肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体的选择性抗体和其它治疗剂的联合体系
专利汇可以提供肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体的选择性抗体和其它治疗剂的联合体系专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的 抗体 与人DR5或与人DR4相互作用，在所述受体下游产生激动或拮抗作用，包括抑制 细胞增殖 和细胞凋亡。已经阐明了任选与各种 治疗 剂联合的所述抗体的方法和用途包括治疗细胞凋亡相关 疾病 和治疗调节异常的细胞生长。，下面是肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体的选择性抗体和其它治疗剂的联合体系专利的具体信息内容。
1.一种选择性诱导表达DR5的靶细胞中的细胞凋亡的方法，包 括以下步骤：(a)使靶细胞接触治疗量的特异性结合TRAIL受体DR5 的抗体，其中所述抗体的可溶性形式在表达DR5的靶细胞中具有体内 和体外细胞凋亡诱导活性，和(b)使靶细胞与治疗量的一种或多种治 疗剂接触。
2.权利要求1的方法，其中至少一个接触步骤在体内进行。
3.权利要求1的方法，其中至少一个接触步骤在体外进行。
4.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是化疗剂。
5.权利要求4的方法，其中所述化疗剂选自博莱霉素、卡铂、 苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、道诺霉素、放线菌素、己 烯雌酚、阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、美法仑、氨甲喋 呤、丝裂霉素、6-巯基嘌呤、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、长春新碱和 长春碱。
6.权利要求4的方法，其中所述化疗剂选自来氟米特、放线菌 素、他莫昔芬、干扰素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯基嘌呤、6-硫 鸟嘌呤、卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、雌氮芥、羟基脲、 甲基苄肼、白消安、甲羟孕酮、磷酸雌氮芥钠、炔雌醇、雌二醇、醋 酸甲地孕酮、甲基睾丸酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚、睾内酯、美 法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、噻替哌、磷酸倍他米松钠、dicarbazine、 天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱和硫酸长春碱。
7.权利要求4的方法，其中所述化疗剂是环磷酰胺、阿霉素、 长春新碱和强的松，或其亚组。
8.权利要求7的方法，进一步包括给予rituximab。
9.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是TNF家族成员。
10.权利要求9的方法，其中所述TNF家族成员是CD40配体， 或其片段或衍生物。
11.权利要求9的方法，其中所述TNF家族成员是Fas配体，或 其片段或衍生物。
12.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是抗炎剂。
13.权利要求12的方法，其中所述抗炎剂是非甾体类抗炎剂。
14.权利要求13的方法，其中所述非甾体类抗炎剂是COX-1抑 制剂或COX-2抑制剂。
15.权利要求12的方法，其中所述抗炎剂是甾体类抗炎剂。
16.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是抗病毒剂。
17.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是抗逆转录病毒剂。
18.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是抗机会性感染剂。
19.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是抗生素。
20.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是免疫抑制剂。
21.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是免疫球蛋白制剂。
22.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是抗疟剂。
23.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是改变病情的抗风湿药 物。
24.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是细胞因子。
25.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是趋化因子。
26.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是生长因子。
27.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是凋亡诱导化合物。
28.权利要求27的方法，其中所述凋亡诱导化合物是双吲哚基 马来酰亚胺VIII(BisVIII)、SN-50或LY294002。
29.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是促进靶细胞凋亡或阻 断靶细胞增殖的第二抗体。
30.权利要求29的方法，其中所述第二抗体选自DR4抗体、TNF 抗体、B7抗体、CD40配体抗体、CD40抗体、CD20抗体和Fas抗体。
31.权利要求1的方法，其中所述治疗剂选自化疗剂、TNF家族 成员、抗炎剂、抗病毒剂、抗逆转录病毒剂、抗机会性感染剂、抗生 素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗疟剂、抗类风湿性关节炎剂、细胞 因子、趋化因子、生长因子、和促进靶细胞凋亡或阻断靶细胞增殖的 第二抗体。
32.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是异常增殖的滑膜细胞。
33.权利要求32的方法，其中所述滑膜细胞是类风湿性关节炎 滑膜细胞。
34.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是活化的免疫细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述活化的免疫细胞是活化的淋 巴细胞。
36.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是中性粒细胞。
37.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是病毒感染的细胞。
38.权利要求1的方法，进一步包括对靶细胞进行放射。
39.一种抑制表达DR5的靶细胞增殖的方法，包括以下步骤：(a) 使靶细胞接触治疗量的特异性结合TRAIL受体DR5的抗体，其中所述 抗体的可溶性形式在表达DR5的靶细胞中具有体内和体外细胞凋亡诱 导活性，和(b)使靶细胞与治疗量的一种或多种治疗剂接触。
40.权利要求39的方法，其中至少一个接触步骤在体内进行。
41.权利要求39的方法，其中至少一个接触步骤在体外进行。
42.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是化疗剂。
43.权利要求42的方法，其中所述化疗剂选自博莱霉素、卡铂、 苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、道诺霉素、放线菌素、己 烯雌酚、阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、美法仑、氨甲喋 呤、丝裂霉素、6-巯基嘌呤、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、长春新碱和 长春碱。
44.权利要求42的方法，其中所述化疗剂选自放线菌素、他莫 昔芬、干扰素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、 卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、雌氮芥、羟基脲、甲基苄 肼、白消安、甲羟孕酮、磷酸雌氮芥钠、炔雌醇、雌二醇、醋酸甲地 孕酮、甲基睾丸酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚、睾内酯、美法仑、 苯丁酸氮芥、氮芥、噻替哌、磷酸倍他米松钠、dicarbazine、天冬 酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱和硫酸长春碱。
45.权利要求42的方法，其中所述化疗剂是环磷酰胺、阿霉素、 长春新碱和强的松，或其亚组。
46.权利要求45的方法，进一步包括给予rituximab。
47.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是TNF家族成员。
48.权利要求47的方法，其中所述TNF家族成员是CD40配体， 或其片段或衍生物。
49.权利要求47的方法，其中所述TNF家族成员是Fas配体， 或其片段或衍生物。
50.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是抗炎剂。
51.权利要求50的方法，其中所述抗炎剂是非甾体类抗炎剂。
52.权利要求51的方法，其中所述非甾体类抗炎剂是COX-1抑 制剂或COX-2抑制剂。
53.权利要求50的方法，其中所述抗炎剂是甾体类抗炎剂。
54.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是抗病毒剂。
55.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是抗逆转录病毒剂。
56.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是抗机会性感染剂。
57.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是抗生素。
58.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是免疫抑制剂。
59.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是免疫球蛋白制剂。
60.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是抗疟剂。
61.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是抗类风湿性关节炎 剂。
62.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是细胞因子。
63.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是趋化因子。
64.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是生长因子。
65.权利要求39的方法，其中所述治疗剂是促进靶细胞凋亡或 阻断靶细胞增殖的第二抗体。
66.权利要求65的方法，其中所述第二抗体选自DR4抗体、TNF 抗体、B7抗体、CD40配体抗体、CD40抗体、CD20抗体和Fas抗体。
67.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是凋亡诱导化合物。
68.权利要求1的方法，其中所述凋亡诱导化合物是双吲哚基马 来酰亚胺VIII(BisVIII)、SN-50或LY294002。
69.权利要求39的方法，其中所述治疗剂选自化疗剂、TNF家族 成员、抗炎剂、抗病毒剂、抗逆转录病毒剂、抗机会性感染剂、抗生 素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗疟剂、抗类风湿性关节炎剂、细胞 因子、趋化因子、生长因子、和促进靶细胞凋亡或阻断靶细胞增殖的 第二抗体。
70.权利要求39的方法，其中所述靶细胞是异常增殖的滑膜细 胞。
71.权利要求70的方法，其中所述滑膜细胞是类风湿性关节炎 滑膜细胞。
72.权利要求39的方法，其中所述靶细胞是活化的免疫细胞。
73.权利要求39的方法，其中所述活化的免疫细胞是活化的淋 巴细胞。
74.权利要求39的方法，其中所述靶细胞是中性粒细胞。
75.权利要求39的方法，其中所述靶细胞是病毒感染的细胞。
76.权利要求39的方法，进一步包括对靶细胞进行放射。
77.一种治疗具有炎性疾病或自身免疫病的受试者的方法，包括 (a)给予受试者治疗量的特异性结合TRAIL受体DR5的抗体，其中所 述抗体的可溶性形式在表达DR5的靶细胞中具有体内和体外细胞凋亡 诱导活性，和(b)给予受试者治疗量的治疗剂。
78.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是化疗剂。
79.权利要求78的方法，其中所述化疗剂选自博莱霉素、卡铂、 苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、道诺霉素、放线菌素、己 烯雌酚、阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、美法仑、氨甲喋 呤、丝裂霉素、6-巯基嘌呤、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、长春新碱和 长春碱。
80.权利要求78的方法，其中所述化疗剂选自放线菌素、他莫 昔芬、干扰素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、 卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、雌氮芥、羟基脲、甲基苄 肼、白消安、甲羟孕酮、磷酸雌氮芥钠、炔雌醇、雌二醇、醋酸甲地 孕酮、甲基睾丸酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚、睾内酯、美法仑、 苯丁酸氮芥、氮芥、噻替哌、磷酸倍他米松钠、dicarbazine、天冬 酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱和硫酸长春碱。
81.权利要求78的方法，其中所述化疗剂是环磷酰胺、阿霉素、 长春新碱和强的松，或其亚组。
82.权利要求81的方法，进一步包括给予rituximab。
83.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是TNF家族成员。
84.权利要求83的方法，其中所述TNF家族成员是CD40配体， 或其片段或衍生物。
85.权利要求83的方法，其中所述TNF家族成员是Fas配体， 或其片段或衍生物。
86.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是抗炎剂。
87.权利要求86的方法，其中所述抗炎剂是非甾体类抗炎剂。
88.权利要求87的方法，其中所述非甾体类抗炎剂是COX-1抑 制剂或COX-2抑制剂。
89.权利要求86的方法，其中所述抗炎剂是甾体类抗炎剂。
90.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是抗病毒剂。
91.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是抗逆转录病毒剂。
92.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是抗机会性感染剂。
93.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是抗生素。
94.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是免疫抑制剂。
95.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是免疫球蛋白制剂。
96.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是抗疟剂。
97.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是抗类风湿性关节炎 药物。
98.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是细胞因子。
99.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是趋化因子。
100.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是生长因子。
101.权利要求77的方法，其中所述治疗剂是促进靶细胞凋亡或 阻断靶细胞增殖的第二抗体。
102.权利要求101的方法，其中所述第二抗体选自DR4抗体、TNF 抗体、B7抗体、CD40配体抗体、CD40抗体、CD20抗体和Fas抗体。
103.权利要求1的方法，其中所述治疗剂是凋亡诱导化合物。
104.权利要求103的方法，其中所述凋亡诱导化合物是双吲哚 基马来酰亚胺VIII(BisVIII)、SN-50或LY294002。
105.权利要求77的方法，其中所述治疗剂选自化疗剂、TNF家 族成员、抗炎剂、抗病毒剂、抗逆转录病毒剂、抗机会性感染剂、抗 生素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗疟剂、抗类风湿性关节炎剂、细 胞因子、趋化因子、生长因子、和促进靶细胞凋亡或阻断靶细胞增殖 的第二抗体。
106.权利要求77的方法，其中所述炎性疾病或自身免疫病选自 系统性红斑狼疮、桥本氏病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、斯 耶格伦综合征、恶性贫血、阿狄森氏病、硬皮病、古德帕斯彻综合征、 克隆氏病、自身免疫性溶血性贫血、不育症、重症肌无力、多发性硬 化、巴塞多病、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿痛、变态反应、 哮喘、特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球性肾炎、再 生不良性贫血。
107.权利要求77的方法，进一步包括给予受试者放疗。
108.一种组合物，包含(a)特异性结合TRAIL受体DR5的抗体， 其中所述抗体的可溶性形式在表达DR5的靶细胞中具有体内和体外细 胞凋亡诱导活性，和(b)一种或多种治疗剂。
109.权利要求108的组合物，其中所述治疗剂选自化疗剂、TNF 家族成员、抗炎剂、抗病毒剂、抗逆转录病毒剂、抗机会性感染剂、 抗生素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗疟剂、改变病情的抗风湿药物、 细胞因子、趋化因子、生长因子、和促进靶细胞凋亡或阻断靶细胞增 殖的第二抗体。
110.权利要求108的组合物，进一步包含药学上可接受的载体。
声明
本申请要求2002年6月24日提交的美国临时申请60/391,478和 2001年11月1日提交的美国临时申请60/346,402的权益，并且要求 目前未决的2001年5月提交的PCT/US01/14151的优先权。 PCT/US01/14151要求2000年5月2日提交的美国临时申请60/201,344 的权益。在此引入本申请要求其权益的那些申请的全文作为参考。
本发明是在国家癌症研究所授予的基金NCI P50 CA89019-01和 国家关节炎及肌肉骨骼和皮肤病研究所授予的NIH R03-AR44982的政 府支持下进行的。政府对本发明享有某些权利。
发明领域
本发明涉及能够特异性地结合单一类型肿瘤坏死因子(在下文称 为“TNF”)相关细胞凋亡诱导配体(在下文称为“TRAIL”)受体的抗体， 更具体地讲，涉及在体内和体外诱导表达所述单一类型受体的细胞细 胞凋亡的单克隆抗体，还涉及基于其的疗法。
发明背景
TRAIL是蛋白质TNF家族的一员，所述家族也包括TNF-α和Fas 配体(1)。这些蛋白质是有效的细胞凋亡诱导物。迄今为止，已经鉴 定了5种TRAIL受体，其中两种-DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2) (2-7)能够转导细胞凋亡信号，而其它三种-DcR1(TRAIL-R3)、DcR2 (TRAIL-R4)和osteoprotegerin(OPG)不转导细胞凋亡信号(8-12)。 所有5种TRAIL受体在其胞外配体结合结构域中共享显著同源性。与 Fas和TNF受体I(在下文称为“TNFRI”)相似，DR4和DR5的胞内区 段都含有一个死亡结构域，通过涉及Fas相关死亡结构域蛋白(在下 文称为“FADD”)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8的途径转导细 胞凋亡信号(6，7)。除转导细胞凋亡信号外，DR4和DR5受体也可以激 活涉及NFκb的途径(6，7)。
已经证明的TRAIL的生物学功能包括TRAIL能够选择性地诱导转 化肿瘤细胞细胞凋亡，而正常细胞对TRAIL介导的细胞凋亡具有相对 抗性(13-15)。这种选择性提示，通过在动物模型中系统给予TRAIL 没有诱导显著毒性证明，与Fas配体相反，TRAIL的给予与非常低水 平的毒性相关(13)。因此，已经提出TRAIL为一种有效的细胞凋亡诱 导剂，它可能是用于治疗癌症和与异常细胞增殖相关的其它疾病的合 适的治疗剂。也提出了TRAIL是一种可能适用于治疗自身免疫病和炎 性疾病的有效的细胞凋亡诱导剂。已经证明，TRAIL介导的细胞凋亡 参与活化诱导的T细胞的细胞死亡，从而用作Fas配体的一种替代机 制(16，17)。TRAIL介导的细胞凋亡也可能在诱导T细胞和其它炎性细 胞细胞凋亡方面起作用(18)，以及在NK细胞的杀伤活性(19-21)和树 突细胞的免疫调节功能(22，23)方面起作用。因此，TRAIL介导的细胞 凋亡也可能在免疫特权和免疫监视方面起作用。
TRAIL受体系统是复杂的，包括至少两种死亡受体(DR4和DR5)和 至少两种非细胞凋亡受体(DcR1和DcR2)。所有这些受体不仅享有高 氨基酸序列同源性，而且表现出与TRAIL相似的结合亲和性(2-12)。 DcR1和DcR2受体竞争与TRAIL结合而不诱导细胞凋亡的能力提示， 它们可能用作阻断或调节TRAIL配体活性的诱饵受体。此外，已经报 道，未经转化的细胞表达的诱饵受体水平高于转化细胞表达的水平。 因此提出了，所述死亡受体和诱饵受体的表达的差别调节可能代表决 定细胞对TRAIL介导的细胞凋亡的敏感性的关键调控机制，但却因为 缺乏受体特异性抗体(2)。尽管已经广泛研究了DR4和DR5的表达和 功能，但由于缺乏受体特异性单克隆抗体而阻碍了进展。DR5的细胞 表面表达尚未有记载。已有报道，已经产生了一组抗TRAIL受体抗体， 所述抗体能够在体外诱导黑素瘤细胞凋亡，但仅在所述抗体被固定化 以促进交联时诱导细胞凋亡，而在某些情况下，所述细胞需要用放线 菌素D培养(24)。已经产生了几种抗DR5抗体(24)。然而，这些先前 产生的抗DR5单克隆抗体在体外甚至在交联条件下，其细胞凋亡诱导 活性也很低。没有报道体内活性。这些抗体已经用来检查TRAIL受体 的细胞表面表达(24)。因此，需要不仅能够与细胞表面受体结合、而 且在体内和体外都强烈诱导各种类型异常细胞(包括肿瘤细胞)细胞凋 亡而无需交联或固定化的对每种具体TRAIL受体选择性的单克隆抗 体。这种抗体可能不仅提供潜在的治疗剂，而且也为TRAIL受体的功 能分析提供一种诊断工具。特别需要对于死亡诱导受体DR4和DR5中 每种特异性的抗体。
在许多疾病的发生或进展中，通常的情况是所述细胞未被清除。 在许多自身免疫病和炎性病症中，存活的活化细胞攻击正常组织或细 胞。此外，肿瘤发生的进展和类风湿性关节炎的增生性淋巴结炎形成 的特征为未加抑制的细胞增殖。因此，不足的细胞凋亡导致发病，应 用细胞凋亡诱导配体或激动性单克隆抗体增强细胞凋亡，被认为是一 种消除那些不想要的细胞的可能的治疗策略。
例如，类风湿性关节炎(在下文称为“RA”)是一种常见的人类自 身免疫病。目前对RA病理生理学的了解是，自身免疫T细胞和B细 胞起始所述关节中的炎性应答，这驱使滑膜细胞增殖过多。由于滑膜 细胞增殖过多，金属蛋白酶(在下文称为“MMP”)过量产生，这进一 步导致RA特征性的软骨和骨的侵蚀性破坏(25)。因此，控制炎性滑 膜细胞增殖过多是治疗RA中的关键一步。导致滑膜细胞增殖过多的 分子机制尚不了解。尽管增殖过多的滑膜细胞是非恶性的且非转化 的，但许多研究提示，它们与转化细胞享有某些共同的特征(46)。所 谓“看来已转化的滑膜细胞”的这些细胞的特征是致密粗面内质网、 大量的不规则细胞核和正常的纺锤形细胞骨架改变。已经提出，癌基 因和病毒来源的基因的掺入可能是RA滑膜细胞已转化外观的主要触 发物(46)。
RA的至少两个方面提示，失调的细胞凋亡可能是引起疾病进程的 主要原因，并且细胞凋亡的治疗诱发可能是一种有效的疗法：活化T 细胞未能耗竭提示，这些T细胞的活化诱导的细胞死亡存在缺陷，这 种活化诱导的细胞死亡是一种涉及Fas介导的细胞凋亡和TRAIL介导 的细胞凋亡的过程，RA滑膜细胞的增殖过多性质是在RA病理生理学 晚期起作用的因素。实际上，已经表明，将抗Fas抗体给予炎性关节， 在人类RA动物模型tax转基因小鼠中抑制慢性关节炎的发生(26)。 此外，用fas配体基因通过腺病毒载体局部转导有效预防胶原蛋白诱 导的关节炎(27)。在两种情况下都观察到通过增强Fas介导的细胞凋 亡对炎性滑膜细胞增殖的抑制。尽管Fas配体在RA滑膜细胞中是一 种强细胞凋亡诱导物，但应用Fas配体介导的细胞凋亡作为人类疗法 由于其致死性肝毒性而受到限制。因此，TRAIL受体诱导的细胞凋亡 代表了一种在治疗RA方面比Fas配体诱导的细胞凋亡更安全更有效 的疗法。
TRAIL受体诱导的细胞凋亡也代表一种在治疗癌症方面比Fas配 体诱导的细胞凋亡更安全更有效的疗法。已知TRAIL介导的细胞凋亡 特异性地诱导转化肿瘤细胞的细胞凋亡，而不影响正常细胞。已经证 明，系统给予三聚体化可溶性TRAIL在实验动物中并不引起毒性，但 能够诱导移植肿瘤的消退(13，28)。其作为传统疗法的辅佐疗法的潜 力被最近的发现所强调，所述发现为，DR5的表达和乳癌细胞对TRAIL 诱导的细胞凋亡的敏感性通过放射得以加强，提示结合放射，TRAIL 的功效在癌症治疗中得以增加(29)。
另外，编码TRAIL受体DR5的基因已经作图至染色体8p21-22， 这在某些癌细胞中是一种高频突变的基因座(30)。已经报道，至少两 种肿瘤细胞-小细胞肺癌(31)以及头颈部癌(32)表现出DR5基因死亡 结构域中有突变。因此，在癌症研究中需要抗DR5抗体，以测定受体 表位变异对癌症发生和发展的影响。此外，当与癌症早期检测的其它 生物标记结合使用并且用作肿瘤侵袭预测因子时，TRAIL受体突变的 功能性将证明是一种有用的临床诊断工具。
发明概述
在一种实施方案中，本发明涉及一种识别TRAIL受体DR5并且在 体内或体外诱导DR5表达细胞凋亡的抗体。还公开了识别DR5、但不 识别DR4、DcR1或DcR2的抗体。具体详细地描述了用杂交瘤生产的DR5 的单克隆抗体。
在另一种实施方案中，本发明涉及一种识别TRAIL受体DR4并且 在体内或体外诱导DR4表达细胞凋亡的抗体。还公开了识别DR4、但 不识别DR5、DcR1或DcR2的抗体。具体详细地描述了用杂交瘤生产 的DR4的单克隆抗体。
本发明提供了通过使细胞接触治疗量的能够与DR5或DR4结合的 抗体而诱导靶细胞凋亡或抑制靶细胞增殖的方法。在方法的各种实施 方案中，可以通过使靶细胞接触其它死亡受体的抗体而诱导细胞凋亡 或抑制细胞增殖。
也公开了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗量的有效抗 DR5单克隆抗体、一种药学上可接受的载体和任选的装有所述抗体和 所述载体的容器。本发明还提供识别DR5的抗体或识别DR4的抗体在 制备使异常细胞或失调的细胞选择性凋亡的治疗剂中的应用。
本发明的抗体与肿瘤坏死因子相关细胞凋亡配体受体，例如DR4、 DR5、DcR1、DcR2和OPG相互作用，诱导表达这种受体的细胞凋亡。 公开了一种本发明的抗体，所述抗体能够选择性结合激动性或拮抗性 肿瘤坏死因子配体受体表位。
本发明提供用于细胞凋亡相关疾病、癌症、炎性疾病、或自身免 疫病的疗法，所述疗法采用这样一种方法，所述方法包括使患病的靶 组织与治疗量的本发明抗体接触，本发明的抗体单独存在或与其它细 胞凋亡诱导抗体和/或其它治疗剂或疗法联合。
还描述了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括一个至少具有10个 碱基、与免疫球蛋白或其片段偶联、能够在受试者体内诱发免疫应答 的抗原性TRAIL受体氨基酸序列。
本发明提供一种基因治疗方法，其中用表达载体中的TRAIL受体 核酸序列转染靶细胞，使得所述TRAIL受体表达在所述靶细胞上。然 后将所述靶细胞暴露于选择性结合所述TRAIL受体的抗体。
提供了编码的DR5选择性抗体的免疫球蛋白重链和轻链的核酸序 列和氨基酸序列。也提供了选择性结合DR4的抗体的序列。也详细描 述了包括本发明核酸序列的载体以及用本发明的载体转化的宿主细 胞。
本发明提供一种人源化DR5抗体(如TRA-8)和人源化DR4抗体 (如2E12)，以及产生人源化DR5抗体的转染的细胞和产生人源化DR4 抗体的转染的细胞。
描述了一种生产人源化DR5抗体或DR4抗体的方法，其中用编码 人源化免疫球蛋白轻链和人源化免疫球蛋白重链的核酸序列转化宿 主，然后将转化宿主孵育预定的时间。
也描述了一种诱导靶细胞凋亡或抑制细胞增殖的方法，所述方法 包括在其它治疗剂和疗法存在下，使靶细胞与药用有效量的人源化DR5 抗体、DR4抗体或抗体与另一种死亡受体的抗体(如DR4的抗体)的 联合体系接触。
提供了用于诱导细胞凋亡的商业试剂盒，所述试剂盒包括DR5的 选择性人源化TRA-8抗体或DR4的人源化抗体(如人源化2E12)；所 述抗体包装在合适的容器内且任选附有使用说明。
附图简述
图1.TRA-8的表征。(a)TRA-8的结合特异性：蛋白质印迹分 析(上图)：用TRA-8或抗人IgG探测的TNFR家族的重组融合蛋白。 第1泳道：DR5/hIgG1融合蛋白(免疫原)；第2泳道：DR4/hIgG1 (TRAIL-R1)；第3泳道：DR5/hIgG1；第4泳道：TRAIL-R3(DcR- 1)/hIgG1；第5泳道：TRAIL-R4(DcR-2)/hIgG1；第6泳道：CD95/hIgG1； 第7泳道：可溶性TNFRI。ELISA分析(下图)：所述孔的数目匹配蛋 白质印迹的孔数，孔8除外，孔8是鼠DR5/hIgG1融合蛋白。(b)可 溶性TRAIL和TRA-8与DR5和DR4的结合活性：ELISA板用DR5/hIgG1(左 图)或DR4/hIgG1(中间图)包被，然后与TRAIL或TRA-8一起孵育。(c) DR5表面表达的流式细胞术分析。用含有全长DR5 cDNA(实心直方图)、 DR4 cDNA(空心直方图，实线)或空载体(空心直方图，虚线)的pcDNA3 表达载体转染的Cos-7细胞。转染后48小时，细胞用TRA-8染色， 然后用PE偶联的抗小鼠IgG1染色。(d)DR5的原位免疫组织化学反 应性：用DR5表达载体或对照载体转染的Cos-7细胞的Cytospin玻片 在转染后48小时用TRA-8染色，(e)TRA-8的杀伤活性：将Jurkat 细胞与指定浓度的TRA-8一起孵育。在过夜培养后，通过ATPLite、MTT 和PI排除测定测量细胞存活力。ATPLite和MTT测定的结果以培养基 对照的百分比表示，PI测定的结果以PI阴性细胞的百分比表示。(f)天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化的蛋白质印迹分析：将Jurkat细 胞与500ng/ml TRA-8一起孵育指定的时间。细胞裂解液通过15％ SDS-PAGE分离，将其制成印迹，用抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 抗体探测。箭头表示每种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的经切割的 亚单位。(g)天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制测定：将Jurkat 细胞在存在各种浓度的指定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的 情况下与50ng/ml TRA-8一起孵育过夜。通过ATPLite测定测量细胞 存活力。
图2.DR5的细胞表面表达和对DR5介导的细胞凋亡的敏感性。 将从外周血新鲜分离的正常T细胞和B细胞、T细胞(a和a’)、神经 胶质瘤(b和b’)、前列腺癌细胞(c)和B细胞(d)细胞系与TRA-8或鼠 IgG1同种型对照抗体一起孵育，然后与PE偶联的山羊抗小鼠IgG1一 起孵育。空心直方图代表所述同种型抗体对照，而实心直方图代表 TRA-8染色。在与可溶性TRAIL(空心圆)或TRA-8(实心圆)一起孵育 过夜后，通过ATPLite测定测量细胞凋亡，如a、b’和d中所示。
图3a’.T细胞系U937与TRA-8或鼠IgG1同种型对照抗体一起孵 育。在与可溶性TRAIL(空心圆)或TRA-8(实心圆)一起孵育过夜后， 通过ATPLite测定测量细胞凋亡。
图3.神经胶质瘤细胞系(b)和前列腺癌细胞系(c)与TRA-8或 鼠IgG1同种型对照抗体一起孵育。在与可溶性TRAIL(空心圆)或TRA-8 (实心圆)一起孵育过夜后，通过ATPLite测定测量细胞凋亡。
图4是一系列曲线图，显示人Jurkat细胞在暴露于指定浓度的(A) 抗体株TRA-1、TRA-8和TRA-10和(B)在固定浓度的图4A所示本发明 抗体株存在下暴露于TRAIL后的细胞存活力；
图5.DR5在正常组织和癌组织中的表达：正常组织匀浆和癌组 织匀浆用TRA-8探测，然后通过化学发光显示。(a)正常组织中DR5 蛋白的蛋白质印迹分析：第1泳道：肝，第2泳道：脑，第3泳道： 肺，第4泳道：肾，第5泳道：脾，第6泳道：睾丸。第7泳道：卵 巢，第8泳道：心脏，第9泳道：胰腺。b.癌组织中DR5蛋白的蛋 白质印迹分析。探测包含得自以下癌的癌组织印迹：卵巢(第1泳道)、 肺(第2泳道)、肝(第3泳道)、直肠(第4泳道)、宫颈(第5泳道)、 皮肤(第6泳道)、睾丸(第7泳道)、甲状腺(第8泳道)、子宫(第10 泳道)、胃(第11泳道)、喉咽(第12泳道)和胰腺(第13泳道)。正常 人组织(c)和癌组织(d)的原位免疫组织化学。冷冻切片用TRA-8免疫 染色。
图6.TRA-8的杀肿瘤活性。给SCID小鼠皮下接种1321N1细胞。 在肿瘤接种后第2天给小鼠静脉注射一剂100μg TRA-8(a)或在肿瘤 接种后开始7天注射三剂100μg TRA-8(b)。肿瘤生长通过重量测定， 并且用H&E染色进行组织学检查。照片显示了对照小鼠中的有活力的 肿瘤生长，而在TRA-8治疗的小鼠中没有所述肿瘤生长(c，上图)， 还显示了肿瘤的H&E染色(c，下图)。给SCID小鼠静脉注射106 Jurkat 细胞，然后注射后第2天用一剂TRA-8治疗。7天后，收获脾细胞， 用抗人CD3抗体染色，并通过流式细胞术(d)或通过免疫组织化学(e) 分析。
图7显示了RA(A)和OA(B)滑膜细胞中细胞表面DR5的表达。1 ×106原代培养滑膜细胞用亲和纯化的TRA-8染色，然后用PE偶联的 山羊抗小鼠IgG1抗体染色。通过FACSvantage分析10,000个活细胞。
图8是一系列曲线图，显示了用各种浓度的重组可溶性TRAIL(空 心圆)或亲和纯化的TRA-8(实心圆)诱导RA(A)和OA(B)滑膜细胞的 代表株系细胞凋亡的随TRAIL和TRA-8浓度而变的细胞存活力。细胞 存活力以经治疗细胞的cpm相对于未经治疗细胞的cpm的百分比表 示。
图9是一系列曲线图，显示了RA滑膜细胞DR5介导的细胞凋亡 的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶依赖性。将RA滑膜细胞(RA512)在 存在各种浓度的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的情况下与50 ng/ml可溶性Fas配体(空心方形)、抗Fas抗体(CH-11)(实心方形)、 可溶性TRAIL(空心圆)或抗DR5抗体(TRA-8)(实心圆)一起孵育。在 培养过夜后，通过ATPLite测定细胞存活力。
图10A是显示NFκb激活的电泳凝胶移动分析。RA1016细胞与20 ng/ml TNF-α、50ng/ml可溶性TRAIL或50ng/ml TRA-8一起孵育指 定的时间，然后进行电泳。图10B和10C是显示MMP-1和MMP-3产生 的曲线图。1×106/ml指定的RA滑膜细胞与指定浓度的TNF-α(空心 圆)、TRAIL(空心三角)或TRA-8(实心圆)一起孵育。培养过夜后， 收集培养上清液。通过ELISA测定培养上清液中MMP的水平。
图11.TRA-8不诱导肝细胞毒性。(a)正常肝组织不表达DR5。 制备两种正常肝组织、一种肝细胞癌组织和HepG2细胞的cytospin 制备物的石蜡切片，以供H&E染色，相应的冷冻切片用TRA-8染色。 (b)DR5细胞表面表达的流式细胞术分析。从两种正常肝组织和一例 肝细胞癌组织分离的肝细胞、以及HepG2细胞用TRA-8、抗Fas抗体(DX2) 或同种型对照抗体染色。实心直方图表示TRA-8或DX2染色，而空心 直方图是相应的同种型对照。
图12.是TRAIL而非TRA-8诱导肝细胞毒性。将新鲜的正常人 肝细胞保持在肝细胞培养基中。(a)在指定的时间点内用1μg/ml可 溶性TRAIL加上交联剂或TRA-8诱导肝细胞细胞凋亡。细胞存活力通 过ATPLite测定。结果以与培养基对照相比的活细胞百分比表示。阴 影条带指示TRAIL，而深色条带代表TRA-8。(b)肝细胞的固缩核用 Hoechst 33352染色，然后通过流式细胞术分析。(c)放线菌酮对肝细 胞细胞凋亡的影响。肝细胞在对照培养基中或加有1μg/ml TRAIL或 TRA-8的培养基中在存在(实心条带)或不存在(空心条带)1μg/ml放 线菌酮的情况下培养8小时。细胞存活力通过ATPLite测定。结果以 两个实验的三份重复培养物的平均值±SEM表示。(d)正常肝细胞对DR5 和Fas介导的细胞凋亡的敏感性的比较。新鲜分离的肝细胞与指定浓 度的可溶性TRAIL、TRA-8、可溶性FasL或抗Fas mAb CH11一起孵育 6小时。细胞存活力通过ATPLite测定来测量。结果以与培养基对照 相比的活细胞百分比表示。对于正常肝细胞，代表4个正常个体的平 均值±SEM。得自一位患者的肝细胞癌细胞和HepG2细胞以三份重复培 养物的平均值表示。
图13.TRAIL诱导肝炎。给B6小鼠静脉内接种109 pfu腺病毒载 体，所述载体编码“Tet-on”转录元件控制下的全长人TRAIL。TRAIL 表达通过指定剂量的四环素来诱导。(a)肝中人TRAIL表达的RNA印 迹分析。接种载体并用四环素诱导后24小时，从肝中分离出总RNA， 并且用人TRAIL cDNA或β-肌动蛋白探测。(b)AST的血清水平。TRAIL 转导后24小时，测量AST血清水平。(c)TRAIL介导的腺病毒载体感 染的肝细胞的细胞死亡：给B6小鼠静脉内接种四环素诱导型腺病毒 载体。接种后48小时，分离得自接种小鼠和未接种对照小鼠的肝细 胞，将其与指定浓度的TRAIL一起孵育8小时(左图)。肝细胞的细胞 存活力通过ATPLite测定来测量。48小时后，给接种上述腺病毒载体 的小鼠静脉注射10μg可溶性人TRAIL。在注射TRAIL后24小时，测 量AST血清水平(右图)。(d和e)TRAIL诱导的肝损伤的组织学分析。 用TRAIL转导后24小时(d)或7天(e)时收集肝脏。对石蜡切片进行H&E 染色，以100X(上图)和400X(下图)拍照。
图14是一系列曲线图，显示了通过静息细胞(空心)和活化细胞(阴 影)的流式细胞术测定，从人PBMC纯化的活化T细胞和B细胞表达增 加水平的DR5。
图15是图14中所示的已经用抗CD3或抗μ刺激48小时的纯化T 细胞和B细胞以及通过不同密度的Ficoll-Paque收集的活化细胞和 母细胞的随TRA-8浓度而变的存活力曲线图。存活力通过ATPLite测 定来测量。
图16是直方图和流式细胞术曲线图，显示了注射了人PBMC和 TRA-8或IgG(对照)的NK细胞耗竭的NOD/SCID小鼠的门控淋巴细胞 群体中的CD3表达。
图17显示了实施例13中详述的小鼠脾组织的CD3和TUNEL染色 的细胞显微照片。
图18显示了慢性溶淋巴细胞性白血病(CCL)和正常人B细胞在 TRA-8、BISVIII及其组合存在下的细胞毒性曲线图。
图19(a).2E12与DR4的特异性结合。用可溶形式的人TRAIL受 体-人IgG1 Fc融合蛋白包被ELISA板，并且与指定浓度的mAb 2E12 一起孵育，然后与HRP偶联的抗小鼠IgG1孵育。用TMB底物缓冲液 对反应显色，在450/650nM下测量OD值。
图19(b).2E12结合细胞表面DR4。用含有DR4的全长cDNA(实 心图)或对照载体(空心图)的载体转染Cos-7细胞。用10μg/ml 2E12 和PE偶联的抗小鼠IgG1对转染的细胞染色。通过流式细胞术分析细 胞。
图19(c).2E12的凋亡诱导活性。在2μg/ml 2E12抗小鼠IgG1 存在下，将人Ramos B淋巴瘤细胞与指定浓度的2E12孵育过夜。通 过ATPLite测定法确定细胞存活力。(d)2E12诱导天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶活化。在指定的时间点用2E12和抗小鼠IgG抗体处理 Ramos细胞。使用特异性抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶或PARP抗 体，通过蛋白质印迹分析确定PARP切割。
图20.2E12和阿霉素在携带乳腺癌异种移植物的无胸腺裸鼠中的 作用。在第0天将2LMP细胞(3×107)皮下注射到无胸腺裸鼠中。在第 7，10，14，17，21和24天给两组小鼠腹膜内注射200μg 2E12。两 组小鼠在第8，12和16天接受静脉内注射阿霉素(6mg/kg)。一组小鼠 不接受抗体。数据表示为相对于第7天肿瘤大小的肿瘤大小平均改变 (n＝8只小鼠/组)。
图21.TRA-8，2E12和阿霉素在携带乳腺癌异种移植物的无胸腺 裸鼠中的作用。在第0天将2LMP细胞(3×107)皮下注射到无胸腺裸鼠 中。在第7，10，14，17，21和24天给两组小鼠腹膜内注射200μg TRA-8 和2E12。两组小鼠在第8，12和16天接受静脉内注射阿霉素(6mg/kg)。 一组小鼠不接受抗体。数据表示为相对于第7天肿瘤大小的肿瘤大小 平均改变(n＝8只小鼠/组)。
发明详述
不能清除细胞是因为在细胞凋亡诱导系统中有与作为说明包括所 述配体、受体或者胞内调节分子和效应分子的表达或功能在内的缺陷 相关的缺陷。本发明提供了一种纠正缺陷型细胞凋亡诱导系统以及阐 述给定缺陷型细胞凋亡诱导系统中具体缺陷的方法。
本发明涉及一类新的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有针对特异 性TRAIL受体(包括DR5、DR4、DcR1和DcR2)的体内和体外选择性细 胞凋亡诱导活性。因此，本发明的抗体特异性结合TRAIL受体之一。 “选择性结合”或“特异性识别”表示采用常规蛋白质印迹分析表明， 抗体只结合一种TRAIL受体，并且对其它类型的TRAIL受体表现出很 少的结合或不与其结合。本发明的DR5抗体选择性结合DR5，并且在 高于背景约1.5倍时不表现出结合DR4，DcR1或DcR2。相似地，本发 明的DR4抗体选择性结合DR4，并且在高于背景约1.5倍时不表现出 结合DR5，DcR1或DcR2。本发明可用作细胞凋亡信号传递研究的试剂， 并且对表达TRAIL受体的细胞是治疗有效的，所述表达TRAIL受体的 细胞例如包括广泛类型的癌细胞，表现出凋亡系统失调的细胞，自身 免疫病的活化的淋巴细胞或其它活化的免疫细胞(如淋巴细胞和髓细 胞)，病毒感染的细胞，和异常增殖的滑膜细胞(如类风湿性关节炎 滑膜细胞，包括炎性滑膜细胞，滑膜种的活化的淋巴细胞和髓细胞， 巨噬细胞样滑膜细胞，和成纤维细胞样滑膜细胞)。本发明的抗体在 结合特定类型TRAIL受体方面有特异性，尽管在它们之间有同源性。 本发明抗体提供了仅表达靶TRAIL受体的细胞的靶向细胞凋亡，或者 阻断表达靶受体的细胞的TRAIL细胞凋亡。
本发明的DR5单克隆抗体或DR4单克隆抗体可用作表达DR5或DR4 的细胞凋亡的体外有效诱导物和细胞凋亡的体内有效诱导物。移植到 人源化抗体骨架的人源化片段CDR序列和本发明的融合蛋白抗DR5或 DR4抗体表现出相似的细胞凋亡特性。
迄今为止，尚未得到与细胞表面DR5结合并且在体外和体外在缺 乏交联剂的情况下都诱导表达DR5的细胞凋亡的单克隆抗体。本发明 包括在疾病的动物模型(例如异种移植动物)中或在体内有效用作治疗 剂的抗DR5抗体。尽管已经表明可溶性TRAIL在体内有效诱导肿瘤细 胞凋亡，但杀伤活性看来非常低，并且常常需要大剂量并且重复给药 (13)。本发明提供了一种结合TRAIL受体DR5的纯化抗体，其中所述 抗体以其可溶形式存在时在低浓度下在表达DR5的靶细胞中具有体内 和体外细胞凋亡诱导活性。在一种优选实施方案中，纯化抗体在不存 在抗体交联的情况下结合TRAIL受体DR5。优选地，该抗体不诱导正 常成纤维细胞的显著交联。优选地，细胞凋亡诱导活性的特征在于在 小于约0.1，1，5，10或20μg/ml或其间的任意浓度下，小于60％，50％， 40％，30％，20％，10％，5％或其间任意百分比的靶细胞存活率。用常规 蛋白质印迹分析时，纯化抗体特异性结合于TRAIL受体DR5并且不结 合TRAIL受体DR4，DcR1或DcR2。在一种优选实施方案中，所述抗体 是单克隆抗体，优选与具有ATCC保藏号PTA-1428的小鼠-小鼠杂交 瘤TRA-8具有相同的表位特异性。
本发明的一系列抗DR5抗体之一-TRA-8在携带人DR5转基因的 动物是药用有效的，并且也可应用于建立可供研究DR5和TRAIL作用 的模型。
本发明的各种实施方案提供了在存在或不存在交联的条件下诱导 细胞凋亡的抗体。例如，DR5抗体的一种优选实施方案(如TRA-8) 在不存在交联时诱导细胞凋亡。“交联”包括，例如，通过第二抗体 交联。一种实施方案在交联剂存在下提供诱导细胞凋亡的抗体，包括， 例如，DR4抗体的优选实施方案(2E12)。
因此，本发明提供了一种纯化的抗体，它特异性结合TRAIL受体 DR4，其中所述抗体的可溶形式在表达DR4的靶细胞中具有体内和体 外细胞凋亡诱导活性。在一种实施方案中，所述抗体是与杂交瘤2E12 具有相同表位特异性的单克隆抗体，杂交瘤2E12具有ATCC保藏号 PTA-3798，保藏于2001年10月24日，指定名称为“抗人DR4的2E12 杂交克隆”，以UAB研究基金会的名义保藏。本发明的一系列DR4抗 体之一，2E12，与未处理对照动物相比，或与治疗前的肿瘤大小相比， 在患有表达DR4的癌症的动物体内，在减少肿瘤大小方面具有药物活 性。
DR5的抗体的可溶形式在低剂量下是有效的，低剂量表示低于约 0.01-约1μg/ml的体外剂量或浓度，和低于约1-10mg/kg的体内 浓度。本发明的抗体的优选特征是它们选择性诱导表达DR5受体的细 胞的凋亡，而不诱导正常的、未活化的、未转化的肝细胞、纤维细胞、 滑膜细胞等的细胞凋亡。按照本发明，从实验动物收获针对TRAIL受 体产生的本发明的抗体，也可以通过本领域公知的任何抗体生产或合 成方法制备。通过按照本发明将所述抗体人源化，以保持受体结合活 性，而在人类受试者体内诱发减弱的且治疗耐受的免疫应答，本发明 的人源化抗TRAIL受体抗体可用作给定TRAIL受体的治疗性激动剂或 拮抗剂。本发明作为体内治疗剂是有效的，因为不需要任选将所述抗 TRAIL受体抗体进行二次交联。
本发明可延伸至具有激动性或拮抗性细胞凋亡效应的单一抗 TRAIL受体抗体之外。而是，使两种或更多种抗TRAIL受体抗体与细 胞培养物在体外接触或与受试者机体组织在体内接触，以产生协同治 疗。例如，神经胶质瘤细胞系U87和造血细胞系U937和Molt-4对协 同暴露于激动性抗DR4抗体和抗DR5抗体有反应，而仅暴露于激动性 抗DR5抗体在诱导细胞凋亡方面仅表现出有限的成功。
另外，当抗体特异性地结合诱饵受体之一-DcR1、DcR2或OPG时， 拮抗性抗TRAIL受体抗体尤其可应用于本发明中。用按照本发明抗体 选择性地封闭诱饵受体在表达诱饵受体的细胞类型中有使所述TRAIL 结合平衡向能够转导细胞凋亡信号的TRAIL受体改变的效应。因此， 在按照本发明的另一种联合治疗中，诱饵受体结合抗体使表达细胞向 转导TRAIL受体结合的激动性细胞凋亡信号方向致敏。
在另一实施方案中，本发明提供一种阐明给定TRAIL受体的激动 性表位和拮抗性表位的方法。此外，按照本发明，通过利用一组分别 具有不同可变区或CDR区的单克隆抗体，阐明个体之间与给定TRAIL 受体相关的多态性。一组已表征的单克隆抗体提供了限定激动性和拮 抗性表位和多态性的能力。因此，一组按照本发明的单克隆抗体可应 用于药物发现和/或疾病倾向的受试者筛选中。
本发明的再一实施方案涉及包括与免疫球蛋白、多肽或其片段偶 联的TRAIL受体的抗原性片段的融合蛋白。TRAIL受体片段定义为含 有足够数目的碱基以诱发针对受试者细胞表面上表达的天然TRAIL受 体的免疫原性应答。TRAIL受体融合片段包括至少10个氨基酸。免疫 球蛋白融合蛋白或其片段在本文中被定义为包括具有足够数目的氨基 酸碱基以激活受试者体内的免疫原性级联应答的天然或合成蛋白或多 肽区段。包括TRAIL受体片段与免疫球蛋白片段偶联的融合体的本发 明免疫原，可用作在受试者体内原位诱发抗TRAIL受体抗体的体内治 疗剂。
在又一实施方案中，本发明可有效作为基因治疗。因此本发明提 供可一种选择性诱导靶细胞中的细胞凋亡的方法，包括以下步骤：用 包含可表达的TRAIL受体核酸序列的载体转染靶细胞；在所述细胞上 表达由所述TRAIL受体核酸序列编码的TRAIL受体；并且使所述细胞 与选择性结合所述TRAIL受体的细胞凋亡诱导抗体接触。在本发明的 一个基因治疗方面，靶细胞用携带对应于TRAIL受体的可表达序列的 载体转染。所述载体是常规的，并且根据靶细胞对所述载体的敏感性 来选择。基因治疗载体作为说明包括腺病毒载体pAdCMV5。当靶细胞 或靶组织表达所述转染的TRAIL受体时，使所述细胞或组织暴露于按 照本发明的特异性结合所述转染的TRAIL受体的抗体。人们会认识到， 所述抗TRAIL受体抗体根据所需治疗结果，或者是激动性抗体或者是 拮抗性抗体。
本发明的抗体与致敏剂结合也有效。本文所用的致敏剂定义为包 括诱导细胞凋亡的任何刺激，包括紫外光、具体包括双吲哚马来酰亚 胺的有机分子、重金属和自由基种类。
在恶性肿瘤治疗方面，TRA-8在缺乏二次交联时能够以天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶依赖性方式诱导大多数TRAIL敏感型肿瘤细胞 凋亡。单独的或与其它抗体联合的TRA-8或2E12表现出强体内杀肿 瘤活性。TRA-8或2E12诱导大多数TRAIL敏感性细胞凋亡的能力，证 实了单独的DR5或DR4足以触发细胞凋亡。本文详述的大多数肿瘤细 胞表达细胞表面DR5，并且其对TRA-8诱导的细胞死亡的敏感性与其 对TRAIL的敏感性相当，表示DR5是大多数肿瘤细胞中TRAIL介导的 细胞凋亡的主要死亡受体。用DR4的特异性抗体(如2E12)也获得了 相似的结果。因此，正常细胞和癌细胞对DR5或DR4的差别表达在TRAIL 介导的细胞凋亡的选择性方面起作用。TRA-8绕过所述诱饵受体，而 诱导TRAIL介导的细胞凋亡。然而，仅少数TRAIL抗性肿瘤细胞对TRA-8 敏感，表明所述诱饵受体看来在肿瘤细胞对TRAIL介导的细胞凋亡抗 性方面不起重要作用。
虽然先前的研究已经表明在动物体内系统给予可溶形式的TRAIL 诱导肿瘤消退而不引起毒性3，4，22，但如本文所表明的，膜结合形式的 人TRAIL在小鼠体内诱导肝损伤。然而，正常肝细胞对TRAIL诱导的 损伤的敏感性小于对Fas配体的敏感性，并且TRAIL在体内没有致死 性，证明了TRAIL的肝毒性比Fas配体要小得多。因此，逐渐增量给 予TRAIL可应用于癌症治疗中。
如本文详述的，表明正常肝细胞没有显著水平的DR5蛋白表达， 并且与肝细胞抗TRA-8诱导的细胞凋亡相关。DR5与单克隆抗体交联 不足以构建能够触发细胞凋亡的同源聚合形式的死亡受体。狨实验没 有显示出TRA-8给予的肝毒性。因此，激动性单克隆抗DR5抗体作为 治疗剂有可能比可溶性TRAIL更具选择性且更安全。类似地，DR4由 转化的或活化的细胞，但正常细胞如成纤维细胞不表达可评估量的 DR4，或者仅仅表达低得多的量的DR4。本发明的DR4抗体诱导某些靶 细胞的凋亡而不诱导可评估量的非靶细胞，如成纤维细胞的死亡。此 处所使用的无作用或缺乏可评估的或缺乏显著作用，是指并且包括完 全缺乏作用或小于或等于背景或对照水平，以及不超过背景和对照水 平的1.5倍的作用。
作为筛选测定，本发明非常适用于检测仍表现出正常细胞形态的 小的DR4或DR5细胞簇。用标记的本发明的抗体将包括肺癌、前列腺 癌和肝癌在内的人癌细胞的原位细胞切片染色，容易鉴定出癌细胞。 本发明的抗体也可用于筛选其它疾病表现，包括，例如，各种炎性和 自身免疫病，如类风湿性关节炎。甚至可以在其它临床症状出现之前 使用所述筛选，并且可以用于筛选有疾病风险的受试者，以便可以在 表现出其它体征或症状之前开始预防性处理。具体地，观测到与同一 类型的正常细胞相比，这些癌细胞表达非常高水平的DR5。因此，本 发明可用作至少包括肺、前列腺、结肠、血液、宫颈、乳腺和肝的组 织内早期恶性肿瘤的灵敏的筛选方法。本文详细描述了一种用于抑制 与例如恶性癌和淋巴细胞性白血病的疾病相关的异常细胞增殖的治疗 方法。
本文详细描述了命名为TRA-8的抗人DR5单克隆抗体，其ATCC 保藏号为PTA-1428。人们会认识到，关于激动性抗人DR5单克隆抗体 TRA-8的详细技术和结果是完全可延伸的，适用于拮抗性DR5抗体以 及以激动性和拮抗性方式作用的针对DR4、DcR1和DcR2产生的抗体。 因此，本发明在此描述了人DR4的特异性细胞凋亡诱导抗体。在一种 实施方案中，所述抗体与杂交瘤2E12具有相同表位特异性，杂交瘤2E12 保藏于2001年10月24日，以UAB研究基金会的名义在美国典型培 养物保藏中心，Rockville，MD获得保藏号。保藏物质说明为“抗人DR4 的2E12杂交克隆”，该株命名为2E12，参考案卷为PCT/US01/14151。 细胞凋亡受体(例如Fas)的表达水平不一定与所述细胞对细胞凋亡的 敏感性相关。对于TRAIL介导的细胞凋亡，已提示TRAIL的诱饵受体 的表达影响所述细胞的敏感性。此外，已提示在通过FADD和天冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶8途径有效转导细胞凋亡信号方面，DR5一 定与DR4相关。激动性抗DR5单克隆抗体的可得性，使得可以阐明DR5 信号的调节及其在TRAIL介导的细胞凋亡中的相对作用。所述细胞对 TRA-8介导的细胞凋亡的敏感性与其对TRAIL介导的细胞凋亡的敏感 性的比较，提供了关于DR5在TRAIL介导的细胞凋亡中的作用以及可 能影响敏感性的机制的深入了解。DR4抗体提供了相似的优点。
这一优点一般可延伸至本发明的人源化抗DR5和DR4抗体。通过 在以下实施例中详述的已知技术，制备抗DR-5抗体的一个分子克隆。 重组DNA方法(33)在此中可有效地用来构建编码单克隆抗体分子或其 抗原结合区的核酸序列。
本发明使得可以构建人源化抗TRAIL受体抗体，其中所述人源化 抗体不太可能诱导人抗小鼠抗体(在下文称为“HAMA”)应答(34)，而 仍具有有效的抗体效应物功能。也可以通过免疫能够制备完全的人抗 体的小鼠(如经遗传修饰而产生人抗体的小鼠)，筛选结合DR5或DR4、 诱导细胞凋亡和竞争TRA-8或2E12表位的克隆而制备完全的人抗 体。见，例如，Lonberg and Huszar(1995)Human antibodies from transgenic mice，Int.Rev.Immunol.13：65-93，在此引入其完整 内容作用参考，其中描述了生产完全的人抗体的方法。本文在抗体方 面所用的术语“人”和“人源化”涉及预期在人类受试者体内诱发治 疗耐受性弱免疫原性应答的任何抗体。
本发明提供一种DR5抗体、人源化抗DR5抗体、TRA-8重链和轻 链免疫球蛋白以及人源化重链和轻链免疫球蛋白。本发明还提供DR4 抗体、人源化抗DR4抗体、DR4抗体的重链和轻链免疫球蛋白以及人 源化重链和轻链免疫球蛋白，编码抗体以及重链和轻链的核酸，包含 这些核酸的载体，以及包含所述载体的细胞。这些蛋白或基因的某些 截短物可执行所述全序列蛋白或基因的调节功能或酶功能。例如，编 码蛋白的核酸序列可以通过取代、添加、缺失或多聚表达加以改变， 以提供功能等同的蛋白或基因。由于核酸编码序列的简并性，编码与 天然存在的蛋白基本相同的氨基酸序列的其它序列可以用于实施本发 明。这些包括但不限于包括编码上述多肽的完整核酸序列或其部分、 通过编码所述序列内功能等同氨基酸残基的不同密码子的取代从而产 生沉默变化而被改变的核酸序列。通过标准方法(“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis，”Macromolecule Sequencing and Synthesis，selected Methods and Applications，pp.127-149，1998， Alan R.Liss，Inc.)计算，预期按照本发明的免疫球蛋白的核苷酸 序列可耐受至多25％的序列同源性变异，只要这种变异体构成识别 TRAIL受体DR5的有效抗体。例如，多肽序列内的一个或多个氨基酸 残基可以被具有相似极性、用作功能等同物产生沉默改变的另一种氨 基酸所取代。所述序列内的氨基酸取代可以从所述氨基酸所属类别的 其它成员中进行选择。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮 氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。 极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、 天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和 组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。也包括在本 发明范围内的有在翻译期间或之后差别修饰(例如通过糖基化、蛋白 酶切、与抗体分子或其它细胞配体连接等)的蛋白质或其片段或衍生 物。另外，可以对编码本发明抗DR5抗体的核酸序列的重组载体进行 工程改造，以修改载体的加工或表达。可以对核酸或氨基酸序列进行 其它修饰，而不会降低或基本不降低抗体的细胞凋亡活性。可以使用 本领域的常规技术使所述修饰发生于CDRs或非CDR区。见，例如Yang et al.(1995)，J.Mol.Biol.254：392-403，在此引入其全文作 为参考，其中描述了CDR walking诱变的方法。
另外，编码抑制剂的核酸序列可以在体外或体内突变，以产生和 /或破坏翻译序列、起始序列和/或终止序列，或在编码区产生变异和 /或形成新的限制性内切核酸酶位点或破坏现有的所述位点，以进一 步促进体外修饰。可以使用本领域已知的任何诱变技术，包括但不限 于体外定点诱变，J.Biol.Chem.253：6551、应用Tab接头(Pharmacia) 等等。
X射线晶体学数据表明，抗体免疫球蛋白折叠一般形成一种长的 圆柱形结构，含有两层分别由3条或4条b-链组成的反向平行的b- 折叠片。在可变区中，来自H链和L链的各个V区的三个环聚集在一 起，形成一个抗原结合位点。这些环中的每个环称为互补性决定区 (CDR)。CDR的变异性在所述抗体的氨基酸序列中是最高的。并非CDR 部分的可变区部分称为“构架区”(“FR”区)，一般在维持CDR结构方 面起作用。最好将得自给定抗体的所有CDR都移植到受体抗体中，以 便保留对于TRAIL受体表位区的结合区。预期将全部CDR中的一部分 移植到供体中在此中是有效的。人们理解，移植一般需要将一个氨基 酸或一个区的残基用另一种氨基酸残基取代。然而，有时尤其是转移 一个区时，可以根据需要添加或删除或取代一个或多个残基，这样的 缺失和插入以及合适的取代和倒位在本领域的技术范围内。
例如通过将抗TRAIL受体单克隆抗体的L链和H链亚基的每个CDR 移植到人抗体的相应CDR区中，从而将有效针对TRAIL受体的小鼠单 克隆抗体人源化，获得本发明的抗体。
采用已知的技术，构建了含有所述分子独特型的抗体片段，所述 片段在此中也是有效的。例如，这类片段作为说明包括可以通过用胃 蛋白酶消化所述抗体分子产生的抗TRAIL受体(AB’)2片段、通过还原 所述TRAIL受体(AB’)2片段的二硫桥产生的TRAIL受体抗体AB’片段、 以及通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理所述抗体分子产生的抗体片段。
可以用本领域的多种技术制备本发明的抗体。例如，通过用人DR5 免疫小鼠，随后将得自所述小鼠的脾细胞或淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤 细胞融合可以获得杂交瘤，培养所述杂交瘤，可以获得抗DR5单克隆 抗体TRA-8。
单克隆抗体的制备作为说明包括下述步骤：
a)纯化生物大分子，用作抗原；
b)在采用注射所述抗原初次免疫动物，给所述动物放血，并且 分析抗体效价以便确定何时取出脾脏之后，制备抗体生产细 胞；
c)制备骨髓瘤细胞；
d)将抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合；
e)选择生产所需抗体的杂交瘤；
f)制备单细胞克隆(克隆)；
g)任选地，培养所述杂交瘤细胞，或让已经移植有杂交瘤细胞 的动物生长，以大规模地制备所述单克隆抗体；和
h)测试如此制备的单克隆抗体的生物活性和特异性、或者分析 标记因子特性。
下面参考上述步骤详细描述用于单克隆抗体制备的方法。制备本 发明抗体的方法仅仅是说明制备方法，并非是限制性的。可以采用其 它已知的方法，或者采用修改的方法，例如利用抗体生产细胞，而不 利用脾细胞和骨髓瘤。
(a)抗原的制备
可有效作为所述抗原的重组蛋白(在下文称为“重组人DR5”或“重 组人DR4”)通过以下步骤获得：通过利用ADENO-Quest试剂盒(Quantum Biotechnologies Inc.，Canada)，用包含人DR5或DR4胞外结构域和 人IgG1抗体(在下文称为“IgG”)的Fc区(参照PTA-1428)的融合蛋 白的表达载体pAdDR5-IgG转染QBI-293A细胞使其表达所述融合蛋白， 收集并部分纯化表达产物。质粒pAdDR5-IgG通过将编码人DR5或DR4 和人IgG的融合蛋白的DNA插入pAdCMV5中构建而成，该质粒是一种 用于动物细胞的表达载体。其它材料例如编码DR5或DR4的DNA、所 述载体和所述宿主在此中是可操作的。
在用载体pAdDR5-IgG转染的QBI-293A细胞的培养上清液中生产 的人DR5或DR4和IgG融合蛋白，通过A蛋白-Sepharose亲和色谱或 G蛋白-Sepharose亲和色谱或采用Resource Q柱(商标；Pharmacia) 的离子交换色谱来部分纯化。
或者，将得自人细胞系的细胞膜的纯化DR5或DR4用作抗原。此 外，由于DR4和DR5的一级结构是已知的(参照PTA-1428)，所以可以 通过已知方法，例如Sanger法化学合成包含SEQ ID No.1氨基酸序 列的肽，并将其用作抗原。
(b)抗体生产细胞的制备
用与佐剂(例如弗氏完全或不完全佐剂或氧化铝)混合的步骤(a) 中生产的免疫原免疫小鼠。其它合适的实验动物作为说明包括大鼠、 豚鼠、兔、狗、鸡、马、猪、牛和羊。
免疫实验动物的合适给药途径包括皮下注射、腹膜内注射、静脉 注射、皮内注射和肌内注射途径，优选皮下注射和腹膜内注射。
免疫任选地通过一剂或以适当间隔(优选1-5周)的数次重复剂量 进行。监测经免疫的动物的血清抗体效价，具有足够高抗体效价的动 物选择作为抗体生产细胞源。选择具有高效价的动物使得后续程序的 效率更高。用于随后融合的细胞一般从最后一次免疫后3-5天的动物 中收获。
分析抗体效价的方法包括各种众所周知的技术，例如放射免疫测 定(在下文称为“RIA”)、固相酶免疫测定(在下文称为“ELISA”)、 荧光抗体测定和被动血凝测定，由于检测灵敏度、快速、精确和自动 化的潜力，优选RIA和ELISA。
抗体效价的测定可以例如通过如下的ELISA进行。首先，将经纯 化或部分纯化的DR5或DR4吸附至固相(例如96孔ELISA板)表面， 然后用与抗原无关的蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA))封闭尚未结合DR5 或DR4的任何残留表面。洗涤后，使孔表面与连续稀释的小鼠血清样 品接触，使得样品中的抗DR5或DR4抗体能够与所述抗原结合。加入 作为第二抗体的酶标抗小鼠抗体，以与小鼠抗体结合。洗涤后，加入 酶底物，通过测定由于底物变化等引起的显色所致的吸光度的变化， 估计抗体效价。
(c)骨髓瘤细胞的制备
得自已建立小鼠细胞系的细胞用作骨髓瘤细胞来源，包括例如得 自BALB/c的8-氮鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤株系P3X63Ag8U.1(P3-U1) (35)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)(36)、Sp2/0-Ag14(SP-2)(37)、 P3X63Ag8.653(653)(38)和P3X63Ag8(X63)(39)。将所选的细胞系 顺序转移到合适的培养基例如8-氮鸟嘌呤培养基中。8-氮鸟嘌呤培养 基包括Iscove氏改进的Dulbecco氏培养基(在下文称为“IMDM”)或 Dulbecco氏改进的Eagle培养基(在下文称为“DMEM”)。在RPMI-1640 培养基中补充谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、胎牛血清(在下文 称为“FCS”)和8-氮鸟嘌呤。然后，在融合前3-4天，将细胞转移到 正常培养基例如含有10％FCS的ASF104培养基(Ajinomoto，K.K.)中， 以确保在融合当天可得到至少2×107细胞。
(d)细胞融合
得自所述动物任何合适部分的淋巴细胞和血浆细胞是生产所述抗 体的祖细胞。淋巴细胞或血浆细胞来源作为说明包括脾、淋巴结、外 周血或任何其合适的组合，脾细胞是最常用的来源。
在最后一次加强注射后，从具有预定抗体效价的小鼠中取出存在 抗体生产细胞的组织。目前用于脾细胞与在步骤c)中制备的骨髓瘤细 胞融合的合适技术利用聚乙二醇。
所述融合技术包括用无血清培养基(例如RPMI 1640)或磷酸缓冲 盐溶液(在下文称为“PBS”)洗涤脾细胞和骨髓瘤细胞，使得脾细胞 与骨髓瘤细胞的数目比率约为5∶1至10∶1，然后离心。在弃去上清液 并使沉淀细胞充分松散后，滴加1ml含有50％(w/v)聚乙二醇(m.w. 1,000-4,000)的无血清培养基并且混合。随后，缓慢加入10ml无血 清培养基，然后离心。再次弃去上清液，将沉淀的细胞悬浮于适量的 含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的溶液和小鼠白介素-2(在下文称为 “IL-2”)的HAT培养基(在下文称为“HAT”)中。然后将悬浮液加入 到培养板(在下文也简称为“板”)的各孔中，在5％v/v CO2存在下、 于37℃培养约2周，可适当地对HAT培养基进行补充添加。
(e)杂交瘤的选择
当采用的骨髓瘤株系抗8-氮鸟嘌呤，即它的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶(HGPRT)有缺陷时，任何非融合的骨髓瘤细胞和任何骨髓 瘤-骨髓瘤融合体都不能在HAT培养基中存活。另一方面，抗体生产 细胞相互之间的融合体以及抗体生产细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤可以 存活，前者仅有有限的寿命。因此，在HAT培养基中连续培养导致仅 选择所需的杂交瘤。
将所得的杂交瘤培养为集落，然后将其转移到缺乏氨基蝶呤的HAT 培养基(HT培养基中)。此后，取出等份的培养上清液，以通过例如ELISA 测定抗Fas抗体效价。当将上述融合蛋白用作ELISA抗原时，也必需 消除生产与人IgG1的Fc区特异性结合的抗体的克隆。这种克隆的存 在与否可以例如采用Fas-IgG1或IgG1作为抗原通过ELISA加以证实。
(f)克隆
然后，将采用与步骤(b)中测定抗体效价的方法相似的方法表明 生产特异性抗体的杂交瘤，转移到另一板中以供克隆。合适的克隆方 法包括：有限稀释法，其中将杂交瘤稀释，使得板的各孔含有一个细 胞，然后进行培养；软琼脂法，其中在软琼脂培养基中培养后回收集 落；采用显微操作器来分离单细胞以供培养的方法；和“分选-克隆 (sort-a-clone)”，其中通过细胞分选器分离单细胞。
对于显示出一定抗体效价的每个孔，将按照例如有限稀释法的克 隆程序重复2-4次，选择具有稳定抗体效价的克隆作为抗DR5单克隆 抗体生产杂交瘤。生产抗小鼠DR5抗体的杂交瘤通过与获得抗DR5单 克隆抗体生产细胞系的相似方法来选择。
作为本发明抗体基础的小鼠-小鼠杂交瘤TRA-8于2000年3月1 日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA-1428。如上文所述， 2E12杂交瘤于2001年10月24日保藏于美国典型培养物保藏中心， 保藏号为ATCC No.PTA-3798。因此，当利用小鼠-小鼠杂交瘤TRA-8 或任何其它已建立的杂交瘤制备抗体时，可以采用省去步骤(a)-(f)、 从以下步骤(g)开始的程序来进行制备。
(g)培养杂交瘤以制备单克隆抗体
然后将通过克隆获得的杂交瘤培养在正常培养基中，而非培养在 HT培养基中。用大培养瓶通过滚瓶培养，或者通过旋动培养，进行大 规模培养。然后收获得自大规模培养的上清液，采用本领域技术人员 熟知的合适方法例如凝胶过滤进行纯化，以获得作为本发明抗体基础 的DR5或DR4单克隆抗体。杂交瘤也可以在同源小鼠(例如BALB/c小 鼠或nu/nu小鼠)腹膜内生长，以获得含大量抗DR5单克隆抗体的腹 水。可以方便地用市售单克隆抗体纯化试剂盒(例如，MAbTrap GII Kit； Pharmacia)来纯化所收获的抗体。
如上制备的单克隆抗体对人DR5或DR4具有高度特异性。
(h)单克隆抗体的测定
所述单克隆抗体的同种型和亚类的合适鉴定方法包括 Ouchterlony法、ELISA和RIA。最好使用市售试剂盒进行鉴定，例如 使用Mouse Typer试剂盒(商标；BioRad)。
可以通过Folin-Lowry法或通过基于280nm吸光度的计算(1.4 (OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml)，进行蛋白质的定量。
所述单克隆抗体所识别的表位的鉴定如下进行。首先，制备单克 隆抗体所识别的分子的各个部分结构。所述部分结构通过其中用已知 的寡肽合成技术合成制备所述分子的各个部分肽的方法、或者其中将 编码所需部分多肽的DNA插入合适的表达质粒中、然后在合适宿主(例 如大肠杆菌)中表达以生产所述肽的方法来制备。一般而言，为达到 上述目标，这两种方法常常结合使用。例如，通过已建立的遗传工程 技术，可以制备从所述抗原蛋白的C末端或N末端开始适当减小长度 的一系列多肽。通过确定所述片段与所述抗体反应，获得近于理想的 所述表位部位。
通过用已建立的寡肽合成技术合成各种各样的对应于所述肽的较 小的寡肽或其突变体，以测定所肽对作为制备本发明抗体基础的抗DR5 单克隆抗体的结合特性以及所述肽与所述单克隆抗体对抗原结合的竞 争性抑制，可以更加精细地鉴定出所述表位。可以方便地用市售试剂 盒例如SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnologies，Inc.)和基于 multipin合成法的一系列multipin肽合成试剂盒(Chiron Corp.)， 获得种类繁多的寡肽。
本发明的抗体具有下述各种功能特性a)-f)，每种特性通过例如 下文所述方法得以证实。
a)TRA-8与表达人DR5的细胞的特异性结合
本发明的一个独特特征是结合细胞表面DR5的能力。这通过表达 DR5的细胞的流式细胞术分析来证明。首先，采用用编码人DR5的全 长cDNA转染的COS-7细胞，证明DR5的特异性细胞表面结合。具体 地说，TRA-8仅识别用DR5转染的COS-7细胞，而不识别用空对照载 体或编码DR4的载体转染的COS-7细胞。其次，测试三种不同来源- 造血谱系、神经胶质瘤和前列腺癌的人类恶性肿瘤细胞。这些转化肿 瘤细胞中的大多数表达显著水平的细胞表面DR5，虽然表达水平变异 很大。第三，检查得自RA患者和OA患者的两组人原代滑膜成纤维细 胞。与OA细胞相比，所有RA滑膜细胞均表达显著更高水平的DR5。
b)在缺乏交联时人恶性肿瘤细胞凋亡的体外诱导
在细胞体外培养期间，用各种浓度的抗体，尤其是TRA-8，通过 细胞存活力测定(ATPLite)，测定按照本发明产生的抗体识别TRAIL 受体并且直接诱导人恶性肿瘤细胞凋亡的能力。大多数肿瘤细胞对 TRA-8诱导的细胞凋亡敏感。对于某些细胞，TRA-8显示出强细胞凋 亡诱导活性，例如TRA-8能够在pg/ml水平内诱导人Jurkat细胞凋亡。 重要的是，TRA-8诱导的细胞凋亡并不需要交联，在大多数细胞中， TRA-8表现出在存在增强剂时比重组可溶性TRAIL更强的细胞凋亡诱 导活性。
c)TRA-8的体内杀肿瘤活性
在两种SCID/人肿瘤细胞模型中评估TRA-8杀肿瘤活性。首先， 给SCID小鼠静脉内接种人白血病Jurkat细胞，用一剂(100μg)TRA-8 治疗。结果表明，经Jurkat细胞的流式细胞术分析和原位免疫组织 化学染色测定，通过用TRA-8治疗，大多数移植的Jurkat细胞从外 周血和脾中消除。其次，在SCID小鼠中皮下接种人星形细胞瘤细胞 1321N1，用一剂TRA-8治疗带有肿瘤的小鼠。根据肿瘤大小和组织学 分析确定，在TRA-8治疗的小鼠中移植的1321N1细胞的生长受到显 著抑制。
d)用TRA-8鉴定RA滑膜细胞
测试了从8位RA患者和4位OA患者分离的原代滑膜细胞的DR5 细胞表面表达。TRA-8能够使所有RA细胞染色阳性，但对于所有OA 细胞染色为阴性。因此，通过用TRA-8检测DR5的表面表达，可以区 别RA与OA。
e)TRA-8对RA滑膜成纤维细胞凋亡的诱导
在存在各种浓度TRA-8的情况下体外培养期间，通过细胞存活力 测定，测定TRA-8诱导RA滑膜细胞凋亡的能力。所有RA细胞都表现 出对100ng/ml TRA-8高水平至中等水平的敏感性。相反，所有OA细 胞基本上都对TRA-8诱导的细胞凋亡有抗性。重要的是，TRA-8表现 出比可溶性TRAIL加增强剂更好的对RA滑膜细胞的细胞凋亡诱导活 性。此外，与抗Fas抗体(CH-11)相比，TRA-8表现出对RA滑膜细胞 更强的选择性。
f)TRA-8在RA滑膜细胞中不诱导MMP的产生
由于TRA-8与TNF-α一样，能够在RA滑膜细胞中诱导NF-kb激活， 所以测定了TRA-8对滑膜细胞产生MMP1和MMP3的影响。虽然TNF-α 诱导MMP的剂量依赖性增加，但TRA-8不能诱导任何MMP产生，在某 些浓度下，TRA-8略微减少RA滑膜细胞中MMP的产生。
g)TRA-8诱导多种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化
由于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶在诱导细胞凋亡中起关键作 用，所以在人Jurkat细胞中测定TRA-8诱导天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶活化的能力。当将Jurkat细胞与低剂量(50ng/ml)TRA-8 一起孵育时，通过蛋白质印迹分析和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 切割分析确定，在早至孵育后15分钟，观测到天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶8、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9和天冬氨酸特异性 半胱氨酸蛋白酶3的活化。就天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化的 时间、数量和强度而论，本发明的抗体包括说明性抗体TRA-8表现出 比任何其它已知的细胞凋亡诱导抗体(例如抗人Fas抗体(CH-11))好 得多的活性。2E12抗体以其可溶形式特异性结合DR4，在表达DR4的 靶细胞(包括，例如，癌细胞、类风湿性关节炎滑膜细胞、活化的免 疫细胞，如活化的淋巴细胞、和病毒感染的细胞)中具有体内和体外 细胞凋亡诱导活性，具有体内杀肿瘤活性(优选，对非肿瘤细胞无毒 性)。本发明的DR4抗体优选具有细胞凋亡诱导活性，其特征在于在 低于30μg/ml，3μg/ml，0.3μg/ml，或0.03μg/ml的浓度下，低 于约60％，50％，40％，30％，20％，或10％的靶细胞存活率，本发明的DR4 抗体还具有杀肿瘤活性，其特征在于使肿瘤大小减少10％，20％，30％， 40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％。因此，本发明的抗体是具 有如作用(a)和(g)中所示的选择性诱导致病细胞凋亡特性的物质。因 此，它可用作用于与细胞不当存活或细胞不当增殖相关疾病的预防剂 和治疗剂，所述疾病例如可归因于细胞凋亡系统包括Fas/Fas配体系 统的失调的那些疾病。
通过在添加试验样品的培养基中培养细胞例如人白血病细胞系 Jurkat(美国典型培养物保藏中心保藏号TIB-152(American Type Culture No.TIB-152))和星形细胞瘤细胞系1321N1，并且通过例如 ATPLite测定测量存活率，证实本发明的抗体诱导细胞凋亡的能力。
本发明的抗体，尤其是对人类的免疫原性与人抗体几乎相同的抗 DR5或DR4抗体，可用作与细胞不当存活或不当增殖相关疾病的预防 剂或治疗剂，所述疾病包括可归因于炎性疾病和自身免疫病中细胞凋 亡系统失调的那些疾病，所述疾病作为说明包括系统性红斑狼疮、桥 本氏病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、斯耶格伦综合征、恶性 贫血、阿狄森氏病、硬皮病、古德帕斯彻综合征、克隆氏病、自身免 疫性溶血性贫血、不育症、重症肌无力、多发性硬化、巴塞多病、血 小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应、哮喘、特应性疾 病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球性肾炎、再生不良性贫血、 器官移植后的排斥以及肺、前列腺、肝、卵巢、结肠、宫颈、淋巴组 织和乳腺组织的许多恶性肿瘤。本发明的抗体可以用于靶定和选择性 诱导活化的免疫细胞，包括活化的淋巴细胞、淋巴样细胞、髓细胞和 类风湿滑膜细胞(包括炎性滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、成纤维 细胞样滑膜细胞)和病毒感染的细胞(例如包括HIV感染的那些)的 凋亡，只要这些被靶定的细胞表达或可以被制备而表达特异性TRAIL 受体(即DR4或DR5)。
这种预防剂或治疗剂可以以各种形式给予。合适的给药模式包括 口服给药，例如通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和糖浆剂给予，或 者通过胃肠外给药，例如通过注射、滴注和栓剂给药。
所述抗体或治疗剂可以经口服、直肠、脑池内、脑室内、颅内、 鞘内、阴道内、胃肠外(静脉内、肌内或皮下)、局部(粉剂、软膏剂 或滴剂)、通过腹膜内注射、经皮、通过吸入或作为颊或鼻喷雾剂给 予。所述抗体或治疗剂的实际所需用量将根据受试者而变化，取决于 受试者的年龄、体重、一般状况、待治疗疾病的严重程度、肿瘤的位 置和大小、所用的具体化合物、给药模式等。本领域技术人员仅用本 文给出的常规实验，可以确定合适的量。抗体典型的单剂量范围为 0.1-10,000微克，优选1-100微克。载体中典型的抗体浓度的范围为 给予的每毫升0.2-2000纳克。对于注射到关节中，抗体和载体的体 积将根据关节而改变，但将大约0.5-10ml，优选1-5ml注射到人的膝 关节中，将大约0.1-5ml，优选1-2ml注射到人的踝关节中。
根据计划的给药模式，所述抗体或治疗剂可以在固体、半固体或 液体剂型的药物组合物中，所述剂型例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊剂、 散剂、液体或悬浮剂，最好为适用于一次给予精确剂量的单位剂型。 所述组合物将包括有效量的所选基质以及药学上可接受的载体，另外 可以包括其它药物、药用试剂、载体或稀释剂。所谓“药学上可接受 的”是指不是生物学希望有的或者在其它方面不希望有的物质，所述 物质可以与所选基质一起给予个体，而不引起显著的不希望有的生物 学效应或以有害方式与所述药物组合物中所含有的任何其它成分相互 作用。
适用于胃肠外注射的组合物可以包含生理上可接受的无菌水性或 非水溶液、分散体、悬浮液或乳液以及适用于重建为无菌注射用溶液 或分散体的无菌粉末。合适的水性或非水载体、稀释剂、溶剂或溶媒 的实例包括水、乙醇、多元醇类(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合 适的混合物、植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯，例如油酸乙酯。 可以例如利用包衣例如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒 径以及利用表面活性剂，可以维持合适的流动性。
这些组合物也可以含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分 散剂。用各种抗细菌药和抗真菌药例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、 苯酚、山梨酸等，确保防止微生物的作用。也可能需要包括等渗剂， 例如糖、氯化钠等。注射用药物形式的延长吸收可以利用延迟吸收的 试剂例如一硬脂酸铝和明胶来达到。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒 剂。在这类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性常规赋形剂(或 载体)例如柠檬酸钠或磷酸二钙或以下物质混合：(a)填充剂或增量 剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂， 例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯 胶，(c)湿润剂，例如甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯 淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂 (retarder)，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如季铵化合物，(g)润湿 剂，例如鲸蜡醇和甘油一硬脂酸酯，(h)吸收剂，例如高岭土和膨润 土，和(i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二 醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。就胶囊剂、片剂和丸剂而论，所述 剂型也可以包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物也可以用作利用诸如乳糖以及高分子量聚 乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
诸如片剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包 衣和壳体制备，例如肠溶衣和本领域已知的其它包衣剂。它们可以含 有遮光剂，也可以是这样的组合物，使得它们在肠道的某一部分以延 迟方式释放一种或多种所述活性化合物。可以使用的包埋组合物的实 例是聚合物质和蜡。如果合适，所述活性化合物也可以为具有一种或 多种上述赋形剂的微囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混 悬剂、糖浆剂和酏剂。除所述活性化合物外，所述液体剂型可以含有 本领域常用的惰性稀释剂例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如 乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、 1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油，特别是棉子油、花生油、玉米胚油、 橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇 的脂肪酸酯或这些物质的混合物等。
除这类惰性稀释剂外，所述组合物还可以包括辅料，例如润湿剂、 乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
混悬剂除含有所述活性化合物外，还可以含有悬浮剂，例如乙氧 基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、氢氧 化铝、膨润土、琼脂和西黄蓍胶或这些物质的混合物等。
用于直肠给药的组合物最好是栓剂，所述栓剂可以通过将本发明 的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体(例如可可脂、聚乙二醇或 栓剂用蜡)混合，所述赋形剂或载体在常温下为固体，但在体温下为 液态，因此溶于直肠或阴道腔中并释放所述活性化合物。
用于局部给予本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、喷雾剂和 吸入剂。根据需要，所述活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载 体和任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。眼用制剂、眼用软膏剂、散 剂和溶液剂也被认为在本发明范围内。
本文所用的术语“药学上可接受的盐、酯、酰胺和前体药物”是 指在合理的医学判断范围内的本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加 成盐、酯、酰胺和前体药物，它们适用于与患者组织接触，而没有过 度的毒性、刺激性、过敏反应等，与合理的利益/风险比率相称，对 于其计划的用途是有效的，合适时也是指本发明化合物的两性离子形 式。术语“盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。 这些盐可以在所述化合物的最后分离纯化期间就地制备，或者通过单 独将游离碱形式的纯化化合物与合适的有机酸或无机酸反应，然后分 离由此生成的盐。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢 盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸 盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、 柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、 甲磺酸盐、葡糖庚酸盐、乳糖酸盐、甲磺酸盐和十二烷基磺酸盐等。 这些可以包括基于碱金属和碱土金属例如钠、锂、钾、钙、镁等的阳 离子、以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、 四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。(参见例如S.M. Barge等，“Pharmaceutical Salts，”J.Pharm.Sci.，1977，66：1-19， 该文献在此引入作为参考。)
术语“前体药物”是指在体内血液中例如通过水解容易被迅速转 化产生上式母体化合物的化合物。在T.Higuchi和V.Stella， “Pro-drugs as Novel Delivery Systems，”A.C.S.Symposium Series Vol.14和Bioreversible Carriers in Drug Design，Edward B.Roche 编著，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press， 1987中提供了全面的论述。
靶细胞是一种动物细胞，所述动物作为说明包括人类、非人类灵 长类、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、牛、马、鸡、猪、狨和 雪貂。
另外，本发明的抗体或治疗剂可以以非溶剂化以及溶剂化形式与 药学上可接受的溶剂(例如水、乙醇等)一起存在。一般而言，对于本 发明目的而言，溶剂化形式被认为与非溶剂化形式等同。
通过已知的技术纯化抗体分子，所述技术作为说明包括氨基吸收 或氨基亲和色谱、色谱技术例如高压液相色谱或其组合。
本发明的另一方面包括用于将生物活性抗TRAIL受体抗体或人源 化抗TRAIL受体抗体传递至脊椎动物的药物制品。药物制品包括药用 有效量的抗TRAIL受体抗体或其片段、一种药学上可接受的载体和一 个以无菌方式装有所述载体和所述抗体的容器。
在本发明的一个优选实施方案中，药用有效量的本发明的抗体通 过与靶细胞接触，抑制细胞增殖。识别DR5或DR4的抗体或识别DR5 或DR4的人源化抗体的药用有效量是给予个体的足以引起所需效应的 量。此处使用的术语“药用有效量”和“治疗量”是同义词。给予药 用有效量的DR5或DR4识别抗体的所需效应包括靶细胞死亡、对靶细 胞的生长抑制、分别刺激DR5或DR4、与DR5或DR4结合以及提高靶 细胞中NFκB水平或活性。靶细胞是表达DR5或DR4的细胞，作为说 明包括异常生长的细胞和肿瘤，例如乳头瘤和疣；乳癌、结肠癌、肝 癌、白血病、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前 列腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、子宫癌和脑部肿瘤例如星形细胞瘤、 活化的免疫细胞(如活化的淋巴细胞、淋巴样细胞和髓细胞)、炎性 细胞、类风湿性关节炎滑膜细胞和病毒感染的细胞。在体内，所述靶 细胞是患有病理状况的个体的细胞，所述状况包括其中细胞增殖异常 或失调的那些病症，例如恶性肿瘤或良性肿瘤以及类风湿性关节炎。
在另一优选实施方案中，所述靶细胞也接触治疗剂。因此，本发 明的抗体和组合物可以单独给药或与一种或多种治疗剂联合给药。所 述治疗剂包括，但不限于TNF家族的其它成员、化疗剂、抗体、抗病 毒剂、甾体和非甾体类抗炎药、常规免疫治疗剂、细胞因子、趋化因 子和/或生长因子。可以伴随(如作为混合物)、分开但同时(如通 过分开的静脉系进入同一受试者)或序贯(如先给予一种化合物或试 剂，然后给予第二种)给予联合体系。因此，术语“联合体系”或“联 合的”是指伴随、同时或序贯给予两种或更多试剂。
在一种实施方案中，联合治疗包括给予TNF家族成员。可以与本 发明的抗体一起给药的TNF、TNF相关或TNF样分子包括，但不限于TNF- α的可溶形式，淋巴毒素-α(LT-α，也称作TNF-β)，LT-β(发 现于复杂的异三聚体LT-α2-β)OPGL，FasL，CD27L，CD30L，CD40L， 4-1BBL，DcR3，OX40L，TNF-γ(WO96/14328)，TRAIL，AIM-II(WO 97/34911)，APRIL(J.Exp.Med.188：1185-90)，endokine-α (WO98/07880)，TR6(WO98/30694)，OPG和神经生长因子(NGF)，以及 Fas，CD30，CD27，CD40和4-IBB的可溶形式，TR2(WO96/34095)，DR3 (WO97/33904)，DR4(WO98/32856)，TR5(WO98/30693)，TRANK，TR9 (WO98/56892)，TRIO(WO98/54202)，312C2(WO98/06842)，和TR12， 以及CD154，CD70和CD153的可溶形式。
在一种实施方案中，本发明的抗体与天然存在的、合成的或工程 化的CD4配体(CD40L)联合给药，所述CD40配体包括，例如，CD40L 的可溶形式(如AVREND)，CD40L的生物活性片段、变体或衍生物， CD40L抗体(如激动性或拮抗性抗体)，和/或CD40抗体(如激动性 或拮抗性的)。
在另一种实施方案中，将本发明的抗体与一种、两种、三种、四 种、五种或更多以下成分联合给药：藤霉素(Fujisawa)，肽胺哌啶酮(如 Celgene)，抗Tac(Fv)-PE40(如Protein Design Labs)，inolimomab (Biotest)，MAK-195F(Knoll)，ASM-981(Novartis)，白介素-1受 体(如Immunex)，白介素-4受体(如Immunex)，ICM3(ICOS)，BMS- 188667(Bristol Myers Squibb)，抗TNF Ab(如Therapeutic Antibodies)，CG-1088(Celgene)，抗B7单克隆抗体(如Innogetics)， MEDI-507(BioTransplant)，和ABX-CBL(Abgenix)。
根据本发明，本发明的抗体可以与结合Fas并且转导导致细胞凋 亡的生物信号的Fas配体(Fas-L)或Fas抗体一起给药。优选地，根 据该方法使用的Fas抗体是单克隆抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体与抗逆转录病毒剂、核苷逆转 录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂联合给药。 可以与本发明的抗体联合给药的核苷逆转录酶抑制剂包括，但不限 于，RETROVIR(齐多夫定/AZT)(Gaxo-Wellcome，Research Triangle Park，NC)，VIDEX(地达诺新/ddI)(Bristol-Myers Squibb，New York)，HIVID(扎西他宾/ddC)(Roche，Nutley，New Jersey)，ZERIT (stavudine)(Bristol-Myers Squibb)。可以与本发明的抗体联合给 药的非核苷逆转录酶抑制剂包括，但不限于，VIRAMUNE(nevirapine) (Boehringer Ingelheim/Roxanne，Columbus，Ohio)，RESCRIPTOR (delavirdine)(Phannacia & Upjohn Company，Kalamazoo，Michigan)， 和SUSTIVA(efavirenz)(Bristol-Myers Squibb)。
可以与本发明的抗体联合给药的蛋白酶抑制剂包括，但不限于， CRIXIVAN(indinavir sulfate)(Merck & Company，Whitehouse Station，NJ)，NORVIR(ritonavir)(Abbott Laboratories，Chicago， IL)，INVIRASE(saquinavir)(Roche Pharmaceuticals，Nutley，NJ)， 和VIRACEPT(nelfinavir)(Agouron Pharmaceuticals，SanDiego， CA)。在一种特定实施方案中，抗逆转录病毒剂、核苷逆转录酶抑制 剂、和/或蛋白酶抑制剂可以与本发明的组合物联合使用，用于治疗 AIDS和/或预防或治疗HIV感染。
在另一种实施方案中，本发明的抗体可以与抗机会性感染剂联合 给药。可以与本发明的组合物联合给药的抗机会性感染剂包括，但不 限于，甲氧苄啶-喷他眯，磺胺甲恶唑、DAPSONE(Jacobus Pharmaceuticals，Princeton，NJ)，ATOVAQUONE(GlaxoSMithKline， Research Triangle Park，NC)，ISONIAZID(CIBA Pharmaceuticals， Summit，NJ)，RIFADIN(利福平)(Hoechst-Marrion-Roussel，Kansas City，MO)，PYRAZINAMIDE(Ledelrle，Pearl River，NY)，BIAXIN(克 拉霉素)(Abbott Laboratories，Chicago，IL)，ETHAMBUTOL (Ledelrle，Pearl River，NY)，RIFABUTIN(Pharmacia & Upjohn Company，Kalamazoo，MI)，AZITHROMYCIN(Pfizer Inc.，NewYork， NY)，GANCICLOVIR(Roche Pharmaceuticals，Nutley，NJ)，FOSCARNET (Astra，Westborough，MA)，CIDOFOVIR(Gilead Science，Foster City，CA)，KETOCONAZOLE(Janssen，Titusville，NJ)， FLUCONAZOLE(Pfizer Inc.，NewYork，NY)，ITRACONAZOLE(Janssen， Titusville，NJ)，ACYCLOVIR(Glaxo-Wellcome，Research Triangle Park，NC)，FAMCICOLCIR(SmithKline Beecham Pharmaceuticals， Pittsburgh，PA)，乙胺嘧啶、亚叶酸、NEUPOGEN(非尔司啶/GM-GSF) (Amgen，Thousand Oaks，CA)和LEUKINE(沙拉斯GM-GSF)(Immunex， Seattle，WA)。
在一种特定的实施方案中，本发明的抗体与甲氧苄啶-磺胺甲恶 唑和/或阿托夸酮，氨苯砜，喷他眯联合使用，从而预防性处理和/或 防止机会性卡氏肺囊虫肺炎感染。
在另一种特定实施方案中，本发明的抗体与异烟肼，RIFADIN (Merrell Dow Pharmaceuticals，Cincinnati，Ohio)，吡嗪酰胺， 和/或乙胺丁醇联合使用，从而预防性处理和/或防止机会性鸟分支杆 菌复合感染。在另一特定实施方案中，本发明的抗体与利福布丁、克 拉霉素和/或阿齐霉素联合使用，从而预防性处理和/或防止机会性结 核分支杆菌感染。在另一特定实施方案中，本发明的抗体与更昔洛韦、 磷卡萘替和/或Cidofovir联合使用，从而预防性处理和/或防止机会 性巨细胞病毒感染。在另一特定实施方案中，本发明的抗体与氟康唑、 Traconazole和/或酮康唑联合使用，从而预防性处理和/或防止机会 性真菌感染。在另一特定实施方案中，本发明的抗体与阿昔洛韦和/ 或泛昔洛韦联合使用，从而预防性处理和/或防止机会性I型和/或II 型单纯疱疹病毒感染。在另一特定实施方案中，本发明的抗体与乙胺 嘧啶和/或亚叶酸联合使用，从而预防性处理和/或防止机会性 Toxoplasma gotidii感染。在另一特定实施方案中，本发明的抗体与 亚叶酸和/或NEUPOGEN(Amgen，Thousand Oaks，CA)联合使用，从 而预防性处理和/或防止机会性细菌感染。
在另一实施方案中，本发明的抗体与抗病毒剂联合给药。可以给 予的抗病毒剂包括，但不限于，阿昔洛韦、利巴韦林、金刚烷胺和 remantidine。
在另一实施方案中，本发明的抗体与抗菌剂联合给药。可以与本 发明的组合物联合给药抗菌剂包括，但不限于，阿莫西林、氨基糖苷 类、β-内酰胺(糖肽)、β-内酰胺酶、氯林可霉素、氯霉素、头孢 菌素、环丙沙星、红霉素、氟喹诺酮类、大环内酯类、甲硝唑、青霉 素、喹诺酮类、ritampin、链霉素、磺胺类、四环素、甲氧苄啶、甲 氧苄啶-sulfamthoxazole、和万古霉素。
可以与本发明的抗体联合给药的常规非特异性免疫抑制剂包括， 但不限于，甾体类、环孢菌素、环孢菌素类似物、环磷酰胺、甲基强 的松、强的松、硫唑嘌呤、FK-506(Fujisawa Pharmaceuticals， Deerfield，IL)、15脱氧司加林和其它通过直接(如通过作用于免疫 细胞)或间接(通过作用于其它介导细胞)抑制应答的免疫细胞(包 括，例如T细胞)的功能而起作用的其它免疫抑制剂。
在一种特定的实施方案中，本发明的抗体与免疫抑制剂联合给药。 可以与本发明的抗体联合给药的免疫抑制剂包括，但不限于 ORTHOCLONE(OKT3)(Ortho Biotech，Raritan，NJ)，SANDIMMUNE ORAL(环孢菌素)(Sandoz Pharmaceuticals，Hanover，NJ)，PROGRAF (藤霉素)(Fujisawa Pharmaceuticals，Deerfield，IL)，CELLCEPT (霉酚酸)(Roche Pharmaceuticals，Nutley，NJ)，硫唑嘌呤，糖皮 质激素类，和RAPAMUNE(sirolimus)(Wyeth，Collegeville，PA)。 在一种特定的实施方案中，与抗体联合给药的免疫抑制剂可以用于防 止器官或骨髓移植排斥。
在另一种实施方案中，本发明的抗体单独给药，或与一种或多种 静脉内免疫球蛋白制剂联合给药。可以与本发明的抗体联合给药的免 疫球蛋白制剂包括，但不限于，GAMMARE(Centeon，Kankakee，IL)， IVEEGAM(Immuno-US Inc.，Rochester，MI)，SANDOGLOBULFN (Sandoz Pharmaceuticals，Hanover，NJ)，GAMMAGARD(Baxter Healthcare，Glendale，CA)，和GAMIMUNE(Bayer Biological，West Haven，CT)。在一种特定的实施方案中，本发明的抗体在移植治疗(如 骨髓移植)中与静脉内的免疫球蛋白制剂联合给药。
在另一种实施方案中，本发明的抗体单独给药，或与抗炎剂联合 给药。可以与本发明的组合物联合给药的抗炎剂包括，但不限于，糖 皮质激素类和非甾体类抗炎药，氨基芳基羧酸、芳基乙酸衍生物、芳 基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮、水杨酸 衍生物、噻嗪羧酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4- 羟基丁酸、amixetrine、苄吲酸、苄达明、布可龙、双苯哌醋胺、双 苯唑醇、依莫法宗、愈创蓝油烃、那布米酮、ninesulide、奥古蛋白、 醋羟脯氨酸、胍苯叉芴、哌异恶唑、哌酰苯肟、proquazone、胺丙恶 二唑和替尼达普。
在一种实施方案中，本发明的抗体与甾体类治疗联合给予。可以 联合给药的甾体类包括甲基强的松龙(如静脉内甲基强的松龙)。在 一种特定的实施方案中，本发明的抗体与强的松联合给药。在另一种 特定的实施方案中，本发明的抗体与强的松和免疫抑制剂联合给药。 可以与强的松联合给药的免疫抑制剂包括，但不限于，硫唑嘌呤、环 磷酰胺和环磷酰胺IV。在一种特定的实施方案中，本发明的抗体与甲 基强的松龙联合给药。在另一种特定的实施方案中，本发明的抗体与 甲基强的松龙和免疫抑制剂联合给药。可以与甲基强的松联合给药的 免疫抑制剂包括，但不限于，硫唑嘌呤、环磷酰胺和环磷酰胺IV。
在另一种实施方案中，本发明的抗体与抗疟药联合给药。可以与 本发明的组合物联合给药的抗疟药包括，但不限于，羟基氯喹、氯喹 和/或阿的平。
在另一种实施方案中，本发明的抗体与非甾体类抗炎药联合给药。 本发明的抗体任选与以下药物的一种、两种、三种、四种、五种、十 种或更多种联合给药：NRD-101(Hoechst Marion Roussel，Kansas City， MO)、双氯酚酸钠(Dimethaid，Ontario，CN)、恶丙嗪钾(Monsanto)、 mecasermin(Chiron，Emeryville，CA)、T-614(Toyama)、pemetrexed disodium(Eli Lilly，Indianapolis，IN)、atreleuton(Abbott， Chicago，IL)、valdecoxib(Monsanto)、eltenac(Byk Gulden，Melville， NY)、campath、AGM-1470(Takeda，Lincolnshire，IL)、CDP- 571(Celltech，Rochester，NY)、CM-101(CarboMed，Nashville，TN)、 ML-3000(Merck)、CB-2431(KS Biomedix，Surrey，UK)、CBF、BS2(KS Biomedix，Surrey，UK)、IL-Ira基因治疗(Valentis，Burlingame， CA)、JTE-522(Japan Tobacco，Tokyo，Japan)、紫杉醇(Angiotech， Vancouver，BC)、DW-166HC(Dong Wha，Seoul，Korea)，darbufelone mesylate(Pfizer Inc.，NewYork，NY)、可溶性TNF受体1(synergen； Amgen，Thousand Oaks，CA)、IPR 6001(Institute for Pharmaceutical Research)、trocade(Hoffman-La Roche，Nutley，NJ)、EF5(Scotia Pharmaceuticals)、BIIL-284(Boehringer Ingelheim，Ridgefield， CT)、BIIF-1149(Boehringer Ingelheim，Ridgefield，CT)、LEUKOVAX (Inflammatics，Malvern，PA)、MK-663(Merck，Whitehouse Station， NJ)、ST-1482(Sigma-Tau，Gaithersburg，MD)、和butixocort propionate(Pfizer Inc.，NewYork，NY)。
在另一种实施方案中，本发明的抗体与一种或多种DMARDs联合给 药。因此，可以使用以下药物中的一种、两种、三种、四种、五种或 更多：氨甲喋呤、来氟米特、依达曲沙、依匹普林、iometrexol、 pyritrexim、曲美沙特、溴莫普林、MX-68、N-[4-[3-(2，4-二氨基-6，7- 二氢-5H-环戊二烯并[d]-嘧啶-5-基)丙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸、N- [[5-[2-(2-氨基-1，4，5，6，7，8-六氢化-4-oxypyryrido[2.3-d] 嘧啶-6-基)乙基]-2-噻吩基]羰基]-L-谷氨酸、(R)N-[[5-[2-(2-氨 基-1，4，5，6，7，8-六氢化-4-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-2- 噻吩基]-羰基]L-谷氨酸、N-((2，4-二氨基-3，4，5，6，7，8-六氢化吡啶 并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基)-2-噻吩基羰基-L-谷氨酸、(S)-2-[[[4- 羧基-4-[[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基] 丁基]氨基]羰基]苯甲酸、N-[4-[3-(2，4-二氨基-1-H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基)丙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸、2，4-二氨基-6-(N-(4-(苯 磺酰基)苄基)甲基氨基)喹唑啉、2，4-二氨基-5-[4-[3-(4-氨基苯 基-4-磺酰基苯基)丙氧基]-3，5-二甲氧基苄基]嘧啶、N-[4-4-(2，4- 二氨基-5-嘧啶基)丁基]苯甲酰基]-L-谷氨酸、N-[4-[3-(2，4-二氨 基-5-嘧啶基)丙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸、N-[4-[2-(2，4-二氨基-6- 蝶啶基)乙基]-苯甲酰基]-4-亚甲基-DL-谷氨酸和N-(1-甲基乙基)- N’[3-(2，4，5-三氯苯氧基)丙氧基]imidodicarbonimidic diamide盐酸 盐(PS15)、柳氮磺胺吡啶、硫代苹果酸金钠、金诺芬、环孢菌素、 青霉胺、硫唑嘌呤、抗疟药(如本文所述)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、 金、Enbrel(etanercept)(Wyeth-Ayerst Laboratories，Philadelphia， PA)、抗TNF抗体、和强的松龙。在一种更优选的实施方案中，本发 明的抗体与抗疟药、氨甲喋呤、抗TNF、Enbrel和/或柳氮磺胺吡啶。
在一种实施方案中，本发明的抗体与氨甲喋呤联合给药。在另一 种实施方案中，本发明的抗体与抗TNF抗体联合给药。在另一种实施 方案中，本发明的抗体与氨甲喋呤和抗TNF抗体或抗Fas抗体联合给 药。在另一种实施方案中，本发明的抗体与柳氮磺胺吡啶联合给药。
在另一种特定的实施方案中，本发明的抗体与氨甲喋呤、抗TNF 抗体、抗Fas抗体和柳氮磺胺吡啶联合给药。在另一种实施方案中， 本发明的抗体与Enbrel联合给药。在另一种实施方案中，本发明的 抗体与Enbrel和氨甲喋呤联合给药。在另一种实施方案中，本发明 的抗体与以下药物联合给药：Enbrel、氨甲喋呤、柳氮磺胺吡啶、来 氟米特、etroricoxib、米索前列腺醇/双氯芬酸钠、valdecoxib、 tiracoxib、rofecoxib、celecoxib、加蓝他米、darbufelone mesilate、 醋氯芬酸、ML-3000、anakinra、hvaluronate sodium、nimesulide、 mvcophenolate mofetil、diacerein、sivelestst sodium、去氟可特、 盐酸纳美芬、samarium-153 lexidronam pentasodium、喷司他丁、T- 614、amiprilose hydrochloride、rocepafant、安吡昔康、 prednisolone famesylate、美洛昔康、双氯芬酸钠、lomoxicam、柳 氮磺胺吡啶、依托度酸、马来酸氟吡汀、ebselen、藤霉素水合物、 那布米酮、氯泼尼醇、肉桂酸吡罗昔康、丙喹酮、双甲丙酰龙、 fenretinide、咪唑羟基苯甲酸盐、卓喜康、双苯噻酸、阿发骨化醇、 二乙酸溴氟龙、盐酸胍立莫司、异丙肌苷、阿克泰特、indometacin farnesil、咪唑立宾、邻甲氯灭酸、双氟尼酸、吡洛昔康、恶丙嗪、 透明质酸钠、布西拉明、环孢素、氟喹氨苯酯、替诺西康、棕榈酸地 塞米松、氨芬酸钠、醋炎痛、金诺芬、氯苯扎利二钠、或其任意组合。
在另一实施方案中，本发明的抗体与Enbrel、氨甲喋呤和柳氮磺 胺吡啶。在其它实施方案中，一种或多种抗疟药与以上联合体系之一 联合给药。在一种特定的实施方案中，本发明的抗体与抗疟药(如羟 基氯喹)、Enbrel、氨甲喋呤和柳氮磺胺吡啶联合给药。在另一种实 施方案中，本发明的抗体与抗疟药(如羟基氯喹)、柳氮磺胺吡啶、 抗TNF抗体和氨甲喋呤联合给药。
在另一种实施方案中，本发明的抗体与化疗剂联合给药。可以与 本发明的组合物联合给药的化疗剂包括，但不限于，抗生素衍生物(如 阿霉素、博莱霉素、道诺霉素和放线菌素)；抗雌激素药物(如他莫 昔芬)；抗代谢药(如氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、干扰素 α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤)；细胞毒性剂(如 卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌氮芥、羟基 脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)；激素(如 甲羟孕酮、磷酸雌氮芥钠、炔雌醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲基睾 丸酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚和睾内酯)；氮芥衍生物(如美法 仑、苯丁酸氮芥、氮芥和噻替哌)；甾体类及其组合(如磷酸倍他米 松钠)和其它(如dicarbazine、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新 碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。其它治疗剂包括，如CPT-11、 deflunomide、放线菌酮和丝裂霉素。
在一种特定的实施方案中，本发明的抗体与CHOP(环磷酰胺、阿 霉素、长春新碱和强的松)或CHOP的任意组合联合给药。在另一种 实施方案中，本发明的抗体与Rituximab联合给药。在另一种实施方 案中，本发明的抗体与Rituximab和CHOP、或Rituxmab与CHOP的成 分的任意组合联合给药。
在另一种实施方案，本发明的抗体与细胞因子联合给药。可以与 本发明的组合物联合给药的细胞因子包括，但不限于，GM-CSF，G-CSF， IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL- 9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL- 18，IL-19，IL-20，IL-21，抗-CD40，CD40L，IFN-α，IFN-β，IFN-γ， TNF-α，和TNFβ。在另一种实施方案中，本发明的抗体与造血生长 因子联合给药。可以与本发明的组合物联合给药的造血生长因子包 括，但不限于，LEUKINE(沙拉斯)和NEUPOGEN(非尔司啶)。
在另一种实施方案中，本发明的抗体与一种或多种其它治疗或预 防方案，如放疗联合给药。
在全文中使用的“治疗剂”是一种有效缓解病理学状况的化合物 或组合物。治疗剂的说明性实例包括，抗癌化合物、TNF家族成员、 抗炎剂、抗病毒剂、抗逆转录病毒剂、抗机会性感染剂、抗生素、免 疫抑制剂、免疫球蛋白、抗疟剂、改变病情的抗风湿药物(DMARDs)、 细胞因子、趋化因子、生长因子和促进靶细胞凋亡的第二抗体。
抗癌化合物或化疗剂是有效抑制异常生长的细胞生长或使其停滞 的化合物或组合物。因此，所述试剂可以在治疗上用于治疗癌症和其 它以异常细胞生长为标志的疾病。药学有效量的抗癌化合物是给予个 体的足够导致异常生长的细胞生长抑制和停滞的量。抗癌化合物的说 明性示例包括：博莱霉素、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环 磷酰胺、道诺霉素、放线菌素、己烯雌酚阿霉素、依托泊苷、5-氟尿 嘧啶、氟尿苷、美法仑、氨甲喋呤、丝裂霉素、6-巯基嘌呤、替尼 泊苷、6-硫鸟嘌呤、长春新碱和长春碱。抗癌化合物和治疗剂的其它 例子见The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，15th Ed.，Berkow et al.，eds.，1987，Rahway，N.J.and Sladek et al.Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs，1987，Powis et al.eds.，Taylor and Francis，New York，N.Y。
本发明的抗体可以进一步与其它疗法联合，如恶性肿瘤的化疗和/ 或放疗，并且可以用凋亡诱导化合物，如双吲哚基马来酰亚胺VIII (BisVIII)或其它致敏剂，如SN-50或LY294002增加疗效。因此，在 一种实施方案中，本发明的抗体可以与BisVIII或其它致敏剂以及化 疗剂(如阿霉素、依托泊苷、topetecan、taxotere或紫杉烷)联合 给药。在另一种实施方案中，本发明的抗体可以与非甾体类抗炎药(如 硫化舒林酸或其它COX-1或COX-2抑制剂)和化疗剂(如阿霉素、依 托泊苷、topetecan、taxotere或紫杉烷)联合给药。在其它疾病， 如自身免疫病和炎性疾病的治疗中，也可以使用联合治疗。例如，抗 体可以与其它治疗剂，如抗炎剂、DMARDs、化疗剂、氨甲喋呤、 bisindolylmaleimide VIII或其它致敏剂等联合给药。在炎性疾病和 自身免疫病的治疗中，也可以联合使用其它治疗剂。本领域技术人员 将对特定的炎性疾病和自身免疫病(如关节炎治疗中的放射滑膜切除 术)采用放疗的形式。
采用本发明的抗体的治疗也可以与采用其它抗体的治疗联合。例 如DR5的抗体可以与DR4，TNF，B7，CD40配体，CD40，CD20(如 rituximab)，Fas或其组合的给药一起、在其之前或之后给予有需要 的受试者。所述联合的抗体治疗可以进一步与一种或多种治疗剂(如 化疗剂、阿霉素和/或氨甲喋呤)的给药、放疗或两者联合。
因此，本发明提供了一种选择性诱导表达DR5的靶细胞凋亡或抑 制其增殖的方法，包括以下步骤：(a)使靶细胞与治疗量的特异性结合 于TRAIL受体DR5的抗体接触，其中所述抗体的可溶性形式在表达DR5 的细胞中具有体内和体外细胞凋亡诱导活性，和(b)使靶细胞与治疗 量的一种或多种治疗剂接触。在一种实施方案中，一个或两个接触步 骤任选在体内进行。在另一实施方案中，一个或两个接触步骤在体外 进行。靶细胞可以选自表现凋亡系统失调的细胞、中性粒细胞、活化 的淋巴细胞或其它活化的免疫细胞(如淋巴细胞和髓细胞)、病毒感 染的细胞、以及自身免疫病中的异常增殖的滑膜细胞(如类风湿性关 节炎滑膜细胞，包括炎性滑膜细胞、滑膜中的活化的淋巴细胞和髓细 胞、巨噬细胞样滑膜细胞和成纤维细胞样滑膜细胞)。与先前公布的 抗DR5抗体(24)相比，本发明的说明性TRA-8抗体的细胞凋亡诱导活 性非常强，并且在体外能够以pg/ml水平诱导Jurkat细胞凋亡，且在 体内证明杀肿瘤活性优于先前报道的可溶性TRAIL。静脉给予一剂TRA-8 足以抑制实体瘤和造血肿瘤细胞的生长，而用可溶性TRAIL诱导体内 肿瘤消退则需要相当高的剂量(每天500ug，给予10天)。本发明的抗 TRAIL受体抗体看来与可溶性TRAIL一样安全，因为示例性抗体TRA-8 并不诱导非转化成纤维细胞凋亡。用DR4抗体观察到了相似结果。
本发明的载体包括一段与调控元件(例如启动子或增强子)可操作性 连接的编码抗DR5或DR4抗体免疫球蛋白重链或轻链的核酸序列。“可 操作性连接”是指所构成的核酸序列的布置使得可执行其正常功能。因 此，与编码多肽的核苷酸序列可操作性连接的调控元件能够指导转录、 复制和/或所述多肽的翻译。本领域技术人员会认识到，单一载体任选 地包括抗DR5或DR4抗体的免疫球蛋白重链和轻链两者的编码序列。在 一种实施方案中，该载体编码人源化的轻链或重链免疫球蛋白。
下文叙述以下实施例是为了说明本发明的方法和结果。这些实施 例并非包括本发明的所有方面，而是说明代表性的方法和结果。这些 实施例并不排除对于本领域技术人员显而易见的本发明的等同方案和 变化。
实施例1.DR5抗原的制备
1.1 DR5 cDNA的克隆
通过以下RT-PCR法，采用以下物质和反应，克隆编码人DR5蛋 白的DNA：
a)模板
通过采用TRIzol试剂(GIBCO BRL)提取HeLa细胞的总RNA。用于 PCR反应的模板使用通过用第一链cDNA合成试剂盒(the First-Strand cDNA synthesis kit)(Amersham Pharmacia Biotech)按照试剂盒中 提供的说明手册获得的cDNA。
b)PCR引物
合成用于PCR的下述寡核苷酸引物：
5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’(DR5p1：SEQ ID No.1)；
5’-ccactgggtgatgttggatggg-3’(DR5p2：SEQ ID No.2)；
除非另有说明，否则在这些实施例中的所有寡核苷酸都由 Lifetechnologies合成。所有的寡核苷酸在溶于蒸馏水后都贮存于-20 ℃。
c)PCR反应
PCR反应溶液的组成：
模板cDNA，总共33μl反应物中的5μl
引物DR5p1，10pmol；
引物DR5p2，10pmol；
10×浓缩PCR缓冲液(试剂盒中提供的)，10μl；
dNTPs(各2.5mM)，4μl；和
Taq聚合酶(Promega)，5单位。
将无菌蒸馏水加入到所述溶液中，至总体积为100μl。除非另有 说明，否则dNTPs为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的等摩尔混合物(每种 2.5mM)。
如下进行PCR反应。首先将溶液于94℃加热2分钟，此后将加热 至94℃30秒、52℃1分钟和72℃3分钟的循环重复40次。完成该程 序后，将反应溶液于72℃加热10分钟。
如此获得的扩增DNA片段在含有0.25μg/ml溴化乙锭的1％琼脂 糖凝胶上分离。用剃刀刀片将确定含有所需DNA片段的条带切下，用 Gene Clean试剂盒(BIO101)从中回收所述DNA。用TA克隆试剂盒(TA Cloning Kit)(Invitrogen，CA)克隆所述DNA片段。这一步如下进行。
将从PCR反应溶液中回收的DNA片段同TA克隆试剂盒中提供的50 ng pCR2.1载体一起与其中加有4单位T4 DNA连接酶(1μl)的1μl 10 ×连接酶反应缓冲液(6mM Tris-HCl(pH7.5)、6mM氯化镁、5mM 氯化钠、7mMβ-巯基乙醇、0.1mM ATP、2mM DTT、1mM亚精胺和0.1 mg/ml牛血清白蛋白)混合。用无菌去离子水将混合物的总体积调至10 μl，将所得的连接酶溶液于14℃孵育15小时。此后，将2μl连接酶 反应溶液加入到其中加入2μl 0.5Mβ-巯基乙醇的50μl感受态大肠 杆菌菌株TOP10F’中，该菌株由TA克隆试剂盒提供，并且按照说明手 册使其成为感受态，将所得混合物在冰上保持30分钟，然后于42℃ 保持30秒，再于冰上保持5分钟。接着，将500μl含有2％v/v胰 蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.05％w/v氯化钠、2.5mM氯化钾、1mM 氯化镁和20mM葡萄糖的培养基(在下文称为“SOC”培养基)加入到 培养物中，将混合物于37℃振荡孵育1小时。此后，将培养物涂布到 含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤琼脂平板(1％v/v胰蛋白胨、0.5％ w/v酵母膏、0.5％w/v氯化钠、0.1％w/v葡萄糖和0.6％w/v细菌培 养用琼脂(Difco))上。选择在平板上出现的氨苄青霉素抗性菌落，用 铂接种环将其刮下，在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤培养基中 于37℃下以200r.p.m.振荡培养过夜。培养后，通过离心收获细胞， 用碱法从中制备质粒DNA。将得自如此获得的质粒的EcoRI-EcoRI DR5cDNA片段亚克隆到pcDNA3质粒(Invitrogen，CA)中。对pcDNA3 中的全长DR5基因测序，该基因匹配已公布的序列。将如此获得的质 粒命名为质粒pcDNA3-DR5。
1.2 DR5-IgG表达载体的构建
为了获得可溶性形式的缺乏跨膜域的人DR5，构建一种表达质粒 载体。这种载体被设计为编码包含与人IgG1 Fc DNA融合的人DR5胞 外域的融合蛋白(41)。编码缺乏跨膜域的人DR5的DNA通过以下PCR 反应获得。
a)模板
用于该PCR反应的模板利用pcDNA3-DR5。
b)PCR引物
合成用于PCR的下述寡核苷酸引物：
5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’(DR5p1：SEQ ID No.1)；
5’-ggatccgtggacacattcgatgtc-3’(DR5p3：SEQ ID No.3)；
除非另有说明，否则在这些实施例中的所有寡核苷酸都由 Lifetechnologies合成。所有的寡核苷酸在溶于蒸馏水后都贮存于-20 ℃。
c)PCR反应
进行PCR反应，按照实施例1.1(c)分离扩增的DNA。
如此获得的质粒命名为质粒pCR-ΔDR5。将从pmFas-hIgG1Fc中回 收的编码人Fc片段的BamHI-EcoRI片段亚克隆到pcDNA3的BamHI和 EcoRI多克隆位点中。如此获得的质粒命名为pcDNAFc。此外，将从 pCR-ΔDR5中回收的编码可溶性人DR5区的BamHI-BamHI片段亚克隆到 pcDNAFc质粒的BamHI位点中。如此获得的质粒命名为质粒 pcDNAΔDR5-Fc。利用DNA聚合酶克列诺片段(GIBCO BRL)，将从 pcDNAΔDR5-Fc质粒中回收的编码可溶性人DR5-人IgG Fc区的EcoRI 片段平端化，然后亚克隆到用BamHI切割后平端化的穿梭载体pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc.，Canada)中。如此获得的质粒命名 为pAdΔDR5-Fc。
1.3人DR5-IgG1融合蛋白的表达和纯化
用ADENO-Quest试剂盒(Quantum Biotechnologies Inc.， Canada)，按照说明手册，用pAdΔDR5-Fc和QBI-病毒DNA(由ADENO- Quest试剂盒提供)共转染QBI-293A细胞(由ADENO-Quest试剂盒提 供)。培养重组病毒噬斑，并且通过上清液的ELISA分析，根据DR5-IgG 融合蛋白的表达进行筛选。阳性噬斑在QBI-293A细胞中扩增，并作 为病毒储备液贮存于-80℃。50个平皿(150mm)的QBI-293A细胞用 pAdΔDR5-Fc重组病毒以10m.o.i.(感染复数)转染。在转染48小时 后收获培养基。
通过在500ml含有10％v/v FCS的DMEM(GIBCO)培养基中于37 ℃、5％v/v CO2环境下培养2天，让具有DR5-IgG基因的转染细胞生 长至1×106细胞/ml的细胞密度。然后将培养物离心(1,000r.p.m.，5 分钟)，并收集上清液。用A蛋白-Sepharose CL-4B亲和色谱(Pharmacia) 在以下条件下达到从上清液中纯化DR5-IgG：
柱子：A蛋白-Sepharose CL-4B柱(柱大小2ml；Pharmacia)；
洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸(pH2.4)，0.15M NaCl；
中和缓冲液：1M Tris-HCl(pH8.5)。
在将所有上清液上样至柱子后，用20ml PBS洗涤3次，然后加 入10次1ml洗脱缓冲液。测量每个洗脱流分(1ml)的光密度。收集 第二流分至第五流分(OD280≥0.1)，加入100μl中和缓冲液后，将 流出液分别置于在透析管中，将流出液对1升PBS(pH7.5)于4℃透 析。更换透析缓冲液两次。
然后，通过ELISA分析流出液中DR5-IgG基因产物的表达。首先， 将100μl每个流分分别置于96孔微量培养板(Costar)的各孔中，于 37℃孵育1小时。此后，除去各孔中的溶液，平板用100μl/孔含有 0.1％v/v Tween 20的PBS(在下文称为“PBS-Tween”)洗涤3次。洗 涤后，以100μl/孔的量加入含有2％w/v牛血清白蛋白(在下文称为 “BSA”)的PBS之后，将平板于37℃孵育1小时。此后，各孔用100μl/ 孔PBS-Tween再洗涤3次，此后向各孔中加入100μl/孔用PBS-Tween 稀释1000倍的抗人IgG1单克隆抗体溶液，将平板再次于37℃孵育1 小时。然后各孔用100μl/孔PBS-Tween洗涤3次。然后以100μl/ 孔的量加入3，3’，5，5’-四甲基-联苯胺(在下文称为“TMB”)液体底物 系统(Sigma)，让平板于室温静置5分钟，然后加入100μl/孔0.2N H2SO4终止反应。读出各孔450nm的吸光度，用650nm的吸光度作为对照 读数，估计结合抗体的浓度。用微量培养板读出仪(Molecular Devices) 测量吸光度。采用这种ELISA法证实DR5-IgG1的产生。用蛋白质印 迹分析，其中用抗人IgG1 mAb(Sigma)检测凝胶上的抗体，测量已表 达DR5-IgG1融合蛋白的分子量。已表达DR5-IgG1融合蛋白的分子量 约为50kDa。通过该蛋白的SDS-PAGE分析和通过考马斯蓝染色测定 评估，达到的纯度高于90％。
实施例2.抗人DR5的单克隆抗体的产生
2.1免疫
用亲和纯化的人DR5/hIgG1融合蛋白免疫6-8周龄雌性Balb/c小 鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。对于初次爪垫免疫，将 融合蛋白(50μg)在弗氏完全佐剂(Difco，Detroit，MI)中乳化。然 后小鼠通过4次每隔一天注射无佐剂给予的50μg融合蛋白进行加强。 最后一次注射后3天，将得自局部淋巴结的淋巴细胞与NS-1骨髓瘤 细胞融合，将杂交瘤培养在补充10％胎牛血清的F104培养基中。通过 ELISA选择阳性杂交瘤，其中所述板用或者1μg/ml DR5/hIgG1或者 等量的作为对照的Fas/hIgG1包被。用一组小鼠Ig同种型特异性山 羊抗体(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)，通过ELISA测 定杂交瘤的同种型。用固定化抗小鼠IgG1或G蛋白(Sigma)，通过亲 和色谱纯化单克隆抗体。
2.2细胞融合
在加强注射后第3天，从小鼠取出局部淋巴结，置于10ml含有 50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素和300μg/ml L-谷氨酸的无血 清RPMI 1640培养基(GIBCO BRL)中，然后用刮刀使器官通过筛网(Cell Strainer；Falcon)将破碎。离心所得的细胞悬浮液，以沉淀局部淋巴 结细胞，然后用无血清RPMI培养基洗涤细胞2次。然后将经洗涤的 细胞重悬于无血清RPMI培养基中并计数。
同时，让骨髓瘤NS1细胞(美国典型培养物保藏中心TIB-18)在含 有10％v/v FCS(Gibco BRL)的ASF104培养基(Ajinomoto，K.K.)(“含 血清ASF培养基”)中于37℃、5％v/v CO2下生长不至超过1×108细 胞/ml的细胞密度，将其同样破碎、洗涤、重悬浮并计数。
将计算含有3×107细胞的量的NS1细胞悬浮液与计算含有3×108 细胞的量的脾细胞悬浮液混合。离心所得的混合物，并弃去上清液。 进行细胞融合的以下步骤，而在所有时间都将含有所述沉淀的塑料管 置于37℃温水的烧杯中。
将1ml 50％(w/v)聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)缓慢加 入所述管中，同时用移液管管尖搅拌沉淀。随后，将预温热至37℃的 1ml无血清RPMI培养基分两份缓慢加入，然后再加入7ml无血清RPMI 培养基。然后将所得的混合物离心，弃去上清液，加入10ml含有10％ v/v FCS的HAT培养基，同时用移液管管尖温和搅拌。再加入20ml 含有10％v/v FCS的HAT培养基后，将悬浮液以100μl/孔分配到96 孔细胞培养微量培养板中，在5％v/v CO2环境下于37℃培养。7天或 8天后，用100μl/孔新鲜HAT培养基替代表现出黄色的任何孔中的 培养基。通过如下所述的有限稀释，克隆得自这些孔的融合细胞。
2.3通过有限稀释克隆
取出4-10周龄雌性BALB/c小鼠(得自Japan SLC，Inc.)的胸腺， 如上所述在筛网(Cell Strainer；Falcon)上破碎，破碎的细胞用含有 10％v/v FCS的HT培养基洗涤2次。将相当于得自一只小鼠的量的胸 腺细胞悬浮于30ml含有10％v/v FCS的HT培养基中，以产生饲养细 胞悬浮液。上述在实施例2.2中获得的融合细胞制备物用这种饲养细 胞悬浮液稀释10-100倍，用饲养细胞悬浮液进一步连续稀释，以制 备融合细胞密度为5细胞/ml、1细胞/ml和0.5细胞/ml的悬浮液。 将如此制备的样品以100μl/孔分配到96孔细胞培养微量培养板的各 孔中，于37℃、5％v/v CO2下孵育5天。
2.4筛选
用包有1μg/ml DR5/hIgG1或者作为对照的等量Fas/hIgG1(41) 的板，通过ELISA筛选得自生长中杂交瘤的培养上清液。用辣根过氧 化物酶(HRP)偶联的抗小鼠免疫球蛋白(Southern Biotechnology. Birmingham，AL)与作为底物的TMB(Sigma，St Louis，MI)，检测结 合抗体。将浓度为1μg/ml的纯化DR5-IgG1或等量Fas-hIgG1加入 到96孔ELISA/RIA STRIP PLATE(Costar，NY)的各孔中。将板于4℃ 静置过夜，让所述蛋白质吸附至孔表面。此后，弃去各孔中的溶液， 用PBS-Tween洗涤各孔3次。然后向各孔中加入100μl含有1％(w/v) 牛血清白蛋白(A3803；Sigma Chemicals Co.)的PBS，将板于37℃孵 育1小时。然后用PBS-Tween将各孔再洗涤3次，向各孔中加入50μl 得自每种生长中杂交瘤的培养上清液。然后将板于37℃孵育1小时， 再次用PBS-Tween洗涤各孔4次。洗涤后，各孔加入50μl用PBS稀 释1000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体 (Southern Biotechnology.Birmingham，AL)，再次将板于37℃孵育 1小时，此后用PBS-Tween洗涤各孔4次。以100μl/ml的量加入 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统(Sigma)，让该板于室温 静置5分钟，然后通过加入100μl/孔0.2N H2SO4终止反应。用微量 培养板读出仪(Molecular Devices)测量各孔450nm的吸光度(对照为 650nm)，从样品中选择吸光度(450nm-650nm，OD值；＞0.5)明显 高于未加融合细胞上清液的吸光度(OD数值；≈0.03)的融合细胞。此 外，也通过用Jurkat细胞测量细胞凋亡诱导活性，对得自生长中杂 交瘤的培养上清液进行功能筛选。在96孔板中，在50μl得自生长 中杂交瘤的培养上清液存在下加入50μl含有Jurkat细胞(1000细胞 /孔)和5μM双吲哚基马来酰亚胺VIII(BisVIII，Alexis，San Diego， CA)的RPMI培养基。将细胞在潮湿培养箱中于37℃培养过夜。用ATPLite 试剂盒，按照生产商(Packard Instruments)的说明，根据细胞存活力 测量细胞凋亡，用TopCounter(Packard Instruments)对样品计数。
2.5 TRAIL和TRA-8与所述受体的ELISA结合
ELISA板用2μg/ml DR4-Ig或DR5-Ig融合蛋白包被过夜。用3％BSA 封闭后，加入指定浓度的可溶性TRAIL-FLAG或TRA-8，于37℃孵育1 小时。分别用HRP偶联抗Flag抗体(Alexis)或HRP偶联抗鼠IgG1 (Southern Biotechnology)检测TRAIL或TRA-8的结合。反应物用TMB 底物缓冲液显色，并用Benchmark Microplate Reader(BioRad)测量。 通过用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，San Diego，CA)， 通过非线性回归的单位点结合模型估计Kd值。对于竞争性ELISA，加 入100ng/ml TRAIL-FLAG，在各种浓度的TRA-8存在下孵育。如上测 定TRAIL的结合。
2.6克隆
对于在以上实施例2.4中选择的细胞，重复在以上实施例2.3和 2.4的步骤5次，从而使得能够选择几个分别产生结合DR5-IgG而不 结合Fas-IgG的单一抗体杂交瘤克隆。作为这种选择程序的结果，获 得命名为TRA-8并且产生与DR5-IgG结合而不与Fas-IgG结合的抗体 的小鼠-小鼠杂交瘤。这种杂交瘤TRA-8于2000年3月1日保藏于美 国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA-1428。
在用单克隆抗体同种型试剂盒(Pierce)测试后，表明小鼠-小鼠 杂交瘤TRA-8(在下文简称为“TRA-8”)产生的抗体亚类为IgG1，κ。
用我们的人DR5-IgG1融合蛋白作为免疫原，通过初步ELISA筛 选获得了7个杂交瘤克隆，每个克隆都是DR5-IgG强阳性，而非Fas- IgG融合蛋白阳性克隆，表明所获得的杂交瘤产生识别DR5胞外部分、 而不识别IgG1的Fc部分的抗体(数据未显示)。
2.7蛋白质印迹分析
用于正常人组织和癌组织匀浆的蛋白质印迹分析的滤膜购自Geno Technology(St Louis，MO)。在每个泳道中加入通过抗β-肌动蛋白抗 体测量的等量蛋白质。印迹用1μg/ml TRA-8探测过夜，然后用HRP 偶联山羊抗小鼠IgG1(Southern Biotechnology)于室温探测1小时， 然后通过化学发光显示。
2.8原位免疫组织化学
人组织得自the Tissue Procurement Center of UAB。将冷冻切 片在70％乙醇中固定，用10％马血清的PBS溶液封闭，然后与10μg/ml 亲和纯化TRA-8一起于室温孵育60分钟。用带有作为比色底物的二 氨基联苯胺的抗小鼠IgG ABC试剂盒(Vector，Burlingame，CA)来显 现反应性。
2.9天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化的分析
将Jurkat细胞(1×106/ml)与500ng/ml TRA-8一起孵育。等份(30 μg蛋白质)细胞裂解液在15％SDS-PAGE上分离，吸印到尼龙膜上，印 迹用抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8、9和3抗体(BD Pharmingen， San Diego，CA)探测，然后通过HRP偶联第二抗体探测，并通过化学 发光显现经切割的产物。设立的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制 剂购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。将每种天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶抑制剂以指定浓度加入到培养物中。
实施例3.TRA-8单克隆抗体的纯化
让小鼠-小鼠杂交瘤TRA-8在500ml含有10％v/v FCS的ASF培 养基中于37℃、5％v/v CO2下培养5天，生长至1×106细胞/ml的细 胞密度。然后将培养物离心(1,000r.p.m.，5分钟)，并收集上清液。 用G蛋白-Sepharose CL-4B亲和色谱(Pharmacia)在以下条件下达到 从上清液中纯化TRA-8：
柱子：G蛋白-Sepharose CL-4B柱(柱大小2ml；Pharmacia)；
洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸(pH2.4)，0.15M NaCl；
中和缓冲液：1M Tris-HCl(pH8.5)。
在将所有上清液上样至柱子后，用20ml PBS洗涤3次，然后加 入10次1ml体积洗脱缓冲液。测量每个洗脱流分(1ml)的光密度。 分别收集第2-5流分(＞OD280＝0.1)。
加入100μl中和缓冲液后，将流出液分别置于在透析管中，将 流出液对1升PBS(pH7.5)于4℃透析。更换透析缓冲液两次。然后 采用用上述技术制备的人DR5-IgG融合蛋白，通过ELISA分析该样品 的抗DR5抗体活性。
实施例4.DR4抗原、DR4-IgG表达载体和抗DR4单克隆抗体的制备
重复实施例1-3的程序，用DR4模板cDNA和引物取代实施例1 中详述的模板和引物，获得DR4抗原，将其按照实施例1.2-3使用， 获得对DR4特异性的单克隆抗体。
实施例5.抗DcR1和DcR2的单克隆抗体
按照实施例1，通过取代相应的cDNA和引物以产生相应的抗原， 产生针对诱饵受体DcR1和DcR2的单克隆抗体。按照实施例2和实施 例3，产生了具有免疫球蛋白G的DcR1或DcR2的表达载体以及所得 的纯化单克隆抗体。
实施例6.单克隆抗体的特异性
由于所有TRAIL受体和TNFR家族其它蛋白享有显著的同源性， 所以采用两种不同的人DR5-IgG融合蛋白和可溶性重组形式的其它相 关蛋白，通过蛋白质印迹分析，测定了示例性抗体TRA-8对DR5的特 异性。通过将得自DR5胞外部分的残基1-180的cDNA与编码人IgG1 恒定区的cDNA融合，构建了第一种DR5-Ig融合蛋白。将融合的cDNA 克隆到重组腺病毒载体(Quantum Biotechnogies，Inc.，Montreal， Canada)中。相对分子量为50kDa的已表达DR5/hIgG1融合蛋白用抗人 IgG亲和柱(Sigma，St Louis，MO)纯化。对于特异性的蛋白质印迹分 析，第二种重组人DR5/IgG1融合蛋白(aa 52-212)以及TRAIL-R1、R3 和R4融合蛋白购自Alexis。可溶性形式的人Fas和TNFR1由Amgen，Inc. (Thousands Oaks，CA，USA)的Carl Edwards博士友好提供。所用的 可溶性重组人DR4、DcR1、DcR2和TNFR1、R4和Fas分子是人IgG1融 合蛋白。0.5μg每种蛋白质通过10％SDS-PAGE分离，并吸印到硝化 纤维素膜上。印迹用5％奶粉的PBS溶液于室温封闭1小时，用1μg/ml 纯化抗DR5单克隆抗体(克隆：TRA-8)或0.1μg/ml HRP偶联山羊抗 人IgG于4℃探测过夜。辣根过氧化物酶(HRP)偶联山羊抗小鼠IgG用 作第二抗体，以检测结合TRA-8。通过化学发光显现印迹。
使用用含有全长DR5或DR4的pcDNA3载体(Clontech，Palo Alto， CA)或空载体转染的Cos-7细胞，进行流式细胞术分析。将编码人TRAIL 或鼠Fas配体的全长cDNA克隆到pTRE载体中四环素控制型启动子下 游(Clontech)。将pTRE-hTRAIL或pTRE-mFasL的XhoI-HindIII片段 进一步克隆到腺病毒穿梭载体pAdBN(Quantum Biotechnologies，Inc.) 中。所述293宿主细胞用线性化pAd-TRE-hTRAIL或pAd-TRE-mFasL和 腺病毒的大片段DNA共转染。来自重组病毒噬斑的功能性人TRAIL或 鼠Fas配体的表达用51Cr-释放测定和作为靶的Jurkat筛选。
TRA-8与图1a中所示用于免疫的DR5-IgG融合蛋白(~50kDa)-DR5， #1强反应，与图1a中所示的第二种DR5-IgG融合蛋白(~60kD)-DR5， #2弱反应。TRA-8与DR4、DcR1、DcR2、Fas(CD95)或TNFRI没有显 著结合。这些结果表明，TRA-8识别并非该家族其它成员共享的、而 是DR5所特有的表位。
TRA-8与TNF受体超家族的其它成员例如Fas(CD95)和TNF受体 I不反应，根据450nm和650nm的吸光度比率表明(其中下图编号为 1-7(图1a，下图的第8栏)，TRA-8与DR5的鼠类同源物也没有交叉 反应。可溶性TRAIL和TRA-8与固定化DR5的结合相当(图1b，左图)。 相反，TRAIL与DR4结合，而TRA-8没有表现出与DR4的任何结合活 性(图1b，中图)。TRAIL和TRA-8与DR5结合的Kd值估计分别为59nM 和3nM。重要的是，TRA-8有效地与TRAIL竞争与DR5的结合，而不 竞争与DR4的结合，如竞争性ELISA所示(图1b，右图)。这些结果确 立了TRA-8对人DR5的特异性。
TRA-8能够检测DR5的细胞表面表达，流式细胞术分析表明与用 全长人DR5转染的Cos-7细胞的细胞表面特异性结合，但不与用DR4 或空载体转染的Cos-7细胞的细胞表面结合(图1c)。同样，用TRA-8 的原位免疫组织化学显示出与用全长DR5 DNA转染的Cos-7细胞的反 应性，但没有与用对照载体转染的Cos-7细胞的反应性(图1d)。TRA- 8不诱导未转染Cos-7细胞的细胞凋亡，采用编码人DR5的成对引物 从Cos-7细胞的RNA进行RT-PCR表明没有特异性PCR产物。用人Jurkat 细胞作为靶的进一步功能分析表明，在缺乏交联时，TRA-8强烈诱导 细胞死亡，这通过细胞存活力的三种不同的测定包括ATPLite、MTT 和PI排除得到证实(图1e)。通过ATPLite测定显示，纳克水平的TRA-8 杀伤超过50％的Jurkat细胞。TRA-8的杀伤活性对于DR5是特异性的， 因为它可以被DR5-Ig所阻断，而不被DR4-Ig融合蛋白阻断(数据未 显示)。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8、3、9和10的切割可以通 过蛋白质印迹分析在早至TRA-8处理Jurkat细胞后30分钟检测到(图 1f)，Jurkat细胞的细胞死亡被通用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 抑制剂(Z-VAD)完全抑制(图1g)。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8、 9和3的各种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂部分抑制细胞死 亡，进一步表明TRA-8介导的细胞死亡主要通过天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶依赖性细胞凋亡机制。
实施例7.细胞表面DR5表达的流式细胞术分析：许多肿瘤细胞上 的主要死亡受体，而非正常细胞上的主要死亡受体
然后，用含有全长人DR5 cDNA或DR4 cDNA的表达载体或作为对 照的空载体转染的COS-7(美国典型培养物保藏中心No.CRL-1651)细 胞，评价TRA-8结合细胞表面上表达的DR5的能力以及该反应的特异 性。藻红蛋白(PE)偶联抗小鼠IgG1(Pharmingen)用作第二抗体，检 测结合TRA-8。用流式细胞仪(FACSVantage)在下述条件下测量1×104 细胞的荧光：
激发波长：488nm；
检测波长：600nm。
流式细胞术分析表明，TRA-8使以DR5载体转染的COS-7细胞中 的大约30％染色，如图1c的实心直方图所示。这一百分比与采用绿色 荧光蛋白(GFP)分析转染所测定的转染效率(数据未显示)类似。TRA-8 没有显著地使用DR4载体(空心直方图)或对照载体(虚线直方图)转染 的细胞染色，表明TRA-8对于细胞表面DR5是特异性的。
尽管已经在mRNA水平上广泛研究了肿瘤细胞中的DR5表达 (Rieger J.等1：FEBS Lett 1998 May 1；427(1)：124-8)，但对于DR5 的表面表达尚不甚了解。Gibson S.B.等1：Mol Cell Biol 2000 Jan； 20(1)：205-12；Kim K.等1：Clin Cancer Res 2000 Feb；6(2)：335- 46。因此，抗DR5单克隆抗体的可得性使得我们可以检查DR5的表面 水平以及将所述表达与细胞对TRAIL介导的细胞凋亡的敏感性相关 联。将下一组细胞(1×106)与10μg/ml亲和纯化TRA-8一起于室温下 孵育30分钟，然后用PE偶联抗小鼠IgG1(Pharmingen)再染色30分 钟。用FACSvantage流式细胞仪在下述条件下分析10,000个活细胞：
激发波长：488nm；
检测波长：600nm。
所测试的5个造血细胞系是Jurkat、CEM-6、Molt-4、H-9和U937 细胞。在Jurkat、CEM-6、H-9和U937细胞表面可检测到DR5表达， 而在Molt-4细胞上几乎检测不到，如图2a和2a’中所示。尽管先前 已经描述了高水平的DR5 RNA表达(43)，但FACs分析表明，这些细 胞不表达高水平的表面DR5。这些结果表明，DR5的细胞表面表达与DR5 的转录表达不相关，这对于这种受体而言并非是意料之外的。DR5的 细胞表面表达水平可以是细胞谱系特异性的，因为造血来源的大多数 细胞表达低水平的DR5，而大多数神经胶质瘤细胞和前列腺细胞表达 高水平的DR5。
用TRA-8单克隆抗体，通过检查在一组不同类型的人肿瘤细胞中 DR5的细胞表面表达以及这些细胞对TRAIL和TRA-8两者介导的细胞 凋亡的敏感性，来确定DR5在诱导TRAIL介导的细胞凋亡方面的作用。 原代外周血T细胞不表达显著水平的细胞表面DR5，并且对TRAIL和 TRA-8介导的细胞凋亡均有抗性(图2a、2a’和3a’)。尽管所测试的所 有5个人T白血病细胞系都表达可检测到的、尽管相对低水平的细胞 表面DR5，但其中两个细胞系(Jurkat和CEM-6)却对TRAIL和TRA-8 两者介导的细胞凋亡高度敏感，表明单独的DR5足以诱导这些细胞的 凋亡。Molt-4和U937细胞对TRAIL介导的细胞凋亡部分敏感，而对 TRA-8介导的细胞凋亡具有相对抗性，提示其它TRAIL受体可能参与 细胞凋亡信号的转导。H-9细胞对TRAIL和TRA-8两者介导的细胞凋 亡均有抗性，暗示有胞内抗细胞凋亡途径介导的阻断。
一组细胞包括人恶性神经胶质瘤细胞系Hs683、U251MG、D37MG、 D54MG、U373MG、CH235MG、U87和正常人星形细胞，这些细胞由the Neurosurgery Department of the University of Alabama at Birmingham的Yancey Gillespie博士提供。人前列腺癌细胞系Du154、 PC3和LnCap由the Pathology Department of the University of Alabama at Birmingham的William Grizzle博士提供，William Grizzle 博士从美国典型培养物保藏中心获得所述细胞系。人白血病T细胞系、 B细胞淋巴瘤、HepG2 Jurkat(美国典型培养物保藏中心TIB-152)和 CCRF-CEM CEM-6(美国典型培养物保藏中心CCL-119)；单核细胞细胞 系U937(美国典型培养物保藏中心CRL-2367)购自美国典型培养物保 藏中心。所有上述细胞系均在补充10％FCS的RPMI 1640中培养。人 星形细胞瘤细胞系1321N1由Psychiatry Department of the University of Alabama at Birmingham的Richard Jope博士友好提 供，在补充5％FCS的DMEM中培养。
购自Alexis Corporation(San Diego，CA)的可溶性重组人TRAIL 是一种融合蛋白，由在N末端与FLAG标志和一个8个氨基酸的接头 肽融合的人TRAIL胞外域(氨基酸残基95-281)组成。与先前报道的His 标志的TRAIL不同，这种单独的TRAIL制备物在Jurkat细胞中不诱导 强细胞凋亡应答，并且需要抗FLAG抗体作为交联剂，以增强细胞凋 亡。这种抗FLAG抗体也购自Alexis。
所测试的所有10种人恶性神经胶质瘤细胞在细胞表面表达可检 测水平的DR5。大多数表达中等至高水平的DR5，如图2b中所示。D- 54MG、U373MG和CH-235MG三个系表达高水平的DR5，而Hs-683、 U251-MG、D37-MG、U87、SMK1和1321N1六个系表达中等水平的DR5。 仅H-465一个细胞系表达低水平的DR5。所有三个前列腺癌细胞系表 达高水平的DR5，如图2c中所示。
同正常原代T细胞一样，原代B细胞不表达显著水平的DR5，并 且在用TRAIL或TRA-8处理后不经历细胞凋亡(图2d)。所测试的4个 B淋巴瘤细胞系中的3个(SKW6.4、EB-3和Raji)表达相对高水平的 DR5，对TRAIL和TRA-8介导的细胞凋亡都非常敏感。第4个细胞系Daudi 表达非常低水平的DR5，对TRAIL或者TRA-8介导的细胞凋亡敏感性 低得多。尽管原代星形细胞并不表达可检测水平的细胞表面DR5(图 2b’)，但所测试的所有4个神经胶质瘤细胞系却表达高水平的DR5。DR5 在神经胶质瘤上的表达水平高于在T细胞和B细胞上的表达水平，这 并不伴随着对TRAIL和DR5介导的细胞凋亡的敏感性显著更高，提示 DR5的细胞表面表达水平不一定与肿瘤细胞凋亡的水平相关。为测定 DR4、DR5和DcR2信使水平而进行的RT-PCR在所测试的所有细胞中都 检测到信使(表1)。然而，一般而言，与转化肿瘤细胞相比，原代正 常细胞表达相对低水平的DR5。
表1：TRAIL受体表达的RT-PCR分析* 细胞 DR5 DR4 DcR2 原代T细胞 ＜0.001 ＜0.001 0.015 Jurkat 0.10 ＜0.001 0.21 CEM-6 0.50 0.59 0.25 Molt-4 0.10 ＜0.001 0.05 H-9 0.73 0.61 0.07 原代B细胞 ＜0.001 ＜0.001 0.024 SKW6.4 0.95 0.66 0.45 EB3 0.40 ＜0.001 0.35 Raji 0.55 0.11 0.45 Daudi 0.73 0.36 0.63 正常星形细胞 0.05 ＜0.001 0.12 SH683 0.56 0.96 0.14 U87 0.44 0.56 0.21 D54 1.15 0.46 0.12 1321N1 0.25 0.35 0.05
*从细胞中分离总RNA，如方法中所述进行RT-PCR。PCR产物在3％琼 脂糖凝胶上分离，并通过Fluor-S MAX MultiImager System(BioRad) 分析。数值以相对于β-肌动蛋白的比率表示。
实施例8.在体外在恶性细胞中诱导细胞凋亡
为了确定TRA-8是否在体外在转化细胞中诱导细胞凋亡，检查了 所有DR5阳性肿瘤细胞对TRA-8或者TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性。
靶细胞(1×103/孔)在指定浓度的可溶性TRAIL加上交联剂 (Alexis)或TRA-8存在下，在96孔板中于37℃培养过夜。细胞存活 力的测定利用：(1)ATPLite试剂盒，按照生产商的说明(Packard Instruments，Meriden，CT)；(2)MTT细胞增殖/存活力试剂盒 (Sigma)；或(3)用PI将死细胞染色，并通过流式细胞术分析。在培 养结束时，细胞用10μg/ml PI染色，PI阴性细胞作为活细胞门控。 对于肝细胞的固缩核的分析，细胞用10ng/ml Hoechst 33352 (Molecular Probes)染色，然后通过流式细胞术分析。
TRA-8抗体能够在大多数人恶性神经胶质瘤细胞系(9/10)、3个 前列腺癌细胞系中的2个细胞系和4个DR5阳性造血细胞系中的2个 细胞系中诱导细胞凋亡。它在Molt-4细胞系中不诱导细胞凋亡，该 细胞系表达几乎不可检测的细胞表面水平的DR5。然而，所述细胞对 TRA-8介导的细胞凋亡的敏感性水平在所述细胞系中变化相当大。
所述细胞对TRA-8抗体诱导的细胞凋亡的变异性和敏感性提示， 尽管需要最低水平的DR5的细胞表面表达，但DR5的细胞表面表达的 水平不一定是敏感性的主要决定因素，其它因素影响该过程。尽管所 有神经胶质瘤细胞一般都表达的表面DR5的水平显著高于造血细胞， 但与所述造血细胞相比，神经胶质瘤细胞对TRA-8诱导的细胞凋亡的 敏感性却不成比例增加。所述神经胶质瘤细胞系中的5个细胞系D- 37MG、D54-MG、U373-MG、CH235-MG和1321N1对TRA-8诱导的细胞凋 亡的敏感性高，与它们对TRAIL介导的细胞凋亡的敏感性相当，如图 3b中所示。所述神经胶质瘤细胞系中的2个细胞系-H-456和SMK1 对TRA-8诱导的细胞凋亡的敏感性低得多。就H-456细胞而论，DR5 的表面表达低；然而，DR5在SMK1上的表面表达与更敏感的细胞系相 似，提示其它机制可能在决定对TRAIL介导的细胞凋亡的敏感性方面 起作用。尽管所有三个前列腺癌细胞系表达高水平的DR5，但Du145 细胞对TRA-8诱导的细胞凋亡最为敏感，PC3细胞部分敏感，而LnCAP 细胞完全具有抗性，如图3c中所示。在所述造血细胞中，发现Jurkat 和CEM-6对TRA-8介导的细胞凋亡非常敏感，如图2a中所示，尽管 发现这两个细胞系表达低水平的DR5。尽管在U937细胞可检测到DR5， 但这些细胞对TRA-8诱导的细胞凋亡具抗性。同样，虽然H-9细胞表 达可检测水平的DR5，但H-9细胞对TRA-8诱导的细胞凋亡具抗性。 这些结果暗示，存在影响DR5介导的细胞凋亡的调控机制。
按照实施例1-3的程序，产生了其它表面结合抗DR5抗体。将命 名为TRA-1和TRA-10的两个其它抗DR5抗体与TRA-8一起研究，以确 定诱导细胞凋亡的相对能力，因而可用作激动剂，或相反阻断TRAIL 介导的细胞凋亡，因而可用作拮抗剂。人Jurkat细胞用作靶，以测 定命名为TRA-1、TRA-8和TRA-10三种抗DR5抗体的激动剂活性和/或 拮抗剂活性。如图4中所示，与2.5μg/ml TRA-10、TRA-1和TRA-8 一起孵育过夜时，细胞存活力分别为约90％、70％和20％。TRA-8以剂 量依赖性方式诱导强细胞凋亡应答，而TRA-1仅诱导中等的细胞凋亡 应答，TRA-10仅诱导弱应答。因此TRA-8被鉴定为激动性抗DR5抗体。 在图4中，显示人Jurkat细胞的存活力随TRAIL诱导的细胞凋亡以 剂量依赖性而变。对在低剂量TRAIL诱导的细胞凋亡研究中，TRA-10 显著阻断人Jurkat细胞的细胞凋亡。因此，TRA-10被鉴定为拮抗性 抗DR5抗体。TRA-1保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA- 1741。TRA-10同样保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA- 1742。
所述神经胶质瘤细胞系中的5个细胞系-D-37MG、D54-MG、U373- MG、CH235-MG和1321N1对TRA-8诱导的细胞凋亡的敏感性等同于它 们对TRAIL介导的细胞凋亡的敏感性，如图3b中所示，表明在这些 细胞中TRAIL诱导的细胞凋亡主要通过DR5介导。此外，所述神经胶 质瘤细胞系中的2个细胞系-Hs683和U251-MG对TRAIL诱导的细胞 凋亡具抗性，而对TRA-8诱导的细胞凋亡部分敏感，表明所述诱饵受 体在这些细胞中起作用，以及应用TRA-8抗体绕过了这种调控机制。 在所述前列腺癌细胞系中，尽管对TRA-8诱导的细胞凋亡的敏感性不 同，但这却与所述细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性相当，再次 提示DR5在前列腺癌细胞的TRAIL介导的细胞凋亡中起主要作用。在 所述造血细胞中，发现Jurkat和CEM-6对TRA-8和TRAIL介导的细胞 凋亡都非常敏感。TRA-8诱导的细胞凋亡的水平与TRAIL诱导的细胞 凋亡相当，如图2a和3a’中所示。仅所述神经胶质瘤细胞系中的一个 细胞系U87和两个造血细胞系U937和Molt-4显示出对TRAIL诱导的 细胞凋亡敏感，而对TRA-8诱导的细胞凋亡的敏感性较低或具抗性。 一个细胞系H-9细胞系表达可检测水平的DR5，但对TRA-8或TRAIL 诱导的细胞凋亡具抗性。TRA-8诱导的细胞凋亡需要最低水平的DR5 表达，DR5表达的水平不一定预示着所述细胞对TRA-8介导的细胞凋 亡的敏感性；在某些细胞中诱饵受体在调节TRAIL介导的细胞凋亡中 起作用，而看来在迄今所测试的大多数细胞中并不起重要作用；正如 所预期的，TRA-8抗体绕过所述诱饵受体的效应；在转化细胞中可能 发生DR5受体的功能突变；以及最后，在限定所述细胞对TRAIL和DR5 介导的细胞凋亡的敏感性方面，胞内调控机制可能与所述诱饵受体一 样重要或者更为重要。
先前研究已经表明，DR5 mRNA广泛分布于正常组织中7。为了评 估DR5在蛋白质水平上的表达，在蛋白质印迹分析中，用TRA-8抗体 探测一组正常人组织匀浆(Geno Technology，St Louis，MO)。在9种 正常人组织中，脑组织为弱阳性(图5a，第2泳道)。通过TRA-8反应 性，在肝(第1泳道)、肺(第3泳道)、肾(第4泳道)、脾(第5泳道)、 睾丸(第6泳道)、卵巢(第7泳道)、心脏(第8泳道)或胰腺(第9泳 道)中没有检测到DR5蛋白。相反，所有13种人癌组织都用TRA-8染 色阳性(图5b)，所述癌组织包括卵巢癌(第1泳道)、肺癌(第2泳道)、 肝癌(第3泳道)、直肠癌(第4泳道)、宫颈癌(第5泳道)、皮肤癌(第 6泳道)、睾丸癌(第7泳道)、甲状腺癌(第8泳道)、子宫癌(第10泳 道)、胃癌(第11泳道)、喉咽癌(第12泳道)和胰腺癌(第13泳道)。 此外，采用TRA-8进行的正常组织和癌组织的原位免疫组织化学证实， 除少数脾中散布的阳性细胞外，DR5在正常乳腺组织、肺组织和脾组 织中的表达不可检测(图5c)。包括乳腺浸润性导管癌、小细胞性肺癌 和淋巴瘤在内的对应癌组织与TRA-8阳性反应(图5d)。在所检查的总 共22种癌组织中，6种乳癌中的5种、2种宫颈癌中的2种、5种肝 癌中的4种、8种淋巴瘤中的5种、2种肺癌中的2种和2种前列腺 癌中的2种与TRA-8反应阳性。这些结果与流式细胞术分析的结果一 致，表明癌组织比正常组织表达更高水平的DR5蛋白。
实施例9.TRA-8的体内杀肿瘤活性
由于各种原因，在体外研究中显示出有前景的许多药物在体内并 不显示出功效。因此，重要的是测试TRA-8在体内动物模型中的功效。 为了完成这一点，将TRA-8抗人DR5抗体给予带有表达人DR5分子的 人类异种移植物的小鼠。采用的小鼠为6-8周龄NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratory)，给所述小鼠皮下接种人星形细胞瘤1321N1细胞(1× 107)，或静脉内接种人白血病Jurkat细胞(1×106)。在肿瘤接种后第 2天，给小鼠静脉内接种TRA-8(100μg)。用TRA-8治疗后5天，根 据肿瘤块的大小和重量测定1321N1肿瘤生长。根据脾重量和人CD3 阳性Jurkat细胞在接种动物的脾中的百分比，测定Jurkat细胞的生 长。取肿瘤组织的活检组织，进行组织学检查。
在肿瘤接种后1天用一次静脉内给予100μg TRA-8进行早期治 疗，完全抑制1321N1细胞形成实体瘤(图6a)。在肿瘤接种后1周， 用三剂100μg TRA-8进行晚期治疗，将肿瘤重量降低至四分之一或 更低(图6b)。在早期时间点用TRA-8治疗的动物中肿瘤形成不可见(图 6c，上图)。组织学分析揭示，用TRA-8治疗的动物中肿瘤组织显著 消退(图6c，下图)。同样，TRA-8治疗抑制Jurkat细胞在脾中定居， 如在脾中CD3阳性Jurakt细胞稀少所证明的(图6d、6e)。所植入肿 瘤的组织学分析显示，在TRA-8治疗的动物的软组织中有少数肿瘤细 胞散布，而对照显示出形成实体瘤，如图6c中所示。通过图6a中所 示的流式细胞术分析和图6c的原位CD3染色证明，在Jurkat细胞模 型中，与对照动物脾中Jurkat细胞数目接近10％相比，在TRA-8治疗 动物的脾中Jurkat细胞数目低于2％。
这些结果证实了最近的实证：系统给予交联重组TRAIL抑制肿瘤 在体内生长(13)。这些结果表明，一剂TRA-8在消除体内肿瘤细胞方 面非常有效。
由于在鼠类模型中使用抗人抗体，所以不可能评价TRA-8治疗的 毒性。然而，体内给予TRAIL的研究表明，没有与该治疗相关的显著 毒性(13)。
实施例10.RA滑膜细胞对TRAIL和TRA-8诱导的细胞凋亡敏感
大多数现有技术关于TRAIL介导的细胞凋亡的研究集中于恶性细 胞。按照本发明的TRAIL介导的细胞凋亡也可治疗自身免疫病和炎性 病症例如RA。
10.1 RA滑膜细胞中细胞表面DR5表达的流式细胞术分析
将一组得自RA患者的8种原代培养滑膜细胞上DR5的表达与得 自骨关节炎(下文称为“OA”)患者的8种原代培养滑膜细胞上DR5的 表达比较。所述8种人原代RA滑膜细胞培养物RA-1014、RA-1016、 RA-1021、RA-512、RA-707、RA-811、RA-716和RA-929由M.Ohtsuki 博士(Sankyo Co.Ltd.，Tokyo，Japan)友好提供，并培养在补充10％ FCS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺的DMEM中。所述7种OA滑膜细胞 原代细胞培养物通过标准胶原蛋白酶法从OA患者的滑膜组织中分离， 并且在相同条件下培养。所有原代细胞的传代数都低于10。如实施例 5中所述，通过FACs分析测定DR5的表达。
所有RA细胞的原代培养物都表达高水平的表面DR5，在从不同患 者分离出的这些滑膜细胞中表达水平变异小，如图7a中所示。相反， 在从OA患者分离出的滑膜细胞表面上表面DR5的表达非常低或不可 检测，如图7b中所示。发现与所述RA细胞的表现相比，SV40转化的 滑膜细胞表达高水平的DR5。相反，在图7b中，与所述OA细胞的表 现相比，未转化的成纤维细胞表达低水平的DR5。
10.2 RA滑膜细胞对TRA-8或TRAIL介导的细胞凋亡的敏感性
一般而言，从RA患者中分离出的所有滑膜细胞都对TRAIL和抗DR5 抗体两者诱导的细胞凋亡敏感，而所有OA细胞对TRAIL和抗DR5抗 体诱导的细胞凋亡具抗性，如图8a、8b所示。这些研究表明，TRA-8 抗体优选靶向改变的细胞，而非正常细胞。此外，对TRAIL诱导的细 胞凋亡的敏感性或抗性的模式与抗DR5抗体诱导的细胞凋亡相关，表 明所述滑膜细胞主要利用DR5触发TRAIL细胞凋亡。
正如关于所述恶性细胞所述的，在所述RA滑膜细胞中对TRAIL 或抗DR5抗体诱导的细胞凋亡的敏感性有不同，尽管它们表达相似水 平的DR5。RA-512和RA-707最为敏感，因为超过80％的细胞被低于20 ng/ml浓度的TRAIL或TRA-8杀死。其中RA-1014、RA-811、RA-716 和RA9 29对TRAIL或TRA-8中等敏感，在存在高浓度(＞50ng/ml)的 TRAIL或TRA-8时发生近100％的细胞死亡。在RA-1016和RA1021细胞 中，尽管大多数(超过60％)细胞被低剂量的TRAIL或TRA-8杀死，但 在存在高浓度TRAIL或TRA-8时一部分细胞却存活下来，表明有一个 细胞亚群对TRAIL介导的细胞凋亡具抗性。相反，所有OA细胞对TRAIL 和TRA-8诱导的细胞凋亡的敏感性却低得多。在OA52F和OA69F中， 甚至在存在高浓度TRAIL或TRA-8时，不超过60％的细胞被杀死。OA72M 细胞完全抵抗TRAIL或TRA-8诱导的细胞凋亡。SV40转化的滑膜细胞 也对TRAIL和TRA-8诱导的细胞凋亡敏感(数据未显示)。相反，未转 化成纤维细胞看来对TRAIL和TRA-8具抗性。
先前已经表明，DR5利用FADD/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8 依赖性途径来触发细胞凋亡(44)。为了确定RA滑膜细胞的天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶依赖性DR5介导的细胞凋亡，在存在特异性天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的情况下将RA细胞与TRAIL或 抗DR5抗体一起培养。在所测试的8种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶6、8和10抑制剂能够 抑制TRAIL和DR5两者诱导的RA滑膜细胞凋亡，如图9中所示，表 明这三种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶参与DR5介导的细胞凋亡。
10.3 TRA-8或TRAIL诱导RA滑膜细胞中NF-κb激活，而不增加MMP 的释放
有相当多的证据支持这样一种概念：在细胞凋亡信号和增殖信号 之间有密切联系(45)。已经确定，除细胞凋亡信号转导之外，DR5还 能够激活NF-κb途径，并且NF-κb激活可能能够转导抗细胞凋亡信号。 因此进行了凝胶移动测定。细胞用50ng/ml重组可溶性TRAIL、在1 mg/ml增强剂存在下的Fas配体或50ng/ml TRA-8刺激指定时间。制 备核提取物，与双重染色的[32P]标记的oligo-DNA探针一起孵育。结 果用旋风分离式(cyclone)磷光成像仪(TopCount NXT，Packard Instrument Company，CT)分析。在RA滑膜细胞与TNF-α或TRAIL一 起孵育后，NF-κb以时间依赖方式被激活。TRA-8抗体能够强激活NF- κb。相反，Fas配体不能诱导NF-κb激活，如图10a所示。
因此，尽管TRAIL和TRA-8抗体在RA滑膜细胞中诱导强细胞凋 亡应答，但它们也激活NF-κb，而NF-κb的激活被认为在RA中引起TNF-α 的促炎作用。因此，有可能TRAIL同TNF-α一样，可以充当促炎细胞 因子。为了确定TRAIL和TNF-α诱导的NF-κb激活是否有相似的生物 学结果，通过ELISA测定MMP的产生。将滑膜细胞在单独的培养基中 或加有50ng/ml白介素1b、10ng/ml TNF-α、50ng/ml TRAIL或50ng/ml TRA-8的培养基中培养过夜。用ELISA试剂盒测定培养上清液中MMP- 1和MMP-3的水平。
当RA滑膜细胞与促炎细胞因子TNF-α或IL-1b一起孵育时，与培 养基对照相比，MMP-1、MMP-3和MMP-13的产生增加，如图10b、10c 所示。相反，用TRAIL或抗DR5抗体处理，与这些MMP的释放增加无 关。
实施例11A.不能诱导肝细胞毒性
对于24小时细胞存活力测定，从In Vitro Technology(Baltimore， MD)购买96孔板中的新鲜正常人肝细胞。将所述肝细胞培养在含有1 μg/ml或者可溶性TRAIL或者TRA-8的肝细胞培养基(Hepatocyte Culture Medium)中。对于6小时存活力测定，从收集于UAB Tissue Procurement Center的新鲜手术样本中分离正常肝细胞或肝细胞癌细 胞。用于分离人类肝细胞的所有试剂包括肝细胞灌注缓冲液、消化培 养基、洗涤培养基和贴壁培养基购自Gibco。组织玻片在肝细胞消化 培养基(Hepatocyte Digest Medium)中于37℃振荡(50rpm)消化1小 时。通过低速离心(50g，3min)收获经分离的肝细胞，用肝细胞洗 涤培养基(Hepatocyte Washing Medium)洗涤6次。将肝细胞的单细胞 悬浮液在96孔Matrigel板(BD)中含有10％FCS的贴壁培养基 (Attachment Medium)中培养6小时。通过用预温热的贴壁培养基洗涤 2次，除去非贴壁肝细胞。贴壁肝细胞进一步与各种浓度的可溶性TRAIL 或FasL在交联剂存在下、或者TRA-8或CH11一起孵育6小时。
TRAIL有至少两种能够诱导细胞凋亡的受体(DR4和DR5)。用TRA- 8测定仅DR5的交联是否足以诱导正常肝细胞凋亡。最初采用TRA-8， 通过原位免疫组织化学，在5种正常人肝组织和5种肝癌组织中在蛋 白质水平上检查DR5的表达。得自正常肝组织的切片在H&E染色时(图 11a，左上图)，在TRA-8对DR5无阳性反应性的情况下(图11a，左下 图)，显示出正常结构和细胞形态。相反，人肝细胞癌组织与TRA-8 反应阳性，其反应模式与癌细胞的细胞膜和胞质都存在DR5一致。人 肝细胞癌细胞系HepG2也是DR5阳性。这些结果在所述5种正常肝组 织中是一致的，5种肝癌组织中仅一种组织(肝腺瘤)为DR5阴性。这 些结果与图5a中所示的蛋白质印迹数据一致，在图5a中，关于其它 正常组织，正常人肝组织不表达显著水平的DR5蛋白。此外，用TRA- 8探测的经分离的正常人肝细胞的蛋白质印迹分析没有显示出可检测 水平的DR5。
通过流式细胞术分析检测的人肝细胞上DR5的细胞表面表达证 明，新鲜制备的正常肝细胞不表达可检测水平的细胞表面DR5(图 11b，左上图)。在冻藏或置于短期培养的正常人肝细胞上也没有检测 到细胞表面DR5。相反，新鲜分离的肝细胞癌细胞以及HepG2细胞表 达细胞表面DR5。用Fas作为比较，所述正常肝细胞、肝细胞癌细胞 和HepG2细胞都表达相同水平的Fas(图11b，下图)。这些结果与用 原位免疫组织化学和蛋白质印迹获得的结果一致，表明细胞表面DR5 在癌性肝细胞中高度表达，而不在正常肝细胞中表达。通过RT-PCR 证明23，在人肝细胞中存在DR4、DR5、DcR1和DcR2的mRNA水平，提 示人肝细胞可能表达非常低水平的DR5蛋白，其表达水平低于通过 TRA-8检测的阈值。
为了确定TRA-8是否诱导肝细胞毒性，检查了正常人肝细胞对 TRA-8诱导的细胞凋亡以及对可溶性TRAIL加交联剂诱导的细胞凋亡 的敏感性。当将正常肝细胞在存在高浓度TRAIL的情况下培养时，通 过ATPLite测定(图12a)和MTT测定，观测到细胞存活力的时间依赖 性降低。TRAIL介导的正常肝细胞的细胞死亡可以在早至加入TRAIL 后4小时观察到。在24小时培养结束时，超过80％的肝细胞被TRAIL 杀死。相反，在同样的培养期中，TRA-8在正常肝细胞中不诱导显著 的细胞死亡。被Hoechst染色的固缩核(细胞凋亡的特征)在TRAIL处 理的肝细胞中增加，而在TRA-8处理的肝细胞中不增加(图12b)。凋 亡的肝细胞数目与通过ATPLite测定测量的细胞存活力降低很好地相 关，提示TRAIL诱导的肝细胞的细胞死亡是通过细胞凋亡介导的。Z- VAD能够抑制TRAIL介导的对肝细胞的毒性证实了这一点。因为放线 菌酮是一种有效的细胞凋亡增强剂，所以研究了这种化合物对TRAIL 和TRA-8处理的肝细胞的效应。在4小时培养期间，放线菌酮显著增 强TRAIL诱导的肝细胞的细胞死亡，超过70％的肝细胞在放线菌酮存 在下被TRAIL杀死(图12c)。然而，放线菌酮处理不能增强肝细胞中 TRA-8介导的细胞死亡。为了比较肝细胞中TRA-8诱导的细胞凋亡与 用TRAIL诱导的细胞凋亡的特征，将正常肝细胞以及癌细胞与可变浓 度的可溶性TRAIL加交联剂或者TRA-8一起孵育。在6小时培养期间， TRAIL在正常肝细胞中诱导中等的细胞凋亡应答。在500ng/ml TRAIL 存在下，超过20％的肝细胞被杀死(图12d，左上图)。用TRA-8处理 正常肝细胞在同样培养期并不诱发任何显著的细胞死亡。与正常肝细 胞相反，原代肝细胞癌细胞(图12d，上部中间图)和HepG2细胞(图 12d，右上图)对TRAIL或TRA-8介导的细胞凋亡高度敏感。超过80％ 的肝细胞癌细胞和接近100％的HepG2细胞在8小时培养期期间被杀 死。这些结果表明，正常肝细胞完全抗TRA-8介导的细胞凋亡，对TRAIL 介导的细胞凋亡的敏感性比肝癌细胞低得多。用Fas配体和抗Fas抗 体(CH-11)，在正常肝细胞、肝细胞癌细胞和HepG2细胞中，对Fas 介导的细胞凋亡的敏感性没有显著差异(图12d，下图)。
比较实施例11B.人膜结合TRAIL在体内诱导肝炎
给8-10周龄雌性B6小鼠静脉注射109pfu的Ad/hTRAIL与等量 的Ad/Tet-on。在接种腺病毒载体后，立即给小鼠在其饮用水中饲喂 不同浓度的四环素。肝损伤采用AST诊断试剂盒(Sigma)通过AST血 清水平来测定。TRAIL的表达通过RNA印迹分析来测定。
为了确定膜结合形式的TRAIL是否在体内诱导肝损伤，构建了编 码全长人TRAIL的重组腺病毒载体(Ad/hTRAIL)，全长人TRAIL的表达 在四环素诱导型启动子的控制之下。给B6小鼠静脉接种Ad/hTRAIL 后24小时，通过RNA印迹分析证明，在肝中观测到剂量依赖形式的 四环素诱导的人TRAIL表达(图13a)。通过再次剂量依赖方式的转氨 酶血清水平的四环素依赖性增加表明，TRAIL的表达水平与肝损伤很 好地相关(图13b)。由于接种腺病毒载体本身可能增加肝细胞对TRAIL 介导的细胞凋亡的敏感性，所以分离出得自接种Ad/TRAIL小鼠的肝 细胞，测试TRAIL介导的细胞死亡。与得自对照小鼠的肝细胞相比， Ad/TRAIL感染的肝细胞的细胞死亡没有显著增加(图13c，左图)。此 外，Ad/TRAIL接种小鼠在静脉注射可溶性人TRAIL后没有表现出肝损 伤增加。因此，得出的结论是，Ad/TRAIL诱导的肝炎是高水平膜形式 的TRAIL表达介导的。肝切片的组织学分析表明，肝细胞的损伤在早 至接种载体后24小时出现(图13d)，并且持续至少7天(图13e)。肝 中的这些病理学改变也是四环素依赖性的，并且以剂量依赖方式发 生。在TRAIL诱导的肝损伤的治疗早期即24小时之内的特征为坏死 病灶。在这一时期没有观察到炎性细胞的浸润，但发生了出血。到接 种后第7天时，弥散的肝损伤清晰可见，肝小叶结构明显紊乱、肝细 胞严重变性，出现不规则凝聚的胞质和大的透明空间，并且有显著的 细胞凋亡和坏死。单核细胞的广泛浸润是这一时期的特征性特征。这 些结果表明，膜结合形式的人TRAIL能够在体内诱导肝损伤。尽管人 TRAIL在小鼠中倾向于引起严重的肝炎，但并不诱导致死性反应。相 反，接种编码Fas配体的相似的四环素控制型载体的小鼠发生暴发性 肝炎，肝细胞大量凋亡和坏死，并伴有严重出血并且死亡率在接种72 小时内以四环素剂量依赖性地发生。在接受3mg/ml或更高剂量的四 环素的那些亚组中，在48小时内死亡率达到100％。相反，所有接受 Ad/hTRAIL的小鼠无论接受何种剂量的四环素，在接种后4周仍存活。 因此，由此得出，膜结合形式的TRAIL在体内是一种效力低于Fas配 体的肝细胞损伤诱导剂。它们还提示，TRAIL可能通过与作为Fas配 体毒性基础的机制不同的机制诱导肝损伤。
实施例12.活化人T细胞和B细胞表达水平增加的DR5
为了确定DR5是否在TRAIL介导的活化T细胞和B细胞凋亡中起 作用，用TRA-8检查静息和活化T细胞和B细胞上DR5的表面表达。 PBMC中未经刺激的人T细胞不表达显著水平的DR5(图14)。用抗CD3 或Con-A刺激后48小时，细胞表面DR5表达显著增加。同样，未经 刺激的B细胞表达非常低水平的DR5。用抗μ刺激而不用LPS刺激，导 致DR5的细胞表面表达增加。这些结果表明，活化T细胞和B细胞都 表达较高水平的细胞表面DR5。细胞用20μg/ml TRA-8和PE抗小鼠 IgG1染色。
实施例13.活化T细胞和B细胞变得对TRA-8介导的细胞凋亡敏 感
为了确定活化T细胞和B细胞是否对TRA-8介导的细胞凋亡敏感， 人PBMC的T细胞和B细胞分别用抗CD3或抗μ在体外刺激48小时。 通过梯度离心收集活细胞和正增殖的母细胞，将其与各种浓度的TRA- 8一起孵育。未经刺激的T细胞和B细胞对TRA-8介导的细胞凋亡不 敏感(图15)。经完全刺激的T细胞和B细胞显示出对TRA-8介导的细 胞凋亡的敏感性中度增加，培养过夜后，20％细胞被TRA-8杀死。高 度增殖的T母细胞甚至对TRA-8介导的细胞凋亡更为敏感。超过70％ 的T母细胞可能被TRA-8杀死。相比之下，B母细胞也对TRA-8介导 的细胞凋亡更为敏感。这些结果表明，活化T细胞和B细胞对DR5介 导的细胞凋亡敏感。
实施例14.TRA-8使人/SCID小鼠中的活化T细胞耗竭
为了确定TRA-8的体内抗T细胞功效，给NOD/SCID小鼠静脉注 射1×108人PBMC。通常，SCID小鼠体内的人T细胞对异种刺激应答 而被快速活化。从转移当天开始，给所述人PBMC/SCID小鼠腹膜内注 射100μg TRA-8或对照IgG1，重复每日注射，注射3天。转移后5 天，从脾中分离出单核细胞，用抗人CD3抗体染色，通过流式细胞术 分析，门控所述淋巴细胞群体，并且分析CD3阳性人T细胞。用抗人 CD3染色在对照治疗的小鼠中测定，大约30％的脾淋巴细胞是人T细 胞。然而，在TRA-8治疗的小鼠的脾淋巴细胞中，仅观测到少数人细 胞(低于3％)(图16)。原位组织学研究表明，在对照小鼠的脾中，人 T细胞在脾中重新建群，通过TUNEL染色证明，仅观察到少数凋亡的 细胞。相反，在TRA-8治疗的小鼠脾中，没有观察到活的人T细胞重 新建群，而是观察到许多凋亡的细胞(图17)。这些结果证明，TRA-8 在体内具有抗T细胞活性，并且表明可应用本发明的抗体治疗GVH疾 病。
实施例15.TRA-8的抗肿瘤治疗活性
15.1 DR5在人癌组织和细胞系中的表达和功能
i)通过用TRA-8原位染色测定的人癌组织中DR5的表达。为 了确定癌细胞和癌组织是否差别表达较高水平的DR5，用TRA-8将一 组人癌组织染色以供免疫组织化学分析，所述组的癌组织包括超过20 种乳癌、6种卵巢癌、5种结肠癌和5种前列腺癌。这些癌组织中的 大多数表达可检测的DR5。这些癌组织中的DR5表达水平不等。一般 而言，癌组织比非相关组织表达更高水平的DR5。另外，DR5表达显 然与p53突变无关。
ii)DR5在人癌细胞系中的表达和功能(表2).检查了9 种人乳癌细胞系、3种卵巢癌系、3种结肠癌系和3种前列腺癌系的DR5 细胞表面表达以及在体外对TRA-8诱导的细胞凋亡的敏感性。9种乳 癌系中的7种、3种卵巢癌系中的3种、3种结肠癌系中的3种和3 种前列腺癌系中的3种表达可变水平的细胞表面DR5。在9种乳癌系 中，3种对TRA-8介导的细胞凋亡非常敏感，3种中度敏感，3种抗TRA-8 介导的细胞凋亡。所有3种卵巢癌系都非常敏感。3种结肠癌系中的 1种非常敏感，而2种具有中度敏感性。3种前列腺癌系中的2种具 有中度敏感性，而1种为抗性。
表2.DR5在人癌细胞中的表达和功能 细胞系 来源 表达1 敏感性2 2LMP 乳腺 + ++++ LCC6 乳腺 +++ ++++ MB468 乳腺 +++ +++ MB231 乳腺 ++ +++ ZR-75-1 乳腺 +++ ++ SKBR3 乳腺 + ++ MB453 乳腺 ++ + BT474 乳腺 + - DY36T2 乳腺 - - Caov-3 卵巢 + ++++ OVCAR-3 卵巢 ++ ++++ Skov-3 卵巢 + +++ WiDR 结肠 +++ ++++ HST29 结肠 ++ +++ T84 结肠 + ++ PC3 前列腺 +++ ++ LnCap 前列腺 +++ + Du-145 前列腺 +++ +
注释：1通过流式细胞术测定，细胞用20μg/ml TRA-8染色，与对照 抗体进行比较。2通过ATPLite测定来测量。++++：超过80％被杀死， +++：60-80％被杀死，++：40-60％被杀死，+：20-40％被杀死，-无杀伤。
iii)TRA-8和阿霉素的联合细胞毒性。在几个乳癌系 中，检查阿霉素对TRA-8诱导的细胞凋亡的影响。高剂量的阿霉素表 现出相加效应。然而，在某些TRA-8抗性系中，低剂量的阿霉素协同 增强TRA-8诱导的细胞凋亡。
iv)TRA-8对人癌细胞的体外和体内结合活性。使用放射性 同位素标记的TRA-8。在体外以及在植入肿瘤的SCID小鼠体内检查了 TRA-8对乳癌系的结合活性。对癌细胞体外结合活性估计为：Kd数值 为3nM，这与我们先前用ELISA进行的估计一致，所述活性至少是可 溶性TRAIL的50倍。在体内，TRA-8局限于植入的肿瘤组织。
15.2用TRA-8治疗NOD/SCID小鼠的慢性溶淋巴细胞性白血病
慢性溶淋巴细胞性白血病(CLL)是一种常见形式的B细胞恶性肿 瘤。CLL中的大多数恶性B细胞具有成熟表型，并且抗许多细胞凋亡 刺激。检查5位CLL患者的B细胞中DR5的表达和功能。所有患者的 外周B细胞计数都高，正如在PBMC中有超过95％的CD19+B细胞所示 的。与正常原代B细胞相比，所有患者的CLL B细胞的细胞表面DR5 水平都较高，并且在体外对TRA-8诱导的细胞凋亡更为敏感。有趣的 是，CLL B细胞也对双吲哚基马来酰亚胺VIII(BisVIII)诱导的细胞 毒性敏感。在用TRA-8和BisVIII联合治疗后，接近50％的CLL B细 胞被杀死，而正常B细胞保持无反应(图18)。将CLL B细胞转移到 NOD/SCID小鼠体内，导致在转移后5天约25-30％CD19+B细胞在受 体小鼠的脾中重新建群。然而，三剂100μg TRA-8治疗完全消除了 受体SCID小鼠脾中5位患者中的4位患者的CLL B细胞。因此，单 独的TRA-8或者TRA-8与其它物质联合作为用于慢性溶淋巴细胞性白 血病的治疗剂是有效的。
实施例16.cDNA克隆
(1)TRA-8重链和轻链N末端氨基酸序列的测定
为了获得TRA-8重链和轻链的cDNA，用已知技术测定TRA-8的重 链和轻链的N末端氨基酸序列以及克隆化TRA-8基因的N末端氨基酸 序列。
将10μg含有抗人DR5抗体TRA-8的溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(“SDS-PAGE”)，所用的凝胶浓度为12％w/v，100V恒定电压， 电泳120分钟。电泳后，将凝胶浸入转移缓冲液25mM Tris-HCl(pH 9.5)、20％甲醇、0.02％v/v SDS中达5分钟。此后，用印迹装置(KS- 8451；Marysol)，在10V恒定电压、4℃条件下，将凝胶的蛋白质内 容物转移至在转移缓冲液中预浸泡的聚偏二氟乙烯膜(“PVDF膜”；孔 径0.45μm；Millipore，Japan)上达14小时。
此后，PVDF膜用洗涤缓冲液25mM NaCl、10mM硼酸钠缓冲液(pH 8.0)洗涤，然后在染色液(50％v/v甲醇、20％v/v乙酸和0.05％w/v 考马斯亮蓝)中染色5分钟，以定位蛋白质条带。然后PVDF膜用90％v/v 甲醇水溶液脱色，将先前位于PVDF膜上对应于重链的条带即迁移率 较低的条带、和对应于轻链的条带即迁移率较高的条带切下，用去离 子水洗涤。
用气相蛋白质测序仪(PPSQ-10；Shimadzu Seisakusyo，K.K.)， 通过Edman自动化法(Edman，P.等，(1967)，Eur.J.Biochem.，1， 80)，测定重链和轻链的N末端氨基酸序列。
对应于重链的条带的N末端氨基酸序列测定为：
Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-
Gly-Ser-Leu-Lys-Leu(序列表中的SEQ ID No.4)；
而对应于轻链的条带的N末端氨基酸序列测定为：
Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-
Gly-Asp-Arg-Val-Ser(序列表中的SEQ ID No.5)。
将这些氨基酸序列与Kabat等产生的抗体的氨基酸序列的数据库 (Kabat E.A.等，(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol.II，”U.S.Department of Health and Human Services) 的比较揭示，TRA-8的重链(γ1链)和轻链(κ链)分别属于亚型3d和亚 型1。
(2)cDNA克隆
根据上述发现，合成寡核苷酸引物，所述寡核苷酸预期与属于这 些小鼠亚型的基因的5’非翻译区和3’翻译区的真正末端(very ends) 的部分杂交。然后，通过以下逆转录和PCR的组合(RT-PCR)，克隆编 码TRA-8重链和轻链的cDNA：
a)模板
用TRIzol试剂(GIBCO BRL)提取TRA-8杂交瘤(ATCC No.PTA-1428) 的总RNA。用于PCR反应的模板利用通过采用第一链cDNA合成试剂盒 (Amersham Pharmacia Biotech)按照试剂盒中提供的说明手册获得的 cDNA。
b)PCR引物
合成以下PCR寡核苷酸引物：
5’-cagcactgaa cacggacccc-3’(H5NCS1：序列表中的SEQ ID No.6)；
5’-aaaggtaatt tattgagaag-3’(H5NCS2：序列表中的SEQ ID No.7)；
5’-cctcaccatg aacttcgggc-3’(H5SS1：序列表中的SEQ ID No.8)；
5’-ctgttgtatg cacatgagac-3’(H5SS2：序列表中的SEQ ID No.9)；
5’-gaagtgatgc tggtggagtc-3’(H5CS1：序列表中的SEQ ID No.10)；
5’-agtgtgaagt gatgctggtg-3’(H5CS2：序列表中的SEQ ID No.11)；
5’-tttaccagga gagtgggaga g-3’(H3CR：序列表中的SEQ ID No.12)；
5’-tgcagagaca gtgaccagag-3’(H3VR：序列表中的SEQ ID No.13)；
5’-tgttcaggac cagcatgggc-3’(L5NCS1：序列表中的SEQ ID No.14)；
5’-aagacatttt ggattctaac-3’(L5NCS2：序列表中的SEQ ID No.15)；
5’-tatcatgaag tctttgtatg-3’(L5SS1：序列表中的SEQ ID No.16)；
5’-gatggagaca cattctcagg-3’(L5SS2：序列表中的SEQ ID No.17)；
5’-gacattgtga tgacccagtc-3’(L5CS：序列表中的SEQ ID No.18)；
5’-ttaacactca ttcctgttga-3’(L3CR：序列表中的SEQ ID No.19)；
5’-gactgggtca tcacaatgtc-3’(LCSR：序列表中的SEQ ID No.20)。
除非另有说明，否则这些实施例中的所有寡核苷酸都由Pharmacia Biotech合成。所有寡核苷酸在溶于蒸馏水后贮存于-20℃。
c)PCR反应
PCR反应溶液的组成：
模板cDNA，总共33μl反应物中的5μl
引物1，10pmol；
引物2，10pmol；
10×浓缩PCR缓冲液(试剂盒中提供的)，10μl；
dNTPs(各2.5mM)，4μl；和
Taq聚合酶(Promega)，5单位。
将无菌蒸馏水加入到溶液中至100μl的总体积。除非另有说明， 否则dNTPs为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的等摩尔混合物(每种2.5mM)。
如下进行PCR反应。首先将溶液于94℃加热2分钟，此后将加热 至94℃30秒、52℃1分钟和72℃3分钟的循环重复40次。完成该程 序后，将反应溶液于72℃加热10分钟。
如此获得的扩增DNA片段在含有0.25μg/ml溴化乙锭的1％琼脂 糖凝胶上分离。用剃刀刀片将确定含有所需DNA片段的条带切下，用 Gene Clean试剂盒(BIO101)从中回收所述DNA。用pGEM-T Easy载体 (Promega)克隆所述DNA片段。这一步如下进行。
将从PCR反应溶液中回收的DNA片段同50ng pGEM-T Easy载体(试 剂盒中提供的)一起，与其中加有4单位T4 DNA连接酶(1μl)的1μl 10 ×连接酶反应缓冲液(6mM Tris-HCl(pH7.5)、6mM氯化镁、5mM 氯化钠、7mMβ-巯基乙醇、0.1mM ATP、2mM DTT、1mM亚精胺和0.1 mg/ml牛血清白蛋白)混合。用无菌去离子水将混合物的总体积调至10 μl，将所得的连接酶溶液于14℃孵育15小时。此后，将2μl连接酶 反应溶液加入到其中加入2μl 0.5Mβ-巯基乙醇的50μl感受态大肠 杆菌菌株JM109(由所述试剂盒提供，并且按照说明手册使其成为感 受态)，将所得混合物在冰上保持30分钟，然后于42℃保持30秒， 再于冰上保持5分钟。接着，将500μl含有2％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v 酵母膏、0.05％w/v氯化钠、2.5mM氯化钾、1mM氯化镁和20mM葡 萄糖的培养基(在下文称为“SOC”培养基)加入到培养物中，将混合 物于37℃振荡孵育1小时。此后，将培养物涂布到含有100μg/ml氨 苄青霉素的L-内汤琼脂平板(1％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.5％ w/v氯化钠、0.1％w/v葡萄糖和0.6％w/v细菌培养用琼脂(Difco))上。 选择在平板上出现的氨苄青霉素抗性菌落，用铂接种环将其刮下，在 含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤培养基中于37℃下以200r.p.m. 振荡培养过夜。培养后，通过离心收获细胞，用碱法从中制备质粒DNA。 将所得的质粒对于TRA-8重链命名为质粒pH62，或者对于TRA-8轻链 命名为pL28。带有这些质粒的转化大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌(E. coli)JM109/pH62和大肠杆菌JM109/pL28，该菌株按照关于微生物保 藏的布达佩斯条约，于2001年4月20日保藏于国际专利生物保藏机 构-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，记录的保藏号分别为 FERM BP-7560和FERM BP-7561。通过双脱氧法(Sanger，F.S.等，(1977)， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467)，用3700DNA分析仪(ABI PRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，证实了编码TRA-8 重链和轻链的这些DNA的核苷酸序列。
TRA-8重链和轻链的核苷酸序列分别以序列表中的SEQ ID No.21 和SEQ ID No.22给出。TRA-8重链和轻链的氨基酸序列分别以序列 表中的SEQ ID No.23和SEQ ID No.24给出。以上确立的TRA-8重 链和轻链的N末端氨基酸序列完全匹配。此外，当将所述重链和轻链 的氨基酸序列与抗体的氨基酸序列数据库进行比较时，确定对于重 链，SEQ ID No.21中的核苷酸编号58-414构成可变区，而SEQ ID No. 21中的核苷酸编号415-1392构成恒定区。对于轻链，SEQ ID No.22 中的核苷酸编号64-387构成可变区，而SEQ ID No.22中的核苷酸编 号388-702构成恒定区。CDR的位置和序列通过比较与数据库的同源 性也得以阐明。TRA-8重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别 示于SEQ ID No.25、SEQ ID No.26和SEQ ID No.27中。TRA-8轻 链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID No.28、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30中。
实施例17.设计TRA-8抗体人源化形式
(1)TRA-8可变区的分子建模
采用一般称为同源性建模的方法(Methods in Enzymology，203， 121-153，(1991))，进行TRA-8可变区的分子建模。将登录于蛋白质 数据库(Protein Data Bank)人免疫球蛋白可变区的一级序列(Nuc. Acid Res.28，235-242(2000))(可得到根据X射线晶体学得出的三 维结构)与以上确定的TRA-8构架区进行比较。结果，1NCD和1HIL被 选择为分别与TRA-8的轻链和重链的构架区具有最高序列同源性。通 过将对应于TRA-8轻链和重链的1NCD和1HIL的坐标组合，产生构架 区的三维结构，以获得“构架模型”。采用Chothia等确定的分类法， TRA-8的CDR的类别确定如下：CDRL1、CDRL2、CDRH1和CDRH2分别属于 典型的类别2、1、1、3，而CDRL3不属于任何具体的典型类别。将CDRL1、 CDRL2、CDRH1和CDRH2的CDR环固定为其相应典型类别固有的构象，并 整合到所述构架模型中。按照Thornton等的分类法(J.Mol.Bio1.，263， 800-815，(1996))，CDRL3被赋予簇8A构象；采用H3规则(H3rule)(FEBS letter 455，188-197(1999))，CDRH3被分类为k(8)C。然后将CDRL3 和CDRH3的相应构象整合到所述构架模型中。
最后，进行能量计算，以消除不利的原子间接触，以便获得就能 量而论可能的TRA-8可变区的分子模型。用市售的常用分子建模系统 ABM(Oxford Molecular Limited，Inc.)进行上述程序。对于所获得 的分子模型，用软件PROCHECK(J.Appl.Cryst.(1993)，26，283- 291)进一步评价所述结构的准确性。
(2)设计人源化TRA-8的氨基酸序列
通过一般称为CDR移植的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86， 10029-10033(1989))进行人源化TRA-8抗体的构建。受体抗体的选择 基于构架区的氨基酸同源性。将TRA-8中构架区的序列与抗体氨基酸 序列的Kabat数据库(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))中的所有 人构架序列进行比较。结果，mAB58’CL抗体被选择为受体，因为构架 区的序列同源性最高，为80％。将mAb58’CL构架区的氨基酸残基与TRA-8 构架区的氨基酸残基进行比对，鉴定出其中使用不同氨基酸的位置。 用以上构建的TRA-8的三维模型分析那些残基的位置，根据Queen等 给出的标准(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))， 选择应该移植到受体上的供体残基。如以下实施例中所述，通过将若 干供体残基转移到受体抗体mAb8’CL中，构建人源化TRA-8序列。
实施例18.所述人源化抗体重链的表达载体的构建
(1)携带人源化TRA-8重链可变区DNA的质粒的构建
为了测定人源化TRA-8的活性，如下构建携带人源化TRA-8重链 的质粒。然而，应该认识到TRA-8的人源化不限于这些实施例。
如序列表的SEQ ID No.31中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8重 链氨基酸序列的人源化，需要分别用谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、甘 氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代第 13号氨基酸(赖氨酸)、第19号氨基酸(赖氨酸)、第40号氨基酸(苏 氨酸)、第42号氨基酸(谷氨酸)、第44号氨基酸(精氨酸)、第84号 氨基酸(丝氨酸)、第88号氨基酸(丝氨酸)、第93号氨基酸(甲硫氨 酸)、第114号氨基酸(苏氨酸)、第115号氨基酸(亮氨酸)。
如下构建携带编码人源化TRA-8重链可变区的DNA(序列表的SEQ ID No.31)的质粒。
用PCR构建以下DNA序列，每种序列的构成描述如上：
合成以下12种寡核苷酸：
5’-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag
caacagctac aggtgtccac -3’(A；SEQ ID No.32)；
5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga
ctctcctgtg cagcctctgg -3’(B；SEQ ID No.33)；
5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga
gtgggttgca accattagta -3’(C；SEQ ID No.34)；
5’-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag
acaatgccaa gaacaccctg -3’(D；SEQ ID No.35)；
5’-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg
ggtgactcta tgattacgac -3’(E；SEQ ID No.36)；
5’-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat
cggtc -3’(F；SEQ ID No.37)；
5’-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3’
(G；SEQ ID No.38)；
5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga
gtggacacct gtagctgttg -3’(H；SEQ ID No.39)；
5’-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat
ccagaggctg cacaggagag -3’(I；SEQ ID No.40)；
5’-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac
tactaatggt tgcaacccac -3’(J；SEQ ID No.41)；
5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata
cagggtgttc ttggcattgt -3’(K；SEQ ID No.42)；
5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta
gtccgtcgta atcatagagt cacc -3’(L；SEQ ID No.43).
按上文所述合成以下两种PCR引物：
5’-ttggataagc ttggcttgac -3’(P1；SEQ ID No.44)；
5’-gaccgatggg cccttggtgg a -3’(P2；SEQ ID No.45).
分别用一种组合的PCR，进行编码多肽链的DNA的合成，所述多 肽链包含一个分泌信号序列、一个人源化TRA-8重链可变区和位于 IgG-CHl区N末端的8个氨基酸残基。
如下制备所述DNA片段。
所述PCR反应溶液的组成：
寡核苷酸A，10pmol；
寡核苷酸B，10pmol；
寡核苷酸C，10pmol；
寡核苷酸D，10pmol；
寡核苷酸E，10pmol；
寡核苷酸F，10pmol；
寡核苷酸G，10pmol；
寡核苷酸H，10pmol；
寡核苷酸I，10pmol；
寡核苷酸J，10pmol；
寡核苷酸K，10pmol；
寡核苷酸L，10pmol；
寡核苷酸引物P1，2μM；
寡核苷酸引物P2，2μM；
10×Pyrobest缓冲液II，10μl；
dNTP混合物，8μl；
Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和
重蒸水至终体积50μl。
PCR反应如下进行。首先将溶液于94℃加热5分钟，然后将加热 至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环重复7次。在完成该程 序后，将反应溶液于72℃加热15分钟。
将等体积的苯酚-氯仿(50％v/v用水饱和的苯酚、48％v/v氯仿、 2％v/v异戊醇)加至200μl的每种PCR产物中，剧烈混合1分钟。此 后，将混合物以10,000×g离心，回收水层，将其与等体积的氯仿- 异戊醇(96％v/v氯仿和4％v/v异戊醇)混合，将其再次剧烈混合并以 10,000×g离心，回收水层。在本段落中引述的系列步骤称为“酚抽 提”。
然后对回收的水层进行乙醇沉淀。本文所用和提及的“乙醇沉淀” 包括将十分之一体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的100％乙醇 加入到待处理溶液中并将其混合，用干冰冷冻所述混合物。然后所得 的混合物以10,000×g离心，以回收作为沉淀的DNA。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，将所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最 小量的重蒸水中，并且通过3％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，凝胶用 1μg/ml溴化乙锭水溶液染色，使得可以在紫外线下检测DNA。用剃 刀刀片切下对应于人源化TRA-8 DNA的DNA条带，用Geneclean Spin 试剂盒(BIO 101，CA，USA)从凝胶中洗脱。在酚抽提后，通过以7,500 ×g离心，然后进行乙醇沉淀，将洗脱的DNA浓缩，最后溶于5μl蒸 馏水中。
用pGEM-T Easy载体(Promega)，将所得的每种提取DNA如下克隆：
从所述PCR反应中回收的DNA片段，5μl；
10×Taq聚合酶缓冲液，1μl；
dNTP混合物，1μl；
Taq聚合酶(5单位/ml)，1μl；和
重蒸水至终体积10μl。
在上述每种溶液于70℃反应30分钟后，用DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit)Version 2.0(Takara Shuzo Co.，Ltd)，使用生产商 的方案，连接每种DNA溶液和pGEM-T Easy载体。
在于15℃孵育4小时后，将2μl经孵育的反应溶液与细胞密度 为1-2×109细胞/ml的100μl感受态大肠杆菌菌株JM109(Takara Shuzo Co.，Ltd.)混合，将混合物在冰上保持30分钟，然后于42℃ 保持30秒，再次在冰上保持1分钟。然后，将500μl SOC培养基(2％ v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.05％w/v氯化钠、2.5mM w/v氯 化钾、1mM氯化镁和20mM葡萄糖)加入到混合物中，将其再振荡孵 育1小时。然后分离转化菌株，如“Molecular Cloning A Laboratory Manual”中所述，从菌株中制备质粒DNA。通过双脱氧法(Sanger，F.S. 等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467)，用3700DNA 分析仪(ABI PRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，证 实编码人源化TRA-8重链的这些DNA的核苷酸序列。
所得质粒命名为pHB14(携带编码人源化TRA-8重链的cDNA的质 粒)。带有这些质粒的转化大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌 JM109/pHB14，该菌株按照关于微生物保藏的布达佩斯条约，于2001 年4月20日保藏于国际专利生物保藏机构-独立行政法人产业技术 综合研究所(Nationaa Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken， 305-5466，Japan，记录的保藏号为FERM BP-7556。
(2)携带人源化TRA-8重链可变区DNA的表达质粒的构建
如下通过插入编码人源化TRA-8重链的DNA(在上述克隆的)，构 建用于动物细胞的重组表达载体。
1μg用于哺乳动物细胞的表达载体-携带人源化抗Fas单克隆抗 体HFE7A重链可变区和人IgG1恒定区基因组DNA的质粒pSRHHH3(欧 洲专利申请EP 0-909-816-A1)用限制性酶HindIII和ApaI消化，通 过3％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭水溶液 染色，使得可以在紫外线下检测DNA。用剃刀刀片切下含有人IgG1恒 定区基因组DNA但无人源化HFE7A重链可变区的载体DNA条带，用 Geneclean Spin试剂盒(BIO 101，CA，USA)从凝胶中洗脱。在酚抽提 后，通过以7,500×g离心，然后进行乙醇沉淀，将洗脱的DNA浓缩， 最后溶于5μl蒸馏水中，然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒 Version 2.0(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，将所得的经消化的去磷酸 化质粒(100ng)与1μg也用HindIII和ApaI消化的含有编码人源化 TRA-8重链可变区的DNA的pHB14 DNA片段连接。然后用连接混合物 转化大肠杆菌JM109，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平 板上铺平板。
将用该方法获得的转化子在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液 体LB培养基中于37℃培养过夜，随后用碱-SDS法从所得的培养物中 提取质粒DNA。
所提取的质粒DNA用HindIII和ApaI消化，经过3％w/v琼脂糖 凝胶电泳，以证实编码人源化TRA-8重链可变区的DNA的插入片段存 在或不存在。用基因序列分析仪(ABI Prism 3700 DNA Analyzer； Applied Biosystems)，通过DNA测序证实所需DNA片段在所述载体中 的插入和方向。所得的携带编码人源化TRA-8重链的cDNA的表达质 粒命名为pHB14-1。
实施例19.所述人源化抗体轻链的表达载体的构建
(1)用于人源化形式的TRA-8抗体轻链的载体的构建
如序列表的SEQ ID No.46中所示，在使小鼠抗人DR5抗体TRA- 8的轻链氨基酸序列人源化时，分别用脯氨酸、丝氨酸、丝氨酸、亮 氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸、 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和 苏氨酸取代TRA-8轻链氨基酸序列N末端的第8号氨基酸(组氨酸)、 第9号氨基酸(赖氨酸)、第10号氨基酸(苯丙氨酸)、第11号氨基酸 (甲硫氨酸)、第13号氨基酸(苏氨酸)、第20号氨基酸(丝氨酸)、第 42号氨基酸(谷氨酰胺)、第43号氨基酸(丝氨酸)、第60号氨基酸(天 冬氨酸)、第63号氨基酸(苏氨酸)、第77号氨基酸(天冬酰胺)、第78 号氨基酸(缬氨酸)、第80号氨基酸(丝氨酸)、第83号氨基酸(亮氨 酸)、第85号氨基酸(天冬氨酸)、第87号氨基酸(苯丙氨酸)和第99 号氨基酸(甘氨酸)、第103号氨基酸(亮氨酸)和第108号氨基酸(丙 氨酸)。所得的序列命名为LM2。
如下构建携带抗人DR5抗体TRA-8的这种类型人源化轻链氨基酸 序列的表达质粒。
1)用于制备人源化TRA-8轻链可变区和恒定区的引物的合 成
采用各种组合的PCR，分别合成编码LM2多肽链(序列表中的SEQ ID No.46)的DNA，其中每种都是人源化抗DR5抗体TRA-8轻链可变区和 人Ig轻链(κ链)恒定区的融合体。
此外对于7AL1P(SEQ ID No.47)和7ALCN(SEQ ID No.48)，合 成用于PCR的以下寡核苷酸引物：
5’-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga
-3’(HKSPR11；SEQ ID No.49)；
5’-ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc -3’
(HKCDF11；SEQ ID No.50)；
5’-agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg -3’
(HKCDR12；SEQ ID No.51)；
5’-tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt -3’
(HKCDF22；SEQ ID No.52)；
5’-ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat
ggt -3’(HKCDR22；SEQ ID No.53)；
5’-cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact
gtg -3’(HKCF12；SEQ ID No.54).
2)质粒pCR3.1/M2-1的构建(人源化TRA-8轻链的克隆)
通过进行两步PCR，制备序列表的SEQ ID No.55中限定的、编 码序列表的SEQ ID No.46中限定的氨基酸序列的LM2-DNA片段，将 其插入到质粒载体中，并且在大肠杆菌中克隆。
a)第一步PCR
在以下条件下制备LM2-F1-DNA片段，该片段编码一个分泌信号 序列和FRL1区的一部分，并且在5’端加入一个Hind III限制性酶切 位点。模板质粒pHSGHM17和pSRPDHH通过采用欧洲专利申请EP 0 909 816 A1中描述的方法获得。
反应溶液的组成：
质粒pHSGHM17 DNA(欧洲专利申请EP 0 909 816 A1)，25ng
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物HKSPR11，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶(PerkinElmer)，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码FRL1的一部分、CDRL1、FRL2和CDRL2的 LM2-F2-DNA片段。
反应溶液的组成：
质粒pL28 DNA，25ng
寡核苷酸引物HKCDF11，50pmol
寡核苷酸引物HKCDR12，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码CDRL2、FRL3和CDRL3一部分的LM2-F3-DNA 片段。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA(欧洲专利申请EP 0 909 816 A1)，25ng
寡核苷酸引物HKCDF22，50pmol
寡核苷酸引物HKCDR22，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码CDRL3、FRL4和恒定区且在3’端加入一个 EcoR I限制性酶切位点的LM2-F4-DNA片段。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA，25ng
寡核苷酸引物HKCF12，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在PCR后，扩增的DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电 泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭染色，以在紫外线下检测所产生的DNA。 用剃刀刀片切下如此检测出的相应DNA条带。
b)第二步PCR
在以下条件下制备其中上述LM2-F1-DNA、LM2-F2-DNA、LM2-F3-DNA 和LM2-F4-DNA片段融合的LM2-DNA。
反应溶液的组成：
在第一步PCR中制备的LM2-F1-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM2-F2-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM2-F3-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM2-F4-DNA凝胶片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5.0μl
10×PCR缓冲液，5.0μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
用真核TA克隆试剂盒(Invitrogen)，按照生产商的方案，将如 此制备的LM2-DNA片段插入到质粒pCR3.1DNA中，将其导入试剂盒中 含有的感受态大肠杆菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析仪(ABI PRISM； Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通过双脱氧法(Sanger，F. S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467)，证实 编码人源化TRA-8轻链的这些DNA的核苷酸序列。
所得的质粒命名为pCR3.1/M2-1(携带编码人源化TRA-8轻链可 变区和人Ig轻链恒定区的cDNA的质粒)。
所获得的含有LM2-DNA的质粒pCR3.1/M2-1用限制性酶Hind III 和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化， 然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III 和EcoR I消化的LM2-DNA片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α， 涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(终浓度)的 LB琼脂培养基上。获得的白色转化子在含有50μg/ml氯霉素的液体 LB培养基中培养，按照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。 所提取的质粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通过1％琼脂糖凝 胶电泳选择出一个携带LM2-DNA片段的克隆。
作为上述程序的结果，获得携带人源化LM2 TRA-8轻链可变区和 人Igκ链恒定区的融合片段的质粒pHSG/M2-1-4。带有这些质粒的转 化大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌DH5α/pHSG/M2-1-4，该菌株按照关于 微生物保藏的布达佩斯条约，于2001年4月20日保藏于国际专利生 物保藏机构-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，记录的保藏号 为FERM BP-7563。
3)质粒pSR/M2-1(人源化LM2 TRA-8轻链的表达质粒)的构 建
所获得的携带人源化LM2 TRA-8轻链可变区和人Igκ链恒定区的 融合片段的质粒pHSG/M2-1-4用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pSRPDHH DNA(欧洲专利申请EP 0-909-816-A1)用 限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA连 接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷 酸化pSRPDHH DNA和从pHSG/M2-1-4中获得的Hind III-EcoR I DNA片 段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α，涂布在LB琼脂上。获得 的转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，按 照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。用基因序列分析仪(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通过DNA测序证 实所需DNA片段在pSRPDHH载体中的插入和方向。
所得的携带编码人源化TRA-8轻链的cDNA的表达质粒命名为 pSR/M2-1。
实施例20.人源化抗体的生产
采用FUGENE6转染试剂法(Boehringer Mannheim Biochemica)， 按照试剂盒中提供的说明手册，用以上获得的人源化TRA-8重链和人 源化TRA-8轻链的表达质粒转染COS-7细胞，即得自猴肾的细胞系。
让COS-7细胞(美国典型培养物保藏中心No.CRL-1651)在含有补 充10％胎牛血清(在下文缩写为“FCS”；Moregate)的Dulbecco氏改 进的Eagle培养基(在下文称为“D-MEM”；Gibco BRL)的培养皿(培养 面积：57cm2；Sumitomo Bakelite)中生长至半汇合(3×106细胞/皿)。
同时，将用碱-SDS法制备的10μg/皿(总共5皿)的人源化DR5 重链表达质粒DNA(pHA15-1)和10μg/皿的人源化DR5轻链表达质粒 DNA与氯化铯密度梯度离心物混合，然后用乙醇沉淀，接着悬浮于5μl/ 皿的dH2O中。
在将15μl/皿的FUGENE6转染试剂与180μl/皿无FCS的D-MEM 混合后，将该FUGENE溶液(185μl/皿)与5μl/皿含有10μg/皿人源 化DR5重链表达质粒DNA和10μg/皿人源化DR5轻链表达质粒DNA的 DNA溶液混合。于室温孵育15分钟后，将所得的质粒悬浮液(200μl) 加入到预先制备的COS-7平板上。在5％CO2、37℃下孵育24小时后， 将培养基更换为无FCS的D-MEM。在5％CO2、37℃下孵育72小时后， 回收培养上清液，以纯化上清液中的表达产物。采用如上所述的方法， 用每种以下质粒组合转染COS-7细胞：
(A)：无质粒DNA
(B)：pHB14-1和pSR/M2-1共转染
然后将培养物离心(1,000r.p.m.，5分钟)，收集上清液。将上 清液再次离心(9,800r.p.m.，15分钟)，并用0.45μm滤膜(ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs，Cat # 25CS045 AS)过滤。用G蛋白-POROS亲和 色谱(Applied Biosystems)在以下条件下完成从滤液中纯化IgG：
HPLC：BioCAD 700E(Applied Biosystems)
柱子：G蛋白-ID传感柱(柱尺寸：2.1mmID×30mmLD，床体
积：0.1ml；Cat # 2-1002-00，Applied Biosystems)
洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)
中和缓冲液：1M Tris-HCl(pH8.5)
检测：280nm
流速：1ml/min
流分大小：0.5ml/0.5min
流分收集管：1.5ml聚丙烯微量试管
温度：4℃
在所有滤液上柱后，用30ml PBS(Sigma，Cat # 1000-3)洗涤 柱子。当将洗脱缓冲液上柱后，开动流分收集器。每个流分收集微量 试管预先含有55μl 1M NaCl、110μl中和缓冲液和74μl 2mg/ml 牛血清白蛋白(Sigma，Cat # A-7030)的PBS溶液。收集第8-10号的 流分，用Slide-A-lyzer(Pierce，Cat # 66450)，将其对1升PBS(pH 7.5)于4℃透析1天。更换两次透析缓冲液。
通过ELISA，用针对抗人IgG的抗体，进行所制备的培养上清液 中所述人源化抗体表达的证实以及所述表达产物的定量测定。
向96孔板(MaxiSorp，Nunc)的各孔中，加入100μl以0.5μg/ml 的终浓度溶于吸附缓冲液(0.05M碳酸氢钠，0.02％叠氮化钠，pH9.6) 的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗体(Kappel)，将孔板于37℃孵育2 小时，以使得抗体吸附。然后，所述板用350μl含有0.05％Tween-20 (BioRad)的PBS(-)(在下文称为“PBS-T”)洗涤5次。洗涤后，向各 孔加入用含10％FCS的D-MEM稀释的培养上清液，于37℃孵育2小时。 用PBS-T再次洗涤后，向各孔加入100μl用PBS-T稀释10,000倍的 碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗体(Jackson Immuno Research Lab.)，于37℃孵育2小时。用PBS-T再次洗涤后，按照试 剂盒中提供的说明手册，加入得自碱性磷酸酶底物试剂盒(Alkaline Phosphatase Substrate kit)(Bio Rad)的对硝基苯磷酸底物溶液。 于37℃孵育0.5-1小时后，测量405nm的吸光度。在所述实验中， 使用以含10％FCS的D-MEM稀释至一定浓度的人血浆免疫球蛋白G亚 类1(IgG1)(Biopure AG)作为所述培养上清液中含有的人源化DR5 抗体的浓度参比样品。
结果，用所述抗人IgG抗体特异性地检测培养上清液中的表达产 物和纯化产物。人IgG抗体的量为8.96μg(800μl)。
实施例21.人源化抗体的细胞凋亡诱导活性
用Jurkat细胞(ATCC No.TIB-152)检查纯化的人源化TRA-8抗体 的细胞凋亡诱导活性。
Jurkat细胞在含10％FCS的RPMI1640培养基(Gibco BRL)中在5％ CO2存在下于37℃培养3天，将培养的所述细胞以50μl/孔分配到96 孔微量培养板(Sumitomo Bakelite)的各孔中。通过按照实施例20中 所述的方法估计所述培养液中感兴趣的终产物的浓度，用含10％FCS 的RPMI1640培养基将实施例20中制备的人源化TRA-8调至100ng/ml 的感兴趣的终产物浓度。用每种如此调至100ng/ml的表达产物的溶 液，通过用含10％FCS的PRMI1640重复连续的2倍稀释，产生连续稀 释液。将每种稀释的人源化TRA-8溶液以50μl/孔加入到各孔中。于 37℃反应12小时后，加入50μl含有1mg/ml XTT(2，3-双[2-甲氧 基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎓-5-羧基aniride内盐；Sigma Chemical Co.)的25μM PMS(吩嗪硫酸甲酯；Sigma Chemical Co.)(XTT 的终浓度为250μg/ml，而PMS的终浓度为5μM)。在孵育3小时后， 利用线粒体的还原能力作为指标，测量各孔的450nm吸光度以便计算 细胞存活力。
各孔中细胞的存活力按照以下公式计算：
存活力(％)＝100×(a-b)/(c-b)
其中“a”为试验孔的测量结果，“b”是无细胞孔的测量结果，而“c” 是未加入抗体孔的测量结果。
结果，证明实施例20中制备的表达产物(人源化TRA-8)在表达人 DR5抗原的T淋巴瘤细胞系的细胞中诱导细胞凋亡。
实施例22.TRA-8对各种DR5分子的反应性
为了确定TRA-8对各种DR5分子的反应性，用活化淋巴细胞如下 检查TRA-8的反应性。
首先，从人(30ml)、狨(3ml)和猕猴(20ml)取外周血样品。在 血样中加入1ml肝素(Novoheparin；Novo)，然后将样品缓慢铺在等 体积Ficoll-Paque PLUS溶液((Amersham Pharmacia Biotech.)比重： 1.077，猕猴除外，其比重为1.072)上，以1,700r.p.m.离心30分钟， 以便获得外周血单核细胞部分。这一单核细胞部分用Hank氏平衡盐 溶液洗涤两次，然后悬浮于含10％v/v FCS的RPMI1640培养基中，至 1×106细胞/ml的细胞密度。将植物凝集素-P(PHA-P，Sigma Chemicals， Co.)加入所得的悬浮液中至5μg/ml的终浓度，样品在5％v/v CO2、 37℃下孵育24小时。此后，通过离心回收细胞，用含10％v/v FCS的 RPMI1640培养基洗涤并重悬于该培养基中。然后，为了活化所回收的 细胞，将白介素-2(Amersham Pharmacia Biotech.)加入悬浮液中至 终浓度10单位/ml，将其在5％v/v CO2、37℃下孵育72小时。
将计算含有1×106活化淋巴细胞的量的活化制备物置于试管中， 或者悬浮于50μl含0.5、1、5、10μg/ml TRA-8的PBS中，或者悬 浮于50μl PBS中。让所得的悬浮液在冰上静置1小时，此后细胞用 500μl等份的PBS洗涤3次，然后悬浮于50μl含20μg/ml FITC标 记的抗小鼠IgG抗体(Bioresource)的PBS中。用500μl PBS中悬浮 的所述细胞作为对照，用流式细胞仪(FACSCalibur；Becton Dickinson) 测量荧光强度。
根据荧光强度获得细胞数的分布，计算染色细胞数与总细胞数的 比例。进而用TRA-8浓度和染色细胞数与总细胞数的比率计算每种Kd 值。与人、狨和猕猴的活化淋巴细胞的每种反应性频率几乎是相同的。 因此，TRA-8能够结合各种各样的灵长类DR5，包括最初制备的TRA-8 所针对人DR5。
实施例23.狨体内TRA-8逐步增加剂量的研究
用1只雄性和1只雌性狨进行一项TRA-8的逐步增加剂量的初步 毒性研究。进行三组一次静脉给药，每次间隔7天的停药期。TRA-8 的剂量设定为50、250和1250μg/动物体。每次治疗后48小时，从 股静脉收集血液，制备血浆。用分析仪(FUJI DRI-CHEM：Fuji Film Medical Co.，Ltd.)测量血浆天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶活性。 所有血液的抽取都不用麻醉。结果，没有证据表明，在每次治疗后在 血浆生化检查中注意到有肝损伤。
实施例24.TRA-8对癌细胞的体外和体内药理学研究
为了确定TRA-8是否在抗肿瘤治疗中有治疗功效，用各种癌细胞 系如下检查了TRA-8的体外杀伤活性。
将得自Gibco BRL、在含有10％FCS(Gibco BRL)的RPMI1640培 养基(用于Jurkat)、DMEM培养基(用于HCT-116)、MEM-R(用于WiDr) 或DMEM-F12(用于COL2-Jck)中在5％CO2、37℃下培养的各种癌细胞 (2-8×103细胞/50μl)分配到96孔微量培养板(Sumitomo Bakelite) 的各孔中。用含10％FCS的培养基调节TRA-8，使得感兴趣的终产物 的浓度为100ng/ml。用所述TRA-8溶液(100ng/ml)通过用含10％FCS 的培养基重复连续2倍稀释，产生连续稀释液。将每种稀释的TRA-8 溶液以50μl/孔加入到各孔中，于37℃孵育。于37℃反应72小时后， 加入50μl含有1mg/ml XTT的25μM PMS(吩嗪硫酸甲酯；Sigma Chemical Co.)(XTT的终浓度为250μg/ml，而PMS的终浓度为5μM)。 在孵育3小时后，利用线粒体的还原能力作为指标，测量各孔的450nm 吸光度以计算细胞存活力。
各孔中细胞的存活力按照以下公式计算：
存活力(％)＝100×(a-b)/(c-b)
其中“a”为试验孔的测量结果，“b”是无细胞孔的测量结果，而“c” 是未加入抗体孔的测量结果。
结果示于以下表3中。
表3 细胞 ED50 (μg/ml) Jurkat 0.001-0.01 HCT-116 0.004-0.02 WiDr 0.007-0.03 COL2-Jck 2.8
在体外条件下，TRA-8对各种癌细胞系强诱导细胞凋亡。
此外，测定了TRA-8在移植WiDr细胞的裸鼠中的体内抗肿瘤效 应，因为TRA-8与鼠DR5无交叉反应。
将TRA-8抗人DR5抗体给予带有表达人DR5分子的人类异种移植 物的裸鼠。所用的小鼠是6周龄BALb/c nude/nude小鼠(雌性，得自 Clea Japan Inc.)，它们移植有人结肠癌细胞系WiDr(5mm3)。在肿 瘤移植后1天，这些移植的小鼠每日通过关节内注射TRA-8(5μg/动 物体)治疗14次。根据肿瘤块的大小每日测量WiDr肿瘤的生长。结 果示于以下表4中。
表4 8天 11天 15天 18天 22天 25天 对照 (PBS) SD TRA-8 SD 196 249 469 584 833 1193 ±55 ±77 ±149 ±230 ±274 ±419 158 97 155 195 365 530 ±78 ±30 ±60 ±58 ±91 ±135
在该模型中，通过肿瘤的大小证明，所有未经治疗的动物表现出 可见的肿瘤生长，而在TRA-8治疗的动物中肿瘤的生长受到抑制。这 一结果表明，TRA-8在体内肿瘤细胞消除方面有效。
实施例25.TRA-8的联合研究
人前列腺癌细胞系PC-3得自美国组织培养物保藏中心(ATCC)， 并且在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)、1％L-谷氨酰胺-200mM (25030-149，Gibco BRL)和0.5％青霉素链霉素溶液(Penicillin Streptomycin Solution)(P-7539，Sigma)的F-12K营养混合物 (Nutrient Mixture)(21127-022，Gibco BRL)中维持。在以下实验中 使用补充10％FBS和0.5％青霉素链霉素溶液的RPMI1640培养基(MED- 008，IWAKI)。通过胰蛋白酶处理收集指数生长的PC-3细胞，用新鲜 培养基洗涤2次。然后在实验开始之前1天对细胞计数，将其以5×104 细胞/ml的密度重悬于新鲜培养基中，以三份重复分配到平底96孔板 (3598，Corning-Coster)中，总体积为100μl/孔。将溶于二甲基亚 砜的典型抗肿瘤药紫杉醇(Paclitaxel)(169-18611，Wako)(10mg/ml) 在新鲜培养基中稀释，然后以50μl/孔加入到含有细胞的96孔板中。 二甲基亚砜的终浓度低于0.1％。在37℃、5％CO2环境下孵育24小时 后，向各孔中加入在新鲜培养基中稀释的TRA-8。再孵育24小时后， 向各孔中加入50μl含有1mg/ml XTT和25mM PMS的极限必需培养 基(11095-098，Gibco BRL)中，将板孵育6小时。然后用SPECTRA MAX 250(Molecular Devices)测量OD450，并如下计算细胞存活力。
细胞存活力(％)＝(含用紫杉醇(Taxol)和/TRA-8(药物)处理的细 胞孔的OD450-不含细胞也不含药物孔的OD450)×100/(含细胞 但无药物孔的OD450-不含细胞也不含药物孔的OD450)
上述TRA-8与典型抗肿瘤药紫杉醇(Paclitaxel)联合的测定的结 果如下。紫杉醇(Paclitaxel)降低了PC-3细胞的细胞存活力，但在至 多200nM的浓度下，仍有超过40％指示活的癌细胞的信号。值得注意 的是，加入0.1ng/ml TRA-8大大降低了癌细胞的细胞存活力，降至 10％，即使在应用一次该浓度的TRA-8后观察到细胞存活力没有降低。 这一结果清楚地表明，TRA-8当与其它抗肿瘤药联合时，协同显示出 抗肿瘤活性。
实施例26.TRA-8的其它类型人源化抗体的分析
(1)设计人源化抗体
通过一般称为CDR移植的方法进行人源化形式的TRA-8的构建。 如参比实施例2中所述将mAB58’CL抗体用作受体，将TRA-8抗体的CDR 区移植到该受体上。在构架区中，根据Queen等给出的标准(Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))，将某些氨基酸从或者TRA-8 或者人共有序列移植到该受体上，如下所述构建人源化TRA-8序列。
(2)携带其它类型人源化TRA-8或小鼠TRA-8的重链可变区DNA 的质粒的构建
如序列表的SEQ ID No.56中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8重 链氨基酸序列的H1型人源化需要分别用谷氨酰胺、谷氨酰胺、精氨 酸、丙氨酸、甘氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸 和缬氨酸取代第3号氨基酸(甲硫氨酸)、第13号氨基酸(赖氨酸)、 第19号氨基酸(赖氨酸)、第40号氨基酸(苏氨酸)、第42号氨基酸(谷 氨酸)、第44号氨基酸(精氨酸)、第84号氨基酸(丝氨酸)、第88号 氨基酸(丝氨酸)、第93号氨基酸(甲硫氨酸)、第114号氨基酸(苏氨 酸)、第115号氨基酸(亮氨酸)。
如序列表的SEQ ID No.59中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8重 链氨基酸序列的H3型人源化需要分别用谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、 甘氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代第13号氨 基酸(赖氨酸)、第19号氨基酸(赖氨酸)、第40号氨基酸(苏氨酸)、 第42号氨基酸(谷氨酸)、第44号氨基酸(精氨酸)、第88号氨基酸(丝 氨酸)、第93号氨基酸(甲硫氨酸)、第114号氨基酸(苏氨酸)、第115 号氨基酸(亮氨酸)。
如序列表的SEQ ID No.60中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8重 链氨基酸序列的H4型人源化需要分别用谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代第13号氨基酸(赖氨酸)、第19号氨基 酸(赖氨酸)、第88号氨基酸(丝氨酸)、第93号氨基酸(甲硫氨酸)、 第114号氨基酸(苏氨酸)、第115号氨基酸(亮氨酸)。
如序列表的SEQ ID No.61中所示，携带嵌合TRA-8重链可变区 DNA的质粒命名为“M型”。另外，实施例17和18中所述的人源化TRA-8 命名为“H2型”。
如下构建携带编码人源化或嵌合TRA-8重链可变区的DNA的质 粒。
用PCR构建以下DNA序列，每种序列的构成描述如上：
合成以下24种寡核苷酸：
5’-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag
caacagctac aggtgtccac -3’(A；SEQ ID No.32)；
5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga
ctctcctgtg cagcctctgg -3’(B；SEQ ID No.33)；
5’-tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga
ctctcctgtg cagcctctgg -3’(B2；SEQ ID No.57)；
5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa
ctctcctgtg cagcctctgg -3’(B3；SEQ ID No.66)；
5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga
gtgggttgca accattagta -3’(C；SEQ ID No.34)；
5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga
gtgggttgca accattagta -3’(C2；SEQ ID No.64)；
5’-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag
acaatgccaa gaacaccctg -3’(D；SEQ ID No.35)；
5’-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg
ggtgactcta tgattacgac -3’(E；SEQ ID No.36)；
5’-tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg
ggtgactcta tgattacgac -3’(E2；SEQ ID No.62)；
5’-tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg
ggtgactcta tgattacgac -3’(E3；SEQ ID No.67)；
5’-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat
cggtc -3’(F；SEQ ID No.37)；
5’-ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat
cggtc -3’(F2；SEQ ID No.68)；
5’-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa
-3’(G；SEQ ID No.38)；
5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga
gtggacacct gtagctgttg -3’(H；SEQ ID No.39)；
5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga
gtggacacct gtagctgttg -3’(H2；SEQ ID No.58)；
5’-tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga
gtggacacct gtagctgttg -3’(H3；SEQ ID No.69)；
5’-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat
ccagaggctg cacaggagag -3’(I；SEQ ID No.40)；
5’-tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat
ccagaggctg cacaggagag -3’(I2；SEQ ID No.65)；
5’-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac
tactaatggt tgcaacccac -3’(J；SEQ ID No.41)；
5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata
cagggtgttc ttggcattgt -3’(K；SEQ ID No.42)；
5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata
cagggtgttc ttggcattgt -3’(K2；SEQ ID No.63)；
5’-ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata
cagggtgttc ttggcattgt -3’(K3；SEQ ID No.70)；
5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta
gtccgtcgta atcatagagt cacc -3’(L；SEQ ID No.43)
gtccgtcgta atcatagagt cacc -3’(L2；SEQ ID No.71).
如上所述合成以下2种PCR引物：
5’-ttggataagc ttggcttgac -3’(P1；SEQ ID No.44)；
5’-gaccgatggg cccttggtgg a -3’(P2；SEQ ID No.45).
分别用一种组合的PCR，进行编码多肽链的H1型DNA的合成，所 述多肽链包含一个分泌信号序列、一个人源化TRA-8重链可变区和 IgG-CH1区N末端的8个氨基酸残基。
如下制备H1型DNA片段。
PCR反应溶液的组成：
寡核苷酸A，10pmol；
寡核苷酸B2，10pmol；
寡核苷酸C，10pmol；
寡核苷酸D，10pmol；
寡核苷酸E，10pmol；
寡核苷酸F，10pmol；
寡核苷酸G，10pmol；
寡核苷酸H2，10pmol；
寡核苷酸I，10pmol；
寡核苷酸J，10pmol；
寡核苷酸K，10pmol；
寡核苷酸L，10pmol；
寡核苷酸引物P1，2μM；
寡核苷酸引物P2，2μM；
10×Pyrobest缓冲液II，10μl；
dNTP混合物，8μl；
Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和
重蒸水至终体积50μl。
如下进行PCR反应。首先将溶液于94℃加热5分钟，此后重复7 次循环：加热至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分钟。在完成该程序 后，将反应溶液于72℃加热15分钟。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，将所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最 小量的重蒸水中，并且通过3％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，凝胶用 1μg/ml溴化乙锭水溶液染色，使得可以在紫外线下检测DNA。用剃 刀刀片切下对应于H1型DNA的DNA条带，用Geneclean Spin Kit(BIO 101，CA，USA)从凝胶中洗脱。在酚抽提后，通过以7,500×g离心， 然后进行乙醇沉淀，将洗脱的DNA浓缩，最后溶于5μl蒸馏水中。
分别用一种组合的PCR，进行编码多肽链的H3型DNA的合成，所 述多肽链包含一个分泌信号序列、一个人源化TRA-8重链可变区和 IgG-CH1区N末端的8个氨基酸残基。
如下制备H3型DNA片段。
PCR反应溶液的组成：
寡核苷酸A，10pmol；
寡核苷酸B，10pmol；
寡核苷酸C，10pmol；
寡核苷酸D，10pmol；
寡核苷酸E2，10pmol；
寡核苷酸F，10pmol；
寡核苷酸G，10pmol；
寡核苷酸H，10pmol；
寡核苷酸I，10pmol；
寡核苷酸J，10pmol；
寡核苷酸K2，10pmol；
寡核苷酸L，10pmol；
寡核苷酸引物P1，2μM；
寡核苷酸引物P2，2μM；
10×Pyrobest缓冲液II，10μl；
dNTP混合物，8μl；
Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和
重蒸水至终体积50μl。
如下进行PCR反应。首先将溶液于94℃加热5分钟，此后重复7 次循环：加热至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分钟。在完成该程序 后，将反应溶液于72℃加热15分钟。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，将所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最 小量的重蒸水中，并且通过3％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，凝胶用 1μg/ml溴化乙锭水溶液染色，使得可以在紫外线下检测DNA。用剃 刀刀片切下对应于H3型DNA的DNA条带，用Geneclean Spin Kit从 凝胶中洗脱。在酚抽提后，通过以7,500×g离心，然后进行乙醇沉 淀，将洗脱的DNA浓缩，最后溶于5μl蒸馏水中。
分别用一种组合的PCR，进行编码多肽链的H4型DNA的合成，所 述多肽链包含一个分泌信号序列、一个人源化TRA-8重链可变区和 IgG-CH1区N末端的8个氨基酸残基。
如下制备H4型DNA片段。
PCR反应溶液的组成：
寡核苷酸A，10pmol；
寡核苷酸B，10pmol；
寡核苷酸C2，10pmol；
寡核苷酸D，10pmol；
寡核苷酸E2，10pmol；
寡核苷酸F，10pmol；
寡核苷酸G，10pmol；
寡核苷酸H，10pmol；
寡核苷酸I2，10pmol；
寡核苷酸J，10pmol；
寡核苷酸K2，10pmol；
寡核苷酸L，10pmol；
寡核苷酸引物P1，2μM；
寡核苷酸引物P2，2μM；
10×Pyrobest缓冲液II，10μl；
dNTP混合物，8μl；
Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和
重蒸水至终体积50μl。
如下进行PCR反应。首先将溶液于94℃加热5分钟，此后重复7 次循环：加热至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分钟。在完成该程序 后，将反应溶液于72℃加热15分钟。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，将所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最 小量的重蒸水中，并且通过3％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，凝胶用 1μg/ml溴化乙锭水溶液染色，使得可以在紫外线下检测DNA。用剃 刀刀片切下对应于H4型DNA的DNA条带，用Geneclean Spin Kit从 凝胶中洗脱。在酚抽提后，通过以7,500×g离心，然后进行乙醇沉 淀，将洗脱的DNA浓缩，最后溶于5μl蒸馏水中。
分别用一种组合的PCR，进行编码多肽链的M型DNA的合成，所 述多肽链包含一个分泌信号序列、一个嵌合TRA-8重链可变区和IgG- CH1区N末端的8个氨基酸残基。
如下制备M型DNA片段。
PCR反应溶液的组成：
寡核苷酸A，10pmol；
寡核苷酸B3，10pmol；
寡核苷酸C2，10pmol；
寡核苷酸D，10pmol；
寡核苷酸E3，10pmol；
寡核苷酸F2，10pmol；
寡核苷酸G，10pmol；
寡核苷酸H3，10pmol；
寡核苷酸I2，10pmol；
寡核苷酸J，10pmol；
寡核苷酸K3，10pmol；
寡核苷酸L2，10pmol；
寡核苷酸引物P1，2μM；
寡核苷酸引物P2，2μM；
10×Pyrobest缓冲液II，10μl；
dNTP混合物，8μl；
Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和
重蒸水至终体积50μl。
如下进行PCR反应。首先将溶液于94℃加热5分钟，此后重复7 次循环：加热至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分钟。在完成该程序 后，将反应溶液于72℃加热15分钟。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，将所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最 小量的重蒸水中，并且通过3％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，凝胶用 1μg/ml溴化乙锭水溶液染色，使得可以在紫外线下检测DNA。用剃 刀刀片切下对应于M型DNA的DNA条带，用Geneclean Spin Kit从 凝胶中洗脱。在酚抽提后，通过以7,500×g离心，然后进行乙醇沉 淀，将洗脱的DNA浓缩，最后溶于5μl蒸馏水中。
用pGEM-T Easy载体(Promega)，如下克隆所得的每种提取的DNA (H1型、H3型、H4型和M型)：
从所述PCR反应中回收的DNA片段(H1型、H3型、H4型或M 型)，5μl；
10×Taq聚合酶缓冲液，1μl；
dNTP混合物，1μl；
Taq聚合酶(5单位/ml)，1μl；和
重蒸水至终体积10μl。
在上述每种溶液于70℃反应30分钟后，用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Shuzo Co.，Ltd)，使用生产商的方案，连接每种DNA溶 液和pGEM-T Easy载体。
在于15℃孵育4小时后，将2μl经孵育的反应溶液与细胞密度 为1-2×109细胞/ml的100μl感受态大肠杆菌菌株JM109(Takara Shuzo Co.，Ltd.)混合，将混合物在冰上保持30分钟，然后于42℃ 保持30秒，再次在冰上保持1分钟。然后，将500μl SOC培养基(2％ v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.05％w/v氯化钠、2.5mM w/v氯 化钾、1mM氯化镁和20mM葡萄糖)加入到混合物中，将其再振荡孵 育1小时。然后分离转化菌株，如“Molecular Cloning A Laboratory Manual”中所述，从菌株中制备质粒DNA。通过双脱氧法(Sanger，F.S. 等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467)，用3700 DNA 分析仪(ABI PRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，分 别证实编码人源化TRA-8或小鼠TRA-8重链的这种DNA的核苷酸序列。
所得质粒命名为pHA15(携带编码H1型人源化TRA-8重链的cDNA 的质粒)、pHC10(携带编码H3型人源化TRA-8重链的cDNA的质粒)、 pHD21(携带编码H4型人源化TRA-8重链的cDNA的质粒)和pM11(携 带编码嵌合TRA-8重链的cDNA的质粒)。带有这些质粒的转化大肠杆 菌菌株命名为大肠杆菌JM109/pHA15、大肠杆菌JM109/pHC10、大肠杆 菌JM109/pHD21和大肠杆菌JM109/pM11，所述菌株按照关于微生物保 藏的布达佩斯条约，于2001年4月20日保藏于国际专利生物保藏机 构-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，记录的保藏号分别为 FERM BP-7555、FERM BP-7557、FERM BP-7558和FERM BP-7559。
(3)携带几种类型人源化TRA-8或小鼠TRA-8重链可变区DNA的 表达质粒的构建
如下通过插入编码H1型、H3型和H4型人源化TRA-8或M型嵌合 TRA-8重链的DNA(在上述克隆的)，构建用于动物细胞的重组表达载 体。
1μg用于哺乳动物细胞的表达载体-携带人源化抗Fas单克隆抗 体HFE7A重链可变区和人IgG1恒定区基因组DNA的质粒pSRHHH3(欧 洲专利申请EP 0 909 816 A1)用限制性酶Hind III和Apa I消化，通 过3％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭水溶液 染色，使得可以在紫外线下检测DNA。用剃刀刀片切下含有人IgG1恒 定区基因组DNA但无人源化HFE7A重链可变区的载体DNA条带，用 Geneclean Spin Kit从凝胶中洗脱。在酚抽提后，通过以7,500×g 离心，然后进行乙醇沉淀，将洗脱的DNA浓缩，最后溶于5μl蒸馏 水中，然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，将所得的经消化的去磷酸化质粒(100ng)与1μg 也用Hind III和Apa I消化的含有编码人源化TRA-8或嵌合TRA-8重链 可变区的DNA的pHA15、pHC10、pHD21或pM11 DNA片段连接。然后用 连接混合物转化大肠杆菌JM109，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素的 LB琼脂平板上铺平板。
将用该方法获得的转化子在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液 体LB培养基中于37℃培养过夜，随后用碱-SDS法从所得的培养物中 提取质粒DNA。
所提取的质粒DNA用Hind III和Apa I消化，经过3％w/v琼脂糖 凝胶电泳，以证实编码人源化或嵌合TRA-8重链可变区的DNA的插入 片段存在或不存在。用基因序列分析仪(ABI Prism 3700 DNA Analyzer； Applied Biosystems)，通过DNA测序证实所需DNA片段在所述载体中 的插入和方向。所得的携带编码人源化或嵌合TRA-8重链的cDNA的 表达质粒分别命名为pHA15-1、pHC10-3、pHD21-1和pM11-1。
(4)所述人源化轻链的载体的构建
(4.1)人源化抗体(LM1型)轻链的表达载体的构建
如序列表的SEQ ID No.72中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8的 轻链氨基酸序列的其它人源化(LM1型)，需要分别用谷氨酰胺、脯氨 酸、丝氨酸、丝氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、 丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪 氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸取代所述TRA-8轻链氨基酸序列N 末端的第3号氨基酸(缬氨酸)、第8号氨基酸(组氨酸)、第9号氨基 酸(赖氨酸)、第10号氨基酸(苯丙氨酸)、第11号氨基酸(甲硫氨酸)、 第13号氨基酸(苏氨酸)、第20号氨基酸(丝氨酸)、第42号氨基酸(谷 氨酰胺)、第43号氨基酸(丝氨酸)、第60号氨基酸(天冬氨酸)、第63 号氨基酸(苏氨酸)、第77号氨基酸(天冬酰胺)、第78号氨基酸(缬 氨酸)、第80号氨基酸(丝氨酸)、第83号氨基酸(亮氨酸)、第85号 氨基酸(天冬氨酸)、第87号氨基酸(苯丙氨酸)以及第99号氨基酸(甘 氨酸)、第103号氨基酸(亮氨酸)和第108号氨基酸(丙氨酸)。所得 的序列命名为LM1。
如下构建携带抗人DR5抗体TRA-8的这种类型人源化轻链氨基酸 序列(LM1型，序列表的SEQ ID No.72)的表达质粒。
1)用于制备人源化TRA-8(LM1型)轻链可变区和恒定区的引物的合成
采用各种组合的PCR，分别合成编码LM1多肽链(序列表中的SEQ ID No.72)的DNA，其中每种都是人源化抗DR5抗体TRA-8轻链(LM1型) 可变区和人Ig轻链(κ链)恒定区的融合体。
此外对于7AL1P(SEQ ID No.47)、7ALCN(SEQ ID No.48)、HKCDF11 (SEQ ID No.50)、HKCDR12(SEQ ID No.51)、HKCDF22(SEQ ID No.52)、 HKCDR22(SEQ ID No.5 3)和HKCF12(SEQ ID No.54)。
合成用于PCR的以下寡核苷酸引物：
5’-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga -3’
(HKSPR12；SEQ ID No.77).
2)质粒pCR3.1/LM1-2的构建(人源化TRA-8轻链LM1型的克隆)
通过进行两步PCR，制备编码序列表的SEQ ID No.72中限定的 氨基酸序列的LM1-DNA片段，将其插入到质粒载体中，并且在大肠杆 菌中克隆。
a)第一步PCR
在以下条件下制备LM1-F1-DNA片段，该片段编码一个分泌信号 序列和FRL1区的一部分，并且在5’端加入一个Hind III限制性酶切 位点。模板质粒pHSGHM17和pSRPDHH通过采用欧洲专利申请EP 0 909 816 A1中描述的方法获得。
反应溶液的组成：
质粒pHSGHM17 DNA，25ng
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物HKSPR12，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶(PerkinElmer)，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码FRL1一部分、CDRL1、FRL2和CDRL2的LM1- F2-DNA片段。
反应溶液的组成：
质粒pL28 DNA，25ng
寡核苷酸引物HKCDF11，50pmol
寡核苷酸引物HKCDR12，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码CDRL2、FRL3和CDRL3一部分的LM1-F3-DNA 片段。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA，25ng
寡核苷酸引物HKCDF22，50pmol
寡核苷酸引物HKCDR22，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码CDRL3、FRL4和恒定区以及在3’端加入一 个EcoR I限制性酶切位点的LM1-F4-DNA片段。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA，25ng
寡核苷酸引物HKCF12，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在PCR后，扩增的DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电 泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭染色，以在紫外线下检测所产生的DNA。 用剃刀切下如此检测出的相应DNA条带。
b)第二步PCR
在以下条件下制备其中上述LM1-F1-DNA、LM1-F2-DNA、LM1-F3-DNA 和LM1-F4-DNA片段融合的LM1-DNA。
反应溶液的组成：
在第一步PCR中制备的LM1-F1-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM1-F2-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM1-F3-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM1-F4-DNA凝胶片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5.0μl
10×PCR缓冲液，5.0μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
用真核TA克隆试剂盒(InVitrogen)，按照生产商的方案，将如 此制备的LM1-DNA片段插入到质粒pCR3.1DNA中，将其导入试剂盒中 含有的感受态大肠杆菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析仪(ABI PRISM； Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通过双脱氧法(Sanger，F. S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467)，证实 编码人源化TRA-8(LM1型)轻链的这些DNA的核苷酸序列。
所得的质粒命名为pCR3.1/LM1-2(携带编码人源化TRA-8(LM1 型)轻链可变区和人Ig轻链恒定区的cDNA的质粒)。
所获得的含有LM1-DNA片段的质粒pCR3.1/LM1-2用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化， 然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III 和EcoR I消化的LM1-DNA片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α， 涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(终浓度)的 LB琼脂培养基上。获得的白色转化子在含有50μg/ml氯霉素的液体 LB培养基中培养，按照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。 所提取的质粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通过1％琼脂糖凝 胶电泳选择出一个携带LM1-DNA片段的克隆。
作为上述程序的结果，获得携带人源化LM1 TRA-8轻链可变区和 人Igκ链恒定区的融合片段的质粒pHSG/M1-2-2。带有这些质粒的转 化大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌DH5α/pHSG/M1-2-2，该菌株按照关于 微生物保藏的布达佩斯条约，于2001年4月20日保藏于国际专利生 物保藏机构-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，记录的保藏号 为FERM BP-7562。
3)质粒pSR/LM1-2(人源化LM1 TRA-8轻链的表达质粒)的构建
所获得的携带人源化LM1 TRA-8轻链可变区和人Igκ链恒定区的 融合片段的质粒pHSG/M1-2-2用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pSRPDHH DNA(欧洲专利申请EP 0 909 816 A1)用 限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA连 接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷 酸化pSRPDHH DNA和从pHSG/M1-2-2中获得的Hind III-EcoR I DNA片 段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α，涂布在LB琼脂上。获得 的转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，按 照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。用基因序列分析仪， 通过DNA测序证实所需DNA片段在pSRPDHH载体中的插入和方向。
所得的携带编码人源化LM1 TRA-8轻链的cDNA的表达质粒命名 为pSR/LM1-2。
(4.2)人源化抗体(LM3型)轻链的表达载体的构建
如序列表的SEQ ID No.73中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8的 轻链氨基酸序列的其它人源化(LM3型)，需要分别用脯氨酸、丝氨酸、 丝氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨 酸取代所述TRA-8轻链氨基酸序列N末端的第8号氨基酸(组氨酸)、 第9号氨基酸(赖氨酸)、第10号氨基酸(苯丙氨酸)、第11号氨基酸 (甲硫氨酸)、第13号氨基酸(苏氨酸)、第20号氨基酸(丝氨酸)、第 42号氨基酸(谷氨酰胺)、第43号氨基酸(丝氨酸)、第77号氨基酸(天 冬酰胺)、第78号氨基酸(缬氨酸)、第80号氨基酸(丝氨酸)、第83 号氨基酸(亮氨酸)、第85号氨基酸(天冬氨酸)、第87号氨基酸(苯 丙氨酸)、第99号氨基酸(甘氨酸)、第103号氨基酸(亮氨酸)和第108 号氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命名为LM3。
如下构建携带抗人DR5抗体TRA-8的这种类型人源化轻链氨基酸 序列(LM3型，序列表的SEQ ID No.73)的表达质粒。
1)用于制备人源化LM3 TRA-8轻链可变区和恒定区的引物的合成
采用各种组合的PCR，分别合成编码LM3多肽链(序列表中的SEQ ID No.73)的DNA，其中每种都是人源化抗DR5抗体TRA-8轻链可变区和 人Ig轻链(κ链)恒定区的融合体。
此外对于7AL1P(SEQ ID No.47)和7ALCN(SEQ ID No.48)，合 成用于PCR的以下寡核苷酸引物：
5’-atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg -3’
(MOD1F1；SEQ ID No.78)；
5’-cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt -
3’(MOD1R1；SEQ ID No.79)；
5’-ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc -3’
(MOD1F22；SEQ ID No.80)；
5’-acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag -3’(MOD1R22；
SEQ ID No.81)；
5’-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa -
3’(MOD1F3；SEQ ID No.82)；
5’-tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga
tgcagacaaa ga -3’(MOD1R3；SEQ ID No.83)；
5’-aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt
ttacaggcag t -3’(MOD1F42；SEQ ID No.84)；
5’-cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag
gc -3’(MOD1R4；SEQ ID No.85)；
5’-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat -
3’(MOD1F5；SEQ ID No.86)；
5’-actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac -3’
(MOD1R52；SEQ ID No.87)；
5’-tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3’
(MOD1F6；SEQ ID No.88)；
5’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac -3’(MOD1R6；
SEQ ID No.89)
5’-aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g -3’(MOD1F7；SEQ
ID No.90)；
5’-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa -3’
(MOD1R7；SEQ ID No.91)；
5’-agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa(LR17；SEQ ID No.101).
2)质粒pCR3.1/LM3-3-44的构建(人源化TRA-8轻链LM3型的克隆)
通过进行两步PCR，制备编码序列表的SEQ ID No.73中限定的 氨基酸序列的LM3-DNA片段，将其插入到质粒载体中，并且在大肠杆 菌中克隆。
a)第一步PCR
在以下条件下制备LM3-F31B-DNA片段，该片段编码一个在5’端 加入一个Hind III限制性酶切位点的分泌信号序列区、FRL1、CDRL1、 FRL2和CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4和恒定区的一部分。
反应溶液的组成：
寡核苷酸引物MOD1F1，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R1，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F22，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R22，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F3，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R3，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F42，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R4，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F5，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R52，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F6，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R6，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol
寡核苷酸引物MOD1R7，5pmol
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物LR17，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码在3’端加入一个EcoR I限制性酶切位点 的恒定区一部分的LM3-F31C-DNA片段。
模板质粒pSRPDHH通过采用欧洲专利申请EP 0 909 816 A1中所 述方法获得。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA，25ng
寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在PCR后，扩增的DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电 泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭染色，以在紫外线下检测所产生的DNA。 用剃刀切下如此检测出的相应DNA条带。
b)第二步PCR
在以下条件下制备其中上述LM3-F31B-DNA和LM3-F31C-DNA片段 融合的LM3-DNA。
反应溶液的组成：
在第一步PCR中制备的LM3-F31B-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM3-F31C-DNA凝胶片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5.0μl
10×PCR缓冲液，5.0μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
用真核TA克隆试剂盒(InVitrogen)，按照生产商的方案，将如 此制备的LM3-DNA片段插入到质粒pCR3.1DNA中，将其导入试剂盒中 含有的感受态大肠杆菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析仪(ABI PRISM； Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通过双脱氧法(Sanger，F. S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467)，证实 编码人源化LM3 TRA-8轻链的这些DNA的核苷酸序列。
所得的质粒命名为pCR3.1/LM3-3-44(携带编码人源化LM3 TRA-8 轻链可变区和人Ig轻链恒定区的cDNA的质粒)。
所获得的含有LM3-DNA片段的质粒pCR3.1/LM3-3-44用限制性酶 Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化， 然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III 和EcoR I消化的LM3-DNA片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α， 涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(终浓度)的 LB琼脂培养基上。获得的白色转化子在含有50μg/ml氯霉素的液体 LB培养基中培养，按照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。 所提取的质粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通过1％琼脂糖凝 胶电泳选择出一个携带LM3-DNA片段的克隆。
作为上述程序的结果，获得携带人源化LM3 TRA-8轻链可变区和 人Igκ链恒定区的融合片段的质粒pHSG/M3-3-22。带有这些质粒的转 化大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌DH5α/pHSG/M3-3-22，该菌株按照关 于微生物保藏的布达佩斯条约，于2001年4月20日保藏于国际专利 生物保藏机构-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1， Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，记 录的保藏号为FERM BP-7564。
3)质粒pSR/LM3-3-44-10(人源化LM3 TRA-8轻链的表达质粒)的构 建
所获得的携带人源化LM3 TRA-8轻链可变区和人Igκ链恒定区的 融合片段的质粒pHSG/M3-3-22用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pSRPDHH DNA(欧洲专利申请EP 0 909 816 A1)用 限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA连 接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷 酸化pSRPDHH DNA和从pHSG/M3-3-22中获得的HindIII-EcoRI DNA片 段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α，涂布在LB琼脂上。获得 的转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，按 照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。用基因序列分析仪(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通过DNA测序证 实所需DNA片段在pSRPDHH载体中的插入和方向。
所得的携带编码人源化LM3 TRA-8轻链的cDNA的表达质粒命名 为pSR/LM3-3-44-10。
(4.3)人源化抗体(LM4型)轻链的表达载体的构建
如序列表的SEQ ID No.74中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8的 轻链氨基酸序列的其它人源化(LM4型)，需要分别用脯氨酸、丝氨酸、 丝氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸取代所 述TRA-8轻链氨基酸序列N末端的第8号氨基酸(组氨酸)、第9号氨 基酸(赖氨酸)、第10号氨基酸(苯丙氨酸)、第11号氨基酸(甲硫氨 酸)、第13号氨基酸(苏氨酸)、第20号氨基酸(丝氨酸)、第42号氨 基酸(谷氨酰胺)、第43号氨基酸(丝氨酸)、第77号氨基酸(天冬酰 胺)、第78号氨基酸(缬氨酸)、第80号氨基酸(丝氨酸)、第83号氨 基酸(亮氨酸)、第85号氨基酸(天冬氨酸)、第99号氨基酸(甘氨酸)、 第103号氨基酸(亮氨酸)和第108号氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命 名为LM4。
如下构建携带抗人DR5抗体TRA-8的这种类型人源化轻链氨基酸 序列(LM4型)(序列表的SEQ ID No.74)的表达质粒。
1)用于制备人源化LM4 TRA-8轻链可变区和恒定区的引物的合成
采用各种组合的PCR，分别合成编码LM4多肽链(序列表中的SEQ ID No.74)的DNA，其中每种都是人源化抗DR5抗体TRA-8轻链可变区和 人Ig轻链(κ链)恒定区的融合体。
此外对于7AL1P(SEQ ID No.47)、7ALCN(SEQ ID No.48)、MOD1F1 (SEQ ID No.78)、MOD1R1(SEQ ID No.79)、MOD1F22(SEQ ID No.80)、 MOD1R22(SEQ ID No.81)、MOD1F3(SEQ ID No.82)、MOD1R3(SEQ ID No.83)、MOD1F42(SEQ ID No.84)、MOD1R4(SEQ ID No.85)、MOD1F5 (SEQ ID No.86)、MOD1R52(SEQ ID No.87)、MOD1F7(SEQ ID No.90) 和MOD1R7(SEQ ID No.91)、LR17(SEQ ID No.101)，合成用于PCR 的以下寡核苷酸引物：
5’-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3’
(MOD1F62；SEQ ID No.92)
5’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag -3’
(MOD1R62；SEQ ID No.93)
2)质粒pCR3.1/LM4-5-3的构建(人源化TRA-8轻链LM4型的克隆)
通过进行两步PCR，制备编码序列表的SEQ ID No.74中限定的 氨基酸序列的LM4-DNA片段，将其插入到质粒载体中，并且在大肠杆 菌中克隆。
a)第一步PCR
在以下条件下制备LM4-F41B-DNA片段，该片段编码一个在5’端 加入一个Hind III限制性酶切位点的分泌信号序列区、FRL1、CDRL1、 FRL2和CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4和恒定区的一部分。
反应溶液的组成：
寡核苷酸引物MOD1F1，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R1，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F22，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R22，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F3，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R3，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F42，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R4，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F5，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R52，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F62，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R62，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol
寡核苷酸引物MOD1R7，5pmol
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物LR17，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码在3’端加入一个EcoR I限制性酶切位点 的恒定区一部分的LM4-F41C-DNA片段。
模板质粒pSRPDHH通过采用欧洲专利申请EP 0 909 816 A1中所 述方法获得。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA，25ng
寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在PCR后，扩增的DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电 泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭染色，以在紫外线下检测所产生的DNA。 用剃刀刀片切下如此检测出的相应DNA条带。
b)第二步PCR
在以下条件下制备其中上述LM4-F41B-DNA和LM4-F41C-DNA片段 融合的LM4-DNA。
反应溶液的组成：
在第一步PCR中制备的LM4-F41B-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM4-F41C-DNA凝胶片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5.0μl
10×PCR缓冲液，5.0μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
用真核TA克隆试剂盒(InVitrogen)，按照生产商的方案，将如 此制备的LM4-DNA片段插入到质粒pCR3.1DNA中，将其导入试剂盒中 含有的感受态大肠杆菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析仪(ABI PRISM； Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通过双脱氧法(Sanger，F. S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467)，证实 编码人源化LM4 TRA-8轻链的这些DNA的核苷酸序列。
所得的质粒命名为pCR3.1/LM4-5-3(携带编码人源化LM4 TRA-8 轻链可变区和人Ig轻链恒定区的cDNA的质粒)。
所获得的含有LM4-DNA片段的质粒pCR3.1/LM4-5-3用限制性酶 Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化， 然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III 和EcoR I消化的LM4-DNA片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α， 涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(终浓度)的 LB琼脂培养基上。获得的白色转化子在含有50μg/ml氯霉素的液体 LB培养基中培养，按照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。 所提取的质粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通过1％琼脂糖凝 胶电泳选择出一个携带LM4-DNA片段的克隆。
作为上述程序的结果，获得携带人源化LM4 TRA-8轻链可变区和 人Igκ链恒定区的融合片段的质粒pHSG/M4-5-3-1。带有这些质粒的 转化大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌DH5α/pHSG/M4-5-3-1，该菌株按照 关于微生物保藏的布达佩斯条约，于2001年4月20日保藏于国际专 利生物保藏机构-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1， Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，记 录的保藏号为FERM BP-7565。
3)质粒pSR/LM4-5-3-3(人源化LM4 TRA-8轻链的表达质粒)的构建
所获得的携带人源化LM4 TRA-8轻链可变区和人Igκ链恒定区的 融合片段的质粒pHSG/M4-5-3-1用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pSRPDHH DNA(欧洲专利申请EP 0 909 816 A1)用 限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA连 接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷 酸化pSRPDHH DNA和从pHSG/M4-5-3-1中获得的HindIII-EcoRI DNA 片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α，涂布在LB琼脂上。获 得的转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养， 按照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。用基因序列分析仪 (ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通过DNA测 序证实所需DNA片段在pSRPDHH载体中的插入和方向。
所得的携带编码人源化LM4 TRA-8轻链的cDNA的表达质粒命名 为pSR/LM4-5-3-3。
(4.4)人源化抗体(LM5型)轻链的表达载体的构建
如序列表的SEQ ID No.75中所示，小鼠抗人DR5抗体TRA-8的 轻链氨基酸序列的其它人源化(LM5型)，需要分别用脯氨酸、丝氨酸、 丝氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸取代所述TRA-8轻链氨基酸 序列N末端的第8号氨基酸(组氨酸)、第9号氨基酸(赖氨酸)、第10 号氨基酸(苯丙氨酸)、第11号氨基酸(甲硫氨酸)、第13号氨基酸(苏 氨酸)、第20号氨基酸(丝氨酸)、第42号氨基酸(谷氨酰胺)、第43 号氨基酸(丝氨酸)、第77号氨基酸(天冬酰胺)、第78号氨基酸(缬 氨酸)、第80号氨基酸(丝氨酸)、第83号氨基酸(亮氨酸)、第103 号氨基酸(亮氨酸)和第108号氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命名为 LM5。
如下构建携带抗DR5抗体TRA-8的这种类型人源化轻链氨基酸 序列(LM5型)(序列表的SEQ ID No.75)的表达质粒。
1)用于制备人源化LM5 TRA-8轻链可变区和恒定区的引物的合成
采用各种组合的PCR，分别合成编码LM5多肽链(序列表中的SEQ ID No.75)的DNA，其中每种都是人源化抗DR5抗体TRA-8轻链可变区和 人Ig轻链(κ链)恒定区的融合体。
此外对于7AL1P(SEQ ID No.47)、7ALCN(SEQ ID No.48)、MOD1F1 (SEQ ID No.78)、MOD1R1(SEQ ID No.79)、MOD1F22(SEQ ID No.80)、 MOD1R22(SEQ ID No.81)、MOD1F3(SEQ ID No.82)、MOD1R3(SEQ ID No.83)、MOD1F42(SEQ ID No.84)、MOD1R4(SEQ ID No.85)、MOD1R52 (SEQ ID No.87)、MOD1F7(SEQ ID No.90)和LR17(SEQ ID No.101)， 合成用于PCR的以下寡核苷酸引物：
5’-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat -3’
(MOD1F52；SEQ ID No.94)
5’-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc -3’
(MOD1F63；SEQ ID No.95)
5’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag -3’
(MOD1R63；SEQ ID No.96)
5’-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa -3’
(MOD1R72；SEQ ID No.102)
2)质粒pCR3.1/LM5-3-42的构建(人源化TRA-8轻链LM5型的克隆)
通过进行两步PCR，制备编码序列表的SEQ ID No.75中限定的 氨基酸序列的LM5-DNA片段，将其插入到质粒载体中，并且在大肠杆 菌中克隆。
a)第一步PCR
在以下条件下制备LM5-F51B-DNA片段，该片段编码一个在5’端 加入一个Hind III限制性酶切位点的分泌信号序列区、FRL1、CDRL1、 FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4和恒定区的一部分。
反应溶液的组成：
寡核苷酸引物MOD1F1，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R1，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F22，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R22，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F3，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R3，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F42，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R4，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F52，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R52，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F63，5pmol
寡核苷酸引物MOD1R63，5pmol
寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol
寡核苷酸引物MOD1R72，5pmol
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物LR17，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码在3’端加入一个EcoR I限制性酶切位点 的恒定区一部分的LM5-F51C-DNA片段。模板质粒pSRPDHH通过采用欧 洲专利申请EP 0 909 816 A1中所述方法获得。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA，25ng
寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在PCR后，扩增的DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电 泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭染色，以在紫外线下检测所产生的DNA。 用剃刀刀片切下如此检测出的相应DNA条带。
b)第二步PCR
在以下条件下制备其中上述LM5-F51B-DNA和LM5-F51C-DNA片段 融合的LM5-DNA。
反应溶液的组成：
在第一步PCR中制备的LM5-F51B-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM5-F51C-DNA凝胶片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5.0μl
10×PCR缓冲液，5.0μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
用真核TA克隆试剂盒(InVitrogen)，按照生产商的方案，将如 此制备的LM5-DNA片段插入到质粒pCR3.1DNA中，将其导入试剂盒中 含有的感受态大肠杆菌TOP10F’中。采用DNA分析仪，通过双脱氧法 (Sanger，F.S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463- 5467)，证实编码人源化LM5 TRA-8轻链的这些DNA的核苷酸序列。
所得的质粒命名为pCR3.1/LM5-3-42(携带编码人源化LM5 TRA-8 轻链可变区和人Ig轻链恒定区的cDNA的质粒)。
所获得的含有LM5-DNA片段的质粒pCR3.1/LM5-3-42用限制性酶 Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化， 然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III 和EcoR I消化的LM5-DNA片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α， 涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(终浓度)的 LB琼脂培养基上。获得的白色转化子在含有50μg/ml氯霉素的液体 LB培养基中培养，按照碱-sDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。 所提取的质粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通过1％琼脂糖凝 胶电泳选择出一个携带LM5-DNA片段的克隆。
作为上述程序的结果，获得携带人源化LM5 TRA-8轻链可变区和 人Igκ链恒定区的融合片段的质粒pHSG/M5-3-27。
3)质粒pSR/LM5-3-27-1(人源化LM5 TRA-8轻链的表达质粒)的构建
所获得的携带人源化LM5 TRA-8轻链可变区和人Igκ链恒定区的 融合片段的质粒pHSG/M5-3-27用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pSRPDHH DNA(欧洲专利申请EP 0 909 816 A1)用 限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA连 接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷 酸化pSRPDHH DNA和从pHSG/M5-3-27中获得的HindIII-EcoRI DNA片 段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α，涂布在LB琼脂上。获得 的转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，按 照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。用基因序列分析仪(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通过DNA测序证 实所需DNA片段在pSRPDHH载体中的插入和方向。
所得的携带编码人源化LM5 TRA-8轻链的cDNA的表达质粒命名 为pSR/LM5-3-27-1。
(4.5)人源化抗体(嵌合型)轻链的表达载体的构建
嵌合型TRA-8轻链氨基酸序列-序列表的SEQ ID No.76中所示 序列命名为LM6。
如下构建携带抗人DR5抗体TRA-8的这种类型人源化轻链氨基酸 序列(LM6型)(序列表的SEQ ID No.75)的表达质粒。
1)用于制备人源化LM6 TRA-8轻链可变区和恒定区的引物的合成
采用各种组合的PCR，分别合成编码LM6多肽链(序列表中的SEQ ID No.75)的DNA，其中每种都是小鼠抗DR5抗体TRA-8轻链(LM6型)可 变区和人Ig轻链(κ链)恒定区的融合体。
此外对于7AL1P(SEQ ID No.47)和7ALCN(SEQ ID No.48)，合 成用于PCR的以下寡核苷酸引物：
5’-tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a -3’(HKSPR13；
SEQ ID No.97)；
5’-tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c -3’(MVF11；
SEQ ID No.98)；
5’-aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc -3’(MVR11；SEQ
ID No.99)；
5’-aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc -3’(MCF11；SEQ ID
Nb.100).
2)质粒pCR3.1/LM6-1-16的构建(人源化TRA-8轻链LM6型的克隆)
通过进行两步PCR，制备编码序列表的SEQ ID No.75中限定的 氨基酸序列的LM6-DNA片段，将其插入到质粒载体中，并且在大肠杆 菌中克隆。
a)第一步PCR
在以下条件下制备LM6-F1-DNA片段，该片段编码一个分泌信号 序列和FRL1区一部分，并且在5’端加入一个Hind III限制性酶切位 点。模板质粒pHSGHM17和pSRPDHH通过采用欧洲专利申请EP 0 909 816 A1中所述方法获得。
反应溶液的组成：
质粒pHSGHM17 DNA，25ng
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物HKSPR13，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶(PerkinElmer)，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备编码FRL1一部分、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、 CDRL3、FRL4和恒定区的一部分的LM6-F2-DNA片段。
反应溶液的组成：
质粒pL28 DNA，25ng
寡核苷酸引物MVF11，50pmol
寡核苷酸引物MVR12，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在以下条件下制备LM6-F3-DNA片段，该片段编码FRL4一部分和 恒定区，并且在3’端加入一个EcoR I限制性酶切位点。
反应溶液的组成：
质粒pSRPDHH DNA，25ng
寡核苷酸引物MCF11，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5μl
10×PCR缓冲液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
在PCR后，扩增的DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电 泳后，凝胶用1μg/ml溴化乙锭染色，以在紫外线下检测所产生的DNA。 用剃刀刀片切下如此检测出的相应DNA条带。
b)第二步PCR
在以下条件下制备其中上述LM6-F1-DNA、LM6-F2-DNA和LM6-F3- DNA片段融合的LM6-DNA。
反应溶液的组成：
在第一步PCR中制备的LM6-F1-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM6-F2-DNA凝胶片段，
在第一步PCR中制备的LM6-F3-DNA凝胶片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol
寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5.0μl
10×PCR缓冲液，5.0μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5单位
通过加入重蒸水将具有上述组成的反应溶液调至50μl的终体 积，用于PCR。
PCR热条件：于94℃加热2分钟，此后进行30次热循环：94℃1 分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，然后于72℃加热10分钟。
用真核TA克隆试剂盒(Invitrogen)，按照生产商的方案，将如 此制备的LM6-DNA片段插入到质粒pCR3.1DNA中，将其导入试剂盒中 含有的感受态大肠杆菌TOP10F’中。采用DNA分析仪，通过双脱氧法， 证实编码人源化TRA-8轻链的这些DNA的核苷酸序列。
所得的质粒命名为pCR3.1/LM6-1-16(携带编码小鼠TRA-8轻链 可变区和人Ig轻链恒定区的cDNA的质粒)。
所获得的含有LM6-DNA片段的质粒pCR3.1/LM6-1-16用限制性酶 Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化， 然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III 和EcoR I消化的LM6-DNA片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α， 涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(终浓度)的 LB琼脂培养基上。获得的白色转化子在含有50μg/ml氯霉素的液体 LB培养基中培养，按照碱-SDS法，从所得的培养物中提取质粒DNA。 所提取的质粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通过1％琼脂糖凝 胶电泳选择出一个携带LM6-DNA片段的克隆。
作为上述程序的结果，获得携带小鼠TRA-8轻链可变区和人Igκ 链恒定区的融合片段的质粒pHSG/M6-1-4-1。带有这些质粒的转化大 肠杆菌菌株命名为大肠杆菌DH5α/pHSG/M6-1-4-1，该菌株按照关于微 生物保藏的布达佩斯条约，于2001年4月20日保藏于国际专利生物 保藏机构-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi l chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，记录的保藏号为FERM BP-7566。
3)质粒pSR/LM6-1-4-6(嵌合型LM6 TRA-8轻链的表达质粒)的构建
所获得的携带小鼠TRA-8轻链可变区和人Igκ链恒定区的融合片 段的质粒pHSG/LM6-1-4-1用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆质粒pSRPDHH DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化， 然后用CIP去磷酸化。用DNA连接试剂盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，连接所得的去磷酸化pSRPDHH DNA和从pHSG/LM6-1-4-1 中获得的HindIII-EcoRI DNA片段。然后用连接的DNA转化大肠杆菌 DH5α，涂布在LB琼脂上。获得的转化子在含有100μg/ml氨苄青霉 素的液体LB培养基中培养，按照碱-SDS法，从所得的培养物中提取 质粒DNA。用基因序列分析仪，通过DNA测序证实所需DNA片段在所 述载体中的插入和方向。
所得的携带编码TRA-8(嵌合型)轻链的cDNA的表达质粒命名为 pSR/LM6-1-4-6。
(5)几种类型的人源化或嵌合TRA-8抗体的产生
采用FUGENE6转染试剂法(Boehringer Mannheim Biochemica)， 按照试剂盒中提供的说明手册，进行COS-7细胞的转染。
让COS-7细胞(美国典型培养物保藏中心No.CRL-1651)在含有补 充10％胎牛血清(在下文缩写为“FCS”；Moregate)的Dulbecco氏改 进的Eagle培养基(在下文称为“D-MEM”；Gibco BRL)的培养皿(培养 面积：57cm2；Sumitomo Bakelite)中生长至半汇合(3×106细胞/皿)。
同时，将用碱-SDS法制备的10μg/皿(总共5皿)的人源化DR5 重链表达质粒DNA(pHA15-1)和10μg/皿的人源化DR5轻链表达质粒 DNA与氯化铯密度梯度离心物混合，然后用乙醇沉淀，接着悬浮于5μl/ 皿的dH2O中。
在将15μl/皿的FUGENE6转染试剂与180μl/皿无FCS的D-MEM 混合后，将该FUGENE溶液(185μl/皿)与5μl/皿含有10μg/皿人源 化DR5重链表达质粒DNA和10μg/皿人源化DR5轻链表达质粒DNA的 DNA溶液混合。于室温孵育15分钟后，将所得的质粒悬浮液(200μl) 加入到预先制备的COS-7平板上。在5％CO2、37℃下孵育24小时后， 将培养基更换为无FCS的D-MEM。在5％CO2、37℃下孵育72小时后， 回收培养上清液，以纯化上清液中的表达产物。采用如上所述的方法， 用每种以下质粒组合转染COS-7细胞：
(A)：pHA15-1和pSR/LM1-2共转染(H1L1)
(B)：pHB14-1和pSR/M2-1共转染(H2L2)
(C)：pHB14-1和pSR/LM3-3-44-10共转染(H2L3)
(D)：pHB14-1和pSR/LM4-5-3-3共转染(H2L4)
(E)：pHC10-3和pSR/M2-1共转染(H3L2)
(F)：pHC10-3和pSR/LM3-3-44-10共转染(H3L3)
(G)：pHC10-3和pSR/LM4-5-3-3共转染(H3L4)
(H)：pHD21-1和pSR/LM5-3-27-1共转染(H4L5)
(I)：pM11-1和pSR/LM6-1-4-6共转染(嵌合)
然后将培养物离心(3,500r.p.m.，15分钟)，收集上清液。上清 液用0.45μm滤膜(ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs，Cat # 25CS045 AS) 过滤。用G蛋白-POROS亲和色谱(Applied Biosystems)在以下条件下 完成从滤液中纯化IgG：
HPLC系统：BioCAD 700E(Applied Biosystems)
柱子：G蛋白-ID传感柱(柱尺寸：2.1mmID×30mmLD，床体
积：0.1ml；Applied Biosystems)
洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)
中和缓冲液：1M Tris-HCl(pH8.5)
检测：280nm
流速：1ml/min
流分大小：0.5ml/0.5min
流分收集管：1.5ml聚丙烯微量试管
温度：4℃
在所有滤液上柱后，用50ml PBS(Sigma，Cat # 1000-3)洗涤 柱子。当将洗脱缓冲液上柱后，开动流分收集器。每个流分收集微量 试管预先含有55μl 1M NaCl、110μl中和缓冲液和74μl 2mg/ml 牛血清白蛋白(Sigma，Cat # A-7030)的PBS溶液。收集第7-8号的流 分。
通过ELISA，用针对抗人IgG的抗体，进行所制备的培养上清液 中所述人源化抗体表达的证实以及所述表达产物的定量测定。
向96孔板(MaxiSorp，Nunc)的各孔中，加入100μl以0.5μg/ml 的终浓度溶于吸附缓冲液(0.05M碳酸氢钠，0.02％叠氮化钠，pH9.6) 的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗体(Kappel)，将孔板于37℃孵育2 小时，以使得抗体吸附。然后，所述板用350μl PBS-T洗涤5次。 洗涤后，向各孔加入用含10％FCS的D-MEM稀释的培养上清液，于37 ℃孵育2小时。用PBS-T再次洗涤后，向各孔加入100μl用PBS-T 稀释10,000倍的碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗 体(Jackson Immuno Research Lab.)，于37℃孵育2小时。用PBS-T 再次洗涤后，按照试剂盒中提供的说明手册，加入得自碱性磷酸酶底 物试剂盒(Bio Rad)的对硝基苯磷酸底物溶液。于37℃孵育0.5-1小 时后，测量405nm的吸光度。在所述实验中，使用以含10％FCS的D-MEM 稀释至一定浓度的人血浆免疫球蛋白G亚类1(IgG1)(Biopure AG) 作为所述培养上清液中含有的人源化DR5抗体的浓度参比样品。
因此，用所述抗人IgG抗体特异性地检测培养上清液中的表达产 物和纯化产物。人IgG抗体的终浓度分别为44.0μg/ml(H1L1)、39.8 μg/ml(H2L2)、26.7μg/ml(H2L3)、41.0μg/ml(H2L4)、39.3μg/ml (H3L2)、24.7μg/ml(H3L3)、21.5μg/ml(H3L4)、16.7μg/ml(H4L5) 和18.3μg/ml(嵌合)。
(6)几种类型人源化抗体或嵌合抗体的细胞凋亡诱导活性
用Jurkat细胞(ATCC No.TIB-152)检查纯化的人源化TRA-8抗体 的细胞凋亡诱导活性。
Jurkat细胞在含10％FCS的RPMI1640培养基(Gibco BRL)中在5％ CO2存在下于37℃培养3天，将培养的所述细胞以50μl/孔分配到96 孔微量培养板(Sumitomo Bakelite)的各孔中。通过按照实施例26中 所述的方法估计所述培养液中感兴趣的终产物的浓度，用含10％FCS 的RPMI1640培养基将实施例26中制备的人源化TRA-8调至100ng/ml 的感兴趣的终产物浓度。用每种如此调至100ng/ml的表达产物的溶 液，通过用含10％FCS的PRMI1640重复连续的2倍稀释，产生连续稀 释液。将每种稀释的人源化TRA-8溶液(H1L1、H2L2、H2L3、H2L4、H3L3、 H3L4或H4L5)以50μl/孔加入到各孔中。于37℃反应12小时后，加 入50μl含有1mg/ml XTT的25μM PMS(XTT的终浓度为250μg/ml， 而PMS的终浓度为5μM)。在孵育3小时后，利用线粒体的还原能力 作为指标，测量各孔的450nm吸光度以便计算细胞存活力。
各孔中细胞的存活力按照以下公式计算：
存活力(％)＝100×(a-b)/(c-b)
其中“a”为试验孔的测量结果，“b”是无细胞孔的测量结果，而“c” 是未加入抗体孔的测量结果。
结果，证明所测试的人源化抗体在表达人DR5抗原的T淋巴瘤细 胞系的细胞中诱导细胞凋亡。
此外，通过加入紫杉醇(Taxol)，按照实施例25中所述的方法， 检查人源化TRA-8对PC-3的细胞凋亡诱导活性。
人前列腺癌细胞系PC-3(ATCC No.CRL-1435)得自美国组织培养 物保藏中心(ATCC)，并且在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)、1％ L- 谷氨酰胺-200mM(25030-149，Gibco BRL)和0.5％青霉素链霉素溶液 (Penicillin Streptomycin Solution)(P-7539，Sigma)的F-12K营 养混合物(Nutrient Mixture)(21127-022，Gibco BRL)中维持。在以 下实验中使用补充10％FBS和0.5％青霉素链霉素溶液的RPMI1640培 养基(MED-008，IWAKI)。通过胰蛋白酶处理收集指数生长的PC-3细胞， 用新鲜培养基洗涤2次。然后在实验开始之前1天对细胞计数，将其 以5×104细胞/ml的密度重悬于新鲜培养基中，以三份重复分配到平 底96孔板(3598，Corning-Coster)中，总体积为100μl/孔。将溶于 二甲基亚砜的典型抗肿瘤药紫杉醇(Paclitaxel)(169-18611，Wako) (10mg/ml)在新鲜培养基中稀释，然后以50μl/孔加入到含有细胞的 96孔板中。二甲基亚砜的终浓度低于0.1％。在37℃、5％CO2环境下 孵育24小时后，向各孔中加入在新鲜培养基中稀释的人源化TRA-8 抗体(H1L1、H2L2、H2L3、H2L4、H3L2、H3L3、H3L4或H4L5)。再孵 育24小时后，向各孔中加入50μl含有1mg/ml XTT和25mM PMS 的极限必需培养基(11095-098，Gibco BRL)中，将板孵育6小时。然 后用ARVO HTS 1420 Multilabel Counter(多标记计数器)(Wallac Berthold)测量OD450，并如下计算细胞存活力。
细胞存活力(％)＝(含用紫杉醇(Taxol)和人源化TRA-8(药物)处 理的细胞孔的OD450-不含细胞也不含药物孔的OD450)×100/ (含细胞但无药物孔的OD450-不含细胞也不含药物孔的OD450)
结果，证实所测试的人源化抗体在表达人DR5抗原的人前列腺癌 细胞中诱导细胞凋亡。
实施例27.DR4抗体的产生
在用重组腺病毒载体转染的Cos-7细胞中表达含有人DR4的胞外 结构域(氨基酸1-236)和人IgG1的Fc部分的融合蛋白。通过蛋白 A层析柱纯化融合蛋白。按上文所述用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小 鼠。将一种对DR4具有结合特异性并且具有诱导Ramos人B淋巴瘤细 胞凋亡的能力的杂交瘤克隆2E12(IgG1，κ)亚克隆3次。采用人DR5， DcR1和DcR2以及IgG1融合蛋白作为对照抗原，通过ELISA和蛋白质 印迹测定2E12的结合特异性。通过编码人DR4的全长cDNA转染的Cos-7 细胞的流式细胞术分析，测定2E12与细胞表面DR4的结合。通过在 山羊抗小鼠IgG1存在下用1μg/ml 2E12孵育Ramos细胞而测定凋亡 诱导活性。按上文所述用ATPLite分析测定细胞存活力。
实施例28.DR4抗体的表征
DR4单克隆抗体(2E12)对人DR4是特异性的，因为它在ELISA中不 结合其它TRAIL受体如DR5，DcR1和DcR2(图19a)。通过DR4转染的 Cos-7细胞的流式细胞术分析证明2E12识别的细胞表面DR4(图19b)。 2E12在以剂量依赖性方式进行的第二抗体交联存在下能够诱导Ramos 淋巴瘤细胞凋亡(图19c)。用2E12进行的Ramos细胞的体外处理导 致天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8，9和3的时间依赖性活化，以及 PARP的切割(图19d)。这些结果表明2E12是一种激动性抗DR4抗体， 它诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶依赖性细胞凋亡。
采用抗-DR4(2E12)，然后采用PE-偶联的山羊抗小鼠IgG1抗体和 流式细胞术，发现DR4抗体结合纤维肉瘤细胞系(Hs 913T)的细胞和 一些乳腺癌细胞系(2LMP.MDA-MB231和MDA-MB 453)，但很少结合正 常人皮肤成纤维细胞系(Malme-3)。
实施例29.DR4抗体的杀肿瘤活性
采用乳腺癌肿瘤模型检验2E12的杀肿瘤活性。用人乳腺癌细胞系 2LMP皮下接种裸鼠。在肿瘤细胞注射后第7，10，14，17，21和24天 腹膜内注射200μg 2E12。动物在第8，12和16天接受静脉内注射阿 霉素(6mg/kg)。用2E12和阿霉素处理(图20)比单独用2E12或阿霉 素产生了更大的肿瘤抑制。
采用同样的乳腺癌肿瘤模型检验TRA-8与2E12联合治疗的杀肿瘤 活性。在肿瘤细胞注射后第7，10，14，17，21和24天腹膜内注射200 μg TRA-8和2E12。动物在第8，12和16天接受静脉内注射阿霉素 (6mg/kg)。用TRA-8+2E12、或TRA-8+2E12与阿霉素分别产生了88％ 和100％的完全肿瘤消退。(图21)。
实施例30.与其它疗法联合的DR4/DR5抗体的杀肿瘤活性
(1)细胞系和试剂
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的2LMP亚克隆，MDA-MB-435的LCC6 亚克隆和MDA-MB-361的DY36T2亚克隆获自Marc Lipmann博士 (Georgetown University，Washington，D.C.)，并且维持在改进的 MEM中，其中补加了FBS(Hyclone，Logan，UT)。从美国典型培养物 保藏中心(Manassas，VA)获得MDA-MB-231，MDA-MB-453，MDA-MB-468， BT-474，SK-BR-3，和ZR-75-1人乳腺癌细胞系。在补加了MEM维生素、 MEM非必须氨基酸、1mM丙酮酸钠和10％FBS的DMEM中生长MDA-MB-231， MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞。在补加了10μg/ml胰岛素、4.5g/l 葡萄糖、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和10％FBS的RPMI 1640中生 长BT-474细胞。在含有15％FBS的McCoy培养基中生长SK-BR-3细胞。 在含有20％FBS的Ham′s F12K培养基中生长ZR-75-1细胞。在无抗生 素的培养基中，37℃下，5％CO2的气氛中维持所有细胞系，并且常规 筛选支原体污染。
纯化的TRA-8(IgG1)mAb在UAB产生，并且也由Sankyo Co.，Ltd. (Tokyo，Japan)提供。从Southern Biotechnology Associates (Birmingham，AL)获得藻红素偶联的山羊抗小鼠IgG1和同种型特异性 IgG1对照抗体。阿霉素和紫杉醇是从Chemical Co.(St.Louis，MO) 购买的，并且分别制备为溶于蒸馏水或DMSO中的10mM储液。对于动 物研究，从University of Alabama at Birmingham Hospital Pharmacy (Birmingham，AL)获得紫杉醇的临床制剂(Bristol-Myers Squibb Co.， Princeton，NJ)。使用前在PBS中1∶5稀释该制剂。
(2)DR5表达的间接免疫荧光和流式细胞术分析
用Dulbecco′s PBS(缺乏Ca2+和Mg2+)洗涤指数生长期的细胞一 次，并且在37℃下用4mM EDTA/0.5％KCl洗涤一次。通过以1,000rpm 在4℃下离心5分钟而收集细胞，洗涤一次并且在4℃下重悬于含有1％ BSA和0.01％叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中。细胞与10μg/ml纯化 的TRA-8或同种型特异性IgG1对照抗体在4℃下孵育60分钟，用缓 冲液洗涤一次，然后4℃下与10μg/ml PE偶联的山羊抗小鼠IgG1一 起孵育20分钟。抗体染色后，用FACS缓冲液洗涤细胞一次，并且在 冰上在1％低聚甲醛中固定15分钟。在Becton Dickinson FACScan(San Jose，CA)上分析样品，用CellQuest软件分析数据。
(3)用ATPLite进行细胞存活力测定
在完全培养基中对细胞进行胰蛋白酶处理并且重悬。将每孔1000 个细胞铺于光学透明的96孔黑色平板(Costar #3904，Corning，NY) 上，在开始处理前37℃下孵育过夜。使用前在培养基中稀释药物和抗 体，DMSO的终浓度总是≤0.001％。在本领域单独的TRA-8之后24小 时测定细胞存活力。对于用细胞毒药物进行的联合治疗，在加入抗体 之前用药物预处理细胞24小时，额外孵育24小时，然后通过采用基 于ATPLite荧光的分析(Packard Instruments，Meriden，CT)，通过 测量细胞ATP水平评估细胞存活力。按照制造商推荐的方案进行，只 是将所有的反应体积(培养基和试剂)减半。所有的样品以三份测定， 并且报道为最少来自3个独立试验的平均值±SE。
(4)在携带乳腺癌异种移植物的裸鼠中进行的单独的TRA-8治疗 研究或与化疗或放疗的联合
用3×1072LMP细胞皮下注射无胸腺裸鼠。肿瘤细胞注射后7天， 腹膜内注射200或600μg(10 or 30mg/kg)TRA-8，然后在第10，14， 17，21和24天进行五次额外的注射。随时间监测肿瘤生长。在随后 的研究中，在第7，10，14，17，21和24天用单独的200μg TRA-8腹 膜内注射携带2LMP的动物，或与阿霉素(6mg/kg静脉内注射，第8， 12和16天)或紫杉醇(20mg/kg腹膜内注射，第8，12，16，20和 24天)联合治疗。测定肿瘤大小和消退速度。此外，用TRA-8和阿霉 素，采用与上述相同的方案进行一项研究，其中在第9和17天与2LMP 移植移植物的3Gy 60Co放疗联合治疗。
(5)异种移植物中的凋亡分析
在第0天接受皮下注射3×107 2LMP细胞的无胸腺裸鼠在第7和10 天接受100μg TRA-8腹膜内注射。每组两只的各组小鼠在第8和11 天接受阿霉素(3mg/kg)，在第8和11天接受紫杉醇(10mg/kg)，或以 相同的剂量和方案接受TRA-8与阿霉素或紫杉醇的联合体系。一组小 鼠未处理。肿瘤细胞注射后第14天对异种移植物进行切除以进行凋 亡研究。与我们的标准处理方案相比治疗密度显著降低的原因是允许 在第14天对充足的肿瘤组织进行分析。按如下所述在肿瘤异种移植 物中进行Tunel凋亡分析。在Superfrost/Plus载玻片上封固组织的 5微米石蜡切片，在58℃下加热1小时。三次更换二甲苯，对组织切 片进行脱石蜡，并且一次更换无水乙醇、95％乙醇和70％乙醇进行再水 合，每次增加5分钟。然后，将切片置于Tris缓冲的盐水(0.5M Tris 碱，0.15 M NaCl，0.0002％Triton X-100，pH7.6)中。采用Apop Tag Peroxidase试剂盒(Intergen，Purchase，NY)检测凋亡的细胞核。将 蛋白酶K(溶于蒸馏的去离子水中的20μg/ml)加入组织样品中，在 室温下孵育15分钟。用3％的过氧化氢水溶液淬灭内源性过氧化物酶 5分钟。用平衡缓冲液处理切片30分钟，然后采用parafilm盖，与 TdT/酶(稀释于标记反应混合物中)37℃孵育1小时。在该孵育过程 中，TdT酶结合DNA片段的3’-OH端，并且催化洋地黄毒苷标记的和 未标记的脱氧核苷酸的添加。用蒸馏水(稀释于标记反应混合物中) 代替TdT酶孵育阴性对照。在室温下加入终止缓冲液10分钟以终止 标记反应。向每个载玻片加入抗洋地黄毒苷偶联物30分钟。用生色 团3，3′DAB显现DNA片段的标记的3′OH。然后用去离子水漂洗载玻片， 用苏木精进行轻微负染，用分级的醇和二甲苯进行脱水，用Permount 加盖玻片。评估大约10个随机视野的Tunel染色百分比和整个组织 中强染色的凋亡小体的百分比。
(6)统计学分析
(A)TRA-8与药物细胞毒性的体外相互作用的分析
用细胞毒性数据评估细胞毒性作用是加和作用、小于加和作用(拮 抗性)、还是大于加和作用(协同的)。用二级反应表面模型模拟单独 和联合试剂的剂量反应关系，其中对9个细胞系中的每一个采用线性、 二次项和相互作用项(Montgomery，D.C.Design and Analysis of Experiments，New York：Wiley，2001)，这是由Genning推荐的(On Testing for Drug/Chemical Interactions：Definitions and Inference，pp.457-468，2000)。根据相互作用项是负(大于加和的 细胞毒性)还是正(小于加和的细胞毒性)，将显著的相互作用项分 类为协同或拮抗作用。如果相互作用项为不显著，那么TRA-8和阿霉 素，或TRA-8和紫杉醇之间的关系将被认为是加和的，前体是加和项 是显著的。
(B)各个动物试验的TRA-8、化疗、放疗和联合治疗的分析
通过各个试验分析来自6个独立试验的数据。在体内抗肿瘤效力， 即抑制肿瘤生长方面比较各个治疗联合体系，所述效力测量为三个终 点：肿瘤加倍时间的延长、肿瘤消退百分比、和随时间的生长速度。 加倍时间分析中使用肿瘤表面积(两个直径的乘积)相对于肿瘤细胞 注射后7天时的基线加倍的实际天数。用非参数Kruskal-Wallis检 验分析治疗之间的中值肿瘤加倍时间比较。用Fisher′s精确检验比 较治疗组之间的肿瘤消退和无复发消退的比例。为了确定是否任何联 合治疗都产生肿瘤生长的显著协同抑制，即，大于加和作用，采用线 性混合模型方法在治疗开始后的前3周比较系列面积测量值的生长曲 线(Lindsey，J.K.Models for Repeated Measurements，pp.100-142， Oxford，1993)。为了检验联合治疗的协同作用，在模型中引入了相 互作用项。如果相互作用项是显著的，并且作用是以大于加和的速度 抑制生长，那么相互作用被认为是协同的。
(C)疗效的综合分析
在综合分析中引入总共166只动物，10个治疗组，和6个独立试 验。在体内抗肿瘤效力方面比较治疗联合体系。用Kruskal-Wallis 检验分析中值肿瘤加倍时间比较，用Fisher′s精确检验比较治疗组 之间的肿瘤消退和无复发消退的比例。
采用SAS(Sas/Stat User′s Guide，SAS OnlineDoc，Version 8， Cary NC：SAS Institute Inc.，1999)进行所有统计分析。
(6)乳腺癌细胞系中的DR5表达和TRA-8诱导的细胞毒性
如图22A中所示，所有9种乳腺癌细胞系都是DR5阳性的，具有 不同程度的表达，从强阳性(LCC6和MDA-MB-453)至弱阳性(MDA-MB-468 和SK-BR-3)。图22B说明了9种细胞系的TRA-8诱导的细胞毒性。四 种细胞系对TRA-8诱导的细胞毒性是敏感的，其IC50浓度为17-299 ng/ml(LCC6，2LMP，MDA-MB-231，MDA-MB-468)，而其它的那些具有显 著抗性(DY36T2，BT-474，MDA-MB-453)。如细胞系MDA-MB-453和MDA- MB-468所示，DR5表达与TRA-8诱导的细胞毒性之间没有良好的相关 性。
然后用阿霉素(图23A)和紫杉醇(图23B)检验TRA-8对化疗诱 导的细胞毒性的作用。检验抗体和药物作用的分析概括于表5。TRA-8 和紫杉醇之间没有显著的协同性相互作用，大多数相互作用是加和 的。9种细胞系中的4种满足TRA-8和阿霉素之间的协同相互作用的 标准。证明细胞系2LMP对TRA-8有良好的敏感性，以及对阿霉素或 紫杉醇有敏感性。选择该细胞系以研究抗体和/或药物的体内效力。
表5.联合治疗的体外相互作用效果 TRA-8+阿霉素 TRA-8+紫杉醇 细胞系 相互作用 P值a 相互作用 P值a LCC6 协同 ＜0.001 加和 0.624 MDA-MB- 453 协同 ＜0.001 无反应c 0.615 2LMP 加和 0.153 加和 0.937 MDA-MB- 231 加和 0.663 加和 0.064 BT-474 协同 ＜0.001 NDb 0.992 ZR-75-1 协同 0.013 加和 0.172 DY36T2 NDb 0.808 NDb 0.798 MDA-MB- 468 加和 0.184 加和 0.724 SK-BR-3 加和 0.361 无反应c 0.871 aP值表示协同相互作用项的显著性。如果TRA-8和药物作用都 是显著的，并且相互作用项是显著的，那么认为联合作用是协 同的。如果相互作用P值不＜0.05，那么认为联合作用是加和的。 b未确定，因为TRA-8的作用不显著，但阿霉素/紫杉醇的作用 是显著的。 c每种试剂都没有显著的剂量反应。
(7)单独的TRA-8或与化疗和/或放疗联合的TRA-8的体内抗肿瘤 作用
剂量为200μg和600μg，每周两次，共6剂的TRA-8对于完全建 立的2LMP皮下肿瘤的肿瘤生长产生了相似的抑制(图24)。在三个额 外的独立试验中，与未处理的对照相比，200μg剂量/方案产生了对 肿瘤生长的统计学显著抑制(p＜0.004，对肿瘤加倍时间的Kruskal- Wallis检验)，并且该剂量和方案被选择用于进一步研究。图25说明 TRA-8、阿霉素或TRA-8和阿霉素的联合体系对抗肿瘤效力的作用。 与未处理的对照相比，用单独的TRA-8或TRA-8+阿霉素治疗产生了 肿瘤生长的显著抑制(p＝0.002 Kruskal-Wallis检验)，而阿霉素与对 照没有不同。TRA-8+阿霉素的联合体系比单独的这两种试剂产生更 大的生长抑制(p＝0.002)，并且比单独的这两种试剂产生更完全的肿 瘤消退(4)，单独的这两种试剂没有观察到完全的消退(p＜0.001， Fisher精确检验)。用早期生长曲线分析评估体内TRA-8和阿霉素的 协同作用。相互作用项是显著的(p＜0.001)和协同性的。在第二个 独立试验中，证实了协同相互作用。
在此相同的模型中研究了TRA-8和紫杉醇的作用，得到了相似的 观察结果(图26)。与未处理的对照相比，TRA-8和TRA-8+紫杉醇产 生了肿瘤生长的显著抑制(p＜0.001，Kruskal-Wallis检验)。用TRA-8 +紫杉醇处理的动物的肿瘤生长与紫杉醇单独处理的动物的肿瘤生长 显著不同(p＝0.008)，并且产生了3/8的完全消退，而用单独的这两 种试剂处理的动物没有表现出完全消退。对早期肿瘤生长曲线的分析 证明，协同作用是接近显著的(p＝0.063)，而加和作用是显著的(p＜ 0.001)。
最后，如图27所示，分析了作为单剂和以各种联合体系存在的 TRA-8、阿霉素和60Co放射的作用。在肿瘤加倍时间方面有显著的差 异(p＜0.001)，并且多重比较表明，用TRA-8、阿霉素和60Co的三 重治疗产生了肿瘤生长抑制，该抑制与所有其它的治疗组具有显著差 异，而双重治疗组(阿霉素+TRA-8或60Co+TRA-8)与任何一个单 试剂治疗组有显著差异。用单独的放疗处理的60Co动物与未处理的对 照没有显著差异(p＝0.926)。所有的双向处理联合体系都具有显著的 协同作用(p＜0.001)。在6/8接受三重治疗的动物中观察到了完全 的消退，并且4只动物在180天的随访中没有出现肿瘤。
(8)疗效的综合分析
体内抗肿瘤研究由166只动物组成，分析了每个治疗组中所有动 物的肿瘤加倍时间和完全肿瘤消退的频率(表6)。平均肿瘤加倍时间 的ANOVA分析表明，在治疗组之间有显著的差异(p＜0.001)，多重比 较表明，TRA-8+紫杉醇，TRA-8+阿霉素，和TRA-8+阿霉素+60Co 比任何缺乏TRA-8的治疗组都具有显著更长的平均肿瘤加倍时间。向 任何治疗方案中加入TRA-8比单独的治疗方案产生了更长的肿瘤加倍 时间。同样，对中值肿瘤加倍时间的Kruskal-Wallis检验表明，所 述中值显著不同于总体值(p＜0.001)。采用Wilcoxin符号秩检验进 行的成对比较表明，肿瘤加倍的中值时间与ANOVA多重比较具有相似 的模式。该分析低估了最有效的治疗所产生的生长抑制，因为在试验 末没有达到肿瘤加倍的组被指定为试验终止日。表6也提供了肿瘤完 全消退的频率和该消退持续到试验末的频率。在用化疗方案或放疗处 理的动物中没有观察到肿瘤的完全消退，证明了充分确立的肿瘤生长 和肿瘤侵袭。根据Fisher精确检验，治疗组之间的肿瘤完全消退频 率之间有显著差异(p＜0.001)。166只动物中的30只达到了完全消 退，这些中的28只接受单独的TRA-8或与其它方案联合。完全消退 发生在1/42对照动物中：1/54动物接受化疗、放疗或其联合；28/68 采用单独的TRA-8或TRA-8联合方案。TRA-8处理的组具有显著(p＜ 0.001)更高的完全消退频率。类似地，14/68接受TRA-8或TRA-8联 合的动物不具有肿瘤再生长，而1/42对照和0/52用化疗和/或放疗 治疗的动物。观察到无复发期为99-171天(146±24天)。
表2.2LMP肿瘤的加倍时间和完全消退的综合结果 完全消退 处理 动物数 肿瘤加倍时 间(天) (平均值/中 值) 总数 (％) 无复发 (％) 平均观察 期(天) 未处理的对照 44(42)a 12/8 1(2％) 1(2％) 177 60Co 8(7) 14/10 0 0 186 阿霉素 31(28) 17/18 0 0 197 紫杉醇 7(5) 25/20 0 0 - 阿霉素+60Co 8(8) 39/36 1(13％) 0 197 TRA-8 30(26) 47/23 6(20％) 5(17％) 159 TRA-8+60Co 8(8) 65/50 3(38％) 1(13％) 186 TRA-8+紫杉 醇 8(8) 71/62 3(38％) 1(13％) 148 TRA-8+阿霉 素 14(12) 81/64 10(71％) 3(21％) 185 TRA-8+阿霉 素+60Co 8(6) ＞140/179 6(75％) 4(50％) 192 a括号内的数字是未检查的动物
(9)经治疗的肿瘤中的细胞凋亡
采用TUNEL技术评估用TRA-8、阿霉素、TRA-8+阿霉素和TRA-8+ 紫杉醇治疗后2LMP异种移植物中的凋亡的诱导。在未处理的动物中， 肿瘤具有4％染色的细胞(1％强染色)，而用阿霉素或紫杉醇治疗具有8％ (6％强染色)和7％(2％强染色)的染色细胞。用单独的TRA-8治疗的 动物具有显著的凋亡，具有25％(15％强染色)染色的细胞。TRA-8+ 阿霉素具有28％(22％强染色)染色的细胞，TRA-8+紫杉醇具有26％(12％ 强染色)染色的细胞。
说明书中提及的任何专利或出版物说明本发明所属领域技术人员 的水平。这些专利和出版物通过引用结合到本文中，其程度如同将每 个单独的出版物具体而单独地指出通过引用结合到本文中一样。
本发明不限于实施例中公开的以上所述的保藏物或实施方案的范 围，所述实施例用来说明本发明的几个方面以及在本发明范围内的功 能等同的任何实施方案。除本文所示和所述的实施方案之外的本发明 的各种修改对于本领域技术人员是显而易见的，这些修改落入所附权 利要求书的范围内。
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<151>2000-05-02
<160>102
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>25
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Ser Leu Lys Leu
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1 5 10 15
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<212>DNA
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<400>21
atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
gtgatgctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgtaatgt cttgggttcg ccagactccg 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240
gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
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gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 540
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aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720
ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780
aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840
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acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 960
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080
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acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200
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<400>22
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<213>合成构建体
<400>23
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
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195 200 205
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
210 215 220
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
225 230 235 240
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
245 250 255
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
260 265 270
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
290 295 300
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
305 310 315 320
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
355 360 365
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
405 410 415
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
420 425 430
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
435 440 445
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210>24
<211>234
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>24
Met Lys Ser Leu Tyr Val Leu Val Tyr Thr His Tyr Leu Phe Leu Phe
1 5 10 15
Ala Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met
20 25 30
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Ser Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>25
Ser Tyr Val Met Ser
1 5
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>26
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>27
Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr
1 5 10
<210>28
<211>11
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>28
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211>7
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>29
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>30
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
1 5
<210>31
<211>119
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>31
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>32
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>32
ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag 60
caacagctac aggtgtccac 80
<210>33
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>33
tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcctctgg 80
<210>34
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>34
attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga 60
gtgggttgca accattagta 80
<210>35
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>35
gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 60
acaatgccaa gaacaccctg 80
<210>36
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>36
tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg 60
ggtgactcta tgattacgac 80
<210>37
<211>64
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>37
ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc 60
ggtc 64
<210>38
<211>60
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>38
ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa 60
<210>39
<211>80
<212>
<213>合成构建体
<400>39
tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga 60
gtggacacct gtagctgttg 80
<210>40
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>40
tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat 60
ccagaggctg cacaggagag 80
<210>41
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>41
ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac 60
tactaatggt tgcaacccac 80
<210>42
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>42
ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 60
cagggtgttc ttggcattgt 80
<210>43
<211>84
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>43
gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta 60
gtccgtcgta atcatagagt cacc 84
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>44
ttggataagc ttggcttgac 20
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>45
gaccgatggg cccttggtgg a 21
<210>46
<211>213
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>47
<211>34
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>47
cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttct 34
<210>48
<211>45
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>48
cccgaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctcttt gtgac 45
<210>49
<211>60
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>49
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<210>50
<211>48
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>50
ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc 48
<210>51
<211>57
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>51
agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg 57
<210>52
<211>48
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>52
tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt 48
<210>53
<211>63
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>53
ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat 60
ggt 63
<210>54
<211>63
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>54
cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact 60
gtg 63
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<211>711
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>55
atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60
gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtcacc 120
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180
gggaaagctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccaagc 240
aggtttagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca ccatctctag tctgcagccg 300
gaggattttg caacctatta ctgtcagcaa tatagtagtt atcggacgtt cggtcaaggc 360
accaaggtgg aaatcaaacg gactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agtaagaatt c 711
<210>56
<211>119
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>57
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>57
tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcctctgg 80
<210>58
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>58
tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga 60
gtggacacct gtagctgttg 80
<210>59
<211>119
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>59
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>60
<211>119
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>60
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211>119
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>61
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>62
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>62
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<210>63
<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>63
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cagggtgttc ttggcattgt 80
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<211>80
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>64
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gtgggttgca accattagta 80
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<212>DNA
<213>合成构建体
<400>65
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<212>DNA
<213>合成构建体
<400>66
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<212>DNA
<213>合成构建体
<400>67
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ggtgactcta tgattacgac 80
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<212>DNA
<213>合成构建体
<400>68
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<212>DNA
<213>合成构建体
<400>69
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<212>DNA
<213>合成构建体
<400>70
ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata 60
cagggtgttc ttggcattgt 80
<210>71
<211>70
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>71
gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta 60
gtccgtcgta 70
<210>72
<211>212
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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<210>73
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<212>PRT
<213>合成构建体
<400>73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
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210
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<212>PRT
<213>合成构建体
<400>74
Asp lle Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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<213>合成构建体
<400>75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>76
<211>213
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>77
<211>60
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>77
gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga 60
<210>78
<211>65
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>78
atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt 60
ccagg 65
<210>79
<211>69
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>79
cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt 60
cttaagctt 69
<210>80
<211>67
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>80
ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga 60
cagggtc 67
<210>81
<211>54
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>81
acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag 54
<210>82
<211>67
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>82
accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa 60
ccaggaa 67
<210>83
<211>72
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>83
tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga 60
tgcagacaaa ga 72
<210>84
<211>71
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>84
aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt 60
ttacaggcag t 71
<210>85
<211>72
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>85
cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg 60
ttggtaccag gc 72
<210>86
<211>63
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>86
gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc 60
tat 63
<210>87
<211>60
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>87
actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac 60
<210>88
<211>57
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>88
tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc 57
<210>89
<211>57
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>89
cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac 57
<210>90
<211>51
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>90
aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g 51
<210>91
<211>63
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>91
gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc 60
gaa 63
<210>92
<211>57
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>92
ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc 57
<210>93
<211>57
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>93
cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag 57
<210>94
<211>63
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>94
gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat 60
tat 63
<210>95
<211>57
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>95
ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc 57
<210>96
<211>57
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>96
cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag 57
<210>97
<211>51
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>97
tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a 51
<210>98
<211>51
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>98
tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c 51
<210>99
<211>49
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>99
aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc 49
<210>100
<211>45
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>100
aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc 45
<210>101
<211>30
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>101
agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa 30
<210>102
<211>63
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>102
gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc 60
gaa 63
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