用于抗原特异性T细胞增殖的方法
阅读：501发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于抗原特异性T细胞增殖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种体外用于激发适合施用于 肿瘤 患者的遗传修饰的T细胞的方法。本发明也涉及通过所述方法获得的组合物及其用途。，下面是用于抗原特异性T细胞增殖的方法专利的具体信息内容。
1.一种体外用于激发适合施用于肿瘤患者的遗传修饰的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的方法，所述方法包括共培养来自待治疗患者的表达肿瘤抗原受体的靶T细胞、树突细胞、抗CD3抗体和针对抗原呈递细胞（APC）上的MHC I类和/或MHC II类抗原已经致敏的淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤抗原受体选自T细胞受体（TCR）和嵌合抗原受体（CAR）。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中，所述致敏由包括培养非增殖抗原呈递细胞与外周血单核细胞（PBMC）的混合白细胞反应诱导，其中，所述PBMC相对于非增殖抗原呈递细胞是同种异体的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞选自由PBMC和单核细胞来源的树突细胞组成的组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，通过首先在包含GM-CSF和IL-4的组合物中培养单核细胞约1-7天以获得未成熟树突细胞，以及随后加入能使未成熟树突细胞成为成熟树突细胞的第二组合物通过培养至少约12小时，获得树突细胞。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述APC相对于所述淋巴细胞是同种异体的。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二组合物包含TNFα、IL-1β、干扰素γ、干扰素α或β和TLR3配体，如聚I:C和/或TLR4配体。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二组合物包含TNFα、干扰素γ、TLR3配体和/或TLR4配体，和TLR7和/或TLR8激动剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述TLR3配体是聚I:C，以及TLR8激动剂是R848。
10.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，所述细胞培养约4-20天。
11.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21。
12.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，所述激发的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞通过与新树突细胞、抗CD3抗体、新致敏的同种异体淋巴细胞一起培养，以及任选地向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21被再刺激。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法获得的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。
14.适合施用于患者的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，其中所述CD4+和/或CD8+T细胞：
－具有增殖能力
－至多40%的细胞应该表现膜联蛋白V阳性染色，和/或
－在其细胞表面表达CD27和/或CD28。
15.根据权利要求13或14所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞用作为药物。
16.根据权利要求13或14所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，用作为治疗肿瘤或在人中引发抗肿瘤免疫学反应的药物。
17.根据权利要求16所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，其中，所述CD4+和/或CD8+T细胞与治疗性癌症疫苗组合施用。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，其中，在第一次刺激后施用所述CD4+和/或CD8+T细胞。
19.根据权利要求16-17中任一项所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，其中，在再刺激后施用所述CD4+和/或CD8+T细胞。
20.根据权利要求13或14所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的用途，用于制备治疗肿瘤或在人中引发抗肿瘤免疫学反应的药物。
21.根据权利要求20的用途，其中，所述CD4+和/或CD8+T细胞与治疗性癌症疫苗组合施用。
22.根据权利要求20-21中任一项的用途，其中，在第一次刺激后施用所述CD4+和/或CD8+T细胞。
23.根据权利要求20-21中任一项的用途，其中，在再刺激后施用所述CD4+和/或CD8+T细胞。
用于抗原特异性T细胞增殖的方法
技术领域
背景技术
[0002] T细胞识别肿瘤或感染细胞并且通过杀伤这些靶细胞防止疾病的发作。然而，肿瘤或病原体与免疫系统的相互作用是复杂的，这通过在存在特异性T细胞时癌症或慢性感染发展，从而病原体或肿瘤明显地可以逃避T细胞监视得到证实。
[0003] 事实上T细胞检测任何致病入侵者的能力是由其非常多样的受体库赋予的，受体库允许T细胞池识别由主要组织相容性复合体（MHC）分子递呈的大量的肽。而且，通过T细胞受体（TCR）(信号1)的信号转导不足以产生充分的T细胞活化，因为共刺激分子提供了用于增殖、存活和分化所不可缺少的信号（信号2）。实际上，仅接受信号1而没有信号2的原初T细胞被认为是无活动力（非反应）的或通过细胞凋亡而死亡。完全的T细胞活化需要信号1和2共同起作用，并且这些信号的强度决定了接着产生的T细胞池的大小。而且，完全分化为效应T细胞通常依赖于第三信号，其由抗原呈递细胞（APC）以可溶性形式提供，并提供用于需要的效应T细胞类型的指导性信号。这个“三个信号”的概念描述了用于活化原初T细胞以及随后形成效应T细胞的模型。然而，免疫系统提供了大量多种共刺激分子并且这些多种类型的信号2和3均以其独特的方式有助于T细胞反应的质量。共刺激分子和可溶性形式的信号3可作用于T细胞活化的特定方面，如存活、细胞周期进程、待发展的效应细胞的类型和分化成效应细胞或记忆细胞。
[0004] 现在普遍接受了成熟的抗原呈递树突细胞（DC）需要由其它淋巴细胞，包括CD4+T+细胞、NK细胞和NKT细胞“辅助”，以诱导长期生存的记忆CD8T细胞。这种“辅助”诱导所述成熟DC进一步分化，这个过程称为激活（licensing）。“辅助”信号对DC有多种作用，包括上调共刺激分子、分泌细胞因子和上调多种抗细胞凋亡分子，这些都累积性地增强DC最+
佳活化同源T细胞，特别是CD8T细胞的能力。而且，“辅助”淋巴细胞也可表达或分泌直接影响T细胞存活、细胞周期进程、待发展的效应细胞类型和分化成效应细胞或记忆细胞的因子。
佳活化同源T细胞，特别是CD8T细胞的能力。而且，“辅助”淋巴细胞也可表达或分泌直接影响T细胞存活、细胞周期进程、待发展的效应细胞类型和分化成效应细胞或记忆细胞的因子。
[0005] 用于对抗慢性感染或侵袭性癌症的一个策略是过继T细胞治疗，其涉及将效应T细胞转移以恢复宿主中的特异性T细胞反应。最近获得需要的特异性的T细胞的技术发展对于在不同临床环境下使用过继T细胞治疗已经引起了越来越大的兴趣。过继细胞转移治疗是施用间接体内活化并扩增的自体肿瘤反应性T细胞。在癌症治疗中使用过继细胞转移治疗有几个潜在优点。肿瘤特异性T细胞可以在间接体内被活化并扩增至大的数量，而不依赖于肿瘤的免疫原性，并且在过继转移前可以对T细胞的功能和表型性质进行选择。
[0006] 过继转移后，对于T细胞必需发生几个事件以引起确定的肿瘤的衰退。更具体而言：T细胞必需通过抗原特异性再刺激在体内被活化，然后T细胞必需被扩增至能够引起显著的肿瘤负荷破坏的水平，抗肿瘤细胞必需存活足够长时间以完成所有肿瘤细胞的消除。
[0007] 以前，用于选择过继转移至实体瘤患者的细胞的标准是在共培养后抗肿瘤T细胞释放IFN-γ并杀伤肿瘤细胞的能力。然而，现在明白了仅仅这些标准不能预测体内效力。Gattinoni等,J.Clin.Invest.115:1616-1626(2005)发现：获得完全效应子性质并且在体+
外显示增强的抗肿瘤反应性的CD8T细胞在体内引发肿瘤衰退和治愈中效果较差。
外显示增强的抗肿瘤反应性的CD8T细胞在体内引发肿瘤衰退和治愈中效果较差。
[0008] 根据现有技术的方法需要一次或多次再刺激以达到肿瘤特异性细胞毒性T细胞的临床相关水平。参见例如Ho等(Journal of Immunological Methods,310(2006),40-50)和Gritzapis等(J.Immunol.,2008;181;146-154)，其中需要再刺激1-2次以达到约19%的+肿瘤特异性CD8T细胞水平。再刺激使得细胞活性降低并接近细胞凋亡。
[0009] 将基因转移到原代人淋巴细胞允许引入可以赋予工程细胞抗肿瘤特异性的肿瘤抗原受体分子（Vera等，Curr Gene Ther.2009;9:396-408.;Sadelain等，Nat Rev Cancer.2003;3:35-45;Murphy等，Immunity.2005;22:403-414.）。可以将自体外周血淋巴细胞（PBL）修饰以表达肿瘤抗原反应性T细胞受体（TCR）。Yang等（J.Immunother.,2010,vol.33;648-658）公开了一种通过体外转导产生抗肿瘤T细胞的方法。他们使用慢病毒介+ +导的系统遗传修饰CD8T细胞以表达抗肿瘤T细胞抗原受体（TCR）。为了有效地扩增CD8T细胞，使用了由来自同种异体外周血单核细胞（PBMC）的照射的饲养细胞和抗CD3抗体组成的快速扩增（REP）方案（Ridell等，美国专利号5,827,642；1998）。然而，虽然在体外扩增T细胞中非常高效，但是REP方案通常诱导非最佳能力的T细胞在再输注后存活和扩增（Robbins等，Journal of Immunology,2004,173:7125-30）。
[0010] 因此，非常需要制备在再输注后增加抗原特异性T细胞增殖和存活的用于过继免疫治疗的T细胞群的方法。
发明内容
[0011] 本发明涉及一种体外用于激发适合施用于肿瘤患者的遗传修饰的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的方法。所述方法包括共培养来自待治疗的患者的表达抗原受体的靶T细胞、树突细胞、抗CD3抗体和针对抗原呈递细胞（APC）上的MHC I类和/或II类抗原已经致敏的淋巴细胞。
[0013] 图1说明，在常规MLR中的照射的同种异体外周血单核细胞（PBMC）上表达的MHC抗原致敏的淋巴细胞（=同种异体致敏的同种异体淋巴细胞；ASAL）显著增强了在共培养的相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的成熟单核细胞来源的DC上CD70的表达。
[0014] 图2说明，γ射线照射的ASAL增强了共培养的相对于用于引发ASAL的照射的PBMC为自体的成熟单核细胞来源的DC上CD70的表达。
[0015] 图3说明，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC的共培养诱导大量产生IL-12。
[0016] 图4说明，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC的共培养诱导大量产生IFN-γ。
[0017] 图5说明，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC的共培养诱导大量产生IL-2。
[0018] 图6说明，IL-2、IL-12和IFN-γ的产生，以及作为成熟单核细胞来源的DC与去+ + +除CD4、CD8 或CD56 淋巴细胞的ASAL的共培养的结果。
[0019] 图7说明，ASAL与相对于用于引发ASAL的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的+DC的共培养，增加了非致敏的同种异体CD8T细胞的增殖反应。
[0020] 图8说明，在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间，向相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的单核细胞来源DC加入照射的ASAL，当用相对于用于初次靶细胞刺激的DC为+自体的B细胞再刺激表达CD27的同种异体反应性CD8 靶细胞时，导致这些靶细胞数目增加。
[0021] 图9说明，在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间，向相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的照射PBMC加入照射的ASAL，当用相对于用于初次靶细胞刺激的DC为自体的B细胞再刺激细胞凋亡（膜联蛋白V阳性）靶细胞时，导致这些靶细胞数目降低。
[0022] 图10说明，在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间，向相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的照射的单核细胞来源DC加入照射的ASAL，当用相对于用于初次靶细胞刺+激的DC为自体的B细胞再刺激这些同种异体反应性CD8 靶细胞时，导致更强的（6倍）二次增殖反应。
[0023] 图11说明，在初次刺激同种异体CD8+靶细胞期间，向相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的照射的单核细胞来源DC加入照射的ASAL，当用相对于用于初次靶细胞刺+激的DC为自体的B细胞再刺激这些同种异体反应CD8 靶细胞时，导致大量增加IFN-γ的产生。
[0024] 图12说明，向相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的成熟的、单核细胞来源的DC加入照射的ASAL，增加了表达CD64的DC的数目，所述CD64为抗CD3抗体的Fc-γ受体。
[0025] 图13说明，与用REP方案扩增的T细胞相比，ASAL方案诱导的T细胞对诱导细胞凋亡的H2O2处理的抗性更强，所述ASAL方案中，CD3+靶T细胞（非转染的）与成熟DC和照射的ASAL在添加OKT3（抗CD3抗体）和IL-2的培养基中共培养并扩增12天。
[0026] 图14说明，与用REP方案扩增的T细胞相比，ASAL方案诱导的T细胞对诱导细胞凋亡的阿霉素处理的抗性更强，所述ASAL方案中，CD3+靶T细胞（非转染的）与成熟DC和照射的ASAL在添加OKT3（抗CD3抗体）和IL-2的培养基中共培养并扩增12天。
[0027] 图15说明，用针对成胶质细胞瘤癌细胞上表达的GD2抗原的嵌合抗原受体（CAR）对CD3+T细胞的有效的慢病毒转染（转染细胞>40%）。
[0028] 图16说明，与标准REP方案相比，ASAL方案诱导相似的CAR转染的CD3+T细胞的扩增。
[0029] 图17说明，与REP方案相比，ASAL方案优选扩增CAR转染的CD8+T细胞。
[0030] 图18说明，与REP方案相比，ASAL方案诱导相似的或更高数目的表达CD27的CAR转染的CD3+T细胞。
[0031] 图19说明，ASAL方案扩增了CAR转染的T细胞，该T细胞的特异性杀伤表达GD2的肿瘤细胞的能力与用REP方案扩增的CAR转染的T细胞的特异性杀伤能力相似。不相关的T2细胞用作对照靶细胞。菱形（◆）＝REP对GD2阴性靶细胞；象限（■）＝ASAL对GD2阴性靶细胞；三角形（▲）＝REP对表达GD2的靶细胞；十字（X）=ASAL对表达GD2的靶细胞。
[0032] 图20说明，与用REP方案扩增的CAR转染的T细胞相比，当CAR转染的T细胞用ASAL方案扩增时，CAR转染的T细胞中肿瘤特异性细胞毒性活性对潜在肿瘤来源抑制因子（IL-10、TNF-β和/或H2O2）的抗性更强（通过膜表达CD107a（裂解颗粒胞吐作用标记物）所测定）。黑色柱＝用REP扩增的T细胞；白色柱＝用ASAL方案扩增的CAR转染的T细胞。
[0033] 图21说明，与已经用REP方案扩增的CAR转染的T细胞相比，在相互作用并杀伤靶细胞后，CAR转染的T细胞对暴露于潜在肿瘤来源抑制因子的增殖反应更高、抗性更强。A：无免疫抑制剂；B：IL-10/TGF-β处理；C：H2O2处理；D：IL-10/TGF-β和H2O2处理。
具体实施方式
[0034] 定义
[0037] 并且，在应用时，术语“约”用于表示给定值的+/-2%的偏差，优选地表示数值的+/-5%，最优选地表示数值的+/-10%。
[0038] 本发明的上下文中，术语“抗原特异性”涉及由在自身MHC分子上存在的短的独特肽序列的独特T细胞受体（TCR）的特异的识别/结合。
[0039] 本发明的上下文中，术语“激发”和“活化”涉及在原初抗原特异性T细胞中发生的程序性活化过程，所述原初抗原特异性T细胞由同时存在或不同时存在“辅助”细胞的抗原呈递细胞刺激。
[0040] 本发明的上下文中，术语“应答细胞”涉及不同的淋巴细胞亚群，包括但不限于通过活化和/或增殖应答共培养的同种异体PBMC的T细胞、NK细胞和NKT细胞。
[0041] 本发明的上下文中，术语“致敏细胞”涉及不同的淋巴细胞亚群，包括已经通过共培养的同种异体细胞（包括PBMC）预活化的T细胞、NK细胞和NKT细胞。
[0042] 本发明的上下文中，术语“靶细胞”涉及通过同种异体或自体APC与抗体（如抗CD3+ +抗体）结合刺激的CD4 或CD8T细胞。患者淋巴细胞（靶细胞）收集的部位可以，例如为外周血、肿瘤、肿瘤引流淋巴结或骨髓。
[0043] 本发明的上下文中，与单核细胞来源的DC相关的术语“成熟”涉及用微生物产物（如LPS）或炎性介质（如TNF-α和/或IL-1β）刺激未成熟DC而诱导的“成熟标记物”（包括但不限于CD40、CD86、CD83和CCR7）的表达。
[0044] 未成熟DC是表征为高内吞活性和低T细胞活化潜力的细胞。未成熟DC经常取样于周围环境的病原体如病毒和细菌。未成熟DC吞噬病原体并将它们的蛋白质降解成小碎片，在成熟时使用MHC分子将那些片段呈递在它们的细胞表面。同时，它们上调在T细胞活化中作为共受体的细胞表面受体，如CD80、CD86和CD40，极大增强了它们活化T细胞的能力。它们也上调CCR7，所述CCR7是诱导树突细胞经过血流进入脾或通过淋巴系统进入淋巴结的趋化因子受体。在此，它们作为抗原呈递细胞：通过向其提呈源自病原体的抗原和非抗原特异性共刺激信号，它们活化辅助性T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。成熟的DC可能由单核细胞（身体中循环的白细胞）产生，并且依赖于正确的信号，可以转变成DC或巨噬细胞。而单核细胞由骨髓中的干细胞形成。单核细胞来源的DC可以从外周血单核细胞体外产生。
[0045] 本发明的上下文中，术语细胞的“非增殖”用于指使细胞不能进行细胞分裂以形成子代。然而，细胞可能能够对刺激物应答，或生物合成和/或分泌细胞产物（如细胞因子）。使细胞非增殖的方法是本领域已知的。优选的使细胞非增殖的方法为用抗增殖的药物如丝裂霉素C处理或照射如γ射线照射处理。已经被固定或透性化和不能分裂的细胞也是非增殖细胞的实例。
[0046] 本发明上下文中，术语“混合淋巴细胞反应”、“混合淋巴细胞培养”、“MLR”和MLC可互换使用，指的是包含同种异型不同的最少两个不同细胞群的混合物。至少一种同种异型不同的细胞是淋巴细胞。将所述细胞在合适的条件下一起培养一段时间以产生淋巴细胞的刺激。MLR的惯常的目的是提供同种异体刺激，如可引发淋巴细胞的增殖；但是除非特别指明，不需要在培养期间的增殖。在适当的上下文中，这些术语或者可以指源自这种培养的细胞混合物。
[0047] 如文中使用的，术语“治疗”指的是试图改变待治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间进行。期望的效果包括防止疾病的发生或重发，缓解症状和减少疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态和缓解或改善预后。
[0048] 术语“抗原呈递细胞”、“APC”包括能够诱导一种或多种抗原呈递，优选与I类MHC分子相关的完整、完全细胞以及其它分子（所有同种异体来源），以及能诱导同种异体免疫应答的所有类型的单核细胞。优选完全的活细胞用作APC。合适的APC的实例包括但不限于，完全细胞如单核细胞、巨噬细胞、DC、单核细胞来源的DC、巨噬细胞来源的DC、B细胞和髓性白血病细胞，例如细胞系THP-1、U937、HL-60或CEM-CM3。据说髓性白血病细胞提供所谓的前单核细胞。
[0049] 术语“癌症”、“瘤”和“肿瘤”互换使用，并且为单数或复数形式，如在本说明书和权利要求书中出现的，指的是已进行恶性转化使得它们对宿主生物体致病的细胞。通过广泛接受的技术，特别是组织学检查可以容易地将原代癌细胞（即，从恶性转化部位附近获得的细胞）与非癌细胞区分开。如文中使用的，癌细胞的定义不仅包括原代癌细胞，还包括任何源自癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞，和源自癌细胞的体外培养物和细胞系。当指通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤是例如，通过如CAT扫描、磁共振成像（MRI）、X-射线、超声或触诊过程在肿瘤块的基础上可检测的肿瘤。与本发明相关的肿瘤/癌症的非限制性实例为癌（例如，乳癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胃癌、胰脏癌），肉瘤（例如，骨癌和滑膜癌），神经内分泌肿瘤（成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤和成神经细胞瘤），白血病，淋巴瘤和鳞状细胞癌（例如，宫颈癌、阴道癌和口腔癌）。此外，与本发明相关的肿瘤/癌症非限制性实例为神经胶质瘤、成纤维细胞瘤、神经肉瘤、子宫癌、黑色素瘤、睾丸肿瘤、星形细胞瘤、异位激素产生肿瘤、卵巢癌、膀胱癌、胚胎性癌肉瘤（Wilm’s tumor）、血管活性肠肽分泌肿瘤、头和颈部鳞状细胞癌、食道癌或转移性癌。特别优选前列腺癌和乳癌。
[0050] 本发明的上下文中，术语“培养”指的是在多种培养基中细胞或生物体的体外增殖。应该理解，在培养中生长的细胞后代可以与亲代细胞（在形态、遗传或表型上）不完全相同。本领域技术人员可以选择合适的培养基，这种培养基的实例为RPMI培养基或Eagles最低基础培养基（EMEM）。
[0051] 术语“主要组织相容性复合体”和“MHC”指的是编码需要用于将抗原呈递至T细胞和用于快速移植物排斥的细胞表面分子的基因复合体。在人中，MHC复合体也已知为HLA复合体。由MHC复合体编码的蛋白质被称为“MHC分子”，并且被分类为I类和II类MHC分子。I类MHC分子包括由与β2微球蛋白非共价连接的MHC中编码的链组成的膜异二聚体+蛋白质。I类MHC分子由几乎所有有核细胞表达，并且显示在抗原呈递至CD8T细胞中起作用。I类分子包括人中的HLA-A、-B和-C。I类分子通常结合长度为8-10个氨基酸的肽。
II类MHC分子也包括膜异二聚体蛋白质。
II类MHC分子也包括膜异二聚体蛋白质。
[0052] 已知II类MHC分子参与抗原呈递至CD4+T细胞，并且在人中，包括HLA-DP、-DQ和DR。II类分子通常结合长度为12-20个氨基酸残基的肽。术语“MHC限制”指的是允许T细胞仅识别被加工后的抗原的特性，并且产生的抗原肽与自身I类或自身II类MHC分子联合展示。
[0053] 文中使用的术语“疫苗”、“免疫原”或“免疫原性组合物”指的是，当施用于人或动物受试者时能赋予一定程度特异免疫力的化合物或组合物。如本公开内容中所使用的，“细胞疫苗”或“细胞免疫原”指的是包含至少一个细胞群（任选地失活的细胞群）作为活性成分的组合物。本发明的免疫原和免疫原性组合物是有活性的，这表示它们能刺激至少部分由宿主的免疫系统介导的特异性免疫学反应（如抗肿瘤抗原或抗癌细胞反应）。免疫学反应可以包含抗体、免疫反应性细胞（如辅助/诱导物或细胞毒性细胞）或其任意组合，并且优选针对在治疗针对的肿瘤上存在的抗原。可以通过施用单剂量或多剂量在受试者中引起或再刺激所述反应。
[0054] 如果能够a)在首次被试验的个体中产生针对抗原（如肿瘤抗原）的免疫反应；或b)如果没有施用化合物或组合物，将不发生个体中重组、增强或维持免疫应答，那么所述化合物或组合物是“免疫原性的”。当施用单剂量或多剂量时，如果能达到这些标准的任一个，则组合物是免疫原性的。
[0055] 本发明涉及同种异体致敏的同种异体淋巴细胞（ASAL）的制备，以促进抗原特异性T细胞在其通过抗原呈递细胞，包括树突细胞（DC）与抗CD3抗体结合的活化期间的增殖和存活的增加。
[0056] 本发明基于体外研究，所述体外研究使用来自人健康血液供者的外周血单核细胞+（PBMC）和其亚群，证实在诱导抗原特异性人CD8T细胞应答中ASAL的阳性调节作用。使用+
同种异体的体外模型，追踪在ASAL存在下同种异体反应性CD8T细胞的增殖和存活，增殖能力在再刺激后增加5倍以上，而且细胞凋亡性细胞死亡降低10-5%。
同种异体的体外模型，追踪在ASAL存在下同种异体反应性CD8T细胞的增殖和存活，增殖能力在再刺激后增加5倍以上，而且细胞凋亡性细胞死亡降低10-5%。
[0057] 通过转导或转染编码肿瘤抗原受体的基因，可以体外产生抗原特异性人CD4+和CD8+T细胞。本发明涉及制备用于过继免疫治疗的T细胞群的方法，所述方法包括（通过病毒转导、转染、电穿孔或其他引入遗传物质的方法）改造T细胞以表达识别靶抗原的T细胞受体（TCR）或嵌合抗原受体（CAR）；在致敏的同种异体淋巴细胞和抗CD3抗体的存在下用DC活化这些改造的T细胞；在培养中扩增这些细胞；以及将这些细胞再引入回患者。
[0058] 加入ASAL导致强烈上调抗原呈递DC上共刺激分子CD70的表达和IL-12和IFN-γ的产生，所述IL-12和IFN-γ两个因子对T细胞发展成为1型CD4+和CD8+T细胞有公知的积极影响。此外，加入ASAL也导致产生公知的T细胞生长因子IL-2。特别地，最近显示，CD70介导的相互作用在连续轮次的整个分裂过程中促进活化的T细胞的存活，从而有助于效应T细胞的累积。
[0059] 更具体而言，本发明涉及一种用于体外激发适合施用于肿瘤患者的遗传修饰的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的方法。所述方法包括共培养来自待治疗患者的表达肿瘤抗原受体的靶T细胞、DC、抗CD3抗体和针对抗原呈递细胞（APC）上的MHC I类和/或MHC II类抗原致敏的淋巴细胞，其中，APC优选对于淋巴细胞为同种异体的，而树突细胞优选为单核细胞来源的。加入抗CD3抗体将导致它们通过Fc/Fc受体相互作用结合至树突细胞，所述Fc/Fc受体相互作用使装备有抗体的树突细胞直接相互作用并且活化表达CD3的T细胞。
[0060] 可以用编码T细胞受体（TCR）的基因转化靶T细胞，或者通过使用能以非MHC限制的方式将兴奋信号传递至T细胞的嵌合抗原受体（CAR）转化靶T细胞。因此，与人类白细胞抗原基因型无关，这些由细胞外的抗原识别域与细胞内T细胞活化域融合组成的杂合蛋白质可以用于患者。在遗传转化之前，优选将靶T细胞预先用抗CD3抗体刺激，以优化随后的转化。本发明中可以使用任何合适的CAR。CAR配体可以由肿瘤细胞表达。选择和制备合适的CAR在本领域技术人员的技能范围内。CAR配体的非限制性实例是VEGFR-2（血管内皮细胞生长因子受体-2）、Her2/neu、CEA（癌胚抗原）、CD19、CD20和GD2（神经节苷脂抗原）。
[0061] 通过使用本领域技术人员已知的任何合适的方法，如转染或转导（参见，例如Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第三版，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，NY），可以将编码TCR或CAR的基因遗传转化到T细胞中。可以使用病毒载体进行转染。病毒载体的非限制性实例包括反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体。转导包括但并不限于质粒的电转移、转座子/转座酶系统和微注射。
[0062] ASAL为获得自混合淋巴细胞反应并且随后与树突细胞和靶细胞在含有抗CD3抗体的培养基中一起培养的应答细胞。所述ASAL相对于患者和相对于树突细胞为自体的或同种异体的。所述树突细胞相对于待治疗的患者和相对于用于ASAL的初次MLR诱导活化+的刺激细胞，为自体的或同种异体的。所述ASAL选自由外周血淋巴细胞（包括CD4T细胞、+ + +
CD8T细胞和自然杀伤（NK）细胞）组成的组。靶细胞为CD4 和/或CD8T细胞。
CD8T细胞和自然杀伤（NK）细胞）组成的组。靶细胞为CD4 和/或CD8T细胞。
[0063] 在本发明的方法中，CD3抗体将作为转染的T细胞的非特异性刺激物（当抗CD3抗体结合到T细胞上的CD3分子时，T细胞将被活化）。所述转染的T细胞和树突细胞是自体的或同种异体的。所述CD3抗体也将再刺激ASAL，表示ASAL相对于树突细胞可以是自体的或同种异体的。优选地，树突细胞和ASAL是同种异体的。所述树突细胞和ASAL相对于转染的患者T细胞优选，但不是必要地，是同种异体的（即来自健康血液供体）。
[0064] 加入ASAL进一步导致表达高水平CD27的靶CD8+T细胞群的富集。CD27+CD8+T细胞由于能够提供用于增殖的抗原驱动自分泌信号，它们代表潜在的用于过继免疫治疗的更+ +有效的CTL（细胞毒性T细胞）。这种辅助性非依赖CD8T细胞不需要以IL-2或CD4T细胞+
形式的外源辅助以存活和扩增。因此，本发明通过向受试者提供CD8T细胞群，提供了用于+
治疗免疫介导疾病的方法，所述CD8T细胞群在没有或少量存在额外的细胞因子（如IL-2）+
或CD4T细胞时，被程序化了强细胞毒性活性。所述方法特别用于间接体内扩增细胞溶解+ +
性、抗原特异性CD8T细胞，但是也可用于扩增肿瘤特异性CD4T细胞。
形式的外源辅助以存活和扩增。因此，本发明通过向受试者提供CD8T细胞群，提供了用于+
治疗免疫介导疾病的方法，所述CD8T细胞群在没有或少量存在额外的细胞因子（如IL-2）+
或CD4T细胞时，被程序化了强细胞毒性活性。所述方法特别用于间接体内扩增细胞溶解+ +
性、抗原特异性CD8T细胞，但是也可用于扩增肿瘤特异性CD4T细胞。
[0065] 以CD8+T淋巴细胞总数的百分数表示的细胞溶解性抗原特异CD8+T细胞的百分数优选至少约5%，更优选至少约10%，更优选至少约15%，更优选至少约20%，甚至更优选至少约25%，甚至更优选至少约30%和最优选至少约35%。
[0066] 有效的细胞毒性需要CD8+和CD4+T细胞。CD8+T细胞是细胞毒性的，而CD4+T细胞释放生长增殖因子，如IL-2。优选地，CD8+T细胞数目超过CD4+T细胞的数目，因为预计相比于CD8+T细胞的扩增，更有利于扩增CD4+T细胞的扩增方案在体内抗肿瘤效力上是不利的（Yang等，Journal of Immunotherapy2010;33:648.）。
[0067] 更具体而言，本发明的方法涉及体外用于激发适合施用于肿瘤患者的TCR-或CAR-转化的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的方法，所述方法包含下述步骤：
[0068] a)将来自患者或来自健康供者的非增殖抗原呈递细胞与相对于所述抗原呈递细胞为同种异体的外周血单核细胞一起培养，
[0069] b)在允许单核细胞成熟为成熟DC的组合物中培养来自患者或来自健康供者的单核细胞（下面进一步描述所述组合物），和
[0070] c)将同种异体致敏淋巴细胞（包括但不限于来自步骤a)的CD4+T细胞、CD8+T细+ +胞和/或自然杀伤（NK）细胞）与来自步骤b)的成熟DC与包括CD4T细胞和CD8T细胞的TCR-或CAR-转化的靶细胞一起，在含有抗CD3抗体的培养基中培养。
[0071] 通过以下方式获得单核细胞来源的DC：首先在包含GM-CSF和IL-4的组合物中培养单核细胞约2-7天，优选约5天以获得未成熟DC；随后加入能使未成熟DC成为成熟DC的第二组合物，培养至少约12-72小时，以及优选约24-48小时。所述第二组合物包含能使未成熟DC成为成熟单核细胞来源的DC的组分，所述成熟单核细胞来源的DC可+ +用于活化CD4 和CD8T细胞。在一种实施方式中，所述第二组合物包含TNFα、IL-1β、干扰素γ、干扰素β和TLR3配体（如聚I:C）(Mailliard等，Alpha-type-1polarized DCs:a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity.Cancer Res.2004;64:5934-5937.)。在另一种实施方式中，所述第二组合物包含干扰素γ、TLR3和/或TLR4配体和TLR7和/或TLR8配体和/或TLR9配体。TLR3配体的非限制性实例是聚I:C，TLR7/8配体的非限制性实例是R848，以及TLR9配体的非限制性实例是CpG。
[0072] 同种异体淋巴细胞的致敏作用是通过传统的混合淋巴细胞反应（MLR或MLC-混合淋巴细胞培养）诱导的，所述传统的混合淋巴细胞反应包括培养失活抗原呈递细胞和来自健康供者的外周血单核细胞（PBMC），其中所述抗原呈递细胞对于所述淋巴细胞是同种异体的。进行MLR是本领域技术人员公知的（Jordan WJ,Ritter MA.Optimal analysis of composite cytokine responses during alloreactivity.J Immunol Methods2002;260:1-14）。在MLR中，来自两个个体的PBMC（主要是淋巴细胞）在组织培养中混合在一起数天。来自不相容个体的淋巴细胞将相互刺激以显著增殖（例如通过氚标记的胸腺嘧啶摄取进行测定），而来自相容个体的淋巴细胞则不相互刺激。在单向MLC中，来自个体之一的淋巴细胞用抗增殖药物，如丝裂霉素预处理，或者用照射预处理，从而仅使来自另一个个体的未处理的淋巴细胞应答外源组织相容性抗原而增殖。
[0073] 在MLR中使用的抗原呈递细胞选自PBMC和单核细胞来源DC。
[0074] 在本发明的方法中，将细胞（来自待治疗患者的表达肿瘤抗原受体的靶T细胞、树突细胞、抗CD3抗体和针对抗原呈递细胞（APC）上的MHC I类和/或MHC II类抗原已经致敏的淋巴细胞）共培养约20天，优选约4-20天，优选6-20天，更优选7-14天，以及最优选约9-14天。
[0075] 向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21，以优化细胞增殖和存活。
[0076] 激发的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞通过与新DC、抗CD3抗体、和新致敏的淋巴细胞一起培养，以及任选地向细胞培养物中加入外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21可以被再刺激，所述新致敏的淋巴细胞已经被相对于所述淋巴细胞为同种异体的非增殖抗原呈递细胞活化。
[0077] 本发明也涉及通过上述方法可获得的免疫原性组合物以及通过上述方法可获得+ +的抗原特异性CD4 和/或CD8T细胞。
[0078] 抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞适合施用于患者，并且优选具有至少以下特征之一：
[0079] －能增殖
[0080] －表达低水平的细胞凋亡标记物膜联蛋白V（即，通过FACS测定，至多40%，优选至多20%的细胞对膜联蛋白V表现出阳性染色）
[0081] －在其细胞表面表达CD27和/或CD28。
[0082] 通过本发明的方法获得的特异性CD4+和/或CD8+T细胞进一步的能力是在体外被肿瘤细胞或相对于抗原特异性T细胞为MHC相容的肿瘤负载的抗原呈递细胞活化，和/或杀伤肿瘤细胞或相对于抗原特异性T细胞为MHC相容的肿瘤负载的抗原呈递细胞的能+ +力。通过本发明的方法获得的特异性CD4 和/或CD8T细胞尽管与免疫抑制因子如IL-10、TGF-β和/或H2O2预培养也具有体外杀伤相关肿瘤靶细胞的能力，具有在杀伤相关肿瘤靶细胞后体外增殖的能力，以及尽管与免疫抑制因子如IL-10、TGF-β和/或H2O2预培养也能够在杀伤相关肿瘤靶细胞后体外增殖的能力。
[0083] 本发明涉及通过本发明的方法获得的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞作为药物+ +和所述抗原特异性CD4 和/或CD8T细胞用于制备药物的用途。
[0084] 此外，本发明涉及通过本发明或如上所限定的方法获得的抗原特异性CD4+和/或+CD8T细胞的用途，用于治疗肿瘤或用于引发人中的抗肿瘤免疫学反应，以及用于制备用于治疗肿瘤的药物或用于引发人中的抗肿瘤免疫学反应的药物。可以在第一次刺激后或者在+ + + +
再刺激之后，施用所述CD4 和/或CD8T细胞。在一种实施方式中，所述CD4 和/或CD8T细胞与治疗癌症疫苗组合施用。
再刺激之后，施用所述CD4 和/或CD8T细胞。在一种实施方式中，所述CD4 和/或CD8T细胞与治疗癌症疫苗组合施用。
[0085] 在人受试者的治疗中使用用于过继细胞治疗的T细胞群的方法是本领域临床医生已知的。根据文中描述的和本领域中已知的方法制备的T细胞群可以用于这种方法。例如，使用肿瘤浸润淋巴细胞与MART-1抗原特异T细胞的过继细胞治疗已经在临床上试验过（Powell等，Blood105:241-250,2005）。肾细胞癌患者已经被接种经照射的自体肿瘤细胞。将收获的细胞继而用抗CD3单克隆抗体和IL-2活化，然后再次施用于患者（Chang等，J.Clinical Oncology 21:884-890,2003）。
[0086] 当在体外初始DC介导的激发期间暴露于ASAL时，在再刺激后，抗原激发T细胞经历增殖增加和细胞凋亡降低。因此，本发明也涉及如果在疫苗接种前和/或疫苗接种期间过继转移回患者，用于基于疫苗接种而增强次级T细胞应答的方法。
[0087] 本发明也提供用于改善癌症疫苗治疗的方法。许多肿瘤表达可以潜在作为用于被免疫系统破坏的靶的外源抗原。癌症疫苗在受试者中产生包含体液和细胞组分的全身肿瘤特异性免疫反应。所述反应通过在远离肿瘤的部位或局部性肿瘤的部位施用疫苗组合物由受试者自身免疫系统引发。抗体或免疫细胞结合肿瘤抗原并裂解肿瘤细胞。然而，在疫苗接种癌症患者时，仍然需要增加T细胞应答。因此，在疫苗接种前或疫苗接种时，过继转移预活化的具有高增殖潜力的细胞凋亡抗性肿瘤特异性T细胞可以体内增强疫苗介导的免疫反应。
[0088] 根据本发明的组合物可以与治疗性癌症疫苗组合施用。这种治疗性癌症疫苗的非限制性实例是间接体内增殖的和荷瘤的DC、细胞因子生成肿瘤细胞、DNA疫苗和使用与肿瘤抗原组合的TLR配体的疫苗。
[0089] 通过本发明的方法可获得的细胞可以直接施用于生物体，如人，以在其活化时增加抗原特异性T细胞的增殖和存活。这些细胞，常常与药学可接受的载体以用于将细胞引入最终与哺乳动物血液或组织细胞接触的任何途径施用。
[0090] 适合用于肠胃外施用，如，例如通过静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下和肿瘤内途径施用的制剂和载体包括含水等渗无菌注射溶液以及含水和非含水无菌悬浮液，所述含水等渗无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使所述制剂与预接受者的血液等渗的溶质，所述含水和非含水无菌悬浮液可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐+ +剂。静脉内施用是施用本发明的CD4 和/或CD8T细胞的优选方法。
[0091] 在本发明的上下文中，施用于患者的CD4+和/或CD8+T细胞的剂量应当足以增强患者的免疫反应。因此，向患者施用足以引起对肿瘤抗原有效的免疫反应和/或减轻、降低、治愈或至少部分阻止疾病的症状和/或并发症的量的细胞。足够达到所述效果的量被定义为“治疗有效剂量”。所述剂量通过产生的细胞的活性和患者的状况，以及待治疗的患者的体重或表面积确定。在确定在治疗或预防疾病（如癌症）中待施用的细胞的有效量时，医生需要评价疾病的进展和针对任何相关肿瘤抗原的免疫反应的诱导。
[0092] 与现有技术的方法相比，本发明具有几个主要优点。本发明提供高水平肿瘤特异+性CD8T细胞而不需要再刺激。再刺激使细胞活性降低并且使其接近细胞凋亡。因此，有效扩增肿瘤特异性T细胞而不需要再刺激的方法是有利的。此外，不需要再刺激所述细胞，可以将肿瘤特异性T细胞在较短时间内再返回患者，因此更节省成本。此外，使用根据本发明的方法，不需要消耗抑制细胞或加入外源性生长因子（其是非常昂贵的过程）。过继转移培养自肿瘤浸润淋巴细胞的自体肿瘤特异T细胞可引起人类中晚期肿瘤的退化，但是不能可靠地培养自大部分人的肿瘤，因此，开发了改造大量血液来源T细胞以表达编码肿瘤抗原特异T细胞受体基因的方法。在嵌合抗原受体（CAR）的情况下，其可用于患者，而与患者的人白细胞抗原基因型无关。
[0093] 虽然本发明的方法的扩增效率类似于REP方案，与REP扩增的T细胞相比，用本发明的方法扩增的ASAL具有更高的体内杀伤能力。这种情况的主要原因在于，与根据本发明的方法扩增的T细胞相比，REP产生的T细胞对肿瘤产生的免疫抑制环境抗性差。此外，与作为显示降低的体内抗肿瘤效力、有利于CD4+T细胞扩增的REP方案相比，本发明的方法以+较高比率扩增CD8T细胞。
[0094] 本发明包含公开的不同方面和特征的任意组合。
[0095] 本发明通过下述非限制性实施例进行进一步说明。
[0096] 实施例
[0097] 实施例1
[0098] 材料和方法：在组织培养瓶中通过在无血清X-VIVO15培养基中以1：1的比例，将来自健康血液供者的γ射线照射的PBMC与来自同种异体供者（相对于健康血液供者）的未照射的PBMC共培养5-7天，在标准单向混合淋巴细胞反应（MLR）中产生同种异体致敏的同种异体淋巴细胞（ASAL）。对于未成熟DC的增殖，在密度梯度（Lymphoprep,Nycomed，奥斯陆，挪威）上分离获自健康血液供者的外周血单核细胞（PBMC）。分离的PBMC在6
AIM-V培养基（Invitrogen公司,佩斯里，英国）上重新悬浮，以2.5×10 个细胞每孔铺在24孔塑料培养板中，并使其粘附2小时。除去非粘附的细胞，并将剩余的粘附的单核细胞在添加重组人GM-CSF和IL-4(R&D Systems,Abingdon,英国；均为1,000U/mL)的AIM-V培养基中培养4-6天。在孵育的最后24小时，通过添加含有IFN-α(3,000U/mL)、IFN-γ(1,000U/mL)、TNF-α(50ng/mL)、IL-1β(25ng/mL)(均来自R&D Systems)和p-I:C（Sigma-Aldrich;20μg/mL）的培养基诱导未成熟DC的成熟。
AIM-V培养基（Invitrogen公司,佩斯里，英国）上重新悬浮，以2.5×10 个细胞每孔铺在24孔塑料培养板中，并使其粘附2小时。除去非粘附的细胞，并将剩余的粘附的单核细胞在添加重组人GM-CSF和IL-4(R&D Systems,Abingdon,英国；均为1,000U/mL)的AIM-V培养基中培养4-6天。在孵育的最后24小时，通过添加含有IFN-α(3,000U/mL)、IFN-γ(1,000U/mL)、TNF-α(50ng/mL)、IL-1β(25ng/mL)(均来自R&D Systems)和p-I:C（Sigma-Aldrich;20μg/mL）的培养基诱导未成熟DC的成熟。
[0099] 通过FACS分析确定，成熟的DC群均含有70%以上的CD83+DC。
[0100] 洗涤后，成熟的DC与未照射的或γ射线照射（25Grey）的ASAL在X-VIVO15培养基中共培养24小时，并通过FACS进行分析。通过在无血清培养基（X-VIVO15）中用γ射线照射的PBMC作为刺激细胞和未照射的PBMC作为应答细胞进行原代单向MLR5-6天，进行同种异体淋巴细胞的致敏。PE-结合的抗人CD70抗体用于FACS研究。
[0101] 结果：如图1所示，ASAL显著增强了相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的成熟单核细胞来源DC上的CD70的表达。
[0102] 如图2所示，类似地，γ射线照射的ASAL增强了相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的成熟单核细胞来源DC上的CD70的表达。
[0103] 如图3、4和5所示，ASAL与相对于用于激发ASAL的照射PBMC为自体的成熟DC共培养，诱导大量产生IL-12、IFN-γ和IL-2。
[0104] 实施例2
[0105] 材料和方法：使用照射的同种异体PBMC作为刺激物，在常规MLR7天期间产生+ + +ASAL（参见实施例1）。收获和照射后，将ASAL（“MLR”）或去除CD4、CD8 或CD56（NK/NKT）的ASAL混合群与成熟的同种异体单核细胞来源DC（相对于用于激发ASAL的PBMC为自体的）共培养。24小时后收集共培养的上清液，随后测定IL-2、IL-12和IFN-γ的产生。
[0106] 结果：发现IL-2的产生为严格的CD4依赖性（图6A），而IL-12的产生（图6B）显示完全没有ASAL依赖性，并且IFN-γ的产生（图6C）显示部分依赖在ASAL群中共培养的+ + +和同种异体激发的CD4、CD8 和CD56（NK/NKT）。
[0107] 实施例3
[0108] 材料和方法：通过塑料粘附单核细胞产生未成熟DC。在添加均为1000U/mL的IL-4和GM-CFS的 DC中培养单核细胞7天。在孵育的最后2天期间，通过加入50ng/mL TNF-α、25ng/mL IL-1β、50ng/mL IFN-γ、3000U/mL IFN-α和20μg/mL聚I:C诱导DC的成熟。
[0109] 以1：1的比例在X-VIVO15中共培养γ射线照射的同种异体PBMC和相对于DC供体的未照射的自体PBMC7天，在单向混合淋巴细胞反应中产生ASAL。
[0110] 从在添加50ng/mL IL-15的X-VIVO15中培养7天的自体PBMC（终浓度为6 +
0.5×10 个淋巴细胞/mL）中通过阳性选择分离出CD8T淋巴细胞。将PBMC离心，并
7 +
在PBS-0.5%BSA-2M EDTA中重新悬浮至终浓度为1×10/80μL。将PBMC与CD8 微珠(Miltenyi Biotec)于4℃下孵育15分钟，洗涤，重新悬浮并置于LS MACS柱上。将未标+
记的细胞洗涤通过并收集含有CD8 淋巴细胞的总流出物。在预温的PBS-1%BSA中重新悬+ 6
浮分离的CD8T淋巴细胞至浓度1×10/mL，并于37℃下用10μΜCFSE(Molecular probes Invitrogen)染色10分钟。通过加入5ml冰冷的X-VIVO15培养基终止染色并在冰上孵育
6
5分钟。在培养基中洗涤细胞2次，并重新悬浮至终浓度1×10/ml。以4:4:1的比例将染+
色的CD8T淋巴细胞与照射的同种异体致敏同种异体PBMC和成熟的自体DC共培养4-7天。
培养后，收获淋巴细胞，并用CD3-APC-H7、CD8-PerCP、CD27-APC和膜联蛋白V染色。通过流+
式细胞术确定增殖的CD8T淋巴细胞的百分数，并用总淋巴细胞百分数表示。
0.5×10 个淋巴细胞/mL）中通过阳性选择分离出CD8T淋巴细胞。将PBMC离心，并
7 +
在PBS-0.5%BSA-2M EDTA中重新悬浮至终浓度为1×10/80μL。将PBMC与CD8 微珠(Miltenyi Biotec)于4℃下孵育15分钟，洗涤，重新悬浮并置于LS MACS柱上。将未标+
记的细胞洗涤通过并收集含有CD8 淋巴细胞的总流出物。在预温的PBS-1%BSA中重新悬+ 6
浮分离的CD8T淋巴细胞至浓度1×10/mL，并于37℃下用10μΜCFSE(Molecular probes Invitrogen)染色10分钟。通过加入5ml冰冷的X-VIVO15培养基终止染色并在冰上孵育
6
5分钟。在培养基中洗涤细胞2次，并重新悬浮至终浓度1×10/ml。以4:4:1的比例将染+
色的CD8T淋巴细胞与照射的同种异体致敏同种异体PBMC和成熟的自体DC共培养4-7天。
培养后，收获淋巴细胞，并用CD3-APC-H7、CD8-PerCP、CD27-APC和膜联蛋白V染色。通过流+
式细胞术确定增殖的CD8T淋巴细胞的百分数，并用总淋巴细胞百分数表示。
[0111] 结果：如图7所说明的，加入照射的“同种异体辅助体”（=ASAL）强烈增加了CD8+T细胞的分裂（更多细胞具有低荧光强度＝在点图中的左侧有更多的点）。因此ASAL增加了+单核细胞来源DC诱导同种异体反应性CD8T细胞增殖反应的能力。
[0112] 实施例4
[0113] 材料和方法：参见实施例1的材料和方法。
[0114] 在共培养DC、照射的ASAL（对DC为同种异体）6天后，（用抗体包被的磁珠进行阴性选择）分离CD8+淋巴细胞，然后用B细胞（对初次刺激期间使用的DC为自体的）再刺激，对表达CD27和膜联蛋白V染色。用FACS进行随后的分析。
[0115] 结果：如图8中所示，在用B细胞再刺激CD8+细胞时，在初次刺激期间加入ASAL极大地增加了CD27的表达。
[0116] 当用B细胞再刺激CD8+细胞时，在初次刺激期间加入ASAL大幅降低了膜联蛋白V（细胞凋亡标志物）的表达（参见图9），因此，使CD8+T细胞对进入细胞凋亡的抗性更强。
[0117] 实施例5
[0118] 材料和方法：参见实施例4的材料和方法。
[0119] 在用B细胞再刺激之前，将激发和分离的CD8+细胞用3H-胸苷脉冲。
[0120] 结果：如图10所示，在再刺激后，在初次刺激期间加入ASAL强烈地增加了同种异体反应性CD8+细胞的增殖反应（通过加入3H-胸苷测定，cpm/分钟，第3天）。
[0121] 实施例6
[0122] 材料和方法：参见实施例4的材料和方法。
[0123] 在共培养B细胞和预活化CD8+细胞2天后，收集培养上清液，通过常规ELISA（R&D Systems）分析IFN-γ的产生。
[0124] 结果：图11示出再刺激后，在初次刺激期间加入ASAL强烈地增加了通过同种异体+反应性CD8 细胞的IFN-γ的产生。
[0125] 实施例7－CAR转染的T细胞的扩增
[0126] 材料和方法：
[0127] 基础培养基由添加10%人血清、1％青霉素（100U/ml）、1%HEPES、0.5%L-谷氨酰胺和160μlβ巯基乙醇的RPMI培养基1640组成。
[0128] 通过塑料粘附单核细胞产生未成熟DC。随后在添加均为1000U/ml的IL-4和GM-CFS的基础培养基中将单核细胞培养7天。在孵育的最后24小时期间通过加入20μg/mL聚I:C、2.5μg/mL R848和50ng/mL IFN-γ诱导DC成熟。
[0129] 通过以1：1的比例，将γ射线照射的PBMC与未照射的同种异体PBMC在基础培养基中共培养7天，在单向混合淋巴细胞反应中产生ASAL。
[0130] T细胞转染：通过向DC培养基中加入IL-2（100IU/mL）和抗CD3抗体（OKT3）（50ng/mL），将分离的PBMC（5×10（5）/mL）初次活化3天。然后通过在含有CAR-慢病毒（20μL）、Sequa Brene（1mg/mL）和IL-2（100IU/mL）的培养基中孵育4小时，用针对GD2（在成神经细胞瘤细胞上高表达的神经节苷脂抗原）的CAR转染非粘附细胞（主要是活化的T细胞）。洗涤后，将细胞在补充IL-2（100IU/mL）的培养基中培养5天。然后使用针对慢病毒CAR的PE-A结合的抗体通过流式细胞术分析转染水平。
[0131] T细胞扩增：洗涤后，随后使用ASAL方案或标准REP方案（Yang等，Journal of Immunotherapy2010；33:648）在T-25瓶子中将CAR转染的T细胞在培养基扩增12天，所述ASAL方案由成熟DC+照射的ASAL+CAR转染的T细胞（1:4:1的比例）、IL-2（100IU/mL）和OKT3（50ng/ml）组成，所述标准REP方案由来自3个不同供体的照射的同种异体PBMC+CAR转染的T细胞（100：1的比例）、IL-2（100IU/mL）和OKT3（50ng/mL）组成。在第3、6和9天，将培养基去除，添加新鲜培养基、100IU/mL的IL-2和50ng/mL的OKT3延长培养。
[0132] 流式细胞术分析：将细胞用PBS洗涤两次，并在室温下通过使用针对细胞表面标记物（CD3、CD4、CD8、CD27、CD64和CAR（GD2））的特定荧光团（异硫氰酸荧光素（FITC）、APC或藻红蛋白（PE））标记的抗体（BDBiosciences，圣地亚哥，CA）染色15分钟（避光）。在BD FACS Canto II（BDBiosciences，美国）进行FACS分析，并用BD FACS Canto II软件对数据进行分析。
[0133] 细胞凋亡的测定：在对照培养基中和随后加入细胞凋亡诱导剂（H2O2或阿霉素）24小时的培养基中用不同的扩增方案扩增12天，，然后用膜联蛋白V细胞凋亡测定法（BD Biosciences）评估T细胞的存活率。简单地说，将T细胞用PBS洗涤两次，再悬浮于结合缓冲液中，然后在室温下与膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）孵育15分钟，然后洗涤和进行流式细胞术分析。
[0134] 肿瘤细胞杀伤的测定：在圆底96孔板的各孔中以不同的效应细胞：靶细胞比率（E:T比率）将CAR转染和扩增的（12天）T细胞与表达GD2的成神经细胞瘤细胞系IMR-3（共表达萤光素酶报告基因）共培养48小时。使用萤光素酶表达测定法（Fu等，PloS1,2010,5,e11867）评估转染的和扩增的T细胞裂解相关肿瘤细胞的能力。从无效应T细胞的靶细胞（IMR-3）将相对细胞存活率（%）计算为原始光单位（RLU）并校正为萤光素酶活性。
[0135] 使用针对膜结合的CD107a的结合的抗体通过流式细胞术也估计了暴露于潜在肿瘤来源抑制因子的T细胞对肿瘤细胞的杀伤，所述CD107a为效应T细胞上裂解颗粒胞吐作用的标记物。在与靶细胞共培养前，将T细胞暴露于IL-10（10ng/mL）和TGF-β（2.5ng/mL）4小时，H2O2（25μM）24小时或IL-10（10ng/ml）和TGF-β（均4小时）与H2O2（24小时）的组合。
[0136] 在暴露于或没有暴露于潜在的肿瘤来源的抑制因子之前，在相互作用/杀伤表达TM靶抗原的肿瘤细胞4天后，使用CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒（Invitrogen，Eugene，OR，美国）来评估T细胞增殖。在与靶细胞共培养前，将T细胞暴露于IL-10（10ng/ml）和TGF-β（2.5ng/mL）4小时，H2O2（25μM）24小时或IL-10（10ng/ml）和TGF-β（均4小时）与H2O2（24小时）的组合。
[0137] 结果：
[0138] 如图12中所示，向相对于用于激发ASAL的照射的PBMC为自体的照射的、成熟的、单核细胞来源的DC加入照射的ASAL增强了表达CD64（Fc-γR）的DC的数目。这个受体被认为抓住了可溶性抗CD3抗体的Fc部分。这样的抗CD3抗体-“装备”的DC然后可以直接与共培养的自体或同种异体表达CD3的T细胞相互作用并活化共培养的自体或同种异体表达CD3的T细胞。
[0139] 图13示出了H2O2处理后的存活率。与使用REP方案扩增的T细胞相比，ASAL方案诱导的T细胞对诱导细胞凋亡的H2O2处理的抵抗性更强。由于H2O2是肿瘤中公知的免疫抑制因子，可以预计ASAL方案将在体内扩增对肿瘤来源H2O2具有优越抗性的T细胞。
[0140] 图14示出了阿霉素处理后的存活率。与使用REP方案扩增的T细胞相比，ASAL方案诱导的T细胞对诱导细胞凋亡的阿霉素处理的抵抗性更强。由于阿霉素是经常使用的抗癌药物，可以预计ASAL方案将在体内扩增对由同时存在的阿霉素抗癌治疗诱导的细胞凋亡具有优越抗性的T细胞。
[0141] 用针对GD2抗原（在胶质母细胞瘤癌细胞上表达）的嵌合抗原受体（CAR）有效地转染CD3+T细胞（>40％的转染的细胞）（参见图15）。左图＝转染前，右图为转染后。右上象限内的所有的点代表CAR转染的T细胞。
[0142] 与标准REP方案相比，ASAL方案诱导相似的CAR转染的CD3+T细胞扩增（参见图16），但是与REP方案相比，以更高的比率扩增CD8+T细胞（参见图17）。由于预计有利于CD4+T细胞扩增的扩增方案不利于体内抗肿瘤效力（Yang等，Journal of Immunotherapy2010;33:648），这个发现具有临床意义。
[0143] 另外，与REP方案相比，ASAL方案诱导相似的或更高数目的表达CD27的CD3+T细胞（参见图18）。由于在人中过继转移后T细胞的持续性已经显示与再输注的T细胞上高+ +水平的CD27表达直接相关，因此这个发现是临床相关的。由于CD27CD8T细胞可提供用于增殖的抗原驱动自分泌信号，因此它们代表用于过继免疫治疗的潜在更有效的CTL（细胞毒+
性T细胞）。这种不依赖辅助体的CD8+T细胞不需要IL-2或CD4T细胞形式的外源性辅助以生存或扩增。
性T细胞）。这种不依赖辅助体的CD8+T细胞不需要IL-2或CD4T细胞形式的外源性辅助以生存或扩增。
[0144] 如图19中所示，ASAL方案扩增的CAR转染的T细胞具有与用REP方案扩增的CAR转染的T细胞的特异性杀伤能力相似的特异性杀伤能力。
[0145] 与用REP方案扩增的CAR转染的T细胞相比，用ASAL方案扩增CAR转染的T细胞时，CAR转染的T细胞中肿瘤特异性细胞毒性能力（通过膜表达CD107a测定）对暴露于潜在肿瘤来源的抑制因子（IL-10、TNF-β和/或H2O2）的抗性更强（参见图20）。
[0146] 与用REP方案（经常用于扩增T细胞的方案；参见Yang等，Journal of Immunotherapy2010;33:648）扩增的CAR转染的T细胞相比，在相互作用和杀伤靶细胞后，CAR转染的T细胞的增殖反应较高并且对潜在肿瘤来源抑制因子的抗性更强。因此，在杀伤靶细胞后，通过本发明的方法产生的T细胞被再刺激，并且因此可攻击和杀伤新的癌细胞。
[0147] 虽然文中详细公开了特定实施方式，其已经通过实施例方式仅用于说明目的完成，并且不意于限制随后所附权利要求的范围。具体而言，本发明人预期可以对本发明进行多种替代、改变和修饰而不背离权利要求所限定的本发明的实质和范围。
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