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一种抑制肿瘤 细胞增殖的药物组合物

阅读：175发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物。所述的组合物，包括活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯和阿霉素以及药剂学上必要的辅料，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和阿霉素的摩尔比为400：1-20：1。本发明实验证实，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯与Doxorubicin制成的组合物，或在给予Doxorubicin时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Doxorubicin抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。对裸鼠肝脏和肾脏基本没有毒性，且活性成分中的表没食子儿茶素没食子酸酯资源丰富，价格低廉，在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。，下面是一种抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）阿霉素；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和阿霉素的摩尔比为400：1-20:1。
2.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和阿霉素的摩尔比为400:1～100:1。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和阿霉素的摩尔比为400:1～200:1。
4.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝癌。
6.一种抑制肿瘤细胞增长的方法，其特征在于，在肿瘤细胞中加入权利要求1所述组合物。
7.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是SK-Hep-1细胞。

说明书全文

一种抑制肿瘤 细胞增殖的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明属于医药及基因工程领域，涉及抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及含有表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与阿霉素（Doxorubicin）的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

背景技术

[0002] 阿霉素，即Adriamycin (Doxorubicin,ADM)，别名：羟柔红霉素、羟正定霉素、多柔比星、ADR。阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首先药物。本品为广谱抗肿瘤药，对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用。其作用机理主要是本品嵌入DNA而抑制核酸的合成。临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、何杰金和非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱瘤、甲状腺瘤、绒毛膜上皮癌、前列腺癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。

[0003] 主要的毒性反应有，白细胞和血小板减少，约60%~80%的病人可发生；100%的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为心律失常，ST-T改变，多出现在停药后的1~6个月，及早应用维生素B6和辅酶Q10可减低其对心脏的毒性；恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。另外，用药后尿液可出现红色。

[0004] 茶叶( tea ,camellia sinensis) 是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20%为绿茶、78%为红茶、2%为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

[0005] 绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30%左右，茶多酚中大部分为儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯〔( - ) epigallocatechin gallate ( EGCG) 〕含量最高，占儿茶素的80%左右。EGCG分子式为 C22H18O11，分子量为458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。但是绿茶提取物毕竟不是细胞毒类药物，在体外对肿瘤细胞的直接杀伤作用不明显。绿茶提取物及其主要成分不会也不能取代现有的抗肿瘤药物，其独特价值在于作为肿瘤化疗中的生化调节剂，有望增强现有抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，降低抗肿瘤药物的毒性。

[0006] 迄今为止，尚未见有关EGCG与Doxorubicin联合使用的报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及含有表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与阿霉素（Doxorubicin）的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

[0008] 本发明实验证实，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Doxorubicin（阿霉素）制成的组合物，或在给予Doxorubicin（阿霉素）时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Doxorubicin抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。

[0009] 本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）Doxorubicin；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和Doxorubicin的摩尔比为400：1-20：1。

[0010] 本发明中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯其分子式为 C22H18O11，分子量为458.4，可以通过市场销售途径获得。例如，本发明的EGCG购自Sigma公司，货号50299，英文全称：(�)-cis-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-gallate, (�)-cis-3,3′,4′,5,5′,7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG；CAS号：989-51-5。MDL号：MFCD00075940。

[0011] 本发明中，所述的Doxorubicin通用名：阿霉素；Doxorubicin是DNA、RNA合成抑制剂。例如本发明的阿霉素购自Sigma公司，货号为D1515。相关参数如下：CAS号: 25316-40-9
Empirical Formula (Hill Notation): C27H29NO11 · HCl
分子量:579.98
Beilstein注册号: 4229251
EC号: 246-818-3
MDL 号： MFCD00077757。

[0012] 本发明中，将制成的含有EGCG和Doxorubicin的组合物用于肿瘤细胞（例如，肝癌细胞株SK-Hep1），结果显示，与仅使用Doxorubicin相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。所述组合物的使用能明显降低Doxorubicin的单独使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。

[0013] 本发明中，将EGCG和Doxorubicin的组合物用于裸鼠移植瘤模型，结果显示，与仅使用Doxorubicin相比，本发明的组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强，并且效果优于雷帕霉素与Doxorubicin组合物。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，EGCG和Doxorubicin联合使用时对裸鼠体重没有明显影响，并且所述的组合物对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性，而雷帕霉素和Doxorubicin联合使用则对裸鼠的肝脏和肾脏有较高毒性。

[0014] 本发明中，采用所述的组合物与单独使用EGCG或者Doxorubicin进行了比较试验，结果显示，所述的组合物在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG和Doxorubicin浓度梯度效应。本发明的实施例中列举了EGCG和Doxorubicin含量摩尔比分别为20:1,100:1，200：1，等等，实验表明，在两者含量为400：1-20:1的范围都是有效果的。

[0015] 本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，其包括步骤：在肿瘤细胞中加入EGCG和Doxorubicin组合物，EGCG和Doxorubicin的摩尔比为400：1-20:1。

[0016] 所述的肿瘤细胞可以是SK-Hep1细胞。

[0017] 本发明所使用的细胞均购自ATCC。

[0018] 本发明的组合物，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

[0019] 以本发明的EGCG与Doxorubicin的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和Doxorubicin可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与Doxorubicin的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

[0020] 本发明中，EGCG与Doxorubicin的组合物可以是针剂或者片剂。

[0021] 当本发明的EGCG与Doxorubicin的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量中通常至少约50毫克EGCG/千克体重。每三周一次，以60－75mg/m2给药当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

[0022] 本发明提供了一种新的含EGCG和Doxorubicin的组合物。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。能明显增强Doxorubicin的抗肿瘤效果，同时相对减少了Doxorubicin的用量及药物成本。

[0023] 由于本发明组合物中的EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

具体实施方式

[0024] 实施例1 EGCG与Doxorubicin的协同效果在SK-hep-1细胞中，EGCG与Doxorubicin的协同效果比较显著。固定Doxorubicin的浓度为0.05μM，EGCG采用浓度为1，5,10,15, 20, 其中效果最好的为是0.05：20，结果见下表。

[0025] 本实施例进一步验证了EGCG与Doxorubicin的联用效果，结果证明在一定的浓度范围内CI值均小于1，两种药物有协同作用。结果表明EGCG与Doxorubicin联合使用可以提高Doxorubicin的抗肿瘤效果。

[0026] 表1Doxorubicin药物浓度 EGCG药物浓度 Doxorubicin单用抑制率 Doxorubicin-EGCG联用抑制率（uM） (uM) （%）（%）
SK-hep-1 0.05 20 60.75 73.7
实施例2 EGCG与Doxorubicin有协同效应
在五种肿瘤细胞系中固定EGCG的浓度，与Doxorubicin联合用药。采用下述金氏公式Q值来评价联用效果。

[0027] Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)其中，Ea+b为合并用药抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率；
分子代表实际测量的两药合并抑制率，分母是期待合并抑制率。

[0028] Q=0.85-1.15范围表示单纯相加，Q=1.15-2范围表示有增强，Q>2表示明显增强，Q<0.55-0.85表示有拮抗效应，Q<0.55表示明显拮抗。

[0029] 结果表明， EGCG与Doxorubicin在特定的细胞株中均有一定的协同效果，说明EGCG在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。

[0030] 表2 EGCG与Doxorubicin的联合用药效果Q值Doxorubicin
SK-Hep1 1.252831
YY1 0.932059
L02 0.963316
Focus 0.986501
PLC 1.023065
为了验证以上实验结果，进一步使用等比联用的方法，用CI（combination index）值来评价联用效果。CI=D1/DX1+D2/DX2+αD1D2/DX1DX2，其中D1、D2为两药合用时产生X效应时两药各自所需浓度，DX1、DX2为两药单独使用时产生X效应时两药各自浓度。α= 0为两种相互排斥性药物，α= 1为两种相互非排斥性药物。CI < 1为协同作用；CI = 1为相加作用；
CI > 1为拮抗作用。在SK-Hep1细胞中，Doxorubicin与EGCG等比联用，结果显示，在一定的浓度范围内CI值均小于1。说明Q值和CI值评价效果一致，在SK-Hep1细胞中EGCG与Doxorubicin联用时均具有协同效应。

[0031] 实施例3 EGCG对裸鼠异种移植瘤生长时对机体的毒副作用BALB/C-nu/nu裸鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养4周-6周。将SK-Hep1细胞取
6
3×10 注射在裸鼠的右侧腋下。瘤体形成后，对照组每天腹腔注射生理盐水；羧甲基纤维素钠组每天口服含0.5% 羧甲基纤维素钠的生理盐水；索拉非尼组剂量为60 mg/kg体重/天，口服；EGCG组剂量为25 mg/kg体重/天或50 mg/kg体重/天，腹腔注射。SK-Hep1细胞裸鼠模型共给药13天。

[0032] 1， EGCG对裸鼠体重的影响裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测SK-Hep1细胞的异种移植瘤模型中裸鼠体重的变化情况可以对药物的毒性作一个直观的评价。结果显示，25 mg/kg EGCG和
50 mg/kg EGCG对裸鼠体重基本无影响，说明毒副作用较低；阳性对照索拉非尼对裸鼠体重也基本无影响。

[0033] 2， EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的毒性通过检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量，尿素氮（BUN）肌酐（CREA）和胆

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