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4,4-双甲基姜黄素协同超声抑制肿瘤细胞增殖的方法

阅读:1027发布:2020-06-15

专利汇可以提供4,4-双甲基姜黄素协同超声抑制肿瘤细胞增殖的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及4,4-双甲基姜黄素协同超声抑制 肿瘤 细胞增殖 的方法,属于医药技术领域。以4,4-双甲基姜黄素作为声敏剂协同超声抑制肿瘤细胞的增殖;所述超声是:超声 频率 为30-50KHz,超声功率为150-250W,超声 温度 为25-50℃,超声处理30-60s。本发明以胃癌BGC-823细胞为研究对象,将DMCU和超声协同作用于肿瘤细胞,可以有效的抑制BGC-823细胞的增殖,从而提高药物的 生物 利用度,为肿瘤 治疗 提供一种新的解决途径。与现有的常规抗癌方法相比,具有更高的有效性、安全性和可操作性,并为声敏剂的研究提供有 力 理论支持,推动声动力疗法(SDT)用于抗肿瘤临床。,下面是4,4-双甲基姜黄素协同超声抑制肿瘤细胞增殖的方法专利的具体信息内容。

1.4,4-双甲基姜黄素协同超声抑制肿瘤细胞增殖的方法,其特征在于,方法如下:以4,
4-双甲基姜黄素作为声敏剂协同超声抑制肿瘤细胞的增殖;所述超声是:超声频率为30-
50KHz,超声功率为150-250W,超声温度为25-50℃,超声处理30-60s,所述4,4-双甲基姜黄素具有如(Ⅰ)所示的结构式:
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述超声是:超声频率为40KHz,超声功率
200W,超声温度为35℃,超声处理60s。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述超声在避光条件下进行。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述4,4-双甲基姜黄素的制备方法,包括如下步骤:
1)将姜黄素、乙酸酐和吡啶加入二氯甲烷中,140-170℃回流反应1-2h,冷却至室温,依次用,饱和酸氢钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,再用乙酸乙酯和石油醚重结晶,得中间产物1,7-二(3-甲基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二
2)将1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-二烯-3,5-二酮、无水碳酸加入丙酮中,滴加碘甲烷,150-180℃回流反应12-14h,冷却至室温,过滤,滤液减压浓缩,再用丙酮和乙醇重结晶,得中间产物1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,
5-二酮;
3)将1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮、无水碳酸钾加入无水甲醇中,室温反应2-3h,过滤,滤液减压浓缩,得粗产物1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮;
4)将粗产物1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮用二氯甲烷溶解,用乙酸调pH=7,先加入水取水相,再于水相中加入二氯甲烷萃取,取有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,再用乙酸乙酯和石油醚重结晶,得到4,4-双甲基姜黄素纯品。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤1)中,按摩尔比,姜黄素:乙酸酐:吡啶=1:3:3。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2)中,按摩尔比,1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-二烯-3,5-二酮:无水碳酸钾:碘甲烷=1:2.5:2.5。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤3)中,按摩尔比,1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮:无水碳酸钾=1:2.2。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。

说明书全文

4,4-双甲基姜黄素协同超声抑制肿瘤细胞增殖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及声动抗癌化学疗法,属于医药技术领域,具体涉及一种声敏剂4,4-双甲基姜黄素(DMCU)协同超声在抑制肿瘤细胞增殖方面的应用。

背景技术

[0002] 声动力疗法(SDT)是利用肿瘤细胞和正常细胞在化还原平衡方面的差异,通过声波照射声敏剂产生协同作用,进而杀伤肿瘤细胞的一种新型抗肿瘤方法。这种协同作用产生的效果比单独药物作用更强,克服了大多数药物抗癌活性显著但体内血药浓度低的缺点。声动力疗法本身无毒或低毒性,以及超声的可聚焦性、穿透性以及对照射部位的选择性,必将为肿瘤治疗提供一个新的、更加安全的疗法。因此,寻找更高活性声敏剂是推动声动力疗法广泛用于抗肿瘤临床的关键因素之一。
[0003] 姜黄素是一种天然的酚类抗氧化剂,对癌症有一定的抑制作用。其对还原剂的稳定性较强,且具有低毒性、易获得等优势,在超声的辅助下产生活性氧,显著增强了本身对肿瘤细胞的抑制作用。因此,开展针对超声辅助姜黄素抗肿瘤的研究及进行抗肿瘤作用条件的优化等方面的研究对其应用开发有着重要理论及实践意义,为以后的研究和工业化生产提供理论依据。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供4,4-双甲基姜黄素(DMCU)与超声协同在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。本发明的方法能有效克服药物在体内血药浓度低的缺点,增强药物抗肿瘤作用。
[0005] 为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是:4,4-双甲基姜黄素协同超声抑制肿瘤细胞增殖的方法,方法如下:以4,4-双甲基姜黄素作为声敏剂协同超声抑制肿瘤细胞的增殖;所述超声是:超声频率为30-50KHz,超声功率为150-250W,超声温度为25-50℃,超声处理30-60s,所述4,4-双甲基姜黄素(DMCU)具有如(Ⅰ)所示的结构式:
[0006]
[0007] 进一步的,所述超声是:超声频率为40KHz,超声功率200W,超声温度为35℃,超声处理60s。
[0008] 进一步的,所述超声在避光条件下进行。
[0009] 进一步的,所述4,4-双甲基姜黄素的制备方法,包括如下步骤:
[0010] 1)将姜黄素、乙酸酐和吡啶加入二氯甲烷中,140-170℃回流反应1-2h,冷却至室温,依次用,饱和酸氢钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,再用乙酸乙酯和石油醚重结晶,得中间产物1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二
[0011] 2)将1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-二烯-3,5-二酮、无水碳酸加入丙酮中,滴加碘甲烷,150-180℃回流反应12-14h,冷却至室温,过滤,滤液减压浓缩,再用丙酮和乙醇重结晶,得中间产物1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮;
[0012] 3)将1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮、无水碳酸钾加入无水甲醇中,室温反应2-3h,过滤,滤液减压浓缩,得粗产物1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮;
[0013] 4)将粗产物1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮用二氯甲烷溶解,用乙酸调pH=7,先加入水取水相,再于水相中加入二氯甲烷萃取,取有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,再用乙酸乙酯和石油醚重结晶,得到4,4-双甲基姜黄素纯品。
[0014] 进一步的,步骤1)中,按摩尔比,姜黄素:乙酸酐:吡啶=1:3:3。
[0015] 进一步的,步骤2)中,按摩尔比,1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-二烯-3,5-二酮:无水碳酸钾:碘甲烷=1:2.5:2.5。
[0016] 进一步的,步骤3)中,按摩尔比,1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮:无水碳酸钾=1:2.2。
[0017] 本发明的有益效果是:本发明,以4,4-双甲基姜黄素作为声敏剂被超声激活,借助产生的活性氧等物质引起的声化学反应,证实其可与超声协同,发挥协同抑制肿瘤细胞增殖作用。本发明的方法具有更高的有效性、安全性和操作性。附图说明
[0018] 图1为不同浓度DMCU联合超声30s对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用。
[0019] 图2为不同浓度DMCU联合超声60s对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用。

具体实施方式

[0020] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0021] 实施例
[0022] (一)4,4-双甲基姜黄素(DMCU)的制备
[0023] 1)中间体1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮的合成[0024] 称取10.0g姜黄素(27.1mmol)、7.7mL乙酸酐(81.3mmol)和6.6mL吡啶(81.3mmol)加入200mL二氯甲烷中,155℃回流反应1h。反应结束后,将产物冷却至室温,依次用水,饱和碳酸氢钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥。于室温下进行过滤,滤液减压浓缩,得到黄色固体。所得黄色固体用乙酸乙酯和石油醚重结晶,得到黄色晶状固体,即中间体1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮,收率95%。
[0025] 2)中间体1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮的合成
[0026] 称取4.5g 1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-1,6-二烯-3,5-二酮(10.0mmol)、3.5g无水碳酸钾(25.0mmol)加入30mL丙酮中进行搅拌溶解,再滴加碘甲烷(25.0mmol),160℃回流反应12h。反应结束后,将反应物冷却至室温,于室温下进行过滤,滤液减压浓缩,得到固体。所得固体用丙酮和乙醇重结晶,得到黄色固体,即中间体1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮,收率75%。
[0027] 3)粗产物1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮的制备
[0028] 称取3.6g 1,7-二(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮(7.9mmol)、2.4g无水碳酸钾(17.4mmol)加入20mL无水甲醇中,室温反应2h。反应结束后,将反应物进行过滤,滤液减压浓缩,得到红色固体,即粗产物1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮。m.p.160-163℃。
[0029] 4)产物纯化
[0030] 将粗产物1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4,4-二甲基-1,6-庚二烯-3,5-二酮用30mL二氯甲烷溶解,用乙酸调节pH=7。先加入50mL水,取水相,再于水相中加入二氯甲烷(20mL×2)进行萃取,将有机相合并,将所得有机相经无水硫酸钠干燥,然后于室温下进行过滤,滤液减压浓缩,得到固体。所得固体用乙酸乙酯和石油醚重结晶,得到黄色固体,即为
4,4-双甲基姜黄素(DMCU)纯品,收率74%。
[0031] 将制得的DMCU溶解于二甲基亚砜中制成溶液,使其浓度达到10μmol/L,将其储存于-20℃箱中冷冻,以备实验需要。
[0032] (二)抑制肿瘤细胞的增长
[0033] 取生长状态良好、处于对数生长期的BGC-823细胞,用常规胰酶消化后加入3mL含2%FBS的RPMI1640培养基吹打成细胞悬液。血球计数板计数后将其稀释成细胞密度为5*
105个/ml的单细胞悬液。
[0034] 分别取2个灭菌EP管,在每个EP管中加入1.5ml上述单细胞悬液。将配置好冷冻保存的浓度为10μmol/L的DMCU解冻并分别稀释为1μM和3μM后,分别加入0.5ml于上述加有1.5ml单细胞悬液的两个EP管中,制成两组不同DMCU浓度的实验组。
[0035] 将每组给药细胞再平均分至3个1.5ml无菌EP管,每组均分的三个无菌EP管分别超声(超声频率为40KHz,超声功率200W,超声温度为35℃)0s、30s、60s。超声结束后按200μl/well将每组细胞接种至96孔板中,用PBS缓冲液填充96孔板的四周边缘孔。在37℃,5%CO2培养箱孵育培养24h。24h后,向96孔板每孔加入20μlMTT溶液,将96孔板放入37℃培养箱中继续培养4h后,1000rpm的转速离心5min,倒掉上清液,然后向每孔加入200μl二甲基亚砜,避光置于脱色摇床上低速摇晃15分钟后,使用酶标仪于570nm波长下检测各孔吸光度值(OD值),采用公式(1)计算肿瘤细胞抑制率。
[0036]
[0037] 由图1和图2可见,
[0038] 未加入DMCU药物组:
[0039] 单独对胃癌BGC-823细胞进行超声处理30s(图1中U.S only),细胞的存活率为93.79%。单独对胃癌BGC-823细胞进行超声处理60s(图2中U.S only),细胞的存活率为
91.87%。
[0040] 加入1μM DMCU药物组:
[0041] DMCU药物单独对胃癌BGC-823细胞进行处理,细胞的存活率为95.75%。DMCU药物联合超声30s对胃癌BGC-823细胞进行处理,细胞的存活率为64.11%。DMCU药物联合超声60s对胃癌BGC-823细胞进行处理,细胞的存活率为62.66%。
[0042] 加入3μM DMCU药物组:
[0043] DMCU药物单独对胃癌BGC-823细胞进行处理,细胞的存活率为90.79%,DMCU药物联合超声30s对胃癌BGC-823细胞进行处理,细胞的存活率为56.39%。DMCU药物联合超声60s对胃癌BGC-823细胞进行处理,细胞的存活率为67.56%。
[0044] 综上可见,DMCU联合超声明显高于单独超声以及单独药物对BGC-823的抑制率。在超声的辅助下,DMCU对胃癌BGC-823细胞的抑制作用显著增强。
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