应当容易地识别可以改变或修改以产生基本相同结果的各种非关键参数。
[0110] 实施例I.大鼠新生血细胞增殖和生长因子产生的锂刺激
[0111] 这一实施例显示了锂促进从新生大鼠血液中分离的干细胞（N01. I细胞)的增殖和生长因子产生。锂也提高所移植的N01. I细胞的存活和生长。
[0112] 结果
[0113] 体外。图I显示了锂促进N01. I细胞的体外增殖。将N01. I细胞在含有3mM氯化锂的生长培养基中培养7天。对两组细胞都进行细胞数计数。氯化锂组中的细胞数比对照组高359%。锂处理的N01. I细胞仍是干蛋白（Nestin)阳性的。
[0114] 图2显示了锂刺激N01. I细胞体外产生生长因子。通过定量实时PCR测定了在含或不含3mM氯化锂的条件下培养的N01. I细胞中诸如LIF、BDNF,⑶NF、NGF Y和NGF^的生长因子的mRNA水平。LIF和NGFP mRNA水平明显高于对照组。NGF y、BDNF和⑶NF的mRNA水平之间没有显著差异。
[0115] 体内。25mm高落重挫伤后立即移植GFP阳性N01. I细胞。每天用100mg/kg的氯化锂腹膜内注射大鼠2周。对照组每天用盐水注射2周。2周后处死动物用于RT-PCR和组织学分析。
[0116] 图3和4显示了锂促进N01. I细胞的体内增殖。图3中，通过定量实时PCR测定了用盐水或锂处理的NO I. I移植后两周脊髓中的GFPmRNA水平。在盐水处理的大鼠中，GFPmRNA的量可以检测到，但是非常低。然而在锂处理的大鼠中，GFP mRNA的量比盐水处理的大鼠中高1000倍。图4中，分离了所移植的脊髓组织的基因组DNA并用GFP引物对进行了基因组PCR分析。在锂处理的组织中，所扩增的GFP DNA的量显著高于对照组中所观察到的量。
[0117] 图5显示了锂促进N01. I细胞的体内存活。将GFP阳性N01. I细胞移植入受伤大鼠脊髓。2周后，处死大鼠并在Zeiss Stemi解剖显微镜下观察脊髓。在盐水处理的大鼠 中，GFP荧光强度低且弥散（图5A-B)。然而在锂处理的大鼠中，GFP荧光强度高并占据两大块区域（图5C-D)。为了进一步对GFP-N01. I细胞的分布进行评估，将相同的脊髓径向切片。在盐水处理的大鼠中，GFP阳性N01. I细胞稀少（图5E)。相反，锂处理的大鼠在挫伤中心具有大量GFP阳性N01. I细胞。
[0118] 图6显示了锂刺激N01. I细胞体内产生生长因子。为了研究锂对细胞因子产生的作用，通过定量实时PCR分析了 4组脊髓。在“损伤”和“损伤/LiCl”组中，生长因子mRNA水平没有明显变化。在“损伤/N01. 1”组中，80即、见'3和如？^1111?應水平提高。在“损伤/N01. Ι/LiCl” 组中，⑶NF、LIF、BDNF, NT-3、NGFP 和 NGFNGF YmRNA 水平显著提高。这些结果说明，在N01. I细胞存在的情况下，锂刺激生长因子产生。
[0119] 图7显示了脊髓损伤后锂对神经保护的影响。脊髓损伤后立即注射(腹腔内)氯化锂或盐水。损伤24小时后测量损伤体积。锂处理的和盐水处理的大鼠之间没有观察到显著差异。
[0120] 讨论
[0121] 检测了脊髓损伤后锂对干细胞增殖、基因表达和组织保护的影响。使用从新生大鼠血液中分离的用绿色荧光蛋白（GFP )转染的表达干蛋白的细胞系（NO I. I )，测定了锂对培养物中N01. I细胞增殖和植入受损脊髓中的N01. I细胞的影响。将N01. I细胞在3mM锂中培养导致I周后细胞数提高了 359%。在25mm挫伤后将N01. I细胞移植入大鼠脊髓的情况下，它们没有脱离控制生长并且遵守脊髓的灰质-白质界线。移植两周后，检测移植部位的GFP mRNA水平。在盐水处理的大鼠中，可以检测到GFP mRNA，但量很低。然而在锂处理的大鼠中，GFP mRNA的量比盐水处理的大鼠中的高1000倍。组织学也显示用锂处理的受损脊髓中具有更多的GFP阳性细胞。锂处理的大鼠中诸如⑶NF、LIF、BDNF、NT-3、NGF@和NGFy的生长因子的mRNA量也较高。因此，这一实施例说明，通过在体内促进细胞增殖和刺激生长因子表达，锂可以用于提高所移植的干细胞的存活和生长。因此对于接受干细胞移植的患者的组合治疗是理想的。
[0122] 方法
[0123] 细胞特征。从野生型新生（PO) Sprague-Dawley (SD)大鼠的血液中分离NOl细胞并用DMEM、10%FBS、EGF和bFGF培养。6周时，60%的NOl细胞是干蛋白阳性的。克隆检验后，选择具有100%干蛋白阳性的称为N01. I的亚克隆。N01. I可以长时间培养而不会发生形态或干蛋白标记的改变。当从生长培养基中去除血清时，N01. I细胞形成类似于由神经干细胞所形成的神经球的球状结构（Sun,第一届干细胞研究科学年会QstAnnual ScientificMetting on Stem Cell Research),新泽西,2004)。
[0124] 体外培养。N01. I细胞用3mM氯化锂在DMEM、10%FBS、bFGF和EGF中在37。C、5%C02的加湿培养箱中处理7天。
[0125] 体内脊髓损伤/细胞移植。用绿色荧光蛋白（GFP)转染N01. I细胞。使用77+1天大的SD大鼠。制造挫伤（MASCIS撞击器，25mm高)，随后用与Hamilton注射器相连的玻璃微移液器在距离挫伤部位2mm的两个位置上合计脊柱内注射200，000个细胞（100，000个细胞/yL)。
[0126] 体内锂治疗。每天将氯化锂以每次注射100mg/kg的量腹膜内给药两周。
[0127] 定量实时PCR。为了评估移植后两周所植入的GFP阳性N01. I细胞的细胞存活，通 过 SYBR 绿色荧光在 Applied Biosystems 7900HT 实时 PCR 系统（Foster City，CA)上测量GFP mRNA的量。测量了 N01. I细胞移植后脊髓中LIF、BDNF、NT3、⑶NF、NGF Y和NGF^的mRNA水平。
[0128] 损伤体积（LV)。为了评估锂对组织保护的作用，根据以下公式测量了损伤后24 小时的损伤体积：LV=0. 75-([K]t_4)/120x 体重（Constantini 等，J. Neurosurg.，80:97-111(1994))。
[0129] 实施例2.人脐带血细胞增殖和生长因子产生的锂刺激
[0130] 这一实施例显示了锂促进从人脐带血细胞所分离的干细胞的增殖和生长因子产生。
[0131] 图8显示了锂在体外促进人脐带血细胞增殖。从新鲜的人脐带血中分离人单核细胞并在含有或不含有3mM氯化锂的含有胎牛血清（FBS)的生长培养基中培养。在为期8周的研究过程中，在锂处理的培养物中的细胞数比对照培养物中的高。虽然5周后在锂处理的和对照培养物中的总细胞数都降低了，第8周时锂处理的培养物中明显具有更多细胞。
[0132] 图9显示了锂在体外刺激生长因子生成。从新鲜的人脐带血中分离人单核细胞。细胞在含有或不含有3mM氯化锂的含有FBS的生长培养基中培养。在第2和第4周进行定量实时PCR以评价生长因子mRNA水平。与对照培养物相比，第4周时锂处理的培养物的生长因子mRNA水平(例如⑶NF、LIF、BDNF, NT-3、NGF β和CNTF)提高了 2-5倍。
[0133] 图10显示了锂在体外刺激生长因子生成。从新鲜的人脐带血中分离人单核细胞。细胞在含有或不含有3mM氯化锂（Li)的含有人血清（HS)的生长培养基中培养。在第I和第2周进行定量实时PCR以评价生长因子mRNA水平。与对照培养物相比，在两个时间点上锂处理的培养物都表现出生长因子mRNA水平(例如BDNF、CNTF,⑶NF、LIF、NGF β和ΝΤ-3)的显著提高。
[0134] 应当理解，以上描述是说明性的而不是限制性的。通过阅读以上描述，许多实施方式对于精通本领域的人员来说是显而易见的。因此，本发明的范围不是通过以上描述确定的，而是应当通过附属的权利要求以及这样的权利要求所享有的权利的全部范围的等价物所确定的。针对所有目的，包括专利申请、专利、PCT公开以及Genbank登录号在内的所有文章和参考文献通过应用整合在本说明书中。
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