本发明涉及最新鉴定的多核苷酸和由其编码的多肽，这种多核苷酸和多肽的生产方法 以及这些多核苷酸和多肽的用途。本发明的多肽已被鉴定为肌细胞抑制因子，下文有时称为 “Fwa267”。本发明的多核苷酸和多肽是人类来源的。

心脑血管病是威胁人类健康的重大疾病之一。据统计，每年约有260万中国人死于此 病，平均每12秒就有一位同胞被该病夺去生命。在中国，心脑血管病死亡人数占总死亡人 数的比率从1957年的12.1％上升至1990年的35.8％，升高了2.9倍。据世界银行预测：到 2020年，全世界心脑血管病死亡人数占总死亡人数的比率将从1990年的28.9％升至36.3％， 其中70％的心脑血管病发生在发展中国家。中国现有高血压患者1亿多人，并以每年350万 人的速度递增；脑中风致残者600万人，并以每年150万的速度递增；冠心病患者100万人， 并以每年50万的速度递增；此外，还有心肌病患者300万人。因此，心脑血管病的防治对 减轻人类经济负担，确保人体健康具有十分重要的意义。

心脑血管病的治疗经历了四个大的阶段：1920年代，循环动力学的研究揭示了心脏是 一个“泵”，由此奠定了心力衰竭的治疗基础；60-70年代，对心血管病危险因素的认识及 处理，使西方国家心脏病的发病率下降了近40％；1970年，对心肌细胞电生理学的研究，提 供了抗心律失常、电生理检查及治疗的新方法；80年代末到90年代初，对血管生物学的 认识，产生了心脏介入治疗的新方法。

心衰、抗心律失常、及介入治疗对抢救心脑血管病人的生命，提高其生活质量起到了 积极作用。然而，由于这些方法仅针对症状进行治疗，没有从根本上触及病因，所以治疗针 对性不强。虽然延长了病人的寿命，但没有真正达到预防和治愈的目的。因此，在分子生物 学的水平进行研究，查明心脑血管病的致病因素及发病机理，有望在该病的治疗方面取得突 破性进展，达到从根本上遏制心脑血管病的目的。

cDNA文库是生物工程领域的重要研究工具之一。通常从细胞中提取mRNA，通过 反转录酶合成mRNA的DNA拷贝(即cDNA，Complementary DNA)。单链cDNA分子在 DNA聚合酶的作用转变成双链DNA分子，然后再插入载体，转化到宿主菌中长成克隆。 这样的每个克隆只包含特定的mRNA信息，这样的一套克隆就称为cDNA文库。

由于cDNA不含内含子，从cDNA文库中可以直接筛选到相应的表达基因，故相对基 因库而言，cDNA文库具有操作简单、使用方便的优点。人体不同细胞表达基因的差异决定了 其组织和器官表型的差异，从人主动脉cDNA文库中分离和鉴定特异表达基因，特别是分离 和鉴定疾病相关基因，是研究遗传性心血管病的有效方法之一。

按照本发明的一个方面，提供了一种新的成熟多肽Fwa267以及具有生物学活性并在诊 断或治疗上有用途的Fwa267的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是人类来源的。

按照本发明的另一个方面，提供了编码本发明多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、 cDNA、基因组DNA，以及具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用途的该核酸分子的片段、 类似物和衍生物。

按照本发明的另一个方面，提供了用重组技术生产Fwa267多肽的方法，该方法包括培 养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。

按照本发明的另一个方面，提供了将Fwa267多肽或编码Fwa267多肽的多核苷酸用于 治疗的方法。例如，治疗心血管增生性疾病，抑制肿瘤形成。

按照本发明的另一个方面，提供了这些多肽的抗体。

按照本发明的另一个方面，提供了所述多肽的拮抗剂，其可用来抑制这些多肽的作用。

按照本发明的另一个方面，提供了与本发明核酸序列中的突变、以及与本发明的多肽 异常表达有关的疾病或疾病易感性的诊断方法。

按照本发明的另一个方面，提供了将本发明的多肽或编码这种多肽的多核苷酸、在体 外用于科学研究、DNA合成以及人工构建DNA载体的方法。

根据本文的教导，上述方面及相关方面对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明是通过如下技术方案实现的。提取mRNA，反转录成cDNA，构建成人主动脉cDNA 文库。从文库中获取Fwa267的基因片段，通过EST拼接得到Fwa267的全长cDNA序列。进 而研究Fwa267基因在不同组织的表达与分布，研究Fwa267多肽的活性与功能。

按照本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的核酸(多核苷酸)序列，其编码具有 推定的、如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟多肽。本发明的多核苷酸是从成人主动脉 的cDNA文库中发现的。其定位于人体细胞的第11号染色体上。其包含一个开放阅读框架， 可以编码具有370个氨基酸残基的多肽。同源性分析表明Fwa267多肽仅与分泌性生长因子 fallotein显示出46％的同源性。

推测的Fwa267蛋白由370个氨基酸组成。其序列特征为：(A)从276至279Aa(NYSV) 为N-糖基化位点；(B)从268至271 Aa(KRYS)为cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶位点；(C) 从262至270Aa(RLNDDAKRY)为酪氨酸激酶位点；(D)从1至61Aa (MHRLIFVYTLICANFCSCRDTSATPQSASIKALRNANLRRDESNHLTDLYRRDETIQVKGN)为TonB依赖的 受体蛋白信号1；(E)从100至105Aa GLEEAE)，192至197Aa(GVSYNS)，303至308Aa (GGNCGC)，304至309Aa(GNCGCG)为豆蔻酰化位点；(F)从17至19Aa(SCR)，29至31 Aa(SIK)，66至68Aa(SPR)，80至82Aa(TWR)，150至152Aa(TFK)，243至245Aa(TPR)， 273至275Aa(TPR)，243至245Aa(TPR)，273至275Aa(TPR)，320至322Aa(SGK) 为蛋白激酶C位点。(G)从17至20Aa(SCRD)，168至171Aa(SLLE)，181至184Aa(TNWE)， 199至202Aa(SVTD)，219至222Aa(TVED)，231至234Aa(SWQE)，250至253Aa(SYHD)， 256至259Aa(SKVD)为酪蛋白激酶II位点。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合 成DNA。DNA可以是双链或单链的，如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反义)链。编 码成熟多肽的编码序列可以和SIQ ID NO：1(全长3739个核苷酸)所示的编码序列(107 至1219位核苷酸)相同；或者，由于遗传密码的丰余性或简并性，编码序列也可以不同与 SIQ ID NO：1所示的编码序列。

编码SIQ ID NO：2所示成熟多肽的多核苷酸可以包括：成熟多肽的编码序列；成熟多 肽的编码序列和附加的编码序列，如编码多肽前导序列或分泌序列的多核苷酸；成熟多肽的 编码序列(以及任选的附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列5’和/或 3’端的非编码序列。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有多肽编码序列的多核苷酸以及含有附 加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码推定的、具有SIQ ID NO：2所示氨基酸 序列的多肽片段、类似物及衍生物。所述变异体可以是天然产生的该多核苷酸的等位基因变 异体，或者是非天然产生的变异体。正如本领域已知的，等位基因变异体是一段多核苷酸的 另一种形式，其可以带有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，而实质上不改变所编码多 肽的功能。

因此，本发明包括能够编码与SIQ ID NO：2所示成熟多肽具有相同氨基酸序列的多核 苷酸，还包括能够编码SIQ ID NO：2所示成熟多肽之片段、衍生物和类似物的多核苷酸变 异体。这些变异体包括缺失变异体、取代变异体、添加或插入变异体。

本发明也包括这样的多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框架中，与 有助于多肽由宿主细胞表达及分泌的多核苷酸(如产生前导序列的多核苷酸)相融合。前导 序列作为分泌序列而控制多肽从细胞中转运。具有前导序列的多肽是前体蛋白 (preprotein)，由宿主细胞切割其前导序列后可以产生成熟多肽。本发明的多核苷酸也可以 编码蛋白原(proprotein)，蛋白原是具有原序列(prosequence)的成熟蛋白，是5’端附加了 氨基酸残基的成熟蛋白，是一种无活性形式。切除原序列后，可以产生有活性的成熟蛋白。

因此，本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白，也可以编码具有原序列的蛋白，还 可以编码既有原序列(prosequence)又有前导序列(presequence)的蛋白质。

本发明的多核苷酸还包括在同一读框中与标记序列融合的编码序列，标记序列可用于 纯化本发明的多肽。例如，当宿主细胞为细菌时，标记序列可以是由pQE-9载体提供的、用 于纯化融合产物的六组氨酸。或者，当宿主为哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可 以是血细胞凝集素(HA)，HA标记对应于从流感血凝集蛋白衍生的一个表位(Wilson，I.， 等，细胞，37：767(1984))。

术语“基因”是指与产生多肽有关的DNA片段，其包括编码区之前和之后的区域，以 及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

本发明全长基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，用来分离全长基因和与该基因 有高度同源性或相似生物活性的其它基因。所说的探针优选具有至少30个碱基，并且可以 含有50个或更多个碱基。所述探针也可以用来鉴别相应于全长转录物的cDNA克隆和含有完 整基因的一个或多个基因组克隆。其中，完整基因包括调节序列、启动子序列、外显子和内 含子。例如可以根据已知的DNA序列合成寡核苷酸探针，进而分离出基因的编码部分。与本 发明基因序列互补的、标记的寡核苷酸探针可以用来从人类cDNA、基因组DNA或mRNA文库 中筛选与其杂交的文库成员。

本发明还涉及与本发明的多核苷酸杂交的核酸序列。条件是两个序列间具有至少85％， 优选至少90％，更优选至少95％的同源性。本发明特别涉及在严格条件下与本发明的多核苷 酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严格条件”是指仅在序列间具有至少95％，优选具有至少 97％的同源性时杂交才会发生。与上述序列杂交的多核苷酸可以编码与本发明成熟多肽具有 相同生物学功能或活性的多肽。

此外，与本发明的多核苷酸具有同源性并能够杂交的多核苷酸可以具有至少20个碱基， 优选至少30个碱基，更优选至少50个碱基，其可以保留或不保留活性。这样的多核苷酸可 以用作SEQ ID NO：1的探针，用于回收多核苷酸、作为诊断探针或作为PCR引物。

因此，本发明涉及与编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸具有至少85％，优选至少 90％，更优选至少95％同源性的多核苷酸及其片段(所述片段具有至少30个碱基，优选至少 50个碱基)，以及由这些多核苷酸编码的多肽。

根据本发明的另一个发明，本发明涉及推定的、具有SIQ ID NO：2所示氨基酸序列的 多肽及其片段、类似物和衍生物。

术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，当涉及由SIQ ID NO：1编码的多肽或者具有如SIQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽时，是指基本上保留了所述多肽生物学功能或活性的多肽。 所说的类似物可以包括蛋白原，蛋白原经部分切除后可以产生有活性的成熟多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。

所说的多肽(SIQ ID NO：2)及其片段、衍生物或类似物可以是：(i)一种多肽，其中一 个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代，并且被取 代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码子编码的，或者(ii)一种多肽，其中一个或多个 氨基酸残基包含取代基，或者(iii)一种多肽，其中成熟多肽与另一种化合物融合，如与增 加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)融合，或者(iv)一种多肽，其中成熟多肽与附 加氨基酸残基融合，例如与前导或分泌序列融合，又如与用来纯化成熟多肽的序列融合。通 过本文的教导，这样的片段、衍生物及类似物可视为在本领域技术人员的知识范围内。

本发明的多肽和多核苷酸优选以分离形式提供的，并且优选将其纯化成均一(同质) 物质。

术语“分离的”是指所述物质脱离了原始环境(例如，如果该物质是天然存在的，则指天 然环境)。例如，一种在活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但从天然系统 中部分或全部共存物质中分离出同样的多核苷酸或多肽则是分离的。这样的多核苷酸可以是 载体的一部分，这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，只要这种载体或者组合物不 是其天然环境的一部分。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2所示的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ ID NO：2 的多肽具有至少85％的同源性，更优选90％的同源性，最优选95％的同源性的多肽。本发明 还包括上述多肽的片段，多肽片段通常包含至少30个，优选至少50个氨基酸。

如本领域所熟知的，两个多肽之间的“同源性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其 保守氨基酸取代与另一个多肽比较而确定的。

通过多肽合成，本发明的多肽片段(或部分多肽)可用于生产全长多肽。此片段可用 作产生全长多肽的中间体。同样的，本发明的多核苷酸片段可以用于合成本发明的全长多核 苷酸。

根据本发明的另一个方面，涉及含有本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体基因工 程化的宿主细胞，以及通过重组技术产生本发明多肽的方法。

宿主细胞是用本发明的载体经基因工程化(转导、转化或转染)而产生的。所说的载体 可以是克隆或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程宿主细胞可以在 经改良适于激活启动子、筛选转化体或扩增本发明Fwa267基因的常规营养培养基中培养。 培养条件(如温度和pH值)是由不同的宿主细胞决定的，这些对本领域技术人员而言是显 而易见的。

通过重组技术，本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。多核苷酸可以包含在任何一种 适于表达多肽的载体中。这样的载体包括染色体来源的、非染色体来源的和合成的DNA序列。 例如SV40衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，杆状病毒，酵母质粒，从质粒和噬菌体DNA结 合得到的载体，病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬病病毒)。此外，还可以 使用其它载体，只要其可以在宿主中复制并存活。

可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，是用本领域已知的方法 将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点中。

表达载体中的DNA序列可以与适当的表达控制序列(启动子)连接，以指导mRNA的合成。 启动子的例子有：LTR或SV 40启动子，大肠杆菌的lac或trp，噬菌体λPL启动子，以及 已知其它的、控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。表达载体也以包含指导 翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以包含用于扩增表达的合适序列。

此外，优选的表达载体包含一个或多个选择标记基因，以便为转化后宿主细胞的筛选 提供表型特征。例如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者如用于大肠 杆菌的四环素和氨苄青霉素抗性。

含有上述合适的DNA序列以及合适的启动子或者调控序列的载体可以用于转化适当的 宿主，以使其表达蛋白质。

作为合适宿主的代表性例子有：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌； 真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS 或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。通过本文的教导，选择合适的宿主可视作在本领域 技术人员的知识范围内。

更具体地说，本发明还包括含有以上广泛描述的一种或多种序列的重组构建体。构建 体包括正向或反向插入了本发明核酸序列的载体，如质粒或病毒载体。在更为理想的实施方 案中，构建体还包含了可操作地与所述序列连接的调节序列，如启动子。许多合适的载体和 启动子是本领域技术人员熟知的，并可以通过商业途径获得。例如，细菌载体：pQE70、pQE60、 pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、 pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)； 真核载体：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、 pSVL(Parmacia)。此外，还可以使用其它的质粒或载体，只要它们能够在宿主中复制并存活。

可以用带有CAT(氯霉素转移酶)或其它选择标记的载体从基因中选择启动子区。两个 合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、 PL、和trp。真核启动子包括CMV立即早期，SV胸苷激酶，早期和晚期SV40、来自逆转录 病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。选择适当的载体与启动子可视作在本领域技术人员的知 识范围内。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等 真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或者是原核细胞(如细菌细胞)。 通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法可以实现构建体向宿主细胞的导入 (Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法，(1986))。

宿主细胞中的构建体可以经由常规方式产生由重组序列编码的产物。而且，本发明的 多肽可以用常规的多肽合成仪合成。

在合适启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或其它 细胞中表达。用来源于本发明DNA构建体的RNA，通过无细胞翻译系统也可以产生目的蛋白。 Sambrook等人在《分子克隆实验室手册》中(1989，第二版，纽约冷泉港实验室)描述了 可用于原核和真核宿主的、合适的克隆及表达载体。

通过向载体中插入增强子序列，可以提高高等真核生物细胞对编码本发明多肽的DNA 的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，一般约10至300bp，它作用于启动子以增强其转 录。增强子的例子有：复制起点上游100至270bp的SV40增强子、多形瘤增强子以及腺 病毒增强子。

一般地，重组表达载体包括复制起点和筛选标记基因(如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基 因和啤酒糖酵母的TRP1基因)，以及从高度表达的基因中得到、能够指导下游结构基因转 录的启动子。这样的启动子可以从编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、 酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子中得到。异源序列以恰当的方式与翻译起始序列及终止 序列装配。优选地，与能够指导蛋白向细胞周质或细胞外培养基分泌的前导序列装配。异源 序列可以编码含有N-末端识别肽的融合蛋白，该识别肽具有理想的特征，如稳定表达的重 组产物或者简化纯化步骤。

将编码目的蛋白的结构基因，合适的翻译起始和终止信号，以及有功能的启动子一起 插入，可以构建适用于细菌的表达载体。所说载体包含一个或多个选择标记和一个复制起点， 以维持载体并在必要时在宿主中扩增载体。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的多个种。

作为代表性但非限制性的例子，用于细菌的表达载体可以含有源自市售载体的选择标 记和复制起点，这些市售载体包含公知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件。这样的 市售载体包括，pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动子和待表达的结构序 列相结合。

转化合适的宿主菌株，待其生长至合适的细胞密度后，用恰当的方法(例如温度变换或 化学诱导)诱导选择的启动子，并继续培养细胞一段时间。常用离心法收获细胞，用物理或 化学方法破碎细胞，保留得到的粗产物以进一步纯化。可以用任一种常规的方法破碎微生物 细胞，所述方法包括冻融法、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技 术人员熟知的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子有由 Gluzman(细胞，23：175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和能够表达相容载体的 其它细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起 点、适合的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体 和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。从SV40病毒基因组中得到的DNA序列， 如SV40复制起点、早期启动子、增强子、剪接及多聚腺苷酸化位点可用来提供所需要的非 转录遗传元件。

可以用多种方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫酸铵 或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层 析、羟基磷灰石层析、植物凝集素层析和高效液相色谱层析(HPLC)。

本发明的多肽可以是天然纯化的，或是化学合成的，或是用重组技术从原核或真核宿 主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)制备的。根据重组方法中使用 的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽也可以包含一个起始的 甲硫氨酸残基。

本发明的多核苷酸和多肽可以用作人类疾病的治疗和诊断的研究试剂和材料。Fwa267 可以抑制心肌细胞和平滑肌细胞的增殖。在正常情况下，其可能参与维持心肌细胞的终末分 化。过渡表达Fwa267可能会诱发心肌细胞调亡坏死(如室壁瘤)，低水平表达则可能导致肌 细胞增生。

根据本发明的另一方面，提供了鉴定本发明多肽激活剂或拮抗剂的方法。方法之一是 在某种化合物存在的情况下，将表达Fwa267受体的哺乳动物细胞或膜制剂与Fwa267多肽一 起培养，检测该化合物增强或阻断Fwa267多肽与受体相互作用后产生第二信使的能力。第 二信使系统包括但不限于：蛋白酪氨酸激酶系统(PTK)、cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或 磷酸肌醇水解作用。鉴定多肽拮抗剂的另一种方法是竞争抑制法。该法将某化合物不存在时， 与受体结合的Fwa267多肽分子数设为对照，通过检测该化合物存在时，与受体结合的Fwa267 多肽分子数的变化来确定潜在的拮抗剂。

潜在的拮抗剂包括抗体，或者在某些情况下包括与本发明多肽结合的寡肽，它们与所 述多肽结合并有效地消除其功能。

另一个潜在的拮抗剂化合物是用反义技术制备的反义构建体。通过三股螺旋形成反义 DNA或RNA从而控制基因的表达，上述方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，可 以依据编码本发明成熟多肽的核酸序列5’端，设计长约10至40个碱基对的反义RNA。又如 设计一种与转录涉及的基因区互补的DNA(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)； Cooney等，科学，241：456，(1988)；和Dervan等，科学，251：1360(1991))，从而阻止 转录以及本发明多肽的产生。反义RNA在体内和mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译成为本发 明的多肽(反义-Okano，J.神经化学杂志，56：560(1991)；作为基因表达反义抑制剂的脱 氧寡核苷酸(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。可以将上述寡核苷酸传送至细胞，从而 在体内表达反义RNA和DNA以抑制本发明多肽的产生。

拮抗剂还包括一些小分子，这些小分子通过与本发明的多肽结合而阻止多肽与其受体 的相互作用，从而阻断其正常的生物活性。小分子包括但不限于小肽或类肽分子。

本发明的多肽、其激活剂和拮抗剂可以与合适的载体结合形成药物组合物。这样的组 合物包含治疗有效量的多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。载体包括但不限于盐水、缓冲 液、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及上述物质的组合。其配方应与给药的方式相宜。

本发明还提供了一种药物包装或试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有本发 明药物组合物的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关 药品或生物制品制造、使用及销售的信息。本发明的药物组合物还可以与其它的治疗化合物 结合使用。

药物组合物可以按常规方式给药，如口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻 内或真皮内途径。以治疗和/或预防特定疾病有效的剂量施用药物组合物。通常以至少大约 10微克/千克体重的量给药。在大多数情况下，以不超过每天约8毫克/千克体重的量给药。 在大多数情况之下，考虑到用药途径和症状等因素，给药剂量从每日大约10微克/千克到1 毫克/千克体重。

根据本发明的另一方面，可以通过在体内表达的方式使用本发明的多肽及其激活剂和 拮抗剂，这种方式常被称作“基因治疗”。

因此，可以在体外用编码本发明多肽的核酸(DNA或者RNA)对患者细胞进行基因工程化 处理，再将工程化的细胞提供给需要治疗的患者。上述方法是本领域熟知的。例如，可以用 含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒对细胞进行基因工程化处理。

类似的，可以通过本领域已知的方法在体内基因工程化细胞，以便在体内表达多肽。 例如，用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒转导包装细胞，以使其能够产生含有目的 基因的感染性病毒颗粒。将这种生产细胞用于患者，从而在体内工程化细胞并表达所说的多 肽。根据本发明的教导，通过上述方法或其它方式施用本发明的多肽对本领域技术人员而言 是显而易见的。

可以得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏(Moloney)鼠白血 病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏(Rous)肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病 毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒。

所述载体包含一个或多个启动子。可使用的合适启动子包括但不限于：反转录病毒 LTR；SV 40启动子；人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller等，生物技术，Vol.7，No.9， 980-990(1989)描述)；或其它启动子(例如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III 和β-肌动蛋白启动子)。其它可采用的病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动子、胸苷激酶(TK) 启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的教导，选择载体上合适的启动子对本领域技术 人员而言是显而易见的。

编码本发明多肽的核酸序列应当有合适的启动子控制。可以使用的合适的启动子包括 但不限于：腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞病毒(CMV) 启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动 子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启 动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒 LTRs)；β-肌动蛋白启动子和人类生长激素启动子。启动子也可以是编码所述多肽的基因的 天然启动子。

可以用反转录病毒质粒载体转导包装细胞以产生生产细胞。可被转染的包装细胞包括 但不限于：PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、 GP+envAm12和DNA细胞系(Miller、人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其 全部内容本文一并参考)。载体可以用任何本领域已知的方法转导包装细胞。这些方法包括 但不限于：电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，逆转录病毒质粒载体可以包埋在脂质 体中，或者偶联到脂类上，然后引入宿主中。

生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，该颗粒包含能够编码所述多肽的核酸序 列。可以用这些逆转录病毒载体在体内或体外转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码 所述多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于：胚胎茎干细胞、胚胎癌细胞、 以及造血茎干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮 细胞。

根据本发明的另一方面，本发明涉及Fwa267基因在诊断或检测中的用途，通过检测 Fwa267核酸序列中的突变可以诊断出相关疾病或对疾病的易感性。

可以用多种技术在DNA水平上检测出携带Fwa267基因突变的个体。可以从患者的细胞， 如来自血液，尿，唾液，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。基因组DNA可以直接用于检测， 或者在分析前可以用PCR扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或cDNA也可 用于相同目的。例如，与本发明多核苷酸互补的PCR引物可于鉴别和分析突变。如通过与正 常的基因型相比较，根据扩增产物的大小改变来检测缺失及插入。可以经与可以用放射性标 记的RNA或反义DNA与扩增后的核酸序列杂交，以鉴别点突变。用RNaseA消化或通过解链 温度的差异，可以辨别完全配对序列和错配的双链。

通过DNA测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异。此外，克隆的DNA 片段可以作为探针检测特异的DNA区段。当与PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高， 例如，将测序引物和双链PCR产物、或者由改良的PCR法产生的单链模板分子一起使用。常 规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。

基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在含有或不含变性剂的凝胶中，DNA片段电 泳迁移率的变化来实现。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示。不同序列的DNA 片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上进行区分，根据其特定的熔点或部分解链温度，不同的DNA 片段将停滞在凝胶的不同位置(参见Myers等，科学，230：1242(1985))。

用RNase和S1保护的核酸酶保护分析法或化学裂解法也可以检测特殊位置上的序列变 化，(如Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。

因此，可以用杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序、或使用限制酶(如限 制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法来检测DNA序列的差异。

除了更常规的凝胶电泳和DNA测序之外，突变也可以用原位分析法检测。

根据本发明的另一方面，本发明涉及一种通过检测不同组织中Fwa267多肽含量的改变 而进行的诊断分析方法。这是基于与正常对照组织相比，某组织中该多肽的过量表达可以检 测疾病或疾病易感性的存在。检测取自宿主的样品中本发明多肽之含量的分析方法是本领域 技术人员熟知的，方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析、酶联免疫吸 附(ELISA)测定和“夹心”测定，优选ELISA检测。ELISA测定包括首先制备本发明多肽 的特异性抗体，优选单克隆抗体。然后制备该单克隆抗体的报导抗体。将报导抗体与一种可 检测试剂相结合，所说试剂如放射性试剂、荧光试剂或者辣根过氧化物酶。从宿主取样，并 将其在与样品中蛋白质结合的固体支持物(如聚苯乙烯皿)中温育。通过和非特异性蛋白质(如 牛血清清蛋白)一起温育，将覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来，在单克隆抗体 和结合到聚苯乙烯皿上的本发明任何多肽结合期间，将单克隆抗体在皿中温育。用缓冲液将 所有未结合的单克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的受体抗体放入皿中，结果 导致受体抗体和任何结合到本发明多肽上的单克隆抗体结合。然后将未结合的单克隆抗体洗 掉。接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即是 给定体积的患者样品中存在的蛋白质的量。

也可以用竞争测定法检测多肽含量。方法包括将Fwa267多肽的特异性抗体结合到固相 支持物上，然后标记(如放射性标记)本发明的多肽，将取自宿主的样品通过固相支持物， 然后通过检测标记量，确定样品竞争性结合抗体的量，从而确定样品中本发明多肽的含量。

本发明的序列对染色体的鉴别也极有价值。该序列特异性地靶向于人染色体的特定位 置，并与之杂交。目前，仅有少数几种基于实际序列数据(重复多形性)的染色体标识试剂可 用于标记染色的体位置。基于本发明DNA的染色体作图是将这些序列和疾病相关基因关联的 首要的步骤。

简言之，通过由cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)可以进行序列的染色体定位。通过 计算机分析基因的3’非翻译区，可以快速选择引物。引物不应跨越基因组DNA的第一个外显 子，否则将使扩增复杂化。然后，将引物用于PCR以筛选含有单个的人染色体的体细胞杂和 体。只有含有与该引物相应的基因的杂和体才会产生扩增片段。

体细胞杂合体的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的快捷方法。根据本发明， 用相同的寡核苷酸引物和来自特定染色体或大基因组克隆的一组片段，依照类似方法可以完 成亚定位。可以用于染色体作图的其它作图方法包括原位杂交、用标记的、经流式分选的染 色体进行预筛选以及用杂交进行预筛选，从而构建染色体特异性的cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以实现更精确的染色体位置。该 技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。详见Verma等人的综述，人类染色体：基本技术 手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦完成了基因在染色体上的精确定位，则可以将该基因在染色体上的物理位置与遗 传图谱数据联系起来。这些数据可以在例如V.McKusick，人类孟德尔式遗传中找到(可通 过互联网在Johns Hopkins大学的Welch医学文库中得到)。然后通过连锁分析(物理相邻 基因的共遗传)，确定基因与已定位到染色体相同区域的疾病之间的关系。

随后需要确定患病个体和正常个体之间cDNA或者基因组序列的差异。如果在部分或全 部患病个体中观察到突变，但在正常个体中观察不到，则所述突变可能是疾病的病因。

所说的多肽、其片段、其衍生物或类似物，或表达上述物质的细胞可用作免疫原而产 生抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链和人源化的抗体，以 及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法均可用于产生这些抗体和片段。

通过向动物体(优选非人体)直接注射或者施用本发明的多肽可以获得相应的抗体。这 样获得的抗体会与所述多肽结合。这样，即使是编码多肽片段的序列也可以产生能够结合整 个天然多肽的抗体。进而用这种抗体从表达该多肽的组织中分离多肽。

为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养而生产抗体的技术。 例如杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、三体杂交瘤技术、人 B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，4：72)和EBV-杂交瘤技术(Co1e，等，1985， 单克隆抗体和癌癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

可以将所述生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)加以改进，以生产抗本发明多 肽(具免疫原性)的单链抗体。也可以用转基因小鼠表达抗本发明多肽(具免疫原性)的人 源化抗体。

为了更清楚地理解本发明的实质，现参照下列附图和实施例对其进行解释。附图和实 施例是为了说明而不以任何方式限制本发明。

在以上所述的教导下，本发明的许多改良和变化是可能的，因此，在附属权利要求的 范围内，可以以不同于以上特定描述的方式实施本发明。

图1显示了fwa267在正常组织的分布。

图2显示了fwa267在不同肿瘤细胞系中的分布。

图3显示了同型半胱氨酸的浓度对平滑肌细胞表达Fwa267的影响。

图4为Fwa267在成人及胎儿心脏中的表达。

图5为Fwa267在成人、胎儿及法乐氏四联症肥厚心肌细胞中的表达。

图6显示了Fwa267在正常和亚急性心衰动物主动脉，以及在慢性心衰动物心脏中的表 达情况。

图7显示了Fwa267在正常心肌组织和心肌梗塞室壁瘤组织中的表达情况。

图8为Fwa267的蛋白电泳及Westen印迹杂交结果。

实施例一、成人主动脉cDNA文库的构建 1.1 RNA的提取

RNA gents Total RNA Isolation System kit购自美国Promega公司(Cat No.Z5110)。操 作如下：称取0.3g液氮中保存的成人主动脉组织，加入10ml变性液(4M异硫氰酸胍、25mM 柠檬酸三钠)和1ml 2M乙酸钠(pH4.0)匀浆。加入等体积水饱和酚和0.2倍体积氯仿，剧 烈振荡15秒，冰上放置15分钟。10,000rpm，4℃离心20分钟。取上清，加等体积异丙醇， -20℃放置2小时，离心。再用变性液5ml悬浮沉淀，重复上述步骤。用1ml冰预冷的75％ 乙醇洗涤沉淀，室温下蒸发痕量乙醇5-10分钟，用焦碳酸二乙脂(diethyl pyrocarbonate，以 下简称DEPC)处理的去离子水溶解RNA。 1.2mRNA的分离

成熟的mRNA的3′端有一条由20-250个腺苷酸组成的Poly(A)。根据该特征，可用亲 和层析法分离mRNA和其它的RNA。本实验使用的oligo(dT)纤维素含有12-18个核苷酸(T) 的多聚链。在多盐条件下，带有oligo(A)尾巴的mRNA与oligo(dT)结合并留在柱子上，而无 oligo(A)尾巴的rRNA与tRNA被洗掉，然后用低盐液洗脱挂在柱子上的mRNA。

Quick prepmicro mRNA purification kit购自瑞典Pharmacia公司。在1.5ml无RNA酶 的离心管1#内加入1ml oligo(dT)纤维素悬液；另取1.5ml离心管2#，加入用上样缓冲液稀释 的总RNA 1ml；管2#和管2#室温离心1分钟，12000rpm；吸去管1#上清，将管2#的上清加 入管1#，轻摇5-10分钟；室温离心10秒，12000rpm；用1ml高盐缓冲液(10mMTris-HClpH7.5， 1mM EDTA，0.5M NaCl)洗涤5次，离心；用1ml低盐缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，0.1M NaCl)洗涤5次，离心；用0.3ml低盐缓冲液悬浮oligo(dT)沉淀并转移到微量 离心柱，12000rpm，离心5秒；用0.5ml低盐缓冲液洗涤3次，离心；用2×0.2ml洗脱液收 集mRNA；用分光光度计测定光密度，计算OD260/280的比值；得到300μl mRNA，加入 7.5μl糖原，30μl 2.5M乙酸钾(pH5.0)，750μl无水乙醇在-70℃保存备用；使用前离心5分 钟，75％乙醇洗涤，DEPC处理的水溶解mRNA。 1.3 cDNA的合成

合成步骤参照ZAP ExpressTmcDNA Synthesis Kit*and ZAP ExpressTmcDNA Gigapack II Gold Cloning Kit*(美国Stregene公司，Catalog No.200403和200404)的说明书。

在0.5ml离心管中依次加入5μl 10×第一链缓冲液，3μl甲基化的dNTP混合物，2μl Xho I连接子oligo(dT)18引物(1.4μg/μl)，32.5μl用DEPC处理的去离子水，1μl RNA 酶抑制剂(40u/μl)，5μg mRNA，置室温10分钟。再加入1.5μl莫洛尼氏鼠白血病病毒 (MMLV)反转录酶(50u/μl)，总反应体积50μl。从中取出5μl转入另一离心管，加入0.5 μl α-32P三磷酸脱氧腺苷(dATP)(800ci/mmol)以鉴定第一链合成质量。上述反应均在37 ℃进行。

得到的DNA/RNA杂交分子在DNA聚合酶I的作用下，以第一链为模板合成第二链。 在冰浴中依次加入45μl第一链cDNA，20μl 10X第二链缓冲液，6μl dNTP混合物，114μ l去离子水，2μl[α-32p]dATP(800ci/mmol)，2μl RNA酶H(1.5u/μl)，1μl DNA聚合酶I(9.0 u/μl)，总体积200μl。混匀，16℃孵育2.5小时。反应结束后，用酚∶氯仿(1∶1)抽提， 乙醇沉淀。 1.4 cDNA与载体的连接

从试剂盒中取出9μl EcoRI连接子(序列分别为5’-AATTCGGCACGAG-3′和3’- GCCGTGCTC-5’)溶解沉淀。取1μl电泳，鉴定第一和第二链合成质量。在剩余的8μl 第二链cDNA中依次加入1μl 10X连接酶缓冲液，1μl 10mmol/L γ-三磷酸腺苷(γ-ATP)， 1μlT4 DNA连接酶(4u/μl)，8℃水浴16小时后，70℃孵育30分钟。用限制酶XhoI消化 1.5小时。琼脂糖凝胶(Sepharose)Cl-2B过柱分离，除去小于400碱基的核苷酸，以提高全长 cDNA在cDNA文库中的比例。 1.5 cDNA克隆入ZAP噬菌体载体

ZAP噬菌体载体(美国Stratagene公司)上的多克隆位点允许插入长达10Kb的核酸片 段，进入宿主后质粒部分可从载体上切开，形成质粒载体Bluescript。该载体多克隆位点两 侧有T7和T3噬菌体的启动子，可以用于序列分析和探针合成。插入载体的cDNA片段可以 表达具抗原性和生物活性的融合蛋白。实验详述如下：

在离心管内加入100ng cDNA，0.5μl 10X连接酶缓冲液，0.5μl 10mmol/L γ-ATP (pH7.5)，1ul ZAP噬菌体载体(1ug/ul)，o.5ul T4 DNA连接酶(4u/ul)，加去离子水至总体积5 μl。12℃连接16小时。

连接产物需包装外壳蛋白以产生有转染活性的重组噬菌体。快速从-70℃取出包装蛋 白，溶解后，在25ul包装蛋白内加1ul连接反应物，混匀，22℃反应2小时，加入500ul SM 缓冲液(0.1M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.05M Tris-HCl，0.01％明胶)，20ul氯仿。此混 合物即为原始的cDNA文库。 1.6 计算阳性克隆的效价

取5ul原始的cDNA文库，用45ul SM缓冲液稀释。将10ul稀释后的溶液，加入200ul 感受态XL1-Blue MRF′宿主菌中(OD600＝0.5)。37℃水浴20-30分钟，加入3ml上层琼脂糖， 混匀，铺于NZY(0.09M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.5％酵母提取液，1％NZ胺A)平板 上，倒置，37℃培养过夜，计算平板上的克隆数。

cDNA文库的效价用噬菌斑成斑数(pfu/ml)表示。pfu/ml＝(噬菌斑数×稀释倍数)×1000/ 稀释液用量(ul)。容量大于1×106个克隆的cDNA文库，能够保证其中含有每一个单拷贝的 mRNA.本发明成人主动脉cDNA文库的库容量为2.4×106个独立重组克隆。 1.7 cDNA文库的扩增和保存

构建的cDNA文库可直接用于筛选，但不稳定。因为非野生型的噬菌体易失活，故需 要扩增以方便多次筛选。取5×104个噬菌体转染XL1-Blue MRF′宿主菌，铺板，37℃孵育8- 10小时，然后在150mm平皿中加入8ml SM缓冲液，4℃培养过夜。离心，收集上清，即得 到扩增后的cDNA文库。加入0.3％氯仿，4℃保存。长期保存需加入7％的二甲基亚砜 (DMSO)，-70℃冻存。 实施例二、新全长cDNA的克隆 2.1 随机克隆的多聚酶链反应(PCR)扩增

cDNA文库铺盘，噬菌斑密度为200-500个克隆/培养皿(150mm)，挑取清亮的单个噬 菌斑转入含有75ul SM缓冲液和5ul氯仿的无菌离心管中，置于4℃。用前混匀离心，取上 清液5ul，用ZAP噬菌体载体3′端引物(5′CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC 3′)和5′端引 物(5′CAGTCAATTGTAATACGACTCACT 3′)进行PCR扩增，反应总体积50ul。扩增参数 为94℃预变性3分钟；再94℃45秒，55℃30秒，72℃3分钟，共30个循环；72℃延伸5-10 分钟。根据1％琼脂糖凝胶中电泳带的亮度估算PCR产物的产量。 2.2 表达序列标签(EST)的序列测定

ABI377自动测序仪(ABI PRISMTM377DNA sequencer)和自动测序试剂盒(BigDyeTM Terminator Ready Reaction Mix)购自美国PE公司。依照推荐的使用条件，用双脱氧链终止 法测序。

用非放射性CY5荧光素(CY5-fluoroscein)作标记物，通用测序引物T3(5′ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3′)和T7(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG3′)进行测序，每份样品 中引物用量为5pmol/ul。测序模板为PCR产物，用量约30-100ng。PCR扩增参数为94℃ 3- 5分钟；再94℃ 30秒，50℃ 15秒，72℃ 1分钟，20个循环；94℃ 30秒，72℃ 1分钟，15 个循环；再72℃延伸5分钟。DNA产物在8mol/L尿素、6％聚丙烯酰胺凝胶板上电泳。电 压1500V，功率34W，电泳250-300分钟(ALF ExpressTM DNA sequence，瑞典Pharmacia公 司)。 2.3 EST的生物信息学分析

用美国生物信息中心的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将每个cDNA 克隆的EST与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov).根 据BLAST的判断标准(国内外大多数实验室的通用标准)：同源序列小于100-200个碱基， Score值小于100的序列为新的EST。本发明Fwa267的EST为新EST。 2.4 EST引物步移法测序 2.4.1 ZAP噬菌体的体内环化

ZAP噬菌体载体能将目的片段在宿主内直接从λ噬菌体载体转移到质粒，环化为PBK- CMV(带有CMV病毒早期启动子)噬菌粒。环化步骤参照说明书(ZAP Express cDNA Synthesis kit and ZAP Express cDNA GigapacktmGold Doning kit)。

用3ul保存在4℃携带新EST的噬菌体和1ul辅助噬菌体(一类自身复制能力极低的 噬菌体突变体，可以为寄主细胞中质粒DNA的复制与包装提供蛋白酶和外壳蛋白质)共转 染300ul大肠杆菌XL1-Blue MRF’株(OD600＝1.0)。获得单链DNA后，再转染大肠杆菌XLOLR 株(试剂盒提供)，在试管内加5ml LB培养液，25ul卡那霉素，37℃培养12-16小时。 2.4.2 质粒的提取和鉴定

用德国QIAGEN公司的“QIAPrep Spin Miniprep kit″提取质粒。2400rpm，4℃离心10 分钟，收集过夜培养的细菌。弃上清，加入25ul缓冲液P1(100ul/ml RNaseA，50mM Tris/HCl， 10mM EDTA，pH8.0)悬浮细菌，移至灭菌的1.5ml离心管内。加250ul缓冲液P2(200mM NaOH，1％SDS)，颠倒上清几次，充分混匀。加350ul缓冲液P3(3.0M Kac，pH5.5)，立 刻摇管4-6次。12,000rpm，离心10分钟(SORVALLMc12V台式离心机)。收集上清， 将其移至底部套有收集管的微型纯化柱(QIA prep Spin Miniprep)内，12000rpm，离心30-60 秒。加0.75ul缓冲液TE(10mMTris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)，离心30-60秒。去掉收集管， 在QLAprep微型纯化柱底部套一个灭菌的离心管，加50ul缓冲液EB(10mM Tris-HCl pH8.5) 或去离子水，在柱床内保留1分钟后离心1分钟，收集纯化的DNA。

在离心管内加入3ul酶切缓冲液(10×)，1ul NotI内切酶(15u/ul)，1ul ECoRI内切酶 (15u/ul)，1ul BSA，2ul DNA，22ul去离子水，总体积30ul。37℃温育4-6小时。酶切后鉴 定质粒大小。 2.4.3 新的全长cDNA的测定

用美国PE公司的ABI377自动测序仪和测序试剂盒BigDye TMTerminator Ready Reaction Mix测定PBK-CMV阳性克隆的序列。

反应液中有BD4ul，BOB2ul(400mM Tris-HCl，pH9.0，10mM MgCl2)，引物2ul(5pmol/ ul)，DNA模板30-100ng，用H2O补足至终体积20ul。用步移法(逐级引物法)测定cDNA 全长序列，即下一轮的测序引物由上轮测序所得产物的末端碱基确定。用oligo 14.0软件 设计PCR引物。

结果：

如SEQ ID NO：1所示，Fwa267 cDNA全长3739个碱基对。根据kozak规律，推测其起 始密码子为107至109核苷酸(ATG)。编码序列为107至1219位核苷酸，终止密码子为1217 至1219位核苷酸。BLAST分析表明该基因定位与11号染色体。

蛋白同源性分析表明：Fwa267蛋白与分泌性生长因子fallotein的同源性为46％。推 测的Fwa267蛋白由170个氨基酸组成。其序列特征为：(A)从276至279 Aa(NYSV)为N- 糖基化位点；(B)从268至271Aa(KRYS)为cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶位点；(C)从262 至270Aa(RLNDDAKRY)为酪氨酸激酶位点；(D)从1至61Aa (MHRLIFVYTLICANFCSCRDTSATPQSASIKALRNANLRRDESNHLTDLYRRDETIQVKGN)为TonB依赖的 受体蛋白信号1；(E)从100至105Aa GLEEAE)，192至197Aa(GVSYNS)，303至308Aa (GGNCGC)，304至309Aa(GNCGCG)为豆蔻酰化位点；(F)从17至19Aa(SCR)，29至31 Aa(SIK)，66至68Aa(SPR)，80至82Aa(TWR)，150至152Aa(TFK)，243至245 Aa(TPR)， 273至275Aa(TPR)，243至245Aa(TPR)，273至275Aa(TPR)，320至322Aa(SGK) 为蛋白激酶C位点。(G)从17至20Aa(SCRD)，168至171Aa(SLLE)，181至184Aa(TNWE)， 199至202Aa(SVTD)，219至222Aa(TVED)，231至234Aa(SWQE)，250至253Aa(SYHD)， 256至259Aa(SKVD)为酪蛋白激酶II位点。 实施例三、Fwa267在正常组织的分布 3.1 实验材料

含12种组织的多组织膜(MTN膜)购自美国Clontech公司，用其检测Fwa267基因在 正常组织中的分布。β-actin是一种管家基因，在多种组织中表达均一，本实验中用作对照。 3.2 Northern杂交

方法参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋主编，中国协和医科大学出版社，第二 版，1999)147-149，202-205，207-213页。详述如下： 3.2.1 总RNA提取

称取0.5g组织于50ml离心管中，加入10ml GTC，匀浆。加等体积水饱和酚及0.2体 积氯仿，剧烈振荡15秒，冰上放置20分钟。4℃，12,000rpm离心25分钟。取上清置于 另一离心管，加等体积异丙醇，-20℃沉淀1小时。4℃ 12,000rpm离心25分钟，弃上清。 用5ml GTC重新溶解沉淀后，重复其它操作。用1ml预冷的75％乙醇洗涤，晾干，用DEPC 处理过的水溶解。测OD(光密度)260及OD280。 3.2.2 甲醛变性凝胶电泳

称取0.6g琼脂糖凝胶加入52.2ml DEPC处理过的水中，加热溶解，待胶冷到65℃，加 入6.0ml 10×MOPS，1.8ml甲醛，灌胶。取4.5ul(40-60ug)总RNA，加入2.0ul10×MOPS， 3.5ul甲醛，10ul甲酰胺，混匀，65℃变性15分钟，冰上冷却2分钟。加入2.0ul上样缓 冲液，混匀。50伏预电泳5分钟，上样。待染料全部进入胶后，电压降为40伏，每10分 钟混合电泳缓冲液1次。 3.2.3 转膜

待溴酚兰泳动到凝胶底部，停止电泳，照相。用DEPC处理过的水洗胶数次，用50mM NaOH处理45分钟，用20×SSC处理45分钟。尼龙膜先用去离子水浸湿，再用20×SSC处理45 分钟。在胶托上铺一层滤纸，用20×SSC浸湿，除去气泡；将胶倒置于胶托上，其上面放一 中间挖空的塑料薄片。小心将膜置于胶上，除去气泡，在膜上铺两张20×SSC浸湿的滤纸， 除去气泡。在滤纸上铺上10cm高的吸水纸，压一500克的重物。转膜16小时，中间换吸 水纸2-3次。小心取下膜，照相，用6×SSC泡膜5分钟。紫外交联，80℃烤膜1小时，4℃ 保存备用。 3.2.4 制备杂交模板

上游引物：5’-CC GAATTC  ATGCACCGGCTCATCTTTGTC-3’，斜体所示为保护碱基，黑体 所示为EcoRI酶切位点，划线部分与fwa267核酸序列107-127位互补；下游引物：5’-GCCTCGAG TCTTATCGAGGTGGTCTTGAGCTG-3’，斜体所示为保护碱基，黑体所示为XhoI酶切位点，划线 部分与fwa267核酸序列1198-1221位互补。

PCR反应体系：10倍缓冲液5.0ul，脱氧核糖核酸2.0ul，上游、下游引物各3.0ul，Taq 酶1.0ul，fwa267测序质粒(模板)2.0ul，无菌水34ul。PCR参数：94℃预变性3分钟； 94℃ 3分钟，94℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 80秒，30个循环。72℃ 7分钟。用醋酸铵/ 乙醇(1∶5)纯化PCR产物，溶于50ul TE，用琼脂糖定量，将其稀释至25ng/μl。 3.2.5 杂交

标记探针：在0.5ml离心管中加入PCR产物(在98℃加热4分钟变性，冰上冷却2分 钟)25ng，5×标记缓冲液10ul，dNTP(无dCTP)2.0ul，BSA 2.0ul，Klenow酶1.0ul，[α -32P]dCTP 5.0ul，用无核酸酶的水补至总体积50ul。室温反应1-3小时。

预杂交：将膜用6×SSC浸5分钟，贴于杂交管壁，除去气泡。加入6ml购于Clontech 的杂交液，68℃ 1小时。

杂交：倒掉杂交液，加入预热的杂交液6ml，加入探针(探针需在98℃加热4分钟变 性，冰上冷却2分钟)，68℃ 3小时。

洗膜：先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％ SDS)在室温洗膜四次，每次10分钟。再用 200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％ SDS)在50℃洗20分钟，56℃洗20分钟。

压片：用滤纸吸去液体，用保鲜膜包好，贴于一张与X光片相同大小的滤纸上，压片。 -70℃曝光适当时间，洗片。

结果：如图1所示：β-actin在多种组织中的表达水平均一(图1A)；fwa267选择性 地在心脏中高水平表达，在胎盘及肾脏细胞中也有表达(图1B)。 实施例四、fwa267基因在肿瘤细胞株中的表达 4.1 实验材料

含8种肿瘤细胞系的mRNA的杂交膜购自美国Clontech公司，用其检测Fwa267基因在 不同肿瘤细胞株中的分布。β-actin作为本实验的对照。 4.2 Northern杂交

参见实施例3.2。

结果：如图2所示：β-actin在若干种肿瘤组织中的表达水平均一(图2A)；Fwa267 在被检测的几株肿瘤细胞系中几乎不表达，仅在早幼粒白血病HL-60细胞系、淋巴母细胞性 白血病MOL-4细胞系、Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞系低水平表达(图2B)。

根据上述结果，推测Fwa267是一个增殖抑制因子。因为正常成人的心肌细胞是无增殖 能力的终末分化细胞，而肿瘤细胞是增生失控的细胞。两类细胞增殖能力的差异可能是由于： Fwa267基因在正常成人心肌细胞中高度表达，以维持其高度分化的状态；Fwa267基因在肿 瘤细胞中低水平表达，导致其增生失控。 实例五、Fwa267基因在不同心肌细胞中表达的差异 5.1 实验材料

来自胎儿、成人和法乐氏四联症患者的心肌细胞。 5.2 Northern杂交

参见实施例3.2。

结果：如图4所示，Fwa267基因在胎儿心脏中不表达，。由于正常成人的心肌细胞是没 有增殖能力的终末分化细胞，而胎儿的心肌细胞仍具有增殖分化的能力，上述结果提示Fwa267 与维持心肌的终末分化有关。

如图5所示，fwa267基因在法乐氏四联症肥厚心肌和成人心脏中的表达水平相当，但 均高于在胎儿心脏的表达。法乐氏四联症肥厚心肌细胞坏死纤维化，而Fwa267在其中的表 达也提示fwa267与细胞增殖抑制有关。 实施例六、同型半胱氨酸对平滑肌细胞表达Fwa267的影响

同型半胱氨酸(Homocysteine)是近年证实的一个导致动脉硬化、脑中风、冠心病、 心肌梗塞及周围血管病的独立危险因素。其能刺激细胞、特别是平滑肌细胞增生。本实验用 不同浓度的同型半胱氨酸处理在体外培养的人主动脉平滑肌细胞，观察细胞内Fwa267表达 的变化。 6.1 复苏传代细胞

将来源于人主动脉的平滑肌原代细胞冻存管从液氮中取出后迅速放入37℃水浴，待其 完全融化，将细胞悬液接种于25cm培养瓶中，瓶内预先加入5ml含10％FBS的RPMI或DMEM。 37℃，CO2浓度为5％，孵育箱内培养过夜，次日换液，培养液仍为含10％FBS的RPMI或DMEM。 6.2 传代培养

待细胞生长至基本融合(覆盖率约为80％)时，弃原培养液，用1×PBS(pH7.4)冲洗细 胞表面2次，加入0.125％胰蛋白酶，37℃消化5-10分钟。显微镜下观察，待细胞回缩变圆 并有部分漂浮时，加入少许含10％ FBS的培养液终止消化，并用吸管反复吹打细胞表面，收 集消化液，1000 RPM离心30秒，弃上清，加入含10％FBS的培养液吹打，混匀，取出0.1ml 用1×PBS稀释至1.0ml，计数，按100000个细胞每ml将细胞悬液接种于培养瓶内，瓶内预 先加入5ml含10％ FBS的RPMI或DMEM。37℃，CO2浓度为5％，孵育箱内培养。按此法将细 胞传3代至所需数量。将基本融合(覆盖率约为80％)的细胞，弃原培养液，换成含0.4％FBS 的培养液继续培养24-72小时，使细胞生长处于静止期。 6.3 用同型半胱氨酸刺激人平滑肌细胞

配制150mM同型半胱氨酸，用0.22um滤膜过滤，再用DMEM稀释成7.5mM、15mM、30mM 三种浓度。分别用0.5mM、1.0mM、2.0mM浓度的同型半胱氨酸刺激细胞18h，在1.0mM组预 先加入100uM的大豆金雀异黄素孵育6h，留取上清后，异硫氰丙酸(GTC)收获细胞。 6.4 Northern杂交

取上述细胞3瓶，提取mRNA。Northern杂交参见实施例3.2。

结果：

用同型半胱氨酸处理人平滑肌细胞18小时，可以抑制Fwa267基因的表达抑制，抑制 的程度随同型半胱氨酸浓度的升高而增加。

该结果提示：具有同型半胱氨酸的细胞增殖作用可能抑制Fwa267基因的表达，从而解 除Fwa267对细胞增生的抑制。 实施例七、Fwa267基因在正常、慢性心衰和亚急性心衰动物心脏中的表达 7.1 慢性心衰模型的建立

50只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300克/只)购自本院动物房。标准块料由北 京动物中心提供，饮水为自来水，水与饲料由动物随意摄取。

称重，根据体重以氯胺酮和安定腹腔内注射全麻大鼠。行气管内插管并接小型动物呼 吸机。在心电监护仪的监护下左侧开胸，以6-10手术缝线结扎左冠状动脉前降支，关胸。以 心电监护仪上有明显ST段升高为结扎成功的标志。待其苏醒后撤除呼吸机。术后饲养条件同 术前，50天后模型即建成。 7.2 亚急性心衰模型的建立

10只雄性Wistar大鼠(250克/只)购自解放军301医院，饲养条件同慢性心衰模型。

腹腔注射去甲肾上腺素30mg/日/只，连续注射4天，第5天模型即可以使用。 7.3 RNA-RNA原位杂交

原位杂交技术基于碱基互补的原理，通过探针特异性地与细胞内特定的mRNA或DNA 杂交，而显现出细胞内的基因及表达产物。该反应灵敏度极高，而且可检测出组织分化过程 中仅瞬间表达的基因。杂交试剂盒DIG RNA Labeling kit(Cat.No.1175025)购自德国 Boehringer Mannheim公司。 7.3.1 探针制备

用特异引物PCR，将200-300bp的Fwa267核酸片段(222-504位核苷酸)克隆入T Vector；重组质粒扩增，纯化；用T7和SP6引物进行PCR扩增；确定基因插入方向，测序 (mRNA和AntimRNA)。加T7RNA聚合酶合成反义探针，SP6 RNA聚合酶正义探针(检查杂 交系统的可靠性)。 7.3.2 探针标记

先用酚/氯仿抽提被转录的线形DNA，再用酒精沉淀。将无RNA酶的离心管置冰上，向 管内加入1μl纯化的线性DNA，2μl NTP标记混合液，2μl 10×转录缓冲液，1μl RNA酶抑制 剂，2μl(40u)SP6或T7 TNA聚合酶，共20μl。混匀，稍加离心，加入20u不含RNA的DNA 酶I，37℃15分钟。加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)以终止聚合反应。

在上述物质中加入2。5μl 4mol/L Licl、和75μl酒精(-20℃)的充分混匀，-70℃放 置至少30分钟(或-20℃放置至少2小时)。12,000rpm离心，70％冷乙醇洗涤，干燥后。加 100μl DEPC水和20u RNase，37℃静置30分钟后分装，-20℃保存。 7.3.3 玻片处理及标本制备

彻底清洗玻片，高压消毒30分钟，将玻片在含有多聚赖氨酸(0.01％)的溶液中浸蘸 几下，干燥，4℃备用。

新鲜标本(取自鼠心脏、主动脉)0.4cm×0.4cm，用1×PBS冲洗两次，置于冰冻切片 机固定头上。8-10μm切片，置有1mg/ml多聚赖氨酸的载玻片上晾干，4％多聚甲醛固定15- 20分钟。1×PBS冲冼2次，每次5分钟。 7.3.4 杂交前处理

用0.2N HCl浸泡25分钟。0.3％的Triton X-100浸泡5分钟。用1×PBS洗两次，每 次5分钟。用4％的多聚甲醛后固定6分钟。用1×PBS洗两次，每次5分钟。在1000毫升 0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)溶液中加入5ml乙酸酐，待其完全溶解将切片置于10分钟。以 上反应均在室温下进行。 7.3.5 杂交反应

杂交液含有5ml去离子甲酰胺，2.5ml 20×SSC，500μl 100×Denhardt’s液(10g聚 蔗糖，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白，500ml消毒双蒸水)，500μl 10％SDS，100 μl 10mg/ml变性的鲑鱼精子DNA，400ul DEPC水。

将切片从乙酰化溶液中捞出，用滤纸吸干标本四周液体，用在标本周围画一小圈。加 预杂交液30ul在小圈内，湿盒内42℃温育2小时。甩去预杂交液，用25ul杂交液覆盖Parafilm 膜，湿盒内42℃温育16小时，封闭湿盒。 7.3.6 杂交后处理

将玻片从温盒取出，去掉Parafilm膜。2×SSC室温冲洗三次，每次10分钟。1×SSC 室温冲洗三次，每次10分钟。0.1×SSC 50℃冲洗两次，每次15分钟。

若本底过高，将玻片置于含20μg/ml RNA酶的溶液(0.5mol/L NaCl，10mmol/L  Tris-Cl，pH8.0)中，37℃消化30分钟。再用不含RNA酶的上述溶液于37℃冲洗30分钟，洗膜。 7.3.7 显色反应

玻片浸泡于清洗液(1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl；0.3％(V/V)Tween-20)。在100ml 封闭液(试剂盒中的阻断剂按10％(W/V)加入顺丁烯二酸缓冲液(0.1mol/L顺丁烯二酸， 0.15mol/LNaCl)，使用时1∶10稀释)中温育30分钟。加20ml抗体溶液，温育30分钟。 用100ml清洗液洗两次，每次15分钟。加20ml检测液(0.1MTris-HCl，0.1MNaCl，pH9.5) 平衡2-5分钟。在10ml新配制的显色液(10ml检测液中加200ul NBT/BCIP)中温育，避 光，勿摇动。用消毒双蒸水或TE冲洗。

结果：如图6所示，Fwa267在正常主动脉的表达较低；亚急性心衰、慢性心衰动物主 动脉Fwa267的表达明显增高。 实例八、免疫组织化学 8.1 实验材料

人急性心肌梗塞并发症室壁瘤组织。 8.2 免疫组织化学分析

用重组正确的原核表达质粒转染E.coli Bl 21感受态细胞，超声破碎细胞，经10％变 性聚丙烯酰胺电泳，确定目的基因条带，选用超声和电洗脱法，从包涵体中获取融合蛋白经 Western印迹鉴定目的蛋白后，免疫动物所获得的血清即为本实验的一抗。

石蜡切片5微米，贴附于包被有多聚赖氨酸的APES玻片上，75℃烤片2小时。二甲苯 脱蜡后经梯度酒精后切片入水。3％ H2O2内10分钟。蒸馏水洗三遍，放入EDTA抗原修复液 内(pH8.0)，置微波炉中烘烤(96℃-98℃)10分钟。室温冷却20-30分钟，蒸馏水洗三 遍。入1×PBS缓冲液5分钟。10％正常兔血清20分钟。加适当稀释的一抗，4℃内孵育过夜。 1×PBS洗三次后，加生物素标记的羊抗兔二抗，室温10分钟。1×PBS洗三次，加酶联链霉亲 和素三抗，室温10分钟。1×PBS洗三次，DAB显色。蒸馏水三次，苏木素浅染胞核、脱水、 封片。

结果：如图7所示，正常心肌细胞低水平表达Fwa267，而室壁瘤组织则高表达Fwa267。 实施例九、Fwa267基因的体外重组及蛋白表达 9.1 构建重组载体 9.1.1 酶切

载体为pGEX-5X-1。取2.0ul pGEX-5x-1载体，5.0ul缓冲液，2.0ul XhoI，2.0ul EcoRI， 39ul无菌水，37℃酶切16小时。纯化酶切产物。

PCR引物(上游引物5’-CCGAATTC  ATGCACCGGCTCATCTTTGTC-3’，下游引物5’-GCCTCGAG TCTTATCGAGGTGGTCTTGAGCTG-3’)同Northern杂交，PCR反应同实施例3.2.4。取10 ul PCR 纯化产物，5.0ul缓冲液，2.0ul XhoI，2.0ul EcoRI，31ul无菌水，37℃酶切16小时。纯 化酶切产物。 9.1.2 连接

2.0ul pGEX-5x-1酶切产物，2.0ul PCR酶切产物，2.0ul 10X缓冲液，1.0ul T4连接 酶，13ul无菌水，16℃连接6小时。 9.1.3 转化

取上述连接产物1.0ul，加入200ul E.coli DH5α感受态细胞。混匀，置于冰上30分 钟。42℃60秒，冰上2分钟。加入800ul SOC培养基37℃摇菌(小于225RPM)45分钟。取 100ul涂于含Amp(氨卞青霉素)抗性的LB平板上。37℃30分钟以充分吸收液体。37℃培养16 小时。挑单克隆置于5ml含50ugAmp的LB培养基中37℃摇16小时。 9.1.4 质粒提取

菌液2000RPM离心10分钟，弃上清。沉淀中加预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH8.0， 2.0mM EDTA，50mM glucose)140ul，悬浮细菌。用280ul新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％ SDS) 裂解细菌。再加入450ul预冷的溶液III(4.0M Potassium acatate)，混匀。离心4000RPM 10 分钟，12000RPM 10分钟。取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，同上离心。用100ul TE(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)和20ug/ml的RNA酶溶解沉淀，37℃30分钟。加600ul醋 酸铵/乙醇(1∶5)，-70℃放置30分钟。离心后用75％乙醇洗涤。用TE 100ul溶解提取的 质粒，测OD260/280定量。 9.1.5 挑选阳性克隆

用PCR的方法鉴定阳性克隆。 9.2 在原核系统中的表达

用重组正确的质粒转化E.coli BL21感受态细胞。转化，培养细菌。按1∶100比例取 上面菌液加入50ml2X YTA培养基中。37℃摇菌4-6小时使其OD600为0.6-0.8。加入IPTG， 使其浓度为0.4mM，继续摇4小时。7700g离心10分钟，弃上清。用冰上预冷的1×PBS(50ul/ml 菌液)悬浮细菌。超声破碎细胞。10000g离心10分钟。在上清及沉淀中加入上样缓冲液， 95℃-100℃煮5分钟变性。在10％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，待溴酚兰到最底端。染色， 脱色，确定目的条带。

结果：如图8A所示，用上海丽珠东风生物技术有限公司的低分子量marker作参照， Fwa267蛋白的分子量约为40KD。 9.3 包涵体分离

收集菌液，按5菌液：1裂解液(体积比)的比例加入裂解缓冲液(1M PMSF，1mg/ml 溶菌酶溶于PBS)，冰浴20分钟。加入Triton-X 100终浓度为1％，冰浴10分钟。20HZ超 声30秒，4℃ 15,000RPM离心25分钟，留少量上清备用。在沉淀中加入5倍体积的包涵体 洗液，重悬包涵体，20HZ超声30秒，4℃15,000 RPM离心25分钟。重复该过程4-5次。3,000RPM 离心10分钟，弃上清。15,000RPM离心15分钟，重悬沉淀于变性缓冲液I(2mM DTT，2mM EDTA pH8.0)(10ml/g)中，超声30秒。重悬沉淀于变性缓冲液II(40mM NaOH((10ml/g)中， 超声1分钟。重悬沉淀于1/4体积的变性缓冲液III(40％甘油，50mM Tris-Cl，pH8.0，1ul PMSF) 中，冰浴5分钟。4℃15,000RPM离心1小时，收集上清，-20℃保存备用。 9.4 Western印迹杂交

电泳分离粗产物。切下目的条带，装入透析袋，50伏电泳12-16小时，100伏2小时， 倒转电极一分钟。弃胶，PEG浓缩，1×PBS透析16小时，4小时换液一次。

取纯化的蛋白20ul加5ul 5×上样缓冲液在12％的SDS-PAGE胶上电泳，100V伏2小时。 取下胶，将胶泡在电转液中30分钟。剪六张与膜同样大小的滤纸，一张硝酸纤维素膜。将 胶置于负极，硝酸纤维素膜置于正极，两侧各加三张滤纸，置于半干式转膜仪中，11mA转 膜一小时(0.65mA/cm2)。取下膜，将膜置于10ml封闭液中室温封闭一小时。倒出封闭液， 加20ml TBST洗膜5分钟，再重复一次。按1∶20,000的比例稀释一抗，加1ul一抗加20ml 封闭液，室温一小时。倒出封闭液，洗膜。按1∶1,000稀释二抗，加10ul兔抗羊IgG/AP+10ml 封闭液，室温一小时。倒出封闭液，洗膜。加20ml PBS洗膜5分钟，再重复一次。加20ml 碱性磷酸酶缓冲液洗膜5分钟。33ul NBT加5ml碱性磷酸酶缓冲液加16.5ul BCIP，室温显 色5分钟。终止显色。加20ml高压水洗5分钟。

结果：如图8B所示，在40KD左右有Fwa267蛋白的杂交带。 本发明并不限于上述具体的实施例，实施例仅用于说明本发明的某些方面。功能上等同的方 法和物质已包括在本发明的范围内。事实上，根据本文的描述和附图，基于本发明的各种改 变对本领域的技术人员而言是显而易见的。这样的改变已包括在本发明权利要求的范围内。

                    序列表 一般信息 (i)申请人：中国医学科学院心血管病研究所 (ii)发明名称：肌细胞增殖抑制因子Fwa267 (iii)序列数：2 (iv)通讯地址：   (A)联系人：惠汝太   (B)街道：西城区北礼士路167号   (C)城市：北京   (D)国家：中国   (E)邮编：100037 (v)计算机可读形式：   (A)介体类型：3.5英寸软盘   (B)计算机：奔腾166MMX   (C)操作系统：WINDOWS 95   (D)软件：WORD 97 (1)SEQ ID NO：1的信息 (i)序列特征：   (A)序列类型：核苷酸   (B)长度：3739个碱基对   (C)链型：单链   (D)拓扑：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)来源：成人主动脉cDNA文库 (iv)在基因组中的定位：11号染色体 (v)序列描述： 1321 CTGCAATGCA ATGAACACAA GTGGTTGCTG AGTCTCAGCC TTGCTTTGTT AATGCCATGG 1381 CAAGTAGAAA GGTATATCAT CAACTTCTAT ACCTAAGAAT ATAGGATTGC ATTTAATAAT 1441 AGTGTTTGAG GTTATATATG CACAAACACA CACAGAAATA TATTCATGTC TATGTGTATA 1501 TAGATCAAAT GTTTTTTTTG GTATATATAA CCAGGTACAC CAGAGCTTAC ATATGTTTGA 1561 GTTAGACTCT TAAAATCCTT TGCCAAAATA AGGGATGGTC AAATATATGA AACATGTCTT 1621 TAGAAAATTT AGGAGATAAA TTTATTTTTA AATTTTGAAA CACAAAACAA TTTTGAATCT 1681 TGCTCTCTTA AAGAAAGCAT CTTGTATATT AAAAATCAAA AGATGAGGCT TTCTTACATA 1741 TACATCTTAG TTGATTATTA AAAAAGGAAA AATATGGTTT CCAGAGAAAA GGCCAATACC 1801 TAAGCATTTT TTCCATGAGA AGCACTGCAT ACTTACCTAT GTGGACTATA ATAACCTGTC 1861 TCCAAAACCA TGCCATAATA ATATAAGTGC TTTAGAAATT AAATCATTGT GTTTTTTATG 1921 CATTTTGCTG AGGCATGCTT ATTCATTTAA CACCTATCTC AAAAACTTAC TTAGAAGGTT 1981 TTTTATTATA GTCCTACAAA AGACAATGTA TAAGCTGTAA CAGAATTTTG AATTGTTTTT 2041 CTTTGCAAAA CCCCTCCACA AAAGCAAATC CTTTCAAGAA TGGCATGGGC ATTCTGTATG 2101 AACCTTTCCA GATGGTGTTC AGTGAAAGAT GTGGGTAGTT GAGAACTTAA AAAGTGAACA 2161 TTGAAACATC GACGTAACTG GAAATTAGGT GGGATATTTG ATAGGATCCA TATCTAATAA 2221 TGGATTCGAA CTCTCCAAAC TACACCAATT AATTTAATGT ATCTTGCTTT TGTGTTCCCG 2281 TCTTTTTGAA ATATAGACAT GGATTTATAA TGGCATTTTA TATTTGGCAG GCCATCATAG 2341 ATTATTTACA ACCTAAAAGC TTTTGTGTAT CAAAAAAATC ACATTTTATT AATGTAAATT 2401 TCTAATCGTA TACTTGCTCA CTGTTCTGAT TTCCTGTTTC TGAACCAAGT AAAATCAGTC 2461 CTAGAGGCTA TGGTTCTTAA TCTATGGAGC TTGCTTTAAG AAGCCAGTTG TCAATTGTGG 2521 TAACACAAGT TTGGCCCTGC TGTCCTACTG TTTAATAGAA AACTGTTTTA CATTGGTTAA 2581 TGGTATTTAG AGTAATTTTT TCTCTCTGCC TCCTTTGTGT CTGTTTTAAA GGAGACTAAC 2641 TCCAGGAGTA GGAAATGATT CATCATCCTC CAAAGCAAGA GGCTTAAGAG AGAAACACCG 2701 AAATTCAGAT AGCTCAGGGA CTGCTAACAG AGAACTACAT TTTTTCTTAT TGCCTTGAAA 2761 GTTAAAAGGA AAGCAGATTT CTTCAGTGAC TTTGTGGTCC TACTAACTAC AACCAGTTTG 2821 GGTGACAGGG CTGGTAAAGT CCCAGTGTTA GATGAGTGAC CTAAATATAC TTAGATTTCT 2881 AAGTATGGTG CTCTCAGGTC CAAGTTCAAC TATTCTTAAG CAGTGCAATT CTTCCCAGTT 2941 ATTTGAGATG AAAGATCTCT GCTTATTGAA GATGTACCTT CTAAAACTTT CCTAAAAGTG 3001 TCTGATGTTT TTACTCAAGA GGGGAGTGGT AAAATTAAAT ACTCTATTGT TCAATTCTCT 3061 AAAATCCCAG AACACAATCA GAAATAGCTC AGGCAGACAC TAATAATTAA GAACGCTCTT 3121 CCTCTTCATA ACTGCTTTGC AAGTTTCCTG TGAAAACATC AGTTTCCTGT ACCAAAGTCA 3181 AAATGAACGT TACATCACTC TAACCTGAAC AGCTCACAAT GTAGCTGTAA ATATAAAAAA 3241 TGAGAGTGTT CTACCCAGTT TTCAATAAAC CTTCCAGGCT GCAATAACCA GCAAGGTTTT 3301 CAGTTAAAGC CCTATCTGCA CTTTTTATTT ATTAGCTGAA ATGTAAGCAG GCATATTCAC 3361 TCACTTTTCT TTGCCTTTCC TGAGAGTTTT ATTAAAACTT CTCCCTTGGT TACCTGTTAT 3421 CTTTTGCACT TCTAACATGT AGCCAATAAA TCTATTTGAT AGCCATCAAA GGAATAAAAA 3481 GCTGGCCGTA CAAATTACAT TTCAAAACAA ACCCTAATAA ATCCACATTT CCGCATGGCT 3541 CATTCACCTG GAATAATGCC TTTTATTGAA TATGTTCTTA TAGGGCAAAA CACTTTCATA 3601 AGTAGAGTTT TTTATGTTTT TTGTCATATC GGTAACATGC AGCTTTTTCC TCTCATAGCA 3661 TTTTCTATAG CGAATGTAAT ATGCCTCTTA TCTTCATGAA AAATAAATAT TGCTTTTGAA 3721 CAAAAAAAAA AAAAAAAAA (2)SEQ ID NO：2的信息  (i)序列特征：   (A)序列类型：氨基酸   (B)长度：370个氨基酸   (C)链型：单链   (D)拓扑：线性  (ii)分子类型：蛋白质  (iii)来源：成人主动脉cDNA文库  (iv)推测蛋白的序列特征：   (A)从276至279Aa(NYSV)为N-糖基化位点   (B)从268至271Aa(KRYS)为cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶位点   (C)从262至270Aa(RLNDDAKRY)为酪氨酸激酶位点   (D)从1至61Aa(MHRLIFVYTLICANFCSCRDTSATPQSASIKALRNANLRRDESNHLTDL YRRDETIQVKGN)为TonB依赖的受体蛋白信号1   (E)从100至105Aa(GLEEAE)，192至197Aa(GVSYNS)，303至308Aa(GGNCGC)， 304至309Aa(GNCGCG)为豆蔻酰化位点

(F)从17至19Aa(SCR)，从29至31Aa(SIK)，从66至68Aa(SPR)，从 80至82Aa(TWR)，从150至152Aa(TFK)，从243至245Aa(TPR)，从273至275 Aa(TPR)，从243至245Aa(TPR)，从273至275Aa(TPR)，从320至322Aa(SGK) 为蛋白激酶C位点

(G)从17至20Aa(SCRD)，从168至171Aa(SLLE)，从181至184Aa(TNWE)， 从199至202Aa(SVTD)，从219至222Aa(TVED)，从231至234Aa(SWQE)，从 250至253Aa(SYHD)，从256至259Aa(SKVD)为酪蛋白激酶II位点   (v)序列描述：

                 5                   10                    15

                 |                    |                     |   1  Met His Arg Leu Ile  Phe Val Tyr Thr Leu  Ile Cys Ala Asn Phe  16  Cys Ser Cys Arg Asp  Thr Ser Ala Thr Pro  Gln Ser Ala Ser Ile  31  Lys Ala Leu Arg Asn  Ala Asn Leu Arg Arg  Asp Glu Ser Asn His  46  Leu Thr Asp Leu Tyr  Arg Arg Asp Glu Thr  Ile Gln Val Lys Gly  51  Asn Gly Tyr Val Gln  Ser Pro Arg Phe Pro  Asn Ser Tyr Pro Arg  76  Asn Leu Leu Leu Thr  Trp Arg Leu His Ser  Gln Glu Asn Thr Arg  91  Ile Gln Leu Val Phe  Asp Asn Gln Phe Gly  Leu Glu Glu Ala Glu 106  Asn Asp Ile Cys Arg  Tyr Asp Phe Val Glu  Val Glu Asp Ile Ser 121  Glu Thr Ser Thr Ile  Ile Arg Gly Arg Trp  Cys Gly His Lys Glu 136  Val Pro Pro Arg Ile  Lys Ser Arg Thr Asn  Gln Ile Lys Ile Thr 151  Phe Lys Ser Asp Asp  Tyr Phe Val Ala Lys  Pro Gly Phe Lys Ile 166  Tyr Tyr Ser Leu Leu  Glu Asp Phe Gln Pro  Ala Ala Ala Ser Glu 181  Thr Asn Trp Glu Ser  Val Thr Ser Ser Ile  Ser Gly Val Ser Tyr 196  Asn Ser Pro Ser Val  Thr Asp Pro Thr Leu  Ile Ala Asp Ala Leu 211  Asp Lys Lys Ile Ala  Glu Phe Asp Thr Val  Glu Asp Leu Leu Lys 226  Tyr Phe Asn Pro Glu  Ser Trp Gln Glu Asp  Leu Glu Asn Met Tyr 241  Leu Asp Thr Pro Arg  Tyr Arg Gly Arg Ser  Tyr His Asp Arg Lys 256  Ser Lys Val Asp Leu  Asp Arg Leu Asn Asp  Asp Ala Lys Arg Tyr 271  Ser Cys Thr Pro Arg  Asn Tyr Ser Val Asn  Ile Arg Glu Glu Leu 286  Lys Leu Ala Asn Val  Val Phe Phe Pro Arg  Cys Leu Leu Val Gln 301  Arg Cys Gly Gly Asn  Cys Gly Cys Gly Thr  Val Asn Trp Arg Ser 316  Cys Thr Cys Asn Ser  Gly Lys Thr Val Lys  Lys Tyr His Glu Val 331  Leu Gln Phe Glu Pro  Gly His Ile Lys Arg  Arg Gly Arg Ala Lys 346  Thr Met Ala Leu Val  Asp Ile Gln Leu Asp  His His Glu Arg Cys 361  Asp Cys Ile Cys Ser  Ser Arg Pro Pro Arg