平清肌鈿胞增殖的调节

本发明涉及平滑肌细胞增殖的调节，尤其是涉及血管内皮生长因 子在增强平滑肌细胞增殖，及治疗与平滑肌细胞增殖减少相关疾病上 的新应用。

PDGF/VEGF生长因子家族包含许多结构上相关的生长因子。该家族 成员含有一个保守的富含半胱氨酸的区域，即半胱氨酸结（Sun， P.D. 1995)，它通过链间二硫键共价连接，形成二聚体（Potgens et al. 1994， Andersson et a1.1992 )。血小板来源的生长因子（PDGF)对包 括成纤维细胞和平滑肌细胞在内的结締组织细胞具有促有丝分裂活性

(综述于Heldin et a1.1999 )。 PDGF由相异的A链和B链的异二聚体 组成，并激活两个受体酪氨酸激酶，PDGFR-a和PDGFR-P。 PDGF mRNA 在正常细胞类型范围内被表达，并可能涉及肿瘤发生及其它疾病过程

(Heldin et al. 1999 )。此外，PDGF-B基因作为v-sis致癌基因由 转化逆转录病毒携带（Devareeta1.，1983 ),表明其过度表达可致癌。 血管内皮细胞生长因子涉及新血管形成及血管通透性（综述于 Ferrara & Davis-Smyth, 1997, Neufeld et al., 1999 )。到目前为止， 五种内源VEGFs (VEGF-A， -B， -C， -D和胎盘生长因子（PLGF ))已被 描述过。VEGF的信号传递是通过一个受体酪氨酸激酶家族（Ferrara & Davis-Smyth, 1997, Neufeld et al. ， 1999 )进4亍的，尽管最近显示神 经菌毛素1也是VEGF-A的一些同工型的受体（Soker et al., 1998)。

VEGF-A在若干包括心脏、胎盘和胰腺的正常组织中被表达（Berse et al., 1992 )。在许多肺瘤中VEGF-A显示出被过度表达（Takahashi et al.，1995 ),并且在动物模型中，VEGF-A作用的抑制显示出会导致肿 瘤的消退（Kim et al.， 1993 )。 VEGF-A也与其它涉及不恰当血管发生 的疾病过程相关（Folkman 1995 )。 VEGF-B mMA在正常组织中的表达 与VEGF-A的表达重叠，但在中枢神经系统中也是可检测的

(Lagercrantz et al.， 1998 )。 VEGF-C以低于VEGF-A和VEGF-B的表 达水平被表达（Lagercrantz et al.， 1998 )，但在一系列组织中可以 检测到（Lee et al. 1996 ， Fitz et al.， 1997 )。 VEGF-D在肺、心

脏和小肠中强表达，且在若干其它组织中也可以检测到（Yamada et al.，1997 )。

通过检索EST数据库，结果鉴定了 一个VEGF/PDGF家族新成员。所 鉴定的多肽序列含一个N-末端CUB结构域和一个C-末端PDGF结构域， 该多肽被命名为血管内皮生长因子-X(VEGF-X;专利WO 0037641; EMBL 编号AX028032 )。相同序列最近被公布，并显示具有PDGF活性（Li et al.， 2000 ),被命名为PDGF-C，这两种命名可交替使用。Li等人发现 PDGF-C的C-末端PDGF结构域具有PDGFR结合活性，并刺激成纤维细 胞增殖，反之，全长PDGF-C不显示该活性。他们提出一种模型，该 模型中，CUB结构域的功能是作为PDGF结构域的抑制物：激活作用是 通过蛋白质水解以释方文活性PDGF-C。

在尿道和膀胱壁中，平滑肌细胞在控制膀胱功能上起着重要作用。 已证实平滑肌细胞数量的增加可治疗充溢性尿失禁和膀胱功能障碍 (Yokoyama et al.， 2000 )。作为一种治疗方法，可直接注射平滑肌 细胞（成肌细胞）于尿道和膀胱壁中，以增加细胞数量。

另一方面，已知动脉平滑肌细胞增生会导致多种疾病，且阻断这

种不希望有的细胞水平事件的试剂可用于对这些疾病的药物定向治疗 中。动脉粥样硬化， 一种大动脉的疾病，是心脏病及中风的主要原因。 在西方社会，它是大约50%死亡的基本原因。动脉粥样硬化症是一种 进展性疾病，该病的特征是在大动脉中积累了脂类及纤维成分。血管 壁细胞，尤其是平滑肌细胞（SMCs)的过度生长，促成了动脉粥样硬 化症的发病（Lusis， AJ, 2000 )。 一种可阻断平滑肌细胞增殖和迁移 的治疗方法足以预防内膜增生，并也可促进血管愈合过程。在当前血 管介入环境中，高的再狭窄率提高了对内膜增生，即一种在血管壁损 伤后出现的慢性结构病变的重要性的注意，该结构病变可引起腔狭窄 和血管闭塞。内膜增生被定义为血管平滑肌细胞的异常迁移和增殖， 并伴随细胞外结締组织基质的沉积（Hagen P.O., et al. 1994 )。心脏 移植动脉粥样硬化是限制受体长期存活的主要原因之一。其特征是由 增殖的平滑肌细胞组成的内膜增厚，由于动脉壁的广泛损伤，这种内 膜增厚可能发生在吻合位点（Suzuki J. et a1.2000 )。对平滑肌细胞 病理性过度增殖的预防可被用于减少愈合微动脉吻合时的内膜增生， 及移植动脉的内膜增生（Robert C., et al., 1995 )。抑制平滑肌细

胞外膜细胞的生长将有助于减少由冠状动脉血管成形术引起的新内膜 增生。在糖尿病受试者的膀胱病变中，膀胱或肾肥大和肾增生是公认 的。平滑肌的过度增殖也能由于慢性和/或急性膀胱出口阻塞而引起

膀胱和肾功能不可逆的改变（Mumtaz FH， et al 2000)。

现在已经令人惊讶地发现，重组的全长VEGF-X和CUB结构域蛋白

CUB结构域除了维持PDGF结构^域潜伏状态的作用外还具有一个功能。 因此，VEGF-X及提高平滑肌细胞增殖的CUB结构域可能在治疗尿失禁、 膀胱功能障碍与其它由平滑肌细胞组成的括约肌的功能障碍上具有优 势。在重建骨盆底时，也可利用VEGF-X和CUB结构域以改善平滑肌 功能。

因此，根据本发明的第一个方面，提供了编码VEGF-X多肽或其功 能等同物、衍生物或变体的核酸分子在制造可于体内或体外刺激平滑 肌细胞增殖的药物上的应用。优选地，VEGF-X多肽序列如闺1 (a) 所示。本发明也提供了 VEGF-X的CUB结构域或功能等同物、衍生物 或其变体于体内或体外刺激平滑肌细胞增殖的应用，该CUB结构域的 优选由如图l(a)所示40 - 150位的氨基酸序列组成。上述多肽、CUB 结构域和核酸分子也可被用作药物，或用于制备可治疗尿道功能障 碍、膀胱功能障碍、括约肌功能障碍或其它与功能性VEGF-X或CUB 结构域蛋白质表达降低相关的疾病或状况的药物，或用来制备用于骨 盆底重建的药物。本发明的另一方面提供了 VEGF-X或其CUB结构域 在体内或体外组织工程应用中，用平滑肌细胞构成基质的用途。

本发明的DNA分子可被方便地包含在适合的表达载体中，以在适合 的宿主中表达由其编码的VEGF-X。如Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press所提供的，将克隆DM掺入适合的表达栽体，以进熟知。

本发明的表达载体包括具有一个本发明的核酸的载体，该核酸可 操作地连接于能够影响所述DNA片段表达的调控序列上，例如启动子 区。术语"可搡作地连接"指一种并置关系，其中所描述的成分处于 一种允许它们以其指定方式发挥功能的关系当中„这样的载体可被转

化到适合的宿主细胞中，以表达本发明的多肽。

这种表达栽体也可被用于刺激平滑肌细胞增殖，并也可被用在对

本发明的包括尿道功能障碍、膀胱功能障碍或其它与功能性VEGF-X 蛋白质表达减少相关疾病在内的疾病或状况的治疗中。

本发明的多肽可以是重组的、合成的或天然存在的，但优选是重 组的„同样，可采用重组或合成技术，例如，采用PCR克隆原理，制 备本发明的核酸序列。

根据另一方面，本发明提供了含有治疗有效量的本发明多肽的药 物组合物的应用，该组合物包含例如：多肽的可溶解形态、或本发明 的核酸分子、或掺入了与药学可接受载体或赋形剂结合的所述核酸分 子的载体。这样的载体包括，但不仅限于：盐水、緩冲盐水、右旋糖、 水、甘油、乙醇、及其组合。根据发明的这一方面，药物组合物可被 用于刺激在组织和器官中的平滑肌细胞增殖，或可选地，治疗或预防 尿道、膀胱或括约肌的功能障碍，或与发明的VEGF-X多肽的异常内 源性活性相关的功能障碍中的任意一种。

本发明进一步涉及药物包装和试剂盒，二者含一个或多个充满一 种或多种上述发明组合物的成分的容器。多肽及其它本发明的化合物 可被单独应用或与其它化合物，例如治疗化合物联合应用。

本发明的蛋白质或多肽（此处两种术语可交替使用）此处被定义 为：包括由本发明的核酸分子编码的所有可能的氨基酸变体，包括被 所述分子编码的多肽，且具有保守氨基酸改变。保守氨基酸取代指在 一种蛋白质中的一个或多个氨基酸的替代，该替代并不影响蛋白质的 功能或表达。本发明的蛋白质或多肽此处被进一步定义为包括这种序 列的变体，包括天然存在、基本上与所述蛋白质或多肽同源的等位变 体。在上下文中，基本同源性被看作是至少有70%、优选80%或90%和 优选95%的氨基酸与本发明的核酸分子编码的蛋白质或多肽同源的序

列。本发明的蛋白质或多肽的"功能等同物"包含所有如本发明方法和 应用所要求的、上文中预见的显示VEGF-X活性的氨基酸和等位变体。 本发明的蛋白质或多肽可以是重组体、合成物或天然存在的，但优选 是重组的。

本发明的蛋白质或多肽此处也被定义为包括所述蛋白质或多肽的 生物前体。该生物前体是能够在生物过程中被转化成具有如发明所要

求的VEGF-X活性的蛋白质或多肽的分子。发明的核酸或蛋白质可被 用作药物，或用于制备治疗癌症或其它与VEGF-X蛋白质表达相关疾 病或状况的药物。

本发明的核酸分子或蛋白质可连同其药学可接受栽体、稀释剂或 赋形剂被方便地提供在药物组合物中。

本发明进一步涉及通过采用反义技术在体内抑制VEGF-X。通过反 义DM或RNA的三螺旋结构形成，反义技术可被用于控制基因表达， 两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的键合。例如，编码本发明蛋 白质的5，编码部分或成熟DNA序列，可被用于设计一种长度为10-50 个碱基对的反义RM寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成与涉及转录的 基因的一个区域互补（三螺旋-见Lee et al. Nucl. Acids Res.， 6:3073 (1979); Cooney et al. ， Science, 241: 456 (1988);以及Dervan et al.， Science, 251:1360 (1991))，从而阻止VEGF-X的转录及产 生。

因此，本发明也提供了一种治疗或预防动脉粥样硬化症、因动脉 吻合术或球嚢导管导致的新内膜增生、因经皮经腔冠状血管成形术后 的动脉扩张（stenting)导致的血管成形术后再狭窄中的任意一种的方 法，该方法包括：给予所述受试者一定量的与编码VEGF-X多肽的核 酸分子反义的多核酸分子，例如可杂交与图1 (a)的核酸，或其在高 严格性条件下的互补序列杂交的反义多核苷酸分子，其浓度足够治疗 或预防所述病症。

高严格性条件通常包括：温度超过30t:、典型地超过37TC、优选 地超过45'C。严格的盐条件通常低于lOOOmM，典型地低于500mM，优 选地低于200mM。

根据给药途径，例如通过全身或口服途径可调整组成。全身给药 的优选形式包括注射、典型地通过静脉注射。其它注射途径，如皮下、 肌内或腹膜内也可被采用。

全身给药的可选方法包括：采用渗透剂，如胆盐或梭链孢酸或其 它去污剂，经粘膜和经皮给药。另外，如果本发明的多肽或其它化合 物可被制剂化为肠道制剂或胶囊化制剂，口J3良给药也是可能的。这些 化合物的给药也可是体表的和/或局部的，以药骨、糊剂、凝胶等形 式。

所需的剂量范围取决于本发明的肽或其它化合物的选择、给药途 径、制剂的性质、受试者状况的性质、及参与的实施者的判断。尽管

如此，合适的剂量仍在0.1-100mg/kg受试者体重范围内。不过，鉴 于可用化合物的多样性及不同给药途径的不同功效，仍然期望在需要 剂量上有广泛的变化。

例如，口服给药预期需要的剂量高于静脉注射给药的剂量。正如 本领域内所熟知的，这些剂量水平上的变化可采用标准经验程序调整 优化。

此处所用的术语"治疗有效量"，意指本发明的VEGF-X、或其它活 性物质的量，当根据预期治疗计划给药时，该剂量会得到预期的治疗 效果或反应、或提供希望的益处。

优选的治疗有效量是可刺激平滑肌细胞增殖的量。

此处所用的"药学可接受的"意指从毒性或安全的角度出发，通常 适合于对哺乳动物，包括人类给药。

本发明中，VEGF-X蛋白质典型地给药一段足够的时间，直到达到 预期治疗效果。此处所用"直到达到预期治疗效果"，意指根据选择 的给药方案，持续给予一种或多种治疗剂，直到临床医生或研究者观 察到被调节的疾病或状况有寻求的临床或医学效果的时间为止。对本 发明的治疗方法而论，化合物被持续给药直到在骨质或结构上观察到 有预期的变化为止。在这些实例中，预期的目标是达到平滑肌细胞的 增加。对降低疾病状态或状况危险的方法而论，只要需要就尽可能长 时间地持续给药化合物，以预防不希望发生的状况。

明的范^内。、、 曰 ' 、、、

"多核苷酸，，通常指任何多聚核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可 以是未修饰的RM或DM，或修饰的RNA或DNA."多核苷酸，，不加限 制地包括：单链和双链DNA、单链和双链区混合物DNA、单链和双链RNA、 及单链和双链区混合物RNA、杂交分子，该杂交分子包含可以是单链、 或更典型的是双链、或单链与双链区域混合物的DNA或RNA。另外，"多 核普酸"指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。

术语"多核苷酸"也包括含有一个或多个已修饰碱基的DNAs或 RMs，及为了稳定性或其它原因而修饰过主链的DMs或RNAs。"已修

饰，，碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基、非常见碱基如次黄噪呤核

苷。对DNA和RNA可进行若干种修饰；这样，"多核苷酸"包括自然

界中典型发现的多核苷酸的化学、酶学或代谢的修饰形式，也包括病 毒和细胞的特征性的DNA和RM的化学形式。"多核苷酸"也包括相 对短的多核苷酸，常常指寡核苷酸。

"多肽，，指任何含有两种或两种以上，通过肽键或已修饰肽鍵彼此 连接的氨基酸的肽或蛋白质，即，肽等排物。"多肽"指短链和长链， 短链一般指肽、寡肽或寡聚物，长链通常指蛋白质。多肽可含有除了 20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。

"多肽"包括通过自然方法，如翻译后加工，或通过本领域内已熟 知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这些修饰方法在基础课本、更 为详细的专著、及大量文献中有很好的描述。修饰可以发生在多肽的 任何位置，包括肽主链，氨基酸側链和氨基或羧基末端。应当理解在 特定多肽的若千位点上，相同类型的修饰可能表现相同或不同的程 度。同样，特定多肽可含有许多修饰类型。多肽可由于遍在蛋白化作 用而有分支，且可为具有或无分支的环状。环状、分支和分支的环状 多肽可由翻译后自然加工产生，或通过合成方法制成。修饰包括乙酰 化作用、酰化作用、ADP核糖基化作用、酰胺化作用、黄素的共价连 接、亚铁原卟啉部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、 脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化 作用、二硫键形成、脱甲基作用、共价交联形成、半胱氨酸键形成、 焦谷氨酸盐形成、甲酰化作用、Y羧化作用、糖基化作用、GPI锚形 成、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、豆蔻跣化作用、氧化、蛋 白水解加工、磷酸化作用、异戊二烯化作用、外消旋作用、硒化作用、 硫酸化作用、转运RM介导的氨基酸添加到蛋白质，例如精氨酰化作 用、及遍在蛋白化作用（见，例如，PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nc Ed. ， T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F. ， Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pages. 1-12 in POSTTRANSLAT醒L COYA固T MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed" Academic Press, New York, 1983; Selfter et al.， "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors，，, Meth Enzymol (1990)

182: 626—646 和 Rattan et al. ， "Protein Synthesis: Post— translational Modifications and Aging，，, Aim NYAcad Sci (1992) 663:48-62)。

含有任何上述修饰的多肽可被描述为本发明的蛋白质或多肽的"衍 生物"。

本发明进一步涉及用于鉴定VEGF-X生物学活性的抑制剂的筛选方 法。这些抑制剂包括中和性VEGF-X抗体、反义VEGF-X序列或与VEGF-X 生物学活性竟争的非蛋白拮抗剂。适合的抗体可由适当的免疫原，例 如分离的和/或重组抗原，或其部分（包括合成分子，如合成肽），或 表达重组抗原的宿主细胞刺激产生。另外，表达重组抗原的细胞，如 转染细胞，可被用作免疫原，或用于对结合受体的抗体进行筛选（举 例见，Chuntharapai et al， J Immunol., 152.-17831-1789 (1994)。

抗体产生细胞，优选的是脾或淋巴结的那些抗体产生细胞，可获 得自经感兴趣的抗原免疫过的动物。融合细胞（杂交瘤）可采用选择 性培养条件进行分离，并通过有限稀释进行克隆。可通过适合的分析 方法（例如：ELISA)选择出产生具有期望特异性的抗体的细胞。

因此，本发明也提供了治疗或预防动脉粥样硬化症、因动脉吻合 术或球嚢导管导致的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后 动脉扩张导致的血管成形术后再狭窄中的任何一种的方法，该方法包 括给予上述受试者一定量的能结合于如图l(a)中所示VEGF-X多肽， 或其表位的抗体，其浓度足够治疗或预防上述病症。

适用于本发明的抗VEGF-X抗体的特征在于高亲和力结合于VEGF-X 受体。抗VEGF-X的抗体可通过吸入法给药（如，加入吸入剂或喷雾 剂中，或作为喷雾的薄雾）。其它给药途径包括鼻内、口服、包括输 注和/浓注（bolus)的静脉内、真皮下、经皮的（如，在緩释聚合物 中）、肌内、腹膜内、皮下、局部的、硬膜外、颊等途径。也可采用 其它适合的给药途径，例如，通过上皮、或粘膜皮肤衬细胞达到吸收 的目的。抗体也可通过基因疗法给药，其中编码特定治疗蛋白质或肽 的MA分子可通过，例如载体的方法给予病人，该载体可引起特定蛋 白质或肽在体内于治疗水平被表达和分泌。另外，抗VEGF-X抗体可 连同其它生物学活性试剂的成分给药，如药学可接受表面活性剂（例 如，甘油酯），赋形剂（例如，乳糖），载体、稀释剂和运载体。抗VEGF-X

抗体可在其它治疗方案或试剂（如，多药物方案）之前、同时或序贯

地，预防性或治疗性地给个体用药。与其它治疗剂同时给药的抗VEGF-X 抗体，可以在相同或不同组合物中给药。抗VEGF-X抗体可与药学可 接受肠胃外运载体一起被制剂化成溶液、悬液、乳剂或冻干粉。

VEGF-X抗体的治疗有效量可根据症状性质和范围、同时进行的治 疗、及预期效果等因素以单次或分开剂量给药（如，按日、周或月的 时间间隔分成系列剂量），或以持续释放形式给药。

另一方面，提供了激动剂和拮抗剂的筛选检验方法，该方法包括： 测定候选化合物对本发明的VEGF-X或CUB结构域多肽结合于VEGF-X 受体的效果。特别地，该方法包括：将VEGF-X受体与本发明的VEGF-X或CUB结构域多肽和候选化合物接触，并且确定VEGF-X或CUB结构 域多肽与VEGF-X受体的结合是否由于候选化合物的存在而增加或减 少。在这个测定方法中，VEGF-X或CUB结构域多肽的结合超过标准结 合的增加，表明候选化合物是VEGF-X或CUB结构域的激动剂。与标 准相比，VEGF-X或CUB结构域多肽结合的减少表明化合物是VEGF-X 或CUB结构域的拮抗剂。

从下列实施例，并参考附图，可以更清晰地理解本发明。其中：

图1 ( a )是PDGF-C的cDNA序列"i兌明。预测的PDGF-C翻译产物示 于序列上方，预测信号序列加有下划线。预测的mRNA剪接剪切事件 实心发生部位以实心三角形指示。通过对分离的BAC克隆直接测序， 或者通过与EMBL数据库中的部分BAC序列比较的方法推断mRM剪切 事件的位置（来自AC0015837的nt. 1-374的区域，公布日期2000年 4月7日，来自AC009582的nt. 375-571的区域，公布日期2000年4 月5日）。对斜体指示的nt.900-957区域而论，目前为止还没有关于 剪切事件的资料。从通过PCR分离的变异序列推断，隐蔽剪切供体/ 受体位点位于nt.719/720和988/989 (空心三角形）。多肽序列中的 潜在N连接糖基化位点于方框中表示，且从小于预期长度的PCR片段 预测（b)变异PDGF-C蛋白质序列-多肽序列。克隆并测序覆盖该区域 的PCR片段，以展现如图1 (a)所示的隐蔽剪切供体/受体位点。

图2是PDGF-C结构域与数据库序列比较说明-. (A )用其它的人类PDGFs和VEGFs的PDGF结构域与PDGF-C的PDGF 结构域进行比对。

(B )用BMPs和神经菌毛素的CUB结构域与PDGF-C的CUB结构域 进行比对；蛋白质如指示所示，来自X. laevis,小鼠或小鸡。

所有结构域序列来自PFAMA数据库（Rocchigiani， M. etal.， （1998) Genomics 47， 204-216 )，并采用CLUSTALW比对程序进行比对 (EMBL， Heidelberg, Germany),表1总结了图2显示的蛋白质区域的 比较结果。从这些比较中，可以清楚地看出：CUB结构域与其它数据 库序列的相似程度高于PDGF结构域与其它数据库序列的相似程度。

图3是从PDGF-C的mRNA表达获得的结果图示说明：

(A) 组织和癌细胞系中的PDGF-C mRNA分布的RNA印迹分析。 采用P肌动蛋白cDM探针进行的对照杂交表明在每一泳道中有等量 的mRNA。 PDGF-C mRNA的位置已指示出。

(B) 来自组织和癌细胞系的cDM的PCR分析。对照采用设计 用于扩增部分甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA的引物，表明在扩增反应中 存在等量的每种cDNA (未显示）。

图4是从PDGF-C (VEGF-X)基因座的FISH图谱获得的结果的图示

说明-显示了一个实例：左边显示的是在人类染色体上的FISH信号， 右边显示的是用4，，6-二脒基-2-苯基p引哚（DAPI)染色的相同有丝分

裂图，以鉴定人类染色体4。同时还显示了图解总结：每一圆点代表 在染色体4上检测到的双FISH信号。

图5是PDGF-C重组蛋白质特性的图示说明：

(A)糖基化&链间二硫化物形成。用表达全长PDGF-C的杆状病毒 感染T.ni Hi5细胞。杆状病毒感染的昆虫细胞培养基样本处理如下： 泳道1-酶緩冲液+N-糖香酶F;泳道2-酶緩沖液，无N-糖苷酶F;泳 道3-还原的；泳道4-非还原的。蛋白质印迹后的检测采用抗His6抗 体，以检测导入的C-末端表位标记。

(B)肝素结合。已纯化的大肠杆菌来源的全长MBP融合蛋白经过 SDS-PAGE，并用考马斯蓝染色凝胶。泳道1-用于肝素柱的上样部分， 泳道2-洗柱，泳道3-高盐洗脱。

(C)全长和CUB结构域-由大肠杆菌制备的PDGF-C全长融合蛋白 (泳道1)和CUB结构域（泳道2)样品经考马斯染色的SDS-PAGE。 通过不溶物质的重折叠制备CUB结构域：在采用抗-Ms6抗体的蛋白 质印迹实验中，20和25kDa的主带均被检测到，因此推断25kDa类型

含有未剪切信号肽。分子量标准以kDa为单位指示于左侧。

图6是PDGF-C (VEGF-X)或PDGF-C CUB结构域对人类冠状动脉平

滑肌细胞增殖的效果图示。细胞经所示浓度的大肠杆菌来源的CUB或 全长PDGF-C蛋白质处理。 材料及方法

VEGF-X的cDM和部分基因组克隆化

基于已知VEGF序列（VEGF-A、 B、 C和D)中的PDGF样结构域对图形 显影aee et al. ， 1996)，并将之用于检索LifeSeq™人类EST数据 库（Incyte Genomics Inc. Palo Alto， CA， USA),检索显示出VEGF 家族的潜在新成员的部分序列。为延伸cDNA序列，采用Marathon-Readya胎盘和骨骼肌cDNAs进行5，RACE (Clontech， Palo Alto， CA, USA)。然后采用标准聚合酶链式反应方法扩增全长编码序列（Fitz et al.,1997 )。将PCR片段克隆进载体pCR2.1 (Invitrogen， Carlsbad, CA.USA)或pCR2. l-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA. USA)中。测序多 个克隆以确定编码序列；所有的亚克隆也同样通过DM测序进行验证。 为获得部分基因组克隆，通过与来源于PDGF-C cDNA序列的寡核苷酸 进行杂交，以筛选人类染色体组BAC基因库（Genome Systems, Inc., St Louis, MI， USA)。为确定内含子/外显子边界，直接采用基于已知cDNA 序列的20-mer测序引物对BAC DM进4亍测序。采用Qiagen质粒midi 试剂盒制备BAC DNA (Qiagen GmbH, Diisseldorf， Germany )。 VEGF-X基因的染色体定位

染色体图傳的研究由See , Biotech Inc. (Toronto, Canada) 采用如以前描述的生物素化的2.7kb探针（Yamada et al., 1997; Gribsteor et al. , 1987，Ausabel et al., 1997 )的FISH分析进行。 通过MA印迹和RT-PCR对VEGF-X mRM表达的分析

将含有来源自不同人类组织的2pg富含poly(A)+的RM的RNA印 迹（Clontech Laboratories; MTN™ blot， MTN™ blot II和癌细胞系 MTNTMblot)与a-[32p]-dCTP随机引物标记的（Multipri瓜e labelling 试剂盒，Roche Diagnostics) 293bp的特异性PDGF-C片段(包括PDGF-C 的3，末端编码区的92bp和3，非翻译区的201bp的PinAI-StuI片段） 杂交。将印迹于681C杂交过夜，并在68匸于0. lx SSC/0. 1%SDS中进 行高严格性的最终洗涤。用增强屏将膜进行1-3天的放射自显影。

就RT-PCR分析而论，采用寡核香酸引物GTTTGATGAAAGATTTGGGCTTG和 CTGGTTCAAGATATCGAATAAGGTCTTCC对来自PDGF-C的350bp片段进行特 异性PCR扩增。PCR扩增是在人类多组织cDNA (MTC™)板（Clontech 人MTC板I和II以及人肿瘤MTC板）上进行，该板标准化为6种不 同管家基因的mRNA表达水平。另外，cDNA由不同肿瘤细胞培养物制 得（Caco-2结直肠腺癌；T-84结肠直肠癌；MCF-7乳腺腺癌；T-47D 乳腺导管腺癌；HT1080骨纤维肉瘤；Sa0S-2骨肉瘤；SK-N-MC成神经 细胞瘤；HepG2肝胚细胞瘤；JURKAT T细胞白血病和THP-1髓单核细 胞白血病）。为制备肿瘤细胞cDNA，将细胞匀浆化，并采用RNeasyMini 试剂盒制备总RM (Qiagen GmbH， Hilden， Germany )。采用寡(dT) 15 为引物，及50U的Expand™逆转录酶（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)对l网的总RNA进行逆转录。然后用PDGF-C特异性或甘油 醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH)特异性引物对ljal该cDM进行PCR反应。 对所有cDMs，用PDGF-C特异性引物进行的PCR反应于50|al总体积 中进行。加热样品至95t:，持续30s，并且完成25、 30或35个循环 操作，每循环包括于951C 30s， 681C 30s。同时进行对照反应，该反 应采用了用于扩增管家基因G3PDH的lkb片段的特异引物。 重组蛋白质的表达、纯化和检测

对哺乳动物细胞表达而论，扩增全长编码序列，并将其克隆进载 体pcDNA6/V5-His ( Invitrogen, Leek, Netherlands)以添加一个C 末端His6肽标记，以便辅助检测与纯化。对大肠杆菌表达而论，PCR 扩增预测的成熟蛋白质（Glu23-Gly345 )的编码区，以添加一个C末 端Hise肽标记，然后将其克隆进栽体pMAL-p2(New England Biolabs， Beverly, MA， USA)。将得到的MBP融合蛋白质首先在镍螯合树脂（Ni-NTA， Qiagen GmbH, Diisseldorf, Germany)上，然后于直链淀粉树脂 (New England Biolabs, Beverly, MA)上进行纯化。PCR扩增编码 了 PDGF-C (Glu23-Val171)的CUB结构域片段的DNA序列，以添加一 个C末端HiSe肽标记，并将其克隆进pET22b(Novagen， Madison, WI) 中，用于在大肠杆菌中的分泌。通过标准方法（Fitz et al.， 1997 ) 从诱导培养物的周质或不含细胞培养基中制备CUB结构域蛋白质。通 过用20°/。饱和的硫酸铵沉淀初步纯化蛋白质。用20raMTris pH8. 0， 300mM NaCl透析过夜，以去除硫酸铵，然后采用前述的镍螯合树脂进一步纯 化蛋白质。采用N-糖苷酶F( Roche Molecular Biochemicals, Brussels, Belgium)进行蛋白质糖基化分析。根据制造商使用说明使用肝素琼 月旨糖柱(HiTrap, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 在其用于基于细胞的分析前，采用可商购试剂盒（COATEST②Endotoxin, Chromogenix AB， Sweden)检验蛋白质样品的内毒素污染。 细胞培养

于EGM-2生长培养基（Clonetics, San Diego， CA)中维持人类脐 静脉内皮细胞（HUVECs ) (Clonetics， San Diego， CA )，并于骨骼肌 生长培养基（Clonetics， San Diego， CA )中培养人类骨骼肌细胞 (SkMC) (Clonetics, San Diego， CA )。于补充有10%胎牛血清（FBS ) (HyClone; Logen， UT)， 6mM Hepes, 501. U./ml青霉素和50|^g/ml 链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM ) ( Gibco， Gaithersburg, MD)中维持包括HCASMs (Clonetics, San Diego, CA )、大鼠心脏心 肌H9c2 (美国典型培养物保藏中心，Rockville， MD )、及人类新生儿 皮肤成纤维细胞（39-SK)(美国典型培养物保藏中心，Rockville， MD) 在内的细胞。采用4-6代的细胞。于补充有10% FBS、 100U/ml青霉 素和100)Lig/ml链霉素的DMEM中维持人类成骨细胞（MG 63)(美国典 型培养物保藏中心，Rockville， MD )。如以前描述的方法（Masure et al.， 1998 ),将原代软骨细胞从牛肩分离。于补充有10%FBS、 10mM HEPES、 0. lmM非必需氨基酸、20jiig/ml L-脯氨酸、50^ig/ml抗坏血酸、 lOOpg/ml青霉素、100)ag/ml链霉素和0. 25pig/ml两性霉素B (软骨细 胞生长培养基）的DMEM (高葡萄糖）中培养原代牛软骨细胞。所有细 胞培养均于37。C、湿化培养箱中、5。化02和95%空气的环境中进行。 细胞增殖分析

用0. 05%胰蛋白酶/0. 53mM EDTA (Gibco， Gaithersburg, MD )消化 HUVECs，并按5，00Q细胞/孔将其分配于96孔组织培养板中。在细胞 贴壁并形成单层（16小时）后，用含有0. 5%-2%FBS的DMEM中如所 示的不同浓度的VEGF-X刺激细胞。对人类皮肤成纤维细胞而论，生 长培养基用含有0. 1仰SA、有或无不同浓度VEGF-X的DMEM替代。对 MG63、人类SkMC， H9c2或HCASMC而论，培养基用含有0. 5%FBS的DMEM 替代。将牛软骨细胞按5, 000细胞/孔接种于补充有10»y4FBS的高葡萄 糖DMEM培养基的96孔组织培养板中，并让其贴壁72h。培养基用含

有2% BSA的DMEM替代，进行或不进行处理两天。对所有的测试细胞 而论，经过处理的孵育后，培养基用100ml含有5%FBS和3|iCi/ml的 [3幻-胸苷替代。脉沖标记后，用甲醇/乙酸（3:1，体积比）于室温固 定细胞lh。以250ml/孔，用80。/。甲醇洗涤细胞两次。将细胞先于0. 05% 胰蛋白酶U00ml/孔）中处理30min，然后于0. 5%SDS (100ml/孔）中 再处理30min，以溶解细胞。细胞裂解物的等分物（180ml)与2ml闪 烁混合物结合，并用液体闪烁计数器（Wallac 1409 )测定细胞裂解 物的放射性。

PDGF-C基因的染色体定位及内含子/外显子结构

通过FISH分析将VEGF-X定位于人类染色体4， q31-q32区的长臂 上（图2)。对该探针而论，杂交效率为约70%。数据库检索鉴定了两 种携有VEGF-X序列的基因组BAC克隆（EMBL编号AC009582和 AC015837 )。这些BAC克隆来源自染色体4，支持FISH数据。分离含 有cDNA的3，部分的BAC克隆。通过对该克隆直接测序，可推断在cDNA 的PDGF结构域中剪切事件的位置（图1中nt.位置1179/1180 )。就 VEGF-A和VEGF-D而论，剪切位点的位置是保守的（Heng et al. ， 1993， Hagen et al. ， 1994 )。图1中所示的其它剪切位点的位置，可从上述 数据库BAC克隆AC009582和AC015837的序列推断出。

VEGF-X和CUB结构域的测试总结

VEGF-X和CUB结构域均不增加人类皮肤成纤维细胞、人类脐内皮 细胞、牛软骨细胞或人类成骨细胞（MG63)的增殖。然而，全长和CUB 结构域结构均能够以剂量依赖方式刺激人类冠状动脉平滑肌细胞的增 殖（图3)。最佳刺激浓度范围为1-10)^g/ml。全长或CUB结构域结 构的效果，于测试的最高浓度，均超过对照水平的四倍（图2)。我们 没有观察到CUB结构域对其它肌细胞类型，例如人类骨骼肌细胞或大 鼠心肌（数据未显示）的促有丝分裂活性。去除第三个半胱氨酸或将 其突变为一个丝氨酸残基，我们发现：CUB结构域对人类冠状动脉平 滑肌细胞的促有丝分裂活性降低到大约为最高浓度下的一半（10Mg/ml) (数据未显示）。

表l.PDGF-C和相关蛋白质同一性和相似性的成对比较

%同一性 ％相似性

NRP一XENLA NRP_MOUSE NRP—CHICK BMP1—XENLA BMP1 HUMAN

35 33 32 28 24

50 46 48 44 41

°/0同一性

%相似性

VEGF已 29 47

VEGFD 29 44

PDGFB 29 40

PDGFA 29 39

VEGFA 25 51

VEGFC 24 43

PLGF 23 42

VEGF.A vs VEGF-C 38 51

比较在图2所示的蛋白质区域间进行，用Genedoc程序 (http: //www- cris- com/〜Ketchup/genedoc. sht迈l )计算o

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<110>詹森药业有限公司 -

<120〉 平滑肌细胞增殖的调节

<130> JAB 1687

<150> US 60/274901 <151〉 2001-03-09

〈160> 6

<170〉 Patentln version 3.1

<210> 1 <211〉 345 <212〉 PRT

<213〉 人(Homo sapiens) <400> 1

Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gin 15 10 15

Arg Gin Gly Thr Gin Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gin Phe 20 25 30

Ser Ser Asn Lys Glu Gin Asn Gly Val Gin Asp Pro Gin His Glu Arg 35 40 45

lie lie Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser lie His Ser Pro Arg Phe Pro 50 55 60

His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val 65 70 75 80

Glu Glu Asn Val Trp lie Gin Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu 85 90 95

Glu Asp Pro Glu Asp Asp lie Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu 100 105 110

Glu Pro Ser Asp Gly Thr lie Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr

115

120 125

Val Pro Gly Lys Gin lie Ser Lys Gly Asn Gin lie Arg lie Arg Phe

130

135 140

Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys lie His Tyr

145

150 155 160

Asn lie Val Met Pro Gin Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu 165 170 175

Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala lie Thr Ala 180 185 190

Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu lie Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp 195 200 205

Gin Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gin Leu Leu Gly 210 215 220

Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu 225 230 235 240

Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser 245 250 255

Val Ser lie Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr lie Phe Trp Pro 260 265 270

Gly Cys Leu Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu 275 280 285

His Asn Cys Asn Glu Cys Gin Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys 290 295 300

Tyr His Glu Val Leu Gin Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu

305 310 315 320

His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp 325 330 335

Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly 340 345

<210> 〈211〉 <212〉 〈213〉

2

111 PRT

人

<400〉 2

Gly Val Gin Asp Pro Gin His Glu Arg lie lie Thr Val Ser Thr Asn 15 10 15

Gly Ser lie His Ser Pro Arg Phe Pro His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr 20 25 30

Val Uu Val Trp Arg Leu Val Ala Val Glu Glu Asn Val Trp lie Gin 35 40 45

Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu Glu Asp Pro Glu Asp Asp lie 50 55 60

Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu Glu Pro Ser Asp Gly Thr lie 65 70 75 80

Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr Val Pro Gly Lys Gin lie Ser 85 恥 95

Lys Gly Asn Gin lie Arg lie Arg Phe Val Ser Asp Glu Tyr Phe 100 105 110

<210> <211> <212> <213>

3

23 DNA

人工序列

<220>

<223〉 PDGF-C正向引物 <400> 3

gtttgatgaa agatttgggc ttg

<210> <211〉 〈212〉 <213〉

4

29 DNA

人工序列

<220>

<223〉 PDGF-C反向引物 <400〉 4

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<210〉 5

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〈212〉 PRT

<213〉 人

<400〉 5

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Arg Gin Gly Thr Gin Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gin Phe 20 25 30

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29

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Glu Asp Pro Glu Asp Asp lie Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu 100 105 110

Glu Pro Ser Asp Gly Thr lie Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr 115 120 125

Val Pro Gly Lys Gin lie Ser Lys Gly Asn Gin lie Arg lie Arg Phe 130 135 140

Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys lie His Tyr 145 150 155 160

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195 200 205

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Leu Thr Glu Glu Val Leu Gin Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly 245 250 255

Leu His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys 260 265 270

Asp Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly 275 280

<210〉 <211〉 <212> <213>

6

167 PRT 人

<400> 6

Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gin 15 10 15

Arg Gin Gly Thr Gin Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gin Phe 20 25 30

Ser Ser Asn Lys Glu Gin Asn Gly Val Gin Asp Pro Gin His Glu Arg 35 40 45

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Glu Glu Asn Val Trp lie Gin Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu 85 90 95

Glu Asp Pro Glu Asp Asp lie Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu 100 105 110

Glu Pro Ser Asp Gly Thr lie Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr 115 120 125

Val Pro Gly Lys Gin lie Ser Lys Gly Asn Gin lie Arg lie Arg Phe

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lie lie Gin Leu His Thr Ser 165