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用于测量细胞增殖的双标记法

阅读：698发布：2020-05-12

专利汇可以提供用于测量细胞增殖的双标记法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了利用核酸的双脉冲标记来测量细胞新生核酸合成的方法。使用核苷类似物进行的核酸的第一脉冲标记允许确定基线核酸合成速率。使用第二核苷类似物进行的核酸的脉冲标记允许测量核酸合成的任何变化。可将核酸合成测量为细胞增殖 (DNA)或基因表达(RNA)。该方法在脉冲标记之间不需要潜在地引入假象的中间清洗步骤。此外，该方法通过在用竞争性核苷类似物进行处理的同时或在此之前用受试化合物处理细胞或生物体，可用于就对细胞增殖的作用筛选化合物。，下面是用于测量细胞增殖的双标记法专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于测量细胞核酸合成的变化的非治疗目的的方法，其包括：
a)将样品与有效量的第一核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第一温育样品；
b)将第一温育样品与至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第二温育样品，其中所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物是竞争性核苷或核苷酸类似物，并且其中在添加所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物之前所述第一核苷或核苷酸类似物完全掺入细胞核酸，或者当所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物存在时，所述第一核苷或核苷酸类似物不掺入细胞核酸；
c)将第二温育样品与第一标记试剂和至少一种第二标记试剂一起温育以形成标记的样品；
d)检测标记的样品，其中测量所述第一和至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平，
其中在与所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育之前，不从样品中除去所述第一核苷或核苷酸类似物，
其中将所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平相对于所述第一核苷或核苷酸类似物的掺入水平的差异测量为细胞核酸合成的变化，
前提是所述第一核苷或核苷酸类似物包含生物正交功能部分，并且所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物包含卤素部分。
2.用于测量细胞DNA合成的变化的非治疗目的的方法，其包括：
a)将样品与有效量的第一核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第一温育样品；
b)将第一温育样品与至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第二温育样品，其中所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物是竞争性核苷或核苷酸类似物，并且其中在添加所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物之前所述第一核苷或核苷酸类似物完全掺入细胞DNA，或者当所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物存在时，所述第一核苷或核苷酸类似物不掺入细胞DNA；
c)将第二温育样品与第一标记试剂和至少一种第二标记试剂一起温育以形成标记的样品；
d)检测标记的样品，其中测量第一和至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平，其中在与所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育之前，不从样品中除去所述第一核苷或核苷酸类似物，
其中将所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平相对于所述第一核苷或核苷酸类似物的掺入水平的差异测量为细胞DNA合成的变化，
前提是所述第一核苷或核苷酸类似物包含生物正交功能部分，并且所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物包含卤素部分。
3.用于测量细胞RNA合成的变化的非治疗目的的方法，其包括：
a)将样品与有效量的第一核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第一温育样品；
b)将第一温育样品与至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第二温育样品，其中所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物是竞争性核苷或核苷酸类似物，并且其中在添加所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物之前所述第一核苷或核苷酸类似物完全掺入细胞RNA，或者当所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物存在时，所述第一核苷或核苷酸类似物不掺入细胞RNA；
c)将第二温育样品与第一标记试剂和至少一种第二标记试剂一起温育以形成标记的样品；
d)检测标记的样品，其中测量第一和至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平，其中在与所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育之前，不从样品中除去所述第一核苷或核苷酸类似物，
其中将所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平相对于所述第一核苷或核苷酸类似物的掺入水平的差异测量为细胞RNA合成的变化，
前提是所述第一核苷或核苷酸类似物包含生物正交功能部分，并且所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物包含卤素部分。
4.权利要求1的方法，其中在用所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物进行处理的同时或在此之前，用受试化合物处理样品。
5.权利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分可经历[3+2]环加成反应。
6.权利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分可经历Staudinger连接反应。
7.权利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分包含叠氮基、炔烃或膦部分。
8.权利要求1的方法，其中所述第一核苷或核苷酸类似物是乙炔基-脱氧尿嘧啶(EdU)。
9.权利要求1的方法，其中所述第一核苷或核苷酸类似物是5-叠氮基-2'-脱氧尿嘧啶(AzdU)。
10.权利要求1的方法，其中卤素部分是溴、氯或碘。
11.权利要求1的方法，其中所述第二核苷或核苷酸类似物是BrdU。
12.权利要求1的方法，其中所述第一标记试剂是包含生物正交功能部分的标记物并且第二标记试剂是抗体。
13.权利要求12的方法，其中所述生物正交功能部分可经历[3+2]环加成反应。
14.权利要求12的方法，其中所述生物正交功能部分可经历Staudinger连接反应。
15.权利要求12的方法，其中所述生物正交功能部分是叠氮基、炔烃或膦部分。
16.权利要求12的方法，其中所述标记物是荧光染料。
17.权利要求12的方法，其中所述抗体是抗BrdU抗体。
18.权利要求12的方法，其中所述第一标记试剂是染料标记的叠氮化物。
19.权利要求18的方法，其中所述染料标记的叠氮化物选自：
罗丹明-叠氮化物、Alexa 350-叠氮化物、Alexa 488-叠氮化物、Alexa
555-叠氮化物、Alexa 568-叠氮化物、Alexa 594-叠氮化物、
Alexa 633-叠氮化物、Alexa 647-叠氮化物、Alexa 680-叠氮化物、
Pacific BlueTM叠氮化物、Cascade 叠氮化物、荧光素-叠氮化物、花菁-叠氮化物、dapoxyl-叠氮化物和四甲基罗丹明(TMR)-叠氮化物。
20.权利要求1的方法，其中以使第一核苷类似物与标记试剂之间形成共价键的方式，将第一标记试剂与第二温育样品一起温育。
21.权利要求1的方法，其中以使第二核苷类似物与标记试剂之间形成共价键的方式，将第二标记试剂与第二温育样品一起温育。
22.权利要求1的方法，其中利用流式细胞术检测所述第一核苷类似物和所述至少一种第二核苷类似物的掺入。
23.权利要求1的方法，其中利用荧光显微术检测所述第一核苷类似物和所述至少一种第二核苷类似物的掺入。
24.权利要求1的方法，其中通过多孔板测定检测所述第一核苷类似物和所述至少一种第二核苷类似物的掺入。
25.权利要求1的方法，其中通过成像来检测所述第一核苷类似物和所述至少一种第二核苷类似物的掺入。
26.权利要求1的方法，其中通过高内涵筛选来检测所述第一核苷类似物和所述至少一种第二核苷类似物的掺入。
27.权利要求1的方法，其中样品是生物体或细胞培养物中的细胞。
28.就对细胞增殖或基因表达的作用筛选化合物的非治疗目的的方法，其包括：
a)将样品与有效量的第一核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第一温育样品；
b)用受试化合物处理第一温育样品以形成处理的样品；
c)在用受试化合物处理第一温育样品的同时或在此之后将处理的样品与至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第二温育样品，其中在与所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育之前，不从样品中除去所述第一核苷或核苷酸类似物，其中所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物是竞争性核苷或核苷酸类似物，并且其中在添加所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物之前所述第一核苷或核苷酸类似物完全掺入细胞核酸，或者当所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物存在时，所述第一核苷或核苷酸类似物不掺入细胞核酸；
d)将第二温育样品与第一标记试剂和至少一种第二标记试剂一起温育以形成标记的样品；
e)检测标记的样品，其中测量第一和至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平，其中将所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平相对于所述第一核苷或核苷酸类似物的掺入水平的差异测量为筛选的化合物对细胞增殖或基因表达的作用，前提是所述第一核苷或核苷酸包含生物正交功能部分，并且所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物包含卤素部分。
29.权利要求28的方法，其中样品是生物体或细胞培养物中的细胞。
30.用于测量细胞核酸合成的变化的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
a)第一核苷或核苷酸类似物，其中所述第一核苷或核苷酸包含生物正交功能部分；
b)至少一种第二核苷或核苷酸类似物，其中所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物是竞争性核苷或核苷酸类似物，当与所述第一核苷或核苷酸类似物同时添加时所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物优先掺入细胞核酸，并且所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物包含卤素部分；
c)第一标记试剂；和
d)第二标记试剂。

说明书全文

用于测量细胞增殖的双标记法

[0001] 本申请是申请号为200980117709.7、申请日为2009年5月14日、发明名称为“用于测量细胞增殖的双标记法”的中国发明专利申请的分案申请。发明领域

[0002] 本公开内容涉及用于双脉冲标记核酸的方法。

[0003] 相关领域的描述

[0004] 通常通过向在其中培养细胞的培养基中或饲喂动物的饮用水中加入核酸糖类似物(核苷)，或通过将其注射入待标记的动物中来进行以测定生长速率为目的的脉冲标记细胞DNA。对DNA类似物的定时暴露(其具有将该DNA类似物掺入活跃地合成的DNA的潜能)被定义为脉冲。用于脉冲标记DNA的标准方法包括使用5-溴2'-脱氧尿苷(BrdU)或放射性标记的核苷类似物。

[0005] 用于检测BrdU标记的DNA或放射性标记的DNA的方法在本领域内是熟知的。例如，可用抗BrdU单克隆抗体，然后用荧光标记的二抗处理含有BrdU标记的DNA的细胞。然后可通过标准技术，包括板测定、荧光显微术、成像、高内涵筛选或流式细胞术来显现和定量荧光标记。

[0006] 剖析复杂的细胞过程(包括细胞增殖)，需要跟踪生物分子(当它们在它们的原住地(native habitat)中行使功能时)的能力。近年来，用于标记生物分子的可选工具已从化学生物领域显现出来--生物正交化学报道分子(bioorthogonal chemical reporter)。已描述了生物正交反应部分用于检测代谢物和翻译后修饰的用途(使用叠氮化物部分作为生物正交化学报道分子)。在通过代谢或通过化学修饰导入靶生物分子后，可通过使用下列3个高选择性反应之一而用探针标记叠氮化物：Staudinger连接、Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成作用或张力提高的(strain-promoted)[3+2]环加成作用。Agard等人J Am Chem Soc.2004Nov 24；126(46):15046-7。

[0007] 生物正交化学报道分子之前已用于通过掺入核苷似类物而标记核酸。因此，可使用生物正交标记例如Staudinger连接、叠氮化物和炔烃的Cu(I)-催化的[3+2]环加成作用(“点击化学”)或“无铜”点击化学(其独立地由Barry Sharpless和Carolyn Bertozzi描述)脉冲标记DNA。Sharpless等人Angew Chem Int Ed Engl.2002Mar 15；41(6):1053-7(通过引用完全合并入本文)；Meldal等人J.Org.Chem.2002，67，3057(通过引用完全合并入本文)；Agard等人J Am Chem Soc.2004Nov 24；126(46):15046-7(通过引用完全合并入本文)；美国专利7,122,703；美国申请案2003000516671。点击化学和Staudinger连接适合于通过直接检测核苷酸掺入来测量细胞增殖。参见Salic等人，Methods and Compositions for Labeling Nucleic Acids，美国申请案20070207476和20070099222(于2006年10月27日提交)(通过引用完全合并入本文)。

[0008] 术语“点击化学(click chemistry)”是指在铜(I)催化剂存在的情况下进行的[3+2]环加成反应。铜(I)催化剂可由铜(I)离子或铜(I)螯合部分组成。铜(I)螯合部分可以是“其特征在于存在2个或更多个可参与铜(I)离子配合物(含有多于一个的配位键)的形成的极性基团的任何实体”。Salic等人，美国专利申请案20070207476(同上)。铜(I)螯合剂在本领域内是熟知的，包括但不限于新亚铜试剂(neocuproine)和浴铜灵二磺酸盐
(bathocuproine disulphonate)。Salic等人，美国专利申请20070207476和Sharpless等人，美国申请案2003000516671。

[0009] [3+2]环加反应也称为1,3偶极环加成，其可在1,3-偶极子与亲偶极试剂(dipolarophile)之间发生。1,3-偶极子与亲偶极试剂的实例在本领域内是熟知的。例如，
1,3-偶极子可以是叠氮化物，亲偶极试剂可以是炔烃。

[0010] 用于脉冲标记DNA的点击化学技术包括用含有反应性不饱和基团的第一核苷类似物处理细胞以便将第一核苷类似物掺入新合成的DNA中。然后，将细胞与包含第二反应性不饱和基团的连接至标记物的试剂接触，以便在第一与第二反应性不饱和基团之间发生[3+2]环加成作用。

[0011] 用于脉冲标记DNA的[3+2]环加成反应的下列描述仅作为例子提供并且无意限定本发明的范围。

[0012] 作为使用点击化学脉冲标记DNA的一个实例，用有效量的炔烃修饰的核苷类似物例如乙炔基-脱氧尿嘧啶(EdU)处理细胞，进行指定的时间，以便将EdU掺入新合成的DNA。在用EdU进行脉冲标记后，固定细胞、透化细胞，然后在铜(I)催化剂存在的情况下，将细胞与染料标记的叠氮化物反应。通过[3+2]环加成反应在染料与掺入的核苷类似物之间形成共价键，然后染料标记可使用标准方法(包括但不限于流式细胞术、荧光显微术、成像、多孔板测定或高内涵筛选)来测量。

[0013] 在使用点击化学脉冲标记DNA的第二实例中，用有效量的叠氮化物修饰的核苷类似物例如5-叠氮基-2'-脱氧尿嘧啶(AzdU)处理细胞，进行指定的时间以便将AzdU掺入新合成的DNA。在用AzdU进行该脉冲标记后，固定细胞，透化细胞，然后在铜(I)催化剂存在的情况下将细胞与染料标记的炔烃反应。作为叠氮化物与炔烃部分之间的[3+2]环加成反应的结果，形成共价键。然后染料标记可使用标准方法(包括但不限于流式细胞术、荧光显微术、成像、多孔板测定或高内涵筛选)来测量。

[0014] 点击化学的一个备选方法(已由Bertozzi等人描述)是“无铜”点击化学反应，其利用紧张的(strained)[3+2]环加成反应而不使用铜(I)催化剂。Bertozzi等人，Compositions and methods for modification of biomolecules，美国专利申请案
20060110782(2005年10月31日提交)(通过引用全部合并入本文中)。

[0015] 例如，可首先用有效量的叠氮化物修饰的核苷类似物例如AzdU处理细胞，进行指定的时间，以便将叠氮化物修饰的核苷类似物掺入新合成的DNA。在该AzdU的脉冲后，用有效量的具有反应性环炔部分的化合物或分子处理细胞以便在叠氮化物与环炔部分之间发生紧张的[3+2]环加成反应。可修饰环炔以进一步包含染料标记，所述染料标记则可使用标准方法(包括但不限于流式细胞术、荧光显微术、成像、多孔板测定或高内涵筛选)来测量。可用于紧张的[3+2]环加成反应以脉冲标记DNA的环炔包括但不限于环辛炔、二氟环辛炔、杂环炔(heterocycloalkyne)、二氯环辛炔、二溴环辛炔或二碘环辛炔。

[0016] 可将本领域内已知的其他化学试剂用于脉冲标记DNA。例如，可将Bertozzi等人描述的叠氮化物-膦化学试剂(也称为Staudinger连接)用于检测叠氮化物修饰的核苷类似物例如AzdU至新合成的DNA的掺入。参见Bertozzi等人，Chemoselective ligation，美国专利申请20070037964(2006年9月19日提交)(通过引用完全合并入本文)。首先将细胞与有效量的叠氮化物修饰的核苷类似物例如AzdU接触，进行指定的时间。然后，将细胞与经工程改造的膦部分反应。经工程改造的膦部分的一个实例是2-二苯基膦-苯甲酸甲酯。当将叠氮化物-膦化学试剂用于脉冲标记DNA时，经工程改造的膦部分还包含染料标记。在叠氮化物与膦部分之间的反应发生后，可使用标准方法，包括但不限于流式细胞术、荧光显微术、成像、多孔板测定或高内涵筛选来测量染料标记。

[0017] 在一些实验中，期望用2种不同的核苷类似物脉冲标记DNA以便可建立基线增殖速率。目前本领域内已知的方法，包括上述方法，需要在加入第二脉冲标记物之前，从培养基或生物体除去核苷类似物的第一脉冲标记。该清洗要求导入了影响DNA合成的定量的假象。因此，在本领域中需要用于双脉冲标记DNA而无中间清洗步骤的方法。

[0018] 发明概述

[0019] 本发明提供了使用2种或更多种核苷类似物来脉冲标记核酸以测量细胞核酸合成的基线和变化的方法。

[0020] 在一个实施方案中，提供了用于测量细胞核酸合成的变化的方法，其中所述方法包括：

[0021] a)将样品与有效量的第一核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第一温育样品(primary incubated sample)；

[0022] b)将第一温育样品与至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第二温育样品(secondary incubated sample)；

[0023] c)将第二温育样品与第一标记试剂和至少一种第二标记试剂一起温育以形成标记的样品；

[0024] d)检测标记的样品，其中测量第一和至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平，

[0025] 其中将至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平相对于第一核苷或核苷酸类似物的掺入水平的差异测量为细胞核酸合成的变化，

[0026] 前提是第一核苷或核苷酸或至少一种第二核苷或核苷酸包含生物正交功能部分(bioorthogonal functional moiety)。

[0027] 在其他实施方案中提供了用于测量细胞RNA合成的变化的方法，用于测量细胞DNA合成的变化的方法和用于就对细胞增殖或基因表达的影响筛选化合物的方法。

[0028] 在某些方面，第一和/或第二核苷类似物包含生物正交功能部分，其中所述功能部分可经历[3+2]环加成反应或Staudinger连接。在一个情况下，生物正交功能部分包含叠氮基、炔基或膦部分。在特定的方面，核苷类似物是乙炔基-脱氧尿嘧啶(EdU)或5-叠氮基-2'-脱氧尿嘧啶(AzdU)。至少第一或第二核苷类似物包含生物正交功能部分。

[0029] 在另一个实施方案中，第一或第二核苷类似物包含卤素部分，其可以是溴、氯或碘。在一个方面核苷类似物是BrdU。

[0030] 还提供了第一和至少一种第二标记试剂，其中标记试剂共价或非共价地键合至掺入的核苷类似物。在一个实施方案中，第一标记试剂和第二标记试剂是包含生物正交功能部分的标记物或抗体。在一个方面，标记物是荧光染料。在另一个方面，抗体是抗BrdU抗体。

[0031] 在某些方面，生物正交功能部分是叠氮化物，其中标记试剂是罗丹明-叠氮化物、Alexa 350-叠氮化物、Alexa 488-叠氮化物、Alexa 555-叠氮化物、Alexa 568-叠氮化物、Alexa 568-叠氮化物、Alexa 594-叠氮
TM
化物、Alexa 633-叠氮化物、Alexa 647-叠氮化物、Pacific Blue 叠氮化
物、Cascade 叠氮化物、荧光素-叠氮化物、花菁-叠氮化物(cyanine-azide)和四甲基罗丹明(TMR)-叠氮化物。

[0032] 在本发明的某些实施方案中，检测第一核苷类似物和至少一种竞争性核苷类似物的掺入还可包括使用流式细胞术、荧光显微术、成像、高内涵筛选或多孔板测定。

[0033] 在本发明的一个实施方案中，通过用下列来测量细胞增殖：用有效量的第一核苷类似物处理细胞；用有效量的至少一种第二核苷类似物处理细胞；检测第一核苷类似物的掺入；以及检测至少一种竞争性核苷类似物的掺入。

[0034] 在本发明的某些实施方案中，在用核苷类似物的第一脉冲标记处理细胞后，应用特殊的处理或测试过程。此类测试处理或测试化合物可引起期望的细胞增殖的改变，如在通过向培养基系统中或向被测试的动物加入药物来筛选癌症治疗药物的情况下一样。该处理可与来自第二核苷类似物的脉冲(例如，BrdU的加入)同时或在此之前进行，而在处理过程中无除去或清除(在动物的情况下)第一核苷类似物的间断。

[0035] 在本发明的某些实施方案中，在选自但不限于下列的细胞上进行测量细胞增殖的方法：Jurkat细胞、MOLT4细胞、HeLa细胞、COS7细胞、CHOK1细胞、A549细胞、3T3细胞、佛波醇刺激的外周血淋巴细胞、U266、H929、L1210、K562、EL4、SK-BR3、HL60、MCF7、A431和BT-474。

[0036] 在另一个实施方案中，提供了用于测量细胞核酸合成的变化的试剂盒，其中试剂盒包括：第一核苷或核苷酸类似物；至少一种第二核苷或核苷酸类似物，其中至少第一类似物或所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物包含生物正交功能部分；第一标记试剂；和第二标记试剂。另外的试剂盒组分包括缓冲剂、检测剂和使用试剂盒组分测量细胞核酸合成的变化的说明书。

[0037] 附图概述

[0038] 图1提供了显示用EdU(10μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体的图，如利用流式细胞术检测的。图被分为4个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，以及第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。

[0039] 图2提供了显示用EdU(10μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体的一系列图(如通过流式细胞术检测的)。第一个图(左)被分成四个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，以及第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。中间的图是EdU对DNA细胞周期的图。使用的P4>P1的门控证实一些EdU阳性细胞是BrdU阴性的。此类细胞是在BrdU-掺入(第二脉冲)之前在只掺入EdU的最初30分钟的脉冲(第一脉冲)过程中已通过细胞周期的合成期的细胞。

[0040] 图3A提供了显示用EdU(10μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体的一系列图(如通过流式细胞术检测的)。第一个图(左)被分成四个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，以及第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。中间的图是EdU对DNA细胞周期的图，门控P5>P1。中间的图显示BrdU阳性细胞的亚群(其是EdU阴性的)，该亚群是在30分钟的只掺入EdU的第一脉冲后进入细胞周期的DNA合成期的细胞群体。图3B提供了显示用20μM浓度的EdU和10μM浓度的BrdU的同时脉冲处理的细胞群体的图(如通过流式细胞术检测的)。该图被分成四个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，以及第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下)中的细胞群体对于EdU和BrdU都是阴性的。象限Q2(右上)中的细胞群体对于EdU和BrdU都是阳性的。该图显示只检测到来自BrdU的阳性信号并且未检测到来自EdU的信号，从而证明BrdU优先于EdU被掺入。

[0041] 图4提供了显示用EdU(10μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体的一系列图(如通过流式细胞术检测的)。第一个图(左)被分成四个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，以及第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。Q4象限是在第一脉冲中被EdU标记但在第二脉冲中未被BrdU的标记的细胞，因为它们已进入G2/M并且不再合成DNA。Q1象限亚群是在第一脉冲中未被EdU标记但在第二脉冲中正好进入DNA合成期并且被BrdU标记的细胞。中间的图是EdU对细胞周期的图。在中间和左边的图中，进入或已通过细胞周期的DNA合成期的亚群只显示单个标记。

[0042] 图5提供了一系列图，其显示当用EdU和BrdU同时处理细胞时，通过流式细胞术只检测到用BrdU标记的DNA群体。左边的第一个图显示EdU对只用EdU的单脉冲标记处理的DNA细胞周期的图。第二个图显示BrdU对只用BrdU的单脉冲标记处理的DNA细胞周期的图。第三和第四个图显示荧光核苷酸标记对用EdU和BrdU同时处理的DNA细胞周期的双参数图。只有BrdU被掺入用EdU和BrdU同时处理的细胞，如第三和第四个图中所显示的。

[0043] 图6提供了核苷类似物至DNA内的掺入的描述。在图的左侧，EdU被掺入DNA双螺旋中。当将EdU掺入DNA时，类似物是可容易地接近的，从而可使用Alexa 叠氮化物进行标记而无需变性步骤。图的右侧显示，变性是掺入的BrdU的标准的基于抗体的标记所必需的。

[0044] 图7提供了标记为A至C的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体(Ramos B淋巴细胞)(如通过流式细胞术检测的)。

[0045] 图8提供了标记为A至C的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体(来自慢性髓性白血病细胞的K562人成淋巴细胞)(如通过流式细胞术检测的)。

[0046] 图9-1至9-3提供了标记为A至I的一系列结果图，其显示细胞群体(TF-1a人成红细胞)。图A至G显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记(使用改变的脉冲时间)处理的细胞群体(如通过流式细胞术检测的)。图H和I显示只用一个脉冲处理的细胞群体，图H显示只有EdU(20μM)的脉冲标记的结果，图I显示只用BrdU(10μM)的脉冲标记的结果，如利用流式细胞术检测的。

[0047] 图10提供了标记为A至F的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体(THP-1单核细胞)(如通过流式细胞术检测的)。

[0048] 图11显示在7个不同的处理条件下，为EdU和BrdU共阳性(Q2)、EdU和BrdU共阴性(Q3)、BrdU阳性且EdU阴性(Q1)以及BrdU阴性且EdU阳性(Q4)的细胞(Jurkat T细胞淋巴细胞)的百分比。

[0049] 图12-1和12-2提供了标记为A至J的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体(Jurkat T-细胞淋巴细胞)(如通过流式细胞术检测的)。

[0050] 发明详述

[0051] 引言：

[0052] 在本文中我们描述了通过掺入生物正交核苷或核苷酸类似物(以便可双标记新合成的细胞核酸而无需中断性的清洗步骤)来测量细胞核酸合成的方法。此类类似物包括但不限于卤代的(例如BrdU)、叠氮基修饰的类似物，炔烃修饰的类似物或膦修饰的类似物。然后通过测量荧光信号来检测此类类似物的掺入，其中标记物因类似物和标记物的官能团或通过抗体而选择性地连接至核酸类似物。对核苷(或核苷酸)类似物的定时暴露(其具有将该类似物掺入活跃合成的细胞核酸的潜能)被定义为脉冲。脉冲可以测量基线增殖、基线基因表达或对特定处理的响应。

[0053] 我们已发现，加入另外的使用不同核苷类似物(其被选择性标记)的脉冲，提供了测量基线增殖和随后的增殖变化而不会引入将类似物清洗或清除出被测量的细胞或系统的假象的机制。还预期可进行第三脉冲，例如，但不限于测量药物对细胞增殖或基因表达的相互作用的能力。可通过核酸的第一脉冲标记记录基线合成速率。无需除去第一脉冲的中断，可开始第二脉冲。通常，除去第一脉冲标记而导致的对细胞的中断改变细胞增殖的速率并且使得评估细胞增殖的变化变得困难。此外，无清洗步骤使得所述方法与高通量筛选(HTS)相容。用于脉冲标记核酸而不使用放射性核苷的两个相容的方法产生了非常强大的工具，该工具在一个情况下可用于评估离体或体内癌症治疗。

[0054] 部分地基于这样的概念来预测新型双标记方法，所述概念是：在加入第二类似物之前来自第一脉冲的类似物被完全掺入，或第二类似物是第一类似物的竞争者，以便第二类似物被选择性地掺入新生核酸聚合物。不希望受理论束缚，已显示，在类似物EdU和BrdU的情况下，在EdU的存在下，BrdU被选择性地掺入。参见，实施例3。

[0055] 定义：

[0056] 在详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的组合物或方法步骤，因为其可发生变化。应当指出，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外明确地指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数所指物。因此，例如，“a fluorescent pH sensitive dye”包括许多染料，“a cell”包括许多细胞等。

[0057] 除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的意义相同的意义。还应理解，当描述连接至另一个化合物的化学部分或分子时，为了缀合的目的，这些部分以基(radical)的形式存在。为了本文中描述的本发明的目的，定义下列术语。

[0058] 如本文中所使用的，术语“炔烃反应性”是指与核苷类似物上的炔烃修饰的基团选择性反应以在炔烃修饰的基团与炔烃反应性基团之间形成共价化学键的化学部分。炔烃反应性基团的实例包括叠氮化物。“炔烃反应性”还可指包含与炔烃基团选择性反应的化学部分的分子。

[0059] 如本文中所使用的，术语“叠氮化物反应性”是指与另一个分子上的叠氮基修饰的基团选择性反应以在叠氮基修饰的基团与叠氮化物反应性基团之间形成共价化学键的化学部分。叠氮化物反应性基团的实例包括炔烃和膦(例如三芳基膦)。“叠氮化物反应性”还可指包含与叠氮基选择性反应的化学部分的分子。

[0060] 如本文中所使用的，术语“叠氮化物选择性膦染料”是指化合物、分子或试剂，所述化合物、分子或试剂包含具有染料标记的工程改造的膦部分以便当与叠氮化物反应时，在工程改造的膦部分与叠氮化物之间产生共价键。术语“工程改造的膦部分”是指包含膦和亲电子部分的部分。工程改造的膦部分的一个实例是2-二苯基膦基-苯甲酸甲酯(2-diphenylphosphanyl-benzoic acid methyl ester)。其他工程改造的膦部分在本领域内是已知的。参见，例如，Bertozzi等人，美国专利申请案20070037964。

[0061] 如本文中所使用的，术语“生物正交化学报道分子”或“生物正交标记试剂”是指包含化学柄(chemical handle)的可检测标记物，所述化学柄在掺入核酸后与存在的核苷类似物选择性地反应，从而形成共价键。

[0062] 如本文中所使用的，术语“细胞”在本发明的体内应用的背景中意欲包括任何属或种的真核和原核细胞，其中哺乳动物细胞尤为吸引人。“细胞”还意欲包括正常细胞和患病细胞，例如癌细胞。

[0063] 术语“细胞增殖”和“细胞的增殖”在本文中可互换地使用并且指通过单个细胞分裂成子细胞而进行的细胞群体的扩增，或指单个细胞至子细胞的分裂。

[0064] 术语“化学柄”或“生物正交部分”，如本文中所使用的，是指特定的官能团，例如叠氮化物、炔烃、活化的炔烃、亚磷酸盐/酯、膦等。化学柄与下面定义的生物学反应性基团的区别在于化学柄是这样的部分，所述部分在天然发生的生物分子中是罕见的并且对于生物分子(例如，天然细胞成分)是化学惰性的，但当与叠氮化物-或炔烃-反应性基团反应时，反应可在生物学相关条件(例如，细胞培养条件，例如在不存在过热或严苛的反应物的情况下)有效地发生。

[0065] 如本文中所使用的，术语“点击化学”是指掺入的核苷类似物(核苷酸类似物)或标记试剂上的第一反应性不饱和基团与存在于标记试剂或核苷类似物(核苷酸类似物)上的第二反应性不饱和基团之间的[3+2]环加成反应的铜催化形式。该点击化学反应由Sharpless等人(Sharpless等人，Angew Chem，Int.Ed.Engl.，2002，41:1596-1599)描述。

[0066] 如本文中所使用的，术语“竞争性核苷类似物”是指当与第一核苷类似物同时加入细胞或生物体中时，产生优先用竞争性核苷类似物而非第一核苷类似物标记的细胞群体的核苷类似物。例如，当在双脉冲实验中将BrdU(竞争性核苷类似物)和EdU(第一核苷类似物)同时加入细胞中时，只有BrdU(该对核苷类似物中的竞争性核苷类似物)被掺入DNA(参见，例如，图5和实验例3)。

[0067] 如本文中所使用的，术语“铜(I)催化剂”是指催化掺入的核苷类似物(核苷酸类似物)或标记试剂上的第一反应性不饱和基团与存在于标记试剂或核苷类似物(核苷酸类似物)上的第二反应性不饱和基团之间的[3+2]环加成反应的化合物、分子或试剂。术语“铜(I)催化剂”包括外源性铜(I)以及铜螯合部分。术语“铜螯合部分”是指特征在于存在2个或更多个可参与铜(I)离子配合物的形成的极性基团的任何化合物、分子或试剂。

[0068] 如本文中所使用的，术语“无铜点击化学”是指可在生理条件下进行的张力提高的[3+2]环加成反应，如由Bertozzi等人美国申请20060110782；Baskin等人PNAS 2007Oct 23；104(43):16793-7；Agard等人J Am Chem Soc.2004Nov 24；126(46):15046-7所描述的。
通过使用包含紧张的环炔部分的第一分子(通常为标记物)和包含叠氮化物部分的第二分子(通常为核苷类似物)来完成反应。第二分子上的叠氮化物部分在催化剂不存在的情况下与第一分子上的紧张的环炔部分反应，从而形成包含融合的叠氮化物/环炔环的终缀合产物。

[0069] 如本文中所使用的，术语“可检测的响应”是指可通过观察或通过仪器直接或间接地检测的信号的发生或其变化。通常，可检测的响应是导致波长分布模式的变化，或吸光度或荧光的强度的变化，或光散射、荧光寿命、荧光偏振的变化，或上述参数的组合的光学响应。

[0070] 如本文中所使用的，术语“染料”是指发射光以产生可观察的可检测信号的化合物。

[0071] 如本文中所使用的，术语“染料标记的叠氮化物”和“叠氮化物-染料分子”是指也用染料标记的具有反应性叠氮化物基团的化合物或分子。实例包括但不限于：罗丹明-叠氮化物、Alexa 350-叠氮化物(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)，Alexa 488-叠氮化物(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)，Alexa555-叠氮化物(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)、Alexa
568-叠氮化物(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)、Alexa
568-叠氮化物(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)、Alexa
TM
594-叠氮化物，Alexa 633-叠氮化物(Molecular Probes /
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)、Alexa 647-叠氮化物(Molecular ProbesTM/
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)，Cascade 叠氮化物(Molecular ProbesTM/
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)、荧光素-叠氮化物、香豆素-叠氮化物、BODIPY-叠氮化物、花菁-叠氮化物或四甲基罗丹明(TMR)-叠氮化物。

[0072] 如本文中所使用的，术语“染料标记的环炔”是指已被进一步修饰从而包含染料标记的环炔。术语“环炔”是指可用于紧张的[3+2]环加成反应以脉冲标记DNA的化合物或分子。在本说明书中，环炔的实例包括但不限于：环辛炔、二氟环辛炔、杂环炔、二氮环辛炔、二溴环辛炔或二碘环辛炔。

[0073] 如本文中所使用的，术语“染料标记的炔烃”是指已被进一步修饰从而包含染料标记的炔烃。

[0074] 如本文中所使用的，术语“双标记”是指其中用产生可区别的信号的两种可检测试剂标记核酸聚合物的标记过程。由这样的标记过程产生的核酸聚合物称为双标记的。

[0075] 如本文中所使用的，术语“有效量”是指在细胞、组织或生物体中引发相关响应的物质、化合物、分子、试剂或组合物的量。例如，在细胞与核苷类似物接触的情况下，有效量是掺入细胞的DNA中的核苷的量。

[0076] 如本文中所使用的，术语“荧光团”或“产生荧光的(fluorogenic)”是指在结合目的生物化合物或分析物后显示荧光的变化的组合物。本发明的优选荧光团包括在水性介质中具有高量子产量的荧光染料。示例性荧光团，特别地，包括呫吨(xanthene)、吲哚、borapolyazaindacene、呋喃和苯并呋喃、花菁。本发明的荧光团可被取代以改变荧光团的溶解度、光谱性质或物理性质。

[0077] 如本文中所使用的，术语“标记或标记物”是指当本发明的标记试剂的部分用于本方法时保持其天然性质(例如光谱性质、构象和活性)的化学部分或蛋白质。示例性报道分子可以是可直接检测的(荧光团)或可间接检测的(半抗原或酶)。此类报道分子包括但不限于可使用辐射计数装置测量的放射性报道分子；可目测观察的或使用分光光度计测量的色素、染料或其他色原(chromogen)；可使用自旋标记分析仪测量的自旋标记物；和荧光部分，其中通过激发合适的分子加合物产生输出信号，并且其可通过用可被染料吸收的光激发来显现或可以例如使用标准荧光计或成像系统来测量。报道分子可以是发光物质例如磷光体或荧光发生素(fluorogen)；生物发光物质；化学发光物质，其中通过化学修饰信号化合物来产生输出信号；含有金属的物质；或酶，其中存在信号的酶依赖性二次产生，例如从无色底物形成有色产物。报道分子还可以以化学或生物化学或惰性粒子的形式存在，包括但不限于胶体金、微球体(microsphere)、量子点或无机晶体例如纳米晶体或磷光体(参见，例如，Beverloo,等人，Anal.Biochem.203，326-34(1992))。术语报道分子还可指“标签”或半抗原，所述标签或半抗原可选择性结合标记的分子以便标记的分子，当随后加入时，用于产生可检测的信号。例如，可使用生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素作为标签，然后使用辣根过氧化物酶(HRP)的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合物来结合标签，然后使用生色底物(例如，四甲基联苯胺)或产生荧光的底物例如Amplex Red或Amplex Gold(Molecular Probes，Inc.)来检测HRP的存在。以相似的方式，标签可以是半抗原或抗原(例如，地高辛)，并且酶促标记的、荧光标记的或放射性标记的抗体可用于结合标签。大量的报道分子对于本领域技术人员来说是已知的，并且包括但不限于颗粒、荧光染料、半抗原、酶和它们的生色底物、产生荧光的底物和化学发光底物，以及Richard P.Haugland的MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS，第10版，(2005)(其内容通过引用合并入本文)和其他公开来源中描述的其他报道分子。如本文中所使用的，报道分子不是氨基酸。

[0078] 如本文中所使用的，术语“标记试剂”是指用于标记和检测掺入的核苷酸类似物的试剂。在一个情况下，标记试剂包含标记物和化学柄。在另一个情况下，标记试剂包含抗体和标记物，其中抗体结合核苷类似物。

[0079] 如本文中所使用的，术语“核苷类似物”和“核苷酸类似物”可互换地使用，并且是指在结构上与掺入新合成的核酸中的天然核苷或核苷酸相似的分子或化合物。在核苷的情况下，当在细胞内时，它们被磷酸化成核苷酸，然后被掺入新生核酸聚合物。核苷酸因它们的电荷而难以穿过细胞膜并且比核苷更不稳定，从而它们的使用通常需要用于转染的额外步骤和试剂，以将核苷酸转运穿过脂双层。以与天然核苷酸相似的方式将所述核苷类似物掺入核酸(DNA或RNA)，其中矫正聚合酶(correct polymerase)将类似物识别为天然核苷酸并且在合成中不存在中断。此类类似物包括最终用于检测的许多不同部分，例如卤代类似物(溴、氯、碘等)和包含生物正交部分例如叠氮基、炔烃或膦的类似物。

[0080] 如本文中所使用的，术语“反应性基团”是指能够与另一个化学基团反应从而形成共价键，即在合适的反应条件下是共价反应性的基团，其通常代表另一种物质的附着点。如本文中所使用的，反应性基团是指通常在生物系统中发现的、在正常生物学条件下反应的化学部分，此类反应性基团在本文中不同于上文中定义的化学柄或生物正交功能部分例如本发明的叠氮基和活化的炔烃部分。如本文中所提及的，反应性基团是能够与不同化合物上的官能团起化学反应以形成共价键的部分，例如羧酸或琥珀酰亚胺酯。反应性基团通常包括亲核试剂、亲电试剂和光激活基团。

[0081] 如本文中所使用的，术语“Staudinger连接”是指由Saxon和Bertozzi(E.Saxon和C.Bertozzi，Science，2000，287:2007-2010)开发的化学反应，该反应是经典Staudinger反应的改进。经典Staudinger反应是其中叠氮化物与膦或亚磷酸盐/酯的组合产生氮杂叶立德(aza-ylide)中间产物的化学反应，该中间产物在水解后产生膦氧化物和胺。Staudinger反应是将叠氮化物还原成胺的温和方法；并且三苯基膦通常用作还原剂。在Staudinger连接中，将亲电阱(electrophilic trap)(通常甲酯)适当地置于三芳基膦芳基上(通常为磷原子的邻位)并且与叠氮化物反应，从而产生氮杂-叶立德中间产物，该中间产物在水性介质中重排以产生具有酰胺基和膦氧化物功能的化合物。Staudinger连接之所以如此命名是因为其将两个起始分子连接在一起(附着/共价连接)，而在经典Staudinger反应中，两个产物在水解后未共价连接。

[0082] 如本文中所使用的，术语“受试化合物”和“受试处理”是指在请求保护的方法中就其对细胞增殖或细胞周期的影响对其进行测试的任何物质、化合物、分子、试剂、组合物或处理。此类“受试化合物”和“受试处理”对细胞增殖的影响不受结果限制，即，它们可增加、减少或不影响细胞增殖或细胞周期。

[0083] 如本文中所使用的，术语“反应性伴侣(reactive partner)”是指与另一个反应性伴侣例如本发明的核苷类似物和报道分子特异性反应的分子或分子部分。

[0084] 双标记试剂：

[0085] 一般地，为了易于理解本发明，首先详细地描述用于通过核苷或核苷酸类似物的掺入而双标记核酸的成分，然后描述双标记方法。之后描述一些实施方案，其中将此类双标记的核酸用于测量细胞增殖。然后公开示例性方法。

[0086] 在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于描述的特定实施方案，因为其当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语只是用于描述特定的实施方案而不意欲限定本发明，因为本发明的范围只受所附权利要求书的限定。

[0087] 我们在本文中描述了用于就对新生细胞核酸合成的作用筛选受试化合物的方法，其中将两种颜色标记用于测量与处理后的合成相比较的基线核酸合成。该方法使用被“饲喂”给细胞并且掺入生长的核酸聚合物的核苷类似物，其中至少一个核苷类似物包含生物正交功能部分。

[0088] 在特定的实施方案中，提供了就对细胞增殖的作用而筛选受试化合物的方法。在本文中，我们描述了用于双标记的方法，其中测量基线增殖以比较体内或离体处理细胞后增殖的变化。这可通过使用卤代类似物(例如BrdU)或含有化学柄的核苷类似物与含有化学柄的核苷类似物(其可使用本发明的标记试剂来选择性标记)的组合来完成。本发明使用至少一种含有化学柄(在本文中也称为生物正交功能部分)的核苷(或核苷酸)类似物。

[0089] 类似地，还可将该双标记法用于测量响应施用的处理的细胞基因表达(RNA合成)。在该情况下，核酸类似物包含核糖，并且是RNA核苷或核苷酸类似物。

[0090] 该双标记法的有利方面是，其在施用核苷类似物的第二脉冲之前不需要从培养基或动物中除去核苷类似物的第一脉冲。对于第二标记的另外脉冲，该‘无清洗’处理的显著有利方面是，可使用第一脉冲核苷类似物，然后施用特定的处理或测试过程(其可引起细胞增殖或基因表达的期望的改变)来进行基线细胞增殖或基因表达的测量。例如，在通过向培养基系统或向测试的动物加入药物而筛选癌症治疗药物的情况下。该处理可以与来自第二核苷类似物的脉冲同时进行或在其之前进行，而无用于除去第一类似物的处理过程的中断。在测试结束时，制备细胞以检测标记核酸的两个脉冲。

[0091] 在一个特定的方面，包含生物正交功能部分的核苷类似物用于第一脉冲，然后使用卤代核苷类似物进行第二脉冲。在另一个方面，包含第一生物正交功能部分的核苷类似物用于第一脉冲，然后使用包含第二生物正交功能部分的核苷类似物进行第二脉冲。使用本领域内已知的方法检测此类掺入的类似物。对于卤代核苷类似物，使用选择性识别特定卤素部分的抗体，所述抗体包含标记物或通过包含标记物的二抗来检测。使用包含互补(complimentary)生物正交功能部分和标记物的试剂(其导致标记试剂与核苷类似物的共价连接)检测包含生物正交功能部分的核苷类似物。

[0092] 用于测量细胞增殖的该双标记法与已知的方法显著不同，因为1)在两个脉冲之间不需要清洗处理和2)利用两种颜色、第一和第二标记物、荧光测量进行检测的两个脉冲标记条件的相容性，其中一个核苷类似物包含生物正交功能部分。优选，选择第一和第二标记物以使它们产生可区别的可检测的信号，换句话说，可以以相同或不同的波长激发标记物，但发射的波长不同。

[0093] 在一个特定方面，当使用两种胸苷类似物时，在加入BrdU时，不必将第一脉冲核苷5-乙炔基2'-脱氧尿苷(在本文中也称为乙炔基尿嘧啶或EdU)从测试系统(细胞或动物)中除去，因为当BrdU存在时，EdU显示不掺入核酸。该重要特征和之前未公开的核苷类似物的特征允许不间断观察基线细胞增殖测量和之后由施用特定处理而导致的细胞增殖的改变的状态。

[0094] 核苷和核苷酸类似物：

[0095] 核苷和核苷酸类似物都可用于测量新生核酸合成的本方法。核苷通常用于其中向细胞培养物中加入或给动物施用类似物的实验，因为核苷类似物易于被活细胞吸收，其中它们被磷酸化成核苷酸，然后掺入生长的核酸聚合物。相反地，核苷酸不稳定并且在掺入细胞之前或之后易于被酶切割，其通常比核苷更不稳定。此外，由于来自磷酸基团的额外的电荷，核苷酸不易被转运入活细胞，并且通常需要转染步骤来获得充足的穿过细胞膜的核苷酸的浓度。这对于其中应当使细胞干扰保持至最低程度以正确地解释结果的体内或离体/体内实验是不理想的。因为这些原因，下列公开内容通常提及核苷作为加入至细胞或动物的类似物，然而这决不意欲是限定性的，其中核苷酸同样重要。

[0096] 核苷类似物可以是4种DNA碱基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T))中的任一种或4种RNA碱基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U))中的任一种的类似物，并且包括它们的三磷酸形式和亚磷酰胺形式，其中利用存在于细胞中的聚合酶将此类类似物掺入新合成的核酸。将核苷修饰为类似物，其中它们包含最终用于检测该核苷和在核苷类似物存在的情况下合成所得的新生核酸聚合物的部分。

[0097] 在一个实施方案中，核苷类似物是卤代类似物，包括但不限于溴、氯和碘部分。在另一个实施方案中，核苷类似物包含化学柄或生物正交功能部分，包括但不限于叠氮基、炔烃和膦部分。卤代类似物在本领域内是熟知的，例如BrdU、IdU、CldU和BrUTP，并且可购自许多提供商(Sigma，Saint Louis，MO；Millipore，Billerica，MA；Anaspec，San Jose，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA)。类似地用于检测此类类似物的抗体也可商购获得(Dako，Carpinteria，CA；BD Bioscience，San Diego，CA；EMD Biosciences，Madison，WI)。

[0098] 包含适用于本文中描述的方法的生物正交功能部分的核苷类似物包括本文中定义的任何核苷类似物，所述类似物包含可进行[3+2]环加成或Staudinger连接的反应性生物正交部分或化学柄。在一些实施方案中，反应性生物正交部分可由核苷的碱基携带。携带反应性生物正交部分的碱基可以是嘌呤(例如，腺嘌呤或鸟嘌呤)或嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶)。在某些实施方案中，碱基是尿嘧啶；在一些此类实施方案中，尿嘧啶在5-位置上携带反应性生物正交部分。在某些实施方案中，碱基是腺嘌呤；在一些此类实施方案，腺嘌呤携带反应性生物正交部分。在某些实施方案，生物正交部分间接地连接至碱基，而在其他实施方案中，生物正交部分直接共价地连接至碱基。可用于本文中描述的方法的核苷类似物的非限定性实例包括乙炔基尿嘧啶或EdU和5-叠氮基-2'-脱氧尿嘧啶(在本文中也称为叠氮基尿嘧啶或AzdU)以及它们的三磷酸形式和亚磷酰胺形式。可基本上如C.-S.Yu和F.Oberdorfer，Synlett，2000，1:86-88中所述合成EdU；并且可使用与P.Sunthankar等人，Anal.Biochem.，1998，258:195-201中描述的合成叠氮基-dUMP的方法类似的方法合成AzdU。EdU还可从Berry and Associates，Inc.(Dexter，MI)商购获得。

[0099] 在某些实施方案中，反应性生物正交部分由核苷的糖(核糖和脱氧核糖)携带。在某些实施方案中，将生物正交部分间接连接至糖，然而在其他实施方案中，将生物正交部分直接且共价地连接至糖。在某些实施方案中，反应性生物正交部分连接至核苷的磷酸部分。携带反应性生物正交部分的糖可共价连接至嘌呤(例如，腺嘌呤或鸟嘌呤)或嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶)。在某些实施方案中，碱基是尿嘧啶，然而在其他实施方案中，碱基是腺嘌呤。可用于本文中描述的方法的核苷类似物的非限定性实例包括EdU、AzdU或链终止双脱氧化合物例如AZT；3'-叠氮基-2',3'-双脱氧腺苷、3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)、
5'-叠氮基-5'-脱氧胸苷、5-(1-乙炔基)-2'-O-甲基尿苷、5-(1-丙炔基)-2'-脱氧尿苷、5-(炔丙基氧基)-2'-脱氧尿苷、8-叠氮基-2'-脱氧腺苷、3'-叠氮基-2',3'-双脱氧腺苷。

[0100] 反应性生物正交部分或化学柄可以是1,3-偶极子例如腈氧化物、叠氮化物、重氮甲烷、硝酮或腈亚胺(nitrile imine)。在某些实施方案中，1,3-偶极子是叠氮化物。备选地，反应性生物正交功能部分可以是亲偶极物(dipolarophile)例如烯烃(例如，乙烯基、丙烯基等)或炔烃(例如，乙炔基、丙炔基等)。在某些实施方案中，亲偶极物是炔烃例如乙炔基。

[0101] 上述的这些生物正交功能部分是非天然、非扰乱性生物正交化学部分，其具有可通过高选择性反应进行修饰的独特的化学功能性。特别地使用标记试剂标记此类掺入的核苷，所述标记试剂包含在细胞环镜存在的情况下与核苷选择性地形成共价键的化学柄。

[0102] 标记试剂：

[0103] 试剂A

[0104] 在特定的实施方案中，标记试剂是一抗，其可被缀合至标记物或可被共价连接至标记物的二抗结合，其中一抗结合掺入的核苷。在一个方面，其为抗BrdU抗体。在另一个方面，抗体是抗IdU或抗CldU抗体。然而，还预期可选择性结合掺入的核苷类似物的其他抗体。

[0105] 试剂B

[0106] 在另一个实施方案中，标记试剂包含标记物和化学柄。化学柄，如上文定义的，是选择性地与功能部分反应以形成共价键的生物正交功能部分。

[0107] 标记或标记物

[0108] 如上文已提及的，标记物的作用是在标记后使得能够显现或检测核酸聚合物，例如，细胞中的DNA。优选，选择标记物(或可检测的试剂或部分)以便其产生可测量的并且其强度与标记的核酸聚合物(例如被分析的样品中的标记的核酸聚合物)的量相关的(例如，成比例的)信号。

[0109] 用于本文描述的方法和组合物中的标记试剂的标记物是在大于280nm的波长上展示最大吸收，并且当共价连接至修饰的核苷例如(仅以举例的方式)，叠氮化物和炔烃或膦时保持其光谱性质的任何化学部分(有机的或无机的)。用于本文中描述的方法和组合物中的标记试剂的荧光团包括但不限于：芘(包括美国专利5,132,432中公开的任何相应的衍生化合物)、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)、花菁(包括美国系列案09/968,401和09/969,853中的任何相应化合物)、羰花青(包括美国系列案09/557,275；09/969,853和09/968,401；美国专利4,981,977；5,268,486；5,569,587；5,569,766；5,486,616；5,627,027；5,808,044；5,877,310；6,002,003；6,004,536；6,008,373；6,043,025；6,127,134；6,130,094；6,133,
445；和公开案WO 02/26891，WO 97/40104，WO 99/51702，WO 01/21624；EP 1065250A1中的任何相应化合物)、喹诺酮(carbostyryl)、卟啉、水杨酸、氨基苯甲酸盐/酯、薁(azulene)、二萘嵌苯(perylene)、吡啶、喹啉、borapolyazaindacene(包括美国专利4,774,339；5,187,
288；5,248,782；5,274,113和5,433,896中公开的任何相应化合物)、呫吨(包括美国专利6,
162,931；6,130,101；6,229,055；6,339,392；5,451,343和美国系列案09/922,333中公开的任何相应化合物)、噁嗪(包括美国专利4,714,763中公开的任何相应化合物)或苯并噁嗪、卡巴嗪(包括美国专利4,810,636中公开的任何相应化合物)、phenalenone、香豆素(包括美国专利5,696,157；5,459,276；5,501,980和5,830,912中公开的相应化合物)、苯并呋喃(包括美国专利4,603,209和4,849,362中公开的相应化合物)和benzphenalenone(包括美国专利4,812,409中公开的任何相应化合物)和其衍生物。如本文中所使用的，噁嗪包括试卤灵(resorufin)(包括5,242,805中公开的任何相应化合物)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪和它们的苯并取代类似物。

[0110] 用于本文中公开的方法和组合物中的标记试剂的呫吨型荧光团包括但不限于荧光素、对甲氨基酚(包括美国专利5,227,487和5,442,045中公开的任何相应化合物)或罗丹明(包括美国专利5,798,276；5,846,737；美国系列案09/129,015中的任何相应化合物)。如本文中所使用的，荧光素包括苯并或二苯并荧光素、半萘并荧光素或萘并荧光素。类似地，如本文中所使用的，对甲氨基酚包括seminaphthorhodafluor(包括美国专利4,945,171中公开的任何相应化合物)。在某些实施方案中，荧光团是通过在呫吨的9-位置上的单个共价键结合的呫吨。在其他实施方案中，呫吨包括在9-位置上连接的3H-呫吨-6-醇-3-酮的衍生物、在9-位置上连接的6-氨基-3H-呫吨-3-酮的衍生物或在9-位置上连接的6-氨基-3H-呫吨-3-亚胺的衍生物。

[0111] 在某些实施方案中，用于本文中描述的方法和组合物中的标记试剂的荧光团包括呫吨(对甲氨基酚、罗丹明、荧光素和其衍生物)香豆素、花菁、芘、噁嗪和borapolyazaindacene。在其他实施方案中，此类荧光团是磺化呫吨、氟化呫吨、磺化香豆素、氟化香豆素和磺化花菁。还包括以商业名称销售并且通常称为Alexa Fluor、DyLight、Cy Dyes、BODIPY、Oregon Green、Pacific Blue、IRDyes、FAM、FITC和ROX的染料。

[0112] 用于标记试剂的连接的荧光团的选择将决定修饰的核酸的吸收和荧光发射性质。可用于检测修饰的核酸的荧光团标记物的物理性质包括但不限于光谱特性(吸收、发射和斯托克司频移)、荧光强度、寿命、偏振和光漂白速率或其组合。所有这些物理性质可用于将一种荧光团与另一种荧光团相区别，从而允许多重分析。在某些实施方案，荧光团在大于
480nm的波长上具有最大吸收。在其他实施方案，荧光团在488nm至514nm处或其附近(特别适合于通过氩离子激光器激发源的输出来激发)或546nm附近(特别适合于通过水银灯来激发)吸收。在其他实施方案中，荧光团可在NIR(近红外区)发射以用于组织或完整生物体的应用。荧光标记试剂的其他期望的性质可包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果将在细胞或生物体(例如，活动物)中进行核酸聚合物的标记。

[0113] 在某些实施方案中，标记试剂包括串联染料(tandem dye)或FRET染料对。这对于获得一组在相同波长下激发但具有不同发射光谱的标记试剂特别有用。两种染料，当它们十分靠近时(通常共价连接)，用作FRET对，这样可使来自激发的第一染料(供体)的能量转移至第二染料(受体)，然后第二染料以更长的波长发射能量(与只激发第一染料而可能产生的波长相比)。特别有用的组合是美国专利7169939；6849745；5945526；5863727；5800996和6967250中公开的FRET染料对。

[0114] 在另一个实施方案中，标记试剂包含荧光纳米晶体。

[0115] 对于各双标记实验，必须基于使用的仪器选择匹配的标记试剂组以便可在正确的波长上适当地激发和测量染料以区别基线核酸合成与因处理而导致的随后的核酸合成的变化。匹配的荧光标记染料对通常产生在光谱上可区别的信号。例如，在一些实施方案，匹配对中的荧光染料不会显著地吸收相同光谱范围内的光(即，它们展示不同的最大吸收波长)并且可使用两个不同的波长来激发(例如，相继地激发)。备选地，匹配对中的荧光染料可发射不同光谱范围内的光(即，它们在激发后产生双色荧光)。成对的荧光标记物在本领域内是已知的(参见，例如，R.P.Haugland，"Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，同上)。

[0116] 特定的标记物组的选择将取决于待进行的标记的目的并且将由几个因素决定，例如标记方法的容易程度和成本、期望的样品标记的质量、可检测部分对细胞或生物的作用、检测系统的性质、由可检测部分产生的信号的性质和强度等。在特定情况下，一个标记物被选择用于试剂A，第二标记物被选择用于试剂B。

[0117] 方法：

[0118] 将上述双标记成分用于本方法以通过细胞核酸的双脉冲标记测量细胞新生核酸的合成。用核苷类似物进行的核酸的第一脉冲标记允许确定核酸合成的基线速率。然后用另外的第二核苷类似物进行的核酸的脉冲标记允许测量核酸合成的任何变化。该方法在脉冲标记之间不需要可能引入假象的中间清洗步骤。可将核酸合成测量为细胞增殖(在DNA的情况下)或基因表达(在RNA的情况下)。此外，该方法可用于就其对细胞增殖或基因表达的作用筛选化合物(通过在用第二核苷类似物处理的同时或在此之前用受试化合物处理细胞或生物体)。

[0119] 因此，在一个实施方案中,提供了用于测量细胞核酸合成的变化的方法，其中所述方法包括：

[0120] a)将样品与有效量的第一核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第一温育样品；

[0121] b)将第一温育样品与至少一种第二核苷或核苷酸类似物一起温育以形成第二温育样品；

[0122] c)将第二温育样品与第一标记试剂和至少一种第二标记试剂一起温育以形成标记的样品；

[0123] d)检测标记的样品，其中测量第一和至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平，

[0124] 其中将所述至少一种第二核苷或核苷酸类似物的掺入水平相对于第一核苷或核苷酸类似物的掺入水平的差异测量为细胞核酸合成的变化，

[0125] 前提是第一核苷或核苷酸或至少一种第二核苷或核苷酸包含生物正交功能部分。

[0126] 因此，在一个方面，提供了用于测量可被测量为细胞增殖的细胞DNA合成的变化的方法。在另一个方面，提供了用于测量可被测量为基因表达的细胞RNA合成的变化的方法。

[0127] 在本发明的某些优选实施方案中，提供了就受试化合物对细胞增殖的作用筛选所述化合物的方法。该方法可包括在用特定化合物治疗疾病的过程中测量患者的细胞增殖变化。

[0128] 可从患者取出癌细胞并且培养于培养物中。可用第一脉冲确定基线DNA合成速率，然后加入药物和第二核苷类似物，并测定DNA合成速率的变化，所述变化在癌细胞的药物抗性/敏感性的情况下可容易地测定。通过加上不改变细胞增殖状态的准确的基线合成测量，可极大地改进对在细胞周期的不同位置刺激或阻断DNA合成的化合物的筛选。

[0129] 例如，可从患者中取出乳腺癌细胞并且培养于培养物中。可通过加入EdU的第一脉冲来确定基线细胞增殖速率。然后，用化疗药物例如他莫昔芬处理细胞，用BrdU的第二脉冲标记处理细胞。然后通过比较EdU与BrdU的掺入来测量响应他莫西芬的细胞增殖速率。可在乳腺癌患者的治疗过程中重复该过程以确保患者的癌细胞保持对选择的化疗剂(在该情况下，他莫西芬)的响应。在本实例中，临床医生期望在用化疗药物治疗之后细胞增殖减少。一旦乳腺癌患者的细胞中DNA的双脉冲标记显示，在用特定的药物治疗后细胞增殖无变化，那么临床医生可重新评估患者是可受益于使用该药物的持续治疗还是应当转向不同的化疗剂。

[0130] 本领域技术人员理解，本方法可适合于就化合物在许多疾病中对细胞增殖的作用来筛选化合物。例如但无意限定本发明的范围，下列是其进展受改变至正常细胞增殖水平影响的疾病：乳腺癌、白血病、结肠癌、前列腺癌等(参见，例如，美国专利6,646,008(于2000年2月22日提交))；神经疾病，包括神经退行性疾病例如亨廷顿病(Huntington's disease)(Curtis等人，Increased Cell Proliferation and Neurogenesis in the Adult Human Huntington's disease brain，100(15)PNAS 9023-9027(2003年7月22日))或HIV相关痴呆(Okamoto等人，HIV/gp120Decreases Adult Neural Progenitor Cell Proliferation via Checkpoint Kinase-Mediated Cell-Cycle Withdrawal and G1 Arrest，1 Cell Stem Cell 230-236(2007年8月16日))；和其他增生疾病包括银屑病、皮脂溢、湿疹、良性前列腺增生、先天性肾上腺增生、子宫内膜增生、鳞状细胞增生、皮脂腺增生、克罗恩氏病、癌、肉瘤、神经胶质瘤和淋巴瘤(参见美国专利7,256,034(于2004年1月5日提交))。

[0131] 在另外的实施方案中，本发明涉及用于鉴定新型化合物的方法，所述化合物可称为“受试化合物”，其对细胞增殖具有期望的作用。取决于应用，该期望的作用可以是刺激、抑制或不影响细胞增殖。

[0132] 在鉴定受试化合物对细胞增殖是否具有作用的筛选方法中，已提出可就潜在有用的药剂的存在测定从天然来源例如植物、动物或甚至来源例如海洋、森林或土壤样品分离的化合物。应理解，待筛选的受试化合物还可来源于化学组合物或人造化合物。受试化合物还可包括蛋白质和肽，例如通过重组DNA技术或通过其他技术(包括肽合成)产生的蛋白质和肽。受试化合物还可以是抗体，包括多克隆和单克隆抗体。受试化合物还可包括天然发生的化合物的片段或部分，或只有作为已知化合物的活性组合才可被发现(否则化合物失活)。受试化合物还可包括核酸，包括但不限于：DNA；核糖核酸(RNA)；小干扰RNA(siRNA)；和单链核酸，更特别地，经设计形成体内三链体的单链核酸。

[0133] 在某些实施方案中，本发明可用于在用已知影响细胞增殖的化合物处理后测量细胞增殖。参见，例如，Nicholas R.Cozzarelli，The Mechanism of Action of Inhibitors of DNA Synthesis，46ANN.REV.BIOCHEM.641-648(1977)。

[0134] 在本发明的某些实施方案中，给生物体施用受试化合物。可对其施用所请求保护的方法的生物体包括但不限于：人、小鼠、大鼠、马、牛、绵羊、兔、狗或猫。

[0135] 可通过本领域技术人员已知的许多方法给生物体施用受试化合物和核苷类似物。此类施用包括口服施用(例如，含有受试化合物和/或核苷类似物的丸剂、食物或液体的摄入)或通过皮下、静脉内或腹膜内施用(例如，通过注射或局部给药)。还可胃肠外、脊柱内或脑内施用受试化合物。

[0136] 在某些实施方案中，本发明提供了测量细胞中而非生物体中的细胞增殖的方法。可向在其中培养细胞的培养基中加入核苷类似物。类似地，如果方法包括就受试化合物对细胞增殖的作用而筛选受试化合物，那么可向在其中培养细胞的培养基中加入受试化合物。

[0137] 受试化合物对细胞增殖的作用的上述论述也预期涉及它们对基因表达的作用，其中测量RNA合成的变化。

[0138] 在本发明的特定实施方案中，通过用有效量的EdU处理细胞，然后用有效量的BrdU处理细胞来测量细胞中的细胞增殖。使用点击化学试剂包括硫酸铜(CuSO4)和染料标记的叠氮化物(例如Alexa 488-叠氮化物(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA))来检测EdU脉冲标记。使用标准的基于抗体的方法检测BrdU脉冲标记。参见，例如，Jonathon Pines等人，Assays for CDK Activity and DNA Replication in the Cell Cycle，CURRENT PROTOCOLS IN CELL BIOLOGY(Juan S.Bonifacino等人eds.，John Wiley&Sons，Inc.2003)(1998)。然后使用流式细胞术测量两种标记物。

[0139] 在本发明的某些实施方案中，可将该双脉冲标记法用于评估离体或体内癌症疗法。可从患者取出癌细胞，并培养于培养物中。可使用第一脉冲确定基线DNA合成速率，然后加入药物和第二核苷类似物，并测定DNA合成速率的变化。不改变细胞增殖状态的准确基线合成测量将极大地改进筛选刺激或阻断DNA合成的化合物的方法。

[0140] 在本发明的某些实施方案中，对神经细胞进行测量细胞增殖的方法。可将该双脉冲标记法用于评估对神经系统疾病的治疗。例如，可通过下列测量在用受试化合物处理后神经细胞的细胞增殖速率的改变：将神经细胞与核苷类似物的第一脉冲接触；用受试化合物进行处理；在使用受试化合物进行处理的同时或在此之后将神经细胞与竞争性核苷类似物接触；检测第一核苷类似物的掺入和检测竞争性核苷类似物的掺入。因此，该双脉冲标记法可用于鉴定刺激或抑制神经细胞增殖的化合物。

[0141] 在本发明的一个实施方案中，使用这样的方法就化合物对细胞增殖的作用筛选所述化合物，所述方法包括步骤：用第一核苷类似物处理细胞；用受试化合物处理细胞；在使用受试化合物处理细胞的同时或在此之后用至少一种竞争性核苷类似物处理细胞；检测第一核苷类似物的掺入；和检测第二核苷类似物的掺入。

[0142] 在本发明的另一个实施方案中，通过下列步骤测量生物体中的细胞增殖：用第一核苷类似物处理生物体；用至少一种第二核苷类似物处理生物体；检测第一核苷类似物的掺入；和检测第二核苷类似物的掺入。

[0143] 在本发明的另一个实施方案中，通过下列步骤测量生物体中的细胞增殖：用第一核苷类似物处理生物体；用受试化合物处理生物体；在用受试化合物处理细胞的同时或在此之后用至少一种竞争性核苷类似物处理生物体；检测第一核苷类似物的掺入；和检测第二核苷类似物的掺入。

[0144] 照射(Illumination)

[0145] 本发明的化合物可以在测定后或测定期间的任何时间用产生可检测的光学响应的波长的光来照射，并且利用检测光学响应的方法来观察。在照射后，例如利用紫色或可见波长发射灯、弧光灯、激光器或甚至阳光或普通室内灯照射后，荧光化合物展示强烈的可见吸收以及荧光发射。选择的用于照射本发明的荧光化合物的设备包括但不限于手提式紫外灯、水银灯、氙气灯、氩激光器、激光二极管和YAG激光器。任选地将这些照射源整合入激光扫描器、流式细胞仪、荧光微板读取器、标准或小型荧光计或色谱检测器。该荧光发射任选地通过目视观察或通过使用任何下列装置来检测：CCD照相机、摄像机、照相胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微板读取器，或通过用于扩增信号的方法(例如光电倍增管)来检测。在使用流式细胞仪、荧光显微镜或荧光计检查样品的情况下，任选地将仪器用于通过可检测的不同的光学性质(通常通过区别本发明的第一荧光化合物的荧光响应与第二荧光团的荧光响应)来区别和区分本发明的第一脉冲标记试剂和第二标记试剂。在使用流式细胞仪检查样品的情况下，样品的检查任选地包括使用分选装置基于荧光响应来分离样品中的颗粒。

[0146] 本发明的试剂盒

[0147] 在另一个方面，本发明提供了包括本发明的至少一种核苷类似物和标记试剂的试剂盒。试剂盒通常还包括在一个或多个方法(所述方法通常用于测量细胞核酸合成的变化)中使用核苷类似物和标记试剂的说明书。

[0148] 在示例性实施方案中，试剂盒包括第一核苷或核苷酸类似物，至少一种第二核苷或核苷酸类似物，其中至少第一类似物或至少一种第二核苷或核苷酸类似物包含生物正交功能部分，第一标记试剂和第二标记试剂。另外的试剂盒成分包括缓冲剂、其他检测试剂和标准品。

[0149] 上文已提供了本发明的详细描述，下列实施例是为了举例说明本发明而提供的并且不应当解释为是对本发明或权利要求的范围的限制。实施例

[0150] 下列实施例描述了本发明的一些优选实施方案。然而，应当理解，这些实施例仅用于举例说明目的并且无意限定本发明的范围。

[0151] 实施例1

[0152] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将Jurkat细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。在将这些细胞培养2或3天后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞，进行30分钟。在30分钟的生长后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，然后将细胞培养30分钟。然后收获、清洗细胞，用70％冰冷的ETOH固定细胞，并于4℃下贮存96小时。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x107/ml重悬浮于0.1％ X-100/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa
488-叠氮化物(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular /
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％ X-100/1％BSA/PBS清洗细胞。
之后，使用抗BrdU抗体Alexa 647缀合物(650nm最大激发/670nm最大发射)
(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料 Blue stain(444nm最大激发/480nm最大发射)(Molecular
/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)和RNA酶(InvitrogenTM，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行
3种标记的检测。为了检测EdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测BrdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用405nm的激发，450/50nm的带通。

[0153] 实施例2

[0154] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将Jurkat细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。在将这些细胞培养2或3天后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞1小时。在1小时的生长后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，然后将细胞培养30分钟。然后收获、清洗细胞，用70％冰冷的ETOH固定细胞，并于4℃下贮存96小时。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％ X-100/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 488-叠氮化物(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular /
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％ X-100/1％BSA/PBS清洗细胞。
之后，使用抗BrdU抗体Alexa 647缀合物(650nm最大激发/670nm最大发射)
(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料 Blue stain(444nm最大激发/480nm最大发射)(Molecular
/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)和RNA酶(InvitrogenTM，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行
3种标记的检测。为了检测EdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测BrdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用405nm的激发，450/50nm的带通。

[0155] 实施例1-2的结果

[0156] 由于在加入核苷类似物的两个脉冲之间没有进行可能导致新合成的DNA的速率的变化的处理，因此两种类似物的掺入应当是相当的。在图中，可看到几个细胞亚群。存在不包含任一标记的细胞(图1，Q3象限)。此类细胞在测试期间未活跃地复制它们的DNA。

[0157] 还存在EdU和BrdU标记都掺入DNA中的细胞(图1，Q2象限)。此类细胞在两个脉冲和处理的整个测试过程中具有持续的DNA合成。

[0158] 还存在只具有来自第一脉冲的标记物(EdU)的细胞群体(图2和4)。此类细胞在利用EdU进行标记的过程中处于合成晚期。这可在总DNA对EdU标记的图上的定位(mapping)中看到。到加入BrdU的脉冲时，此类细胞已停止复制它们的DNA。

[0159] 还存在只具有来自第二脉冲的标记物的细胞群体(图3和4)。此类细胞在第一脉冲期间未活跃地复制它们的DNA，但在第二脉冲期间进入DNA合成期。根据通过流式细胞术收集的细胞群体的图的模式，可容易地观察和定量引起合成速率增加或减少的处理。

[0160] 实施例3

[0161] 在第三实验中，EdU和BrdU核苷类似物的同时加入只产生其DNA被BrdU标记的细胞群体(图5)。该第三实验证实，在加入第二标记物之前无需清洗除去第一标记物。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存96小时。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％ X-100/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试
剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 488TM
缀合物(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular /Invitrogen ，
Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％ X-100/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，使用抗BrdU抗体Alexa 647缀合物(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular
ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料Blue stain(444nm最大激发/480nm最大发射)(Molecular /
TM TM
Invitrogen ，Carlsbad，CA)和RNA酶(Invitrogen ，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。为了检测EdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测BrdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用405nm的激发，450/50nm的带通。该结果证明，在两种核苷类似物存在的情况下，只有BrdU类似物被掺入DNA，从而确认了在加入竞争性核苷类似物之前无需清洗步骤的方法的功效。BrdU类似物显示与EdU竞争(当两者在核酸合成期间都存在时)。

[0162] 实施例4:

[0163] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将Jurkat细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。在将这些细胞培养2或3天后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞1小时。在1小时的生长后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，然后将细胞培养1小时。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存96小时。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％TritonX/1％BSA/PBS中。使用抗BrdU抗体Alexa 647缀合物(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrdU的标记。然后用0.1％TritonX/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4TM
和Alexa 488-叠氮化物(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular Probes /
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。为了检测DNA含量，加入核酸染料 Blue
stain(444nm最大激发/480nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，TM
CA)和RNA酶(Invitrogen ，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。为了检测EdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测BrdU标记，使用633nm的激发，660/
20nm的带通。为了检测DNA含量，使用405nm的激发，450/50nm的带通。

[0164] 实施例5

[0165] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的RNA(基因表达))的标准方法。在本实施例中，将HeLa细胞培养物在6孔板内的盖玻片上以1:4稀释至2x 105个细胞的密度。在将这些细胞培养2天后，以适合于掺入活跃地转录信使的细胞的RNA中的浓度加入第一核苷类似物EU。在EU存在的情况下培养细胞1小时。在1小时的生长后并且在不除去EU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrU，然后将细胞培养30分钟。然后收获、清洗细胞，用3.7％甲醛/PBS在4℃下固定细胞30分钟。然后用3％BSA/PBS清洗细胞，在1.0％ X-100/PBS中进行透化，并通过首先用1MHCl在4℃下进行10分钟，然后用2M HCl在室温下进行30分钟来进行变性。然后使用硼酸盐缓冲液中和细胞。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 488缀合物(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular /
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用1.0％ X-100/3％BSA/PBS清洗和封闭细胞。之后，使用抗BrdU抗体和第二检测抗体Alexa 647缀合物(650nm最大激
发/670nm最大发射)(Molecular /InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrU的标记。
为了检测EdU标记，使用470/50nm的激发，545/75nm的带通。为了检测BrdU标记，使用630/
50nm的激发，695/55nm的带通。使用标准技术和适当的滤光片通过荧光显微术进行2种标记的检测。

[0166] 实施例6

[0167] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的RNA(基因表达))的标准方法。在本实施例中，将HeLa细胞培养物在6孔板内的盖玻片上以1:4稀释至2x 105个细胞的密度。在将这些细胞培养2天后，以适合于掺入活跃地转录信使的细胞的RNA中的浓度加入第一核苷类似物EU。在EU存在的情况下培养细胞1小时。在1小时的生长后并且在不除去EU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM浓度加入适当量的α-鹅膏蕈碱(100μg/mL)和适当量的竞争性核苷类似物BrU，然后将细胞培养15分钟。让细胞生长另外5至30分钟的时间。然后收获、清洗细胞，用3.7％甲醛/PBS在4℃下固定细胞30分钟。然后用3％BSA/PBS清洗细胞，在1.0％
X-100/PBS中进行透化，并通过首先用1M HCl在4℃下进行10分钟，然后用2M HCl在室温下进行30分钟来进行变性。然后使用硼酸盐缓冲液中和细胞。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa
TM
488缀合物(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular /Invitrogen ，
Carlsbad，CA)的溶液。然后用1.0％ X-100/3％BSA/PBS清洗和封闭细胞。之后，使用抗BrdU抗体和第二检测抗体Alexa 647缀合物(650nm最大激发/670nm最大发
射)(Molecular /InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrU的标记。使用标准技术和适当的滤光片通过荧光显微术进行2种标记的检测。为了检测EdU标记，使用470/50nm的激发，545/75nm的带通。为了检测BrdU标记，使用630/50nm的激发，695/55nm的带通。

[0168] 实施例7

[0169] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的RNA(基因表达))的标准方法。在本实施例中，将HeLa细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。在将这些细胞培养2或3天(达到70％汇合)后，用第一核苷类似物EUTP脂质体转染(lipofect)它们，以将化合物以适合于掺入活跃地转录信使的细胞的RNA中的浓度递送至细胞核。在EUTP存在的情况下培养细胞15分钟。在15分钟的培养后并且在不除去EUTP的情况下，用以适当的浓度加入的竞争性核苷类似物BrUTP脂质体转染细胞，然后让细胞再生长另外15分钟。然后在收获前让细胞生长不同的时间。然后收获、清洗细胞，用3.7％甲醛/PBS在4℃下固定细胞30分钟。然后用3％BSA/PBS清洗细胞，在1.0％ X-100/PBS中进行透化，并通过首先用1M HCl在4℃下进行10分钟，然后用2M HCl在室温下进行30分钟来进行变性。然后使用硼酸盐缓冲液中和细胞。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 488缀合物(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular
/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用1.0％ X-100/3％BSA/PBS
清洗和封闭细胞。之后，使用抗BrdU抗体和第二检测抗体Alexa 647缀合物(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular /InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrU的标记。使用标准技术和适当的滤光片通过荧光显微术进行2种标记的检测。为了检测EdU标记，使用470/50nm的激发，545/75nm的带通。为了检测BrdU标记，使用630/50nm的激发，695/
55nm的带通。

[0170] 实施例8

[0171] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA)的标准方法。在本实施例中，将HeLa细胞培养物在6孔板内的盖玻片上以1:4稀释至2x105个细胞的密度。在将这些细胞培养2天后，以10μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞1小时。在1小时的生长后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10mM加入适当量的用于标记新合成的DNA的第二核苷类似物AzdU，和加入改变细胞增殖速率的药物，并且培养细胞另外30分钟。在第二次温育后，以10μM浓度加入第三竞争性类似物BrdU，和加入改变细胞增殖速率的第二处理，并且培养细胞另外30分钟。然后收获、清洗细胞，用3.7％甲醛/PBS在4℃下固定细胞30分钟。然后用3％BSA/PBS清洗细胞，在1.0％ X-100/PBS中进行透化，并通过首先用1M HCl在4℃下进行10分钟，然后用2M HCl在室温下进行20分钟来进行变性。然后使用硼酸盐缓冲液中和细胞。然后，通过下列来进行AzU的标记：用3％的在PBS中的BSA清洗细胞2次，并加入基于无铜点击化学的试剂，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的Alexa 488-限制性环炔(495nm最大激发/519nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。在该反应后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 594缀合物(590nm最大激发/615nm最大发射)(Molecular /InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用1.0％ X-100/3％BSA/
PBS清洗和封闭细胞。之后，使用抗BrdU抗体和第二检测抗体Alexa 647缀合物
(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular /InvitrogenTM，Carlsbad，CA)进行BrdU的标记。使用标准技术通过荧光显微术进行3种标记的检测。为了检测AzdU标记，使用470/50nm的激发，545/75nm的带通。为了检测EdU标记，使用560/55nm的激发，645/75nm的带通。为了检测BrdU标记，使用630/50nm的激发，695/55nm的通带。

[0172] 实施例9

[0173] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将Ramos人B-淋巴细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。在将这些细胞培养1或2天后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下将细胞培养2小时。在2小时的培养后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM的浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，然后培养细胞
2.5小时。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存96小时。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％TritonX/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa
647-叠氮化物(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular ProbesTM/
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％TritonX/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，使用抗BrdU抗体FITC缀合物(494nm最大激发/518nm最大发射)(Exalpha Biologicals，Inc.,Maynard California)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料DAPI(358nm最大激发/461nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。为了检测BrdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测EdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用355nm的激发，450/
50nm的带通。

[0174] 图7提供了标记为A至C的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体，如通过流式细胞术检测的。图A被分成4个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，和第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下，淡蓝色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上，深蓝色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。象限Q1(左上，淡绿色)中的细胞群体对于BrdU是阳性的并且对于EdU是阴性的，BrdU阳性细胞的亚群(其为EdU阴性的)，该亚群是在只使用EdU的掺入之后进入S期的细胞群体。Q4(右下，红色)中的细胞群体对于EdU是阳性的并且对于BrdU是阴性的，EdU阳性细胞的亚群(晚S期)(其为BrdU阴性的)，该亚群是在BrdU-掺入前离开S期的细胞群体。图B是BrdU对DNA含量的图，其显示来自图A的相同颜色的群体。图C是EdU对DNA含量的图，其显示来自图A的相同颜色的群体。

[0175] 实施例10

[0176] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将来自慢性髓性白血病细胞培养物的K562人成淋巴细胞以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。在将这些细胞培养1或2天后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下将细胞培养2小时。在2小时的培养后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM的浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，然后培养细胞2.5小时。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存96小时。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％TritonX/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 647-叠氮化物(650nm最大激发/670nm最大发射)TM TM，
(Molecular Probes /Invitrogen Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％TritonX/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，使用抗BrdU抗体FITC缀合物(494nm最大激发/518nm最大发射)(Exalpha Biologicals，Inc.,Maynard California)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料DAPI(358nm最大激发/461nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。为了检测BrdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测EdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用355nm的激发，450/50nm的带通。

[0177] 图8提供了标记为A至C的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体，如通过流式细胞术检测的。图A被分成4个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，和第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下，淡蓝色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上，深蓝色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。象限Q1(左上，淡绿色)中的细胞群体对于BrdU是阳性的并且对于EdU是阴性的，BrdU阳性细胞的亚群(其为EdU阴性的)，该亚群是在只使用EdU的掺入之后进入S期的细胞群体。Q4(右下，红色)中的细胞群体对于EdU是阳性的并且对于BrdU是阴性的，EdU阳性细胞的亚群(晚S期)(其为BrdU阴性的)，该亚群是在BrdU-掺入前离开S期的细胞群体。图B是BrdU对DNA含量的图，其显示来自图A的相同颜色的群体。图C是EdU对DNA含量的图，其显示来自图A的相同颜色的群体。

[0178] 实施例11

[0179] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将TF-1a人5
成红细胞培养物以1:4稀释至2x 10个细胞/ml的密度。培养基含有GM-CSF或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子以用于生长。在将这些细胞培养1或2天后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞，进行表1中所列的时间。在初始培养之后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM的浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，然后培养细胞，进行表1中所列的时间。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存直至使用。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％TritonX/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 647-叠氮化物(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular ProbesTM/
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％TritonX/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，使用抗BrdU抗体FITC缀合物(494nm最大激发/518nm最大发射)(Exalpha Biologicals，Inc.,Maynard California)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料DAPI(358nm最大激发/461nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。为了检测BrdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测EdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用355nm的激发，450/
50nm的带通。

[0180] 表1

[0181]

[0182] 图9-1至9-3提供了标记为A至I的一系列结果图，其显示细胞(TF-1a人成红细胞)的群体。图A至G显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体(使用不同的脉冲时间)，如通过流式细胞术检测的。图H和I显示只用一个脉冲处理的细胞群体，图H显示只使用EdU(20μM)的脉冲标记的结果，图I显示只使用BrdU(10μM)的脉冲标记的结果，如通过流式细胞术检测的。

[0183] 双参数图被分成4个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，和第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。象限Q1中的细胞群体对于BrdU是阳性的并且对于EdU是阴性的，BrdU阳性细胞的亚群(其为EdU阴性的)，该亚群是在只使用EdU的掺入之后进入S期的细胞群体。Q4中的细胞群体对于EdU是阳性的并且对于BrdU是阴性的，EdU阳性细胞的亚群(晚S期)(其为BrdU阴性的)，该亚群是在BrdU-掺入前离开S期的细胞群体。

[0184] 实施例12

[0185] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将TF-1a人成红细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。培养基含有不同量的GM-CSF，或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(以等于推荐的GM-CSF浓度的全部(2ng/ml)或1/4(0.5ng/ml)的量，和无GM-CSF)。在将这些细胞培养18小时后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞3小时。在初始培养之后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM的浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，并且与BrdU同时加入GM-CSF(以等于推荐的2ng/ml的GM-CSF浓度的量或使之保持在相同的GM-CSF初始浓度)。将细胞培养6小时。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存直至使用。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％TritonX/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 647-叠氮化物(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％TritonX/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，使用抗BrdU抗体FITC缀合物(494nm最大激发/518nm最大发射)(Exalpha Biologicals，Inc.,Maynard California)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料DAPI(358nm最大激发/461nm最大发射)
(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。
为了检测BrdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测EdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用355nm的激发，450/50nm的带通。

[0186] 表2显示在不同CM-CSF处理过程中为EdU阳性和BrdU阳性的细胞的百分比。使用2ng/ml GM-CSF的完全量的双脉冲是对照并且显示预期的EdU和BrdU阳性细胞的百分比。不使用GM-CSF的双脉冲对于两种类似物都显示减少的增殖，对于使用BrdU的脉冲，GM-CSF的加入显示一定程度的细胞增殖恢复(BrdU阳性增加)。使用0.5ng/ml GM-CSF的双脉冲只显示增殖的轻微减少(相对于对照)，并且对于BrdU脉冲,将GM-CSF添加至2ng/ml不显示任何增殖恢复。这显示了在于脉冲之间加入生长因子的情况下，使用双脉冲系统观察增殖变化的有用性。

[0187] 表2

[0188]

[0189] 实施例13

[0190] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将THP-1单核细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。在将这些细胞培养1至2天后，以20μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞1小时。在初始培养之后并且在不除去EdU(通过在新鲜培养基中清洗细胞)的情况下，以10μM的浓度加入适当量的竞争性核苷类似物BrdU，并将细胞培养1小时。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存直至使用。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％TritonX/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 647-叠氮化物(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular /
InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％TritonX/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，使用抗BrdU抗体FITC缀合物(494nm最大激发/518nm最大发射)(Exalpha Biologicals，Inc.,Maynard California)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料DAPI(358nm最大TM TM
激发/461nm最大发射)(Molecular Probes /Invitrogen ，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。为了检测BrdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测EdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用355nm的激发，450/
50nm的带通。

[0191] 图10提供了标记为A至F的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞(THP-1单核细胞)群体，如通过流式细胞术检测的。图A被分成4个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，和第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下，深绿色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上，深蓝色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。象限Q1(左上，淡绿色)中的细胞群体对于BrdU是阳性的并且对于EdU是阴性的，BrdU阳性细胞的亚群(其为EdU阴性的)，该亚群是在只使用EdU的掺入之后进入S期的细胞群体。Q4(右下，红色)中的细胞群体对于EdU是阳性的并且对于BrdU是阴性的，EdU阳性细胞的亚群(晚S期)(其为BrdU阴性的)，该亚群是在BrdU-掺入前离开S期的细胞群体。图B是BrdU对DNA含量的图，其显示来自图A的相同颜色的群体。图C是EdU对DNA含量的图，其显示来自图A的相同颜色的群体。图D和E显示EdU(图D)(P3标志物显示EdU阳性事件)；和BrdU(图E)(P2标志物显示BrdU阳性事件)的单参数直方图。

[0192] 实施例14

[0193] 按照已知的细胞活跃生长所需的条件，通过提供恰当的培养基和营养需求来建立制备培养细胞(用于测量新合成的DNA(细胞增殖))的标准方法。在本实施例中，将Jurkat T细胞淋巴细胞培养物以1:4稀释至2x 105个细胞/ml的密度。以0、32nM、75nM、125nM、250nM、500nM和1μM的浓度用细胞周期阻断剂秋水仙素(其在细胞周期的G2M期终止增殖)处理培养物，进行18小时。对于各条件，以10μM(适合于掺入正在经历DNA合成的细胞的DNA中的浓度)加入第一核苷类似物EdU。在EdU存在的情况下培养细胞1小时。然后将细胞离心以沉淀细胞并且除去培养基和阻断剂，然后给细胞更换新鲜培养基。在以10μM的浓度加入适当量的第二核苷类似物BrdU并将细胞培养1小时之前让细胞培养物恢复2小时。然后收获、清洗细胞，用70％的冰冷ETOH固定细胞，并于4℃下贮存直至使用。然后清洗细胞，将其在室温下重悬浮于4M HCL中，进行20分钟。加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液，将细胞清洗2次，然后以1x 107/ml重悬浮于0.1％TritonX/1％BSA/PBS中。然后，通过加入基于点击化学的试剂进行EdU的标记，所述试剂包括含有在Tris-缓冲盐溶液中的CuSO4和Alexa 647-叠氮化物
(650nm最大激发/670nm最大发射)(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)的溶液。然后用0.1％TritonX/1％BSA/PBS清洗细胞。之后，使用抗BrdU抗体FITC缀合物(494nm最大激发/518nm最大发射)(Exalpha Biologicals，Inc.,Maynard California)进行BrdU的标记。为了检测DNA含量，加入核酸染料DAPI(358nm最大激发/461nm最大发射)
(Molecular ProbesTM/InvitrogenTM，Carlsbad，CA)。利用流式细胞术进行3种标记的检测。
为了检测BrdU标记，使用488nm的激发，530/30nm的带通。为了检测EdU标记，使用633nm的激发，660/20nm的带通。为了检测DNA含量，使用355nm的激发，450/50nm的带通。

[0194] 图11显示在7个不同的处理条件下，为EdU和BrdU共阳性(Q2)、EdU和BrdU共阴性(Q3)、BrdU阳性且EdU阴性(Q1)以及BrdU阴性且EdU阳性(Q4)的细胞的百分比。未加入秋水仙素阻断剂的对照显示增殖，如通过EdU和BrdU脉冲检测到的。所有浓度的秋水仙素处理的细胞对于EdU和BrdU的脉冲都显示减少的增殖，如所预期的。如果在除去秋水仙素后的2小时的过程中存在一定程度的细胞恢复，那么预期BrdU百分比将增加。然而，如通过BrdU的第二脉冲观察到的，自秋水仙素处理去除后，在第一次EdU脉冲后，在任何秋水仙素浓度上未看到恢复。

[0195] 图12-1和12-2提供了标记为A至J的一系列结果图，其显示用EdU(20μM)的第一脉冲标记和BrdU(10μM)的第二脉冲标记处理的细胞群体，如通过流式细胞术检测的。图A至E代表未用秋水仙素处理的对照细胞，图F至J代表在第一脉冲之前用32nM秋水仙素处理18小时的细胞。双参数图A和F被分成4个象限，第一象限(Q1)位于左上角，第二象限(Q2)位于右上角，第三象限(Q3)位于左下角，以及第四象限(Q4)位于右下角。象限Q3(左下，淡蓝色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阴性的。象限Q2(右上，深蓝色)中的细胞群体对于EdU(第一脉冲)和BrdU(第二脉冲)都是阳性的。象限Q1(左上，淡绿色)中的细胞群体对于BrdU是阳性的并且对于EdU是阴性的，BrdU阳性细胞的亚群(其为EdU阴性的)，该亚群是在只使用EdU的掺入之后进入S期的细胞群体。Q4(右下，红色)中的细胞群体对于EdU是阳性的并且对于BrdU是阴性的，EdU阳性细胞的亚群(晚S期)(其为BrdU阴性的)，该亚群是在BrdU-掺入前离开S期的细胞群体。图B和G是BrdU对DNA的图，图C和H是EdU对DNA含量的图，其显示来自图A和F的相同颜色的群体。图D和I显示对于两个可区别的细胞群体(对于BrdU是阳性的细胞和对于BrdU是阴性的细胞)的BrdU的单参数直方图。图E和J显示对于两个可区别的细胞群体(对于EdU是阳性的细胞和对于EdU是阴性的细胞)的EdU的单参数直方图。与来自用32nM秋水仙素处理的细胞的图(F至J)(其显示减少的增殖，如对于阻断剂处理所预期的)相比，对照图(A至E)显示更高的EdU和BrdU阳性事件、预期的细胞增殖。

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