检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法
阅读：77发布：2020-05-12
专利汇可以提供检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及检测体外 细胞增殖 用载体及体外细胞增殖动态检测方法。动态检测体外细胞增殖用载体，其特征在于，载体包括：依次连接的PLKO.1序列、CMV序列、eGFP序列、IRES序列和Puro序列。本发明构建的稳转细胞株，与同类细胞株相比， 荧光 亮度 强、光 稳定性 好、背景 信号 低，且对细胞的生理无显著性影响。所述检测方法包括：用本发明的载体、psPAX2载体和PMD2.G载体三载体 包装 慢病毒；用步骤一得到的慢病毒 转染 目标细胞，嘌呤霉素筛选、流式细胞术分选，得到稳转细胞株；选择合适的细胞数量加入细胞培养板中，待细胞贴壁后，高内涵细胞成像系统采集图像；处理数据，并绘制细胞增殖曲线。本发明自动化程度高，误差小，重复性好，灵敏度高。，下面是检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法专利的具体信息内容。
1.一种动态检测体外细胞增殖用载体，其特征在于，载体包括：
PLKO.1序列、CMV序列、eGFP序列、IRES序列和Puro序列；
所述PLKO.1序列、CMV序列、eGFP序列、IRES序列和Puro序列依次连接。
2.一种动态检测体外细胞增殖用载体的构建方法，其特征在于，方法是在PLKO.1-TRC载体基础上构建所述动态检测体外细胞增殖用载体，包括：
(1)通过TOPO克隆技术，用CMV启动子替换U6启动子；
(2)在CMV启动子与shRNA Construct之间，插入绿色荧光蛋白eGFP；
(3)在eGFP和shRNA Construct之间插入IRES序列。
3.权利要求2所述的动态检测体外细胞增殖用载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中在CMV启动子前插入TATA box或CAAT box调控元件。
4.权利要求2所述的构建方法，其特征在于，方法还包括：步骤(1)中在eGFP起始密码子ATG前加入Kozak序列。
5.一种体外细胞增殖动态检测方法，其特征在于，方法包括：
步骤一，用权利要求1-4中任一权利要求所述载体、psPAX2载体和PMD2.G载体三载体包装慢病毒；
步骤二，用步骤一得到的慢病毒转染目标细胞，经嘌呤霉素筛选、流式细胞术分选，得到稳转细胞株；
步骤三，将细胞加入细胞培养板中，待细胞贴壁后，高内涵细胞成像系统采集图像；
步骤四，采用高内涵细胞分析系统处理步骤三的数据，用细胞面积和荧光强度为指标选择活细胞,并绘制细胞增殖曲线。
检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于细胞检测技术领域，涉及一种动态检测体外细胞增殖的方法。
背景技术
[0002] 细胞增殖是生命体的重要特征，是指细胞在周期调控因子的作用下通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等反应进行的分裂过程。生物通过细胞增殖产生新的个体，当细胞增殖失控时，就会导致各种疾病，例如癌症就是由于肿瘤细胞在机体内无序增殖而形成的恶性肿瘤。因此，细胞增殖一直是医学研究的热点之一。细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域，其作为一种实验技术方法，不仅在研究细胞的基本生物学特征中非常重要，而且是分析细胞状态、研究遗传性状和评估应激反应的一种基本方法。
[0003] 目前检测细胞增殖的常用方法主要包括间接观察DNA合成含量和直接检测细胞代谢活性等两类方法，前者包括3H-胸腺嘧啶核苷(3H-labled thymidine,3H-TdR)掺入法、5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2-deoxyuridine,EdU)标记法、5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU),后者主要为四甲基偶氮唑盐法(3-4,5-diemethylthiazol-2-yl-2,5-dipheuyl tetrazolium bromide,MTT)。
[0004] 3H-TdR法是将放射性标记的3H-TdR掺入DNA合成期的细胞，用液体闪烁计数仪检测3H的放射活性即可反映细胞增殖能力。该方法有较好的重复性，但是由于使用了放射性的同位素，对实验者和环境有一定的危害而限制了使用；EdU/BrdU标记法是将DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物插入细胞周期S期的DNA分子中，EdU/BrdU与染料的共轭反应可以高效快速地检测细胞增殖，该方法排除了初代细胞的干扰，准确性及灵敏度较高。但是EdU/BrdU的掺入会对DNA产生损伤，从而会抑制细胞的生长，不能全面的反映细胞的增殖。
[0005] MTT法的原理是活细胞中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。在一定细胞范围内，甲瓒的量与活细胞数成正比。因此，MTT法有经济、简单、灵敏、无放射性污染等特点，成为目前检测细胞增殖最常用的方法。但是MTT法也存在一些缺点：首先，MTT的测定产物为结晶，因此需要用有毒的有机溶剂如二甲基亚砜溶解，且溶解常常不完全，影响方法的灵敏度；其次，MTT法检测的活细胞中，不仅有新增殖的细胞，也有初始的原代细胞，因此其结果不能去掉原代细胞所带来的干扰；另外，MTT法检测时对细胞造成损伤，只能使用终点法，不能用于后续研究。为克服MTT法的不足，出现了一些改良的检测方法如XTT法、MTS法、Cell Counting Kit-8(CCK-8)法等，这些方法和MTT检测条件有所不同，但是都没有很好的解决原代细胞的干扰和对细胞的损伤的两大缺陷。
[0006] 总之，目前常用的检测细胞增殖技术的主要缺点是：需要标记和破坏细胞，所以无法得到活细胞在生长时的真正状态；采用的是终点法，只能给出最终结果，所以无法对细胞的生长过程作为动态的检测和分析。
发明内容
[0007] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种动态检测体外细胞增殖用载体。
[0008] 本发明的动态检测体外细胞增殖用载体包括：PLKO.1序列、CMV序列、eGFP序列、IRES序列和Puro序列；所述PLKO.1序列、CMV序列、eGFP序列、IRES序列和Puro序列依次连接。
[0010] eGFP序列：用于编码荧光蛋白，荧光蛋白整合到基因组中，随着细胞的分裂而增殖，因此能标记细胞的数量；
[0011] IRES序列：用于招募核糖体对mRNA进行翻译，将IRES与外源基因融合，IRES能独立地起始翻译；
[0012] Puro序列：用于细胞系筛选。可以杀死没有稳定整合慢病毒载体的细胞，得到稳定整合的细胞系本发明的目的之二是提供一种动态检测体外细胞增殖用载体的构建方法，[0013] 本发明提供的动态检测体外细胞增殖用载体的构建方法是在PLKO.1-TRC载体基础上构建所述动态检测体外细胞增殖用载体，包括：
[0014] (1)通过TOPO克隆技术，用CMV启动子替换U6启动子；
[0015] (2)在CMV启动子和shRNA Construct之间插入绿色荧光蛋白eGFP；
[0016] (3)在eGFP和shRNA Construct之间，插入IRES序列。
[0017] 一种具体实施方案中，本发明的载体构建方法还包括步骤(1)中在CMV启动子前插入TATA box或CAAT box调控元件。
[0018] 一种具体实施方案中，本发明的构建方法还包括步骤(1)中在eGFP起始密码子ATG前加入Kozak序列。
[0019] 本发明的目的之三是提供一种体外细胞增殖检测方法。
[0020] 本发明的检测方法包括：
[0021] 步骤一，用本发明的载体、psPAX2载体、PMD2.G载体三载体包装慢病毒；
[0022] 步骤二，用步骤一得到的慢病毒转染目标细胞，经嘌呤霉素(puro)筛选、流式细胞术分选，得到稳转细胞株；
[0023] 步骤三，将细胞加入细胞培养板中，待细胞贴壁后，高内涵细胞成像系统采集图像；
[0024] 步骤四，高内涵细胞分析系统处理步骤三的数据：用细胞面积和荧光强度为指标选择活细胞。为了减少初始细胞的影响，本发明可采用细胞的增值率作为衡量细胞增殖的参数，并绘制细胞增殖曲线。
[0025] 在有些具体实施方案中，本发明步骤三中包括：
[0026] (1)初始细胞铺板密度为15％-50％，优选地为15％-30％；用于检测药物毒性等数量逐渐减少的实验，初始细胞铺板密度为60％-100％，优选为70％-80％。
[0027] (2)在细胞贴壁后即可以上机检测，优选地为2h-4h；用于检测药物毒性等数量逐渐减少的实验，在细胞完全贴壁后开始加药，上机检测，优选地为12h-16h。
[0028] (3)根据细胞的成长状态、培养基的情况决定是否换液，优选地为48h-72h换液一次。
[0029] 与现有方法相比，本发明有如下有益效果：
[0032] (3)该发明与MTT、CCK8等传统方法获得结果具有较好的一致性。但该发明无需染色或掺入其它成分，对细胞无损伤，可以在保持细胞结构和功能的完整性的前提下，长时间检测细胞的增殖状态，因此反映了细胞真正的生长状态；
[0033] (4)与MTT等传统方法相比，起始细胞密度允许在相对大的范围波动；
[0034] (5)用多参数选择活细胞替代单个因素选择细胞，减少了失活细胞和细胞碎片等因素的影响；
[0035] (6)用细胞的增值率代替细胞数作为衡量细胞增殖的参数，降低初始细胞密度的影响。
[0036] (7)高内涵细胞成像分析系统具有自动化、可以在单一试验用获得大量的相关信息等特点，因此基于高内涵细胞成像分析系统的本发明自动化程度高，人为参与少，可以从多个方面检测增殖，故误差小，重复性好，灵敏度高。附图说明
[0037] 图1为两种不同的转染方式(瞬转和稳转)对胃癌细胞系SGC7901荧光强度的影响图。具体而言，用瞬转和稳转两种方法将慢病毒载体PLVX-shRNA2转染细胞SGC7901。培养7天后，检测其荧光强度。结果显示：稳转细胞中的荧光强度明显高于瞬转，两者差异具有统计学意义。
[0038] 图2为两种不同的载体(上调载体和下调载体)对胃癌细胞系SGC7901中eGFP荧光强度的影响。具体而言，将GAPDH基因转入上调载体中。同时将GAPDH基因的siRNA转入下调载体中，然后分别将其转入SGC7901细胞中，培养7天后，检测eGFP的荧光强度。结果显示：下调载体中的的荧光强度明显高于上调载体中的荧光强度，两者差异具有统计学意义。
[0039] 图3为启动子和不同的调控元件联合使用对shRNA Construct的影响。具体而言，本发明在原载体克隆位点shRNA construct前分别加入IRES、U6启动子，同时设置非启动子序列为空白对照(CK)，和CMV启动子构成了CMV/U6双启动子体系组、CMV/IRES体系组、CMV单启动子体系组。通过Real Time PCR检测其对下调GAPDH的效果。结果显示：IRES的下调效果强于U6，U6强于CK。
[0040] 图4和图5是载体PLKO.1-TRC构建示意图，其中，图4是LKO.1-TRC质粒原图谱，在RRE和shRNA construct之间，仅有U6启动子启动；图5是改建后的载体PLKO.1-GFP-IRES-puro构建区域示意图；具体而言，用CMV启动子替代U6启动子，同时设计TATA box、CAAT box等各种调控元件，可以增强启动子的效果；在CMV启动子后直接插入eGFP，使细胞中表达的eGFP荧光强度更强、持续时间更久；在eGFP起始密码子ATG前，加入Kozak序列(GCCACC)，增强eGFP的翻译效率；在eGFP和shRNA construct加入IRES，IRES能独立地启动下游shRNA construct，不会明显影响该质粒的原有功能。
[0041] 图6为多参数选择细胞(Parameters)与非参数(Nonpara)选择细胞对细胞数的影响图。具体而言，非参数选择细胞的误差大，而多参数选择细胞时，误差小。这是由于用细胞面积和细胞荧光强度等参数联合选择细胞中，可以去除坏细胞碎片或凋亡细胞的影响，因此所选细胞为正常状态的细胞。
[0042] 图7为MTT和HSC两种方法检测起始细胞密度(铺板率)对细胞增值率的影响结果。具体而言，当用HSC检测其影响时，不同密度的细胞之间细胞增值率无显著差异；而当MTT法检测时，不同密度的细胞之间细胞增值率有显著性差异。这是因为MTT法是用溶液吸光度间接反映活细胞数量，而检测吸光度的仪器酶联免疫检测仪的工作原理是Lambert-Beer定理，因此，只有在一定范围内，吸光度与溶液浓度成正比。当溶液浓度过大或过小超过其直线范围会引入误差；而HSC检测的是细胞数量，则无此限值。本发明可采用细胞的增值率作为衡量细胞增殖的参数。
[0043] 图8为本发明与两种传统研究方法(MTT法和CCK8kit)的细胞增殖曲线图。具体而言，按1X104的细胞浓度将细胞加入96孔板中，每个样本重复3-5次，同时设置空白对照。24小时后，放入高内涵活细胞培养站中，用Cellomics Scan系统每隔24h采集图像1次，连续观测7天；同时每隔24小时，分别取出一板，用MTT法和CCK8kit检测细胞增殖并绘制细胞增殖曲线。结果显示本发明的检测结果与MTT、CCK8kit具有较好的一致性，且本发明的误差更小。
具体实施方式
[0044] 本发明的检测方法适用贴壁细胞的检测，不适用于悬浮细胞的检测。同一种细胞仅需构建一次稳转细胞株，后续试验无需构建细胞株，可直接使用第一次构建的稳转细胞株上机即可。
[0045] 为阐述本发明采取的技术手段及其效果，以下以胃癌细胞系SGC7901为例，结合附图和实施例，进一步说明说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
[0046] (1)转染体系的选择
[0047] 常规的转染体系分为瞬时转染(瞬转)体系和稳定转染(稳转)体系两大类。在本发明的早期试验中，发明人发现，稳转细胞的转染率、荧光强度、荧光的表达时间皆优于瞬转(如图1所示)。这是由于瞬转时，外源DNA/RNA不整合到宿主基因组中，因此不能随着细胞的分裂而复制。随着细胞的增殖，平均每个细胞中的外源DNA/RNA不断减少，效果也随之减弱直至消失；而稳转时外源性DNA/RNA整合到宿主基因组中，会随着细胞的分裂而复制，因此能稳定表达。本发明检测细胞增殖的时间一般为7天，根据需要可达14天，因此选择稳定转染体系构建稳转细胞系。
[0048] 目前，主要通过逆转录病毒和慢病毒构建稳转细胞系。逆转录病毒表达时间快，但是只能感染分裂期细胞，不能感染非分裂期细胞，同时能容纳外源性目的基因片段小；慢病毒不但可以感染分裂期细胞，还可以感染非分裂期细胞，同时还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，因此本发明选用慢病毒构建稳转细胞系。
[0049] (2)载体的选择
[0050] 慢病毒载体由表达载体和包装载体组成，其中包装载体提供所有的转录并包装RNA到重组的慢病毒载体所有的辅助载体，一般是不可变动的；表达载体携带目的基因病并与包装载体共转染细胞并在细胞中进行慢病毒的包装，是慢病毒构建过程中的改装的区域。
[0051] 慢病毒表达载体分为上调载体和下调载体。在本发明的早期实验中，我们发现，我们发现，下调载体的荧光强度、表达时间明显强于过表达载体(如图2所示)，因此，本发明载体首选下调载体。
[0052] (3)启动子的选择
[0053] 本发明比较了慢病毒表达载体常用的CMV启动子和U6启动子对eGFP表达的影响，研究发现：CMV启动eGFP的能力明显优于U6启动子，因此本发明选用CMV启动子。
[0054] 在稳定表达eGFP的同时，为了不影响载体的功能，本发明比较了双启动子、启动子/IRES的效果。本发明在原载体克隆位点shRNA construct前分别加入IRES、U6启动子，同时设置原载体为空白对照(CK)。结果显示：IRES的下调效果强于U6，U6强于CK(如图3)。因此，本发明选用启动子/IRES体系。
[0055] (4)序列合成
[0056] 查阅文献，找到已公布的、允许免费使用的CMV序列、IRES序列、eGFP序列，同时选用下调载体PLKO.1-TRC。然后在CMV启动子前后设计TATA box、CAAT box等调控元件，优化IRES序列，同时在eGFP前加入Kozak序列(如图4-5所示)。化学合成这些序列。
[0057] CMV序列：
[0058] TTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC
[0059] IRES序列：
[0060] ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAA
[0061] eGFP序列：
[0062] GCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
[0063] (5)构建PLKO.1-GFP-IRES-puro载体
[0064] I、线性化载体PLKO.1-TRC:根据PLKO.1-TRC的基因序列，在U6启动子两端，设计反向克隆引物(如表1所示)，通过反向PCR扩增，线性化PLKO.1-TRC同时去除U6启动子，然后电泳、回收PCR产物。具体步骤如下：
[0065] PCR反应体系：在冰上配制如表2所示的优化PCR反应系统。其中超保真DNA聚合酶为Vazyme公司的Phanta-Super-Fidelity DNA Polymerase(货号：P501)。
[0066] 表1:构建PLKO.1-GFP-IRES-puro载体所用的引物序列
[0067]
[0068] 表2：PCR反应体系
[0069]
[0070]
[0071] PCR反应程序：用美国Bio-RAD公司PTC-200PCR按表3所示的优化条件扩增目标片段。
[0072] 表3：PCR反应条件
[0073]名称 循环数 循环步骤
预变性 1 98℃，3min
扩增 35 98℃，10sec；68℃，30sec；72℃，30sec
延伸 1 72℃，10min
保温 1 4℃,forever
预变性 1 98℃，3min
扩增 35 98℃，10sec；68℃，30sec；72℃，30sec
延伸 1 72℃，10min
保温 1 4℃,forever
[0074] PCR片段回收：0.8％的琼脂糖电泳分离PCR反应液。在紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司，货号:AP-GX-50)回收DNA,Nanodrop 2000(Thermo Scientific公司)检测DNA浓度和纯度。
[0075] II、亚克隆：用Phanta-Super-Fidelity DNA Polymerase扩增、回收线性化的PLKO-TRC、CMV、IRES、eGFP片段(引物参见表1所示)；用ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme公司，货号：C113)重组线性化的PLKO-TRC、CMV、IRES、eGFP；转化；克隆鉴定。具体步骤如下：
[0076] PCR扩增：同上
[0077] 重组反应：在冰上配制按照ClonExpress-MμltiS One Step Cloning Kit说明配制如表4所示的优化重组反应系统；然后与37℃孵育30min；反应完成后，迅速将其放于冰上冰浴5min。
[0078] 表4：重组反应体系
[0079]
[0080]
[0081] 转化：取重组反应液10μl加入100μl感受态细胞DH5α中，冰浴30min。然后42℃热激90sec后，迅速冰浴5min。加入800μl无抗生素SOC培养基，37℃，200rpm摇菌30min。最后取
100μl菌液涂布于含Amp的平板后，37℃过夜培养。
100μl菌液涂布于含Amp的平板后，37℃过夜培养。
[0082] 克隆鉴定：挑5-10个单克隆，于37℃、200rpm条件下过夜摇菌。然后从菌体中取1μl当PCR模板，PCR鉴定(检测引物见表5)。取阳性克隆子提质粒，Takara公司测序(测序引物见表5)。
[0083] 表5：鉴定引物和测序引物
[0084]序号 引物名称 序列序列(5'to3') 说明
1 Dec-F CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG 鉴定引物正向序列
2 Dec-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 鉴定引物反向序列
3 Seq-F ATAGAGTTAGGCAGGGAT 测序引物正向序列
4 Seq-R AAATGATTGAAGCAGGAG 测序引物反向序列
1 Dec-F CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG 鉴定引物正向序列
2 Dec-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 鉴定引物反向序列
3 Seq-F ATAGAGTTAGGCAGGGAT 测序引物正向序列
4 Seq-R AAATGATTGAAGCAGGAG 测序引物反向序列
[0085] (6)慢病毒包装
[0086] I、共转染：将PLKO.1-GFP-IRES-puro、psPAX2、pMD2.G定量后按4：3：1的比例共转染293T细胞。转染前将细胞密度控制在70％～～80％。
[0087] 以6cm plate为例：
[0088]组分 用量
PLKO.1-GFP-IRES-puro 4μg
psPAX2 3μg
pMD2.G 1μg
lipofectamine2000 20μl
PLKO.1-GFP-IRES-puro 4μg
psPAX2 3μg
pMD2.G 1μg
lipofectamine2000 20μl
[0089] 按lipofectamine2000(Invitrogen公司，货号：11668-027)说明进行转染。
[0090] 8h后换液，加5ml DMEM完全培养基继续培养。
[0091] II、收获病毒
[0092] 换液后24h第一次收取上清液。将上清液移入15ml离心管4℃保存，再加入5ml新鲜DMEM完全培养基继续培养。
[0093] 24h后第二次收取上清液,并与前日收集上清液混合。4℃，1250rpm，离心5min去除293T细胞，收集上清即为病毒原液。
[0094] III、病毒浓缩
[0095] (1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766g；PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121℃、30min湿热灭绝30min；保存在4℃。
[0096] (2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
[0097] (3)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5ml；
[0098] (4)每20～30min混合一次，共进行3-5次；
[0099] (5)4℃放置过夜；
[0100] (6)4℃，4000g，离心20min；
[0101] (7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
[0102] (8)加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
[0103] (9)将病毒悬液分装成50μl每份，保存在冻存管中。用碎干冰速冻后储存在-80℃。
[0104] (7)细胞转染
[0105] I、慢病毒转染前12-18h，用5000cells/孔的浓度将细胞铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时铺板率30％左右。
[0106] II、第二天，用无血清的培养基Opti-MEM替换原培养基培养2-4h，然后按梯度加入病毒悬液(1μl、10μl、100μl)。37℃孵育4-6h。
[0107] III、用新鲜完全培养基替换含有病毒的培养基。
[0108] IV、继续培养。一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
[0109] V、用0.1～～10μg/ml puromycin进行筛选2-3代，流式细胞仪分选。
[0110] 备注：此步得到的细胞可以视为稳定细胞株，可以长期传代、保存。
[0111] (8)高内涵采集图像
[0112] I、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至1X104。取稀释后的细胞悬液加入96孔板中，每孔加入200μl。每个样本重复3-5次，并设置只加培养基的空白对照孔，边缘孔用无菌PBS填充。
[0113] II、放入CO2培养箱中，在5％CO2，37℃条件下孵育2-4小时，细胞贴壁后放入高内涵活细胞培养站中。
[0114] III、用Cellomics Scan系统选择曝光时间，每隔24h采集图像1次，连续观测7天。
[0116] I、为了降低细胞碎片、坏死细胞、凋亡细胞的影响(如图6所示)，本发明用DISK MODE软件统计每孔细胞面积、荧光强度等参数，然后结合细胞形态学选择合适的范围。一般参数范围：细胞的面积范围为细胞平均面积的0.5～2倍，荧光强度为平均荧光强度的0.5～10倍。在此范围内的细胞为正常细胞。计算每孔的细胞数。
[0117] II、本发明的起始细胞数允许在范围大(如图7所示)，为了降低各孔间起始细胞数量的影响，本发明以时间为X轴，细胞增殖速率为Y轴绘制细胞生长曲线(如图8所示)。其中细胞增殖速率＝(时间点对应的细胞数-起始细胞数)/起始细胞数。
[0118] 实施例二：常用的细胞增殖检测方式--MTT法
[0119] 1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至1X 104。取稀释后的细胞悬液加入96孔板中，每孔加入200μl。每个样本重复3-5次，并设置只加培养基的空白对照孔，边缘孔用无菌PBS填充。共接种7块96孔板。
[0120] 2、放入CO2培养箱中，5％CO2，37℃孵育。以后每隔2天换液一次。
[0121] 3、第二天，取出一块96孔板，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4小时。
[0122] 4、小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μl DMSO,置摇床上低速振荡10分钟，是结晶充分溶解。
[0123] 5、在酶联免疫检测仪上，选择490nm处测量各孔的吸光值，计算其平均值。
[0124] 6、以后每隔24小时，取出一块96孔板重复步骤3-5。
[0125] 7、以时间为X轴，吸光度为Y轴绘制细胞生长曲线(如图8所示)。
[0126] 实施例三：常用的细胞增殖检测试剂盒--CCK-8法
[0127] 1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至1X104。取稀释后的细胞悬液加入96孔板中，每孔加入200μl。每个样本重复3-5次，并设置只加培养基的空白对照孔，边缘孔用无菌PBS填充。共接种7块96孔板。
[0128] 2、放入CO2培养箱中，5％CO2，37℃孵育。以后每隔2天换液一次。
[0129] 3、第二天，取出一块96孔板，每孔加入20μl Cell Counting kit溶液，继续培养4小时。
[0130] 4、在酶联免疫检测仪上，选择450nm处测量各孔的吸光值，计算其平均值。
[0131] 5、以后每隔24小时，取出一块96孔板重复步骤3-4。6、以时间为X轴，吸光度为Y轴绘制细胞生长曲线(如图8所示)。
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