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一种非酿酒 酵母菌株及其应用

阅读：283发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种非酿酒酵母菌株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种非酿酒酵母菌株及其应用。本发明提供的非酿酒酵母菌YLL16（Hanseniaspora thailandica），是从南丰蜜桔自然发酵醪中分离得到的，于2018年3月18日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018140，该菌株既具有良好的酒精发酵能力，还具有很强降解有机酸能力。该菌株可应用于生物发酵和酿制果酒，利用该菌株发酵柑桔压榨果汁酿制柑桔果酒，具有良好的酒精发酵能力以及很强的生香除涩能力，这对于改善柑桔果酒口感和提高柑桔果酒品质具有重要意义。，下面是一种非酿酒酵母菌株及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种酵母菌株，其特征在于：所述菌株为非酿酒酵母菌株YLL16（Hanseniaspora thailandica），于2018年3月18日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018140。
2.根据权利要求1所述的酵母菌株，其特征在于：所述菌株是从南丰蜜桔自然发酵醪中分离得到。
3.根据权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16于生物发酵中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述生物发酵包括果汁发酵。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述果汁发酵包括柑桔汁发酵。
6.根据权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16于制备果酒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述果酒为柑桔果酒。
8.根据权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16于发酵时生香除涩的应用。
9.一种制备果酒的方法，其特征在于，包括采用如权利要求1所述的非酿酒酵母菌株YLL16发酵果汁的过程。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述非酿酒酵母菌株YLL16以1.11×106 9.88×107 cfu/mL接种量接入pH为3.0 6.0的果汁中，在20 25℃下发~ ~ ~
酵5 20天。
~

说明书全文

一种非酿酒酵母菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种酵母菌株及其应用，尤其是涉及一种非酿酒酵母菌株，但是其可以用于酿酒。

背景技术

[0002] 当前以水果为原料，酿造风味独特的果酒已成为一种趋势。以新鲜柑桔汁为原料，酿造生产柑桔果酒不仅能够减少柑桔资源的浪费，而且可以满足人们对高档果酒消费的需要，也是蜜桔深加工研究的方向之一。柑桔果酒具有酒度低、营养高、益脑健身等特点，且柑桔果酒中含有柑桔中大部分的营养物质，如糖类、维生素类、柠檬酸、黄酮类化合物等物质，均对人体具有益处。

[0003] 然而，由于柑桔含糖量高，不易储藏，极易腐烂，所以柑桔主要用于鲜食，用于深加工量极少，严重制约柑桔产业的发展。而且，果酒往往因为有机酸含量较高，导致酒体酸涩、粗糙感较强，这已成为果酒产业进一步拓宽市场和规模化发展的瓶颈制约。在柑桔果酒的酿造过程中，酵母菌参与果酒的发酵过程。在发酵过程中，酵母菌将果汁中的绝大部分糖转化为酒精和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、醛、酯等代谢产物，直接影响果酒的香气及口感，决定着果酒的质量，对果酒特色的形成至关重要。

[0004] 目前，柑桔果酒的酵母多为延用葡萄酒酵母或果酒干酵母，专用酵母菌的研究很少，缺乏适用的酵母菌株，导致柑桔果酒风味不突出、风味欠佳的缺陷，影响了柑桔果酒的品质及销量。对于果酒酿造而言，菌种的选择决定着果酒的质量。果酒酵母通常分为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非酿酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）。通常，酿酒酵母有较好的产酒精能力，但产香能力相对较弱；非酿酒酵母产香能力相对较强，能够生成多种芳香类物质，对果酒风味有积极的影响。因此，选择优良的果酒酵母已不只局限于酿酒酵母，还包括相关环境中的一些非酿酒酵母。

[0005] 陈清婵等从柑桔果实上分离得到优良的产香酵母JZ-3，该菌株发酵得到的柑桔果酒酒体丰满、香气浓郁、典型性强，整体品质较高。剧柠等从枸杞果园土壤、鲜果及自然发酵液中筛选到适宜枸杞果酒发酵的孢汉逊酵母（Hanseniaspora thailandica）GF-60，与商用酿酒酵母混合发酵有更多种类的香气成分。Luy等研究发现，戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）和耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）发酵的榴莲酒中高级醇和乙基酯含量更高，酒风味更浓厚，口感更丰富。

发明内容

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酵母菌株,其是一种非酿酒酵母菌株，但是其可以用于酿酒。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种酵母菌株，其为非酿酒酵母菌株YLL16（Hanseniaspora thailandica），于2018年3月18日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO：M
2018140，所述菌株为孢汉逊酵母属酵母菌。

[0008] 进一步的，所述菌株是从南丰蜜桔自然发酵醪中分离得到的。

[0009] 本发明一方面提供了所述非酿酒酵母菌株在生物发酵中的应用。

[0010] 进一步的，所述生物发酵包括果汁发酵，优选柑桔汁发酵，最优选蜜桔汁发酵。

[0011] 本发明另一方面提供了所述酿酒酵母菌株在酿造果酒中的应用。

[0012] 进一步的，所述果酒为柑桔果酒，优选为蜜桔果酒。

[0013] 本发明还提供了一种制备果酒的方法，所述方法包括采用上述非酿酒酵母菌株YLL16发酵果汁的过程。

[0014] 进一步的，所述方法包括将所述非酿酒酵母菌株YLL16以1.11×106 9.88×107 ~cfu/mL接种量接入总SO2浓度50 200 mg/L，pH为3.0 6.0的果汁中，在20 25℃下发酵5 20~ ~ ~ ~
天。

[0015] 进一步的，所述果汁为柑桔果汁，更优选为蜜桔果汁。

[0016] 与现有技术相比，本发明的有益技术效果：本发明的非酿酒酵母菌株YLL16能够应用于果酒的发酵，具有良好的酒精发酵能力并且具有很强的生香除涩能力，这对于改善果酒口感和提高果酒品质具有重要意义。
附图说明

[0017] 下面结合附图说明对本发明作进一步说明。

[0018] 图1是26S rDNA序列系统发育进化树的示意图。

[0019] 图2是本发明的非酿酒酵母菌株YLL16的平板菌落形态的照片。

[0020] 图3是本发明的非酿酒酵母菌株YLL16的细胞显微形态的照片。

具体实施方式

[0021] 实施例1：非酿酒酵母菌株（产香酵母菌株）YLL16的分离选育
1、非酿酒酵母菌株YLL16的分离
以南丰蜜桔为原料，经挑选、清洗、榨汁，过滤等工艺，制成蜜桔果汁，调节果汁总SO2浓度为80 mg/L，分装在5 L 发酵罐中，在20 25℃下自然发酵，作为酵母菌选育菌源。
~

[0022] 待果汁样品在发酵罐中有大量气泡时，取发酵液10%接入酵母富集培养基（酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%），28℃培养1天。在无菌条件下将发酵液进行10倍梯度稀释，选取3个适宜的稀释度10-1、10-2和10-3使得平板菌落能够彼此分开，各吸取0.1 mL，涂布于YPD培养基平板上，每个稀释度做2个平行，置于28℃培养箱中恒温培养2天。典型的非酿酒酵母菌落表面光滑、湿润、黏稠，质地柔软，易挑起，多为乳白或奶油色，有酒香味。挑取具有上述典型酵母菌落形态的单菌落，在YPD培养基平板上上划线培养纯化，并通过嗅闻法初步判断是否有酯香或醇香，筛选具有较浓酯香气或特殊果香气的菌株，经显微镜镜检，从采集的样品中共分离得到45株酵母菌株。首先对45株菌株进行TTC试验，挑选岀具有上述典型酵母菌菌落特征的初筛菌株24株。初筛菌经杜氏小管产气试验，得到6株带有酒香的菌株，通过测量6株菌发酵蜜桔果酒的品质指标及感观分析，得到6株产香酵母为YLL6、YLL7、YLL10、YLL14、YLL16、YLL22并分别转移至YPD琼脂斜面培养基上，于4℃条件下保藏、备用。

[0023] 非酿酒酵母菌株YLL16的平板菌落形态如图2所示。

[0024] 2、非酿酒酵母YLL16的选育将分离得到的YLL6、YLL7、YLL10、YLL14、YLL16、YLL22酵母菌分别以1×107 9×107 ~
cfu/mL菌量接种于含总SO2 60 mg/L、可滴定酸9.5 g/L(柠檬酸计)的柑桔果汁中，于20 25~
℃自然发酵10天，以发酵速率、产酒能力、产香水平、感官评价等进行模糊综合评判，筛选岀适于果酒发酵、具有酸代谢能力且综合性能优良的酵母菌株。

[0025] 结果如表1所示，产香酵母YLL16产酒度最高，果酒残糖含量低于1%，且降酸能力强，酿造的果酒总酸下降了2.0 g/L；从果酒的色泽、澄清度、香气、滋味和典型性进行综合感官评价，也以YLL16酿制的果酒分值最高，为90分，且果酒风味纯正、协调、口感柔顺、圆润，说明产香酵母YLL16是1株优良产香酵母菌株。产香酵母YLL16已保藏位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018140。产香酵母YLL16适宜的种子发酵培养基的组分为：YPD琼脂培养：1% Yeast Extract（酵母膏），2% Peptone（蛋白胨），2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），2%琼脂，25 30℃培养2天。~

[0026] 表1 不同菌株发酵对比试验结果注：酿造前总酸为10.5g/L (柠檬酸计)。

[0027] 3、非酿酒酵母YLL16的鉴定 (1)非酿酒酵母YLL16的形态学
非酿酒酵母菌株YLL16的细胞显微形态附图3所示。

[0028] (2) 26S rDNA D1/D2序列测定与同源性分析采用试剂盒提取的方法（E.Z.N.A. TM Yeast DNA Kit）提取纯培养目标菌株的基因组DNA。以引物NL1、NL4扩增其26S rDNA D1/D2 基因保守区。NL1：5'-
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

[0029] 采用40 µL反应体系进行PCR 扩增，反应体系为：premix rTaq 20 µL、NL1 2.0 µL、NL4 2.0 µL、DNA 1 µL、dd H2O 15 µL。扩增条件：95℃预变性2 min，然后95℃变性30 s，52℃退火30 s ，72℃延伸 1 min，共29次循环，最后72℃充分延伸5 min，4℃保存。PCR产物检测：取5 µL的 PCR产物，1 µL的上样缓冲液，在1.0% 琼脂糖凝胶电泳中分离，130 V 20 min。用凝胶成像系统进行分析，将含有目标片段的产物进行测序。将YLL16的26S rDNA D1/D2序列输入Genebank，以Blast 软件进行序列同源性比较，利用MEGA软件构建系统发育进化树，进行亲缘关系和系统发育分析，其26S rDNA D1/D2 序列系统发育进化树示于图1。结果显示，与YLL16菌株基因序列相似性较高的序列主要为孢汉逊酵母属，与其相似性最高的是该属中的Hanseniaspora thailandica，与Hanseniaspora thailandica同源性达99%以上，说明该菌在分子系统发育分类学上属于孢汉逊酵母属中的一个种。经26S rDNA D1/D2 序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态，最终确定YLL16菌株为Hanseniaspora thailandica，命名为Hanseniaspora thailandica YLL16（MF979224）。

[0030] 为了充分公开本发明的非酵母新菌株YLL16及其应用，现结合附图和发明人给出孢汉逊酵母Hanseniaspora thailandica YLL16在果汁发酵和果酒酿造中的应用，来进一步说明本发明的有益效果。

[0031] 实施例2：非酿酒酵母菌株YLL16发酵的柑桔果酒品质的指标测定将孢汉逊酵母YLL16在种子发酵培养基中活化后，以4.0×107 cfu/mL接种量5%接入80 mg/L、pH值在4.0、起始总酸为1.01 g/L的南丰蜜桔果汁中，在28℃下发酵10天，发酵结束后对蜜桔果酒品质的指标测定，指标测定方法：糖度测定：浓硫酸-苯酚法；总酸的测定：滴定法；酒精体积分数的测定：酒精计法。

[0032] 指标测定结果：用孢汉逊酵母YLL16所酿造的果酒，其总酸为7.9 g/L，总糖为9.0 g/L，酒精体积分数为5.7%，市售葡萄酒高活性干酵母安琪酵母所酿造的果酒，其总酸为8.5 g/L，总糖为3.7 g/L，酒精体积分数为10.7%。与干酵母安琪酵母相比，菌株YLL16降酸更明显。

[0033] 表2南丰蜜桔果酒品质指标测定结果实施例3：孢汉逊酵母YLL16发酵蜜桔果酒的感官评定
将实施例2中的两组蜜桔果酒发酵原液请10位评委品尝，参照GB 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官评分标准打分（表3），得出孢汉逊酵母YLL16发酵的蜜桔果酒口感要优于市售葡萄高活性干酵母安琪酵母。用孢汉逊酵母YLL16所酿造的果酒颜色为浅黄色，酒体具有纯正和谐的蜜桔果香，酒体丰满，回甘明显，具有蜜桔独特的典型性，结果见表
4。

[0034] 表3 蜜桔果酒感官评分标准表4 两组菌种发酵蜜桔果酒后的感官评分
实施例4：蜜桔果酒中香味成分的GC-MS（色谱-质谱）分析
取实施例2的两组蜜桔果酒发酵原液各10 mL，在8000 r/min下离心10 min，取上清液分析发酵后蜜桔果酒的香气成分。采用气相色谱串联质谱联用仪（安捷伦7000 GC）分析发酵后蜜桔果酒的香气成分。

[0035] GC条件：毛细管柱为DB-FFAP（30 m×320 μm×0.25 μm），顶空瓶装量为5 mL（顶空瓶为20 mL规格），顶空瓶温度为80℃，保留20 min，进样口温度250℃；程序升温：初始温度40℃，保留2 min，以5℃/min的速率升至180℃，保留2 min，再以8℃/min的速率升至230℃，保留5 min；检测器温度250℃；载气He，流速1 mL/min；分流进样，分流比为10:1。

[0036] MS条件：四级杆温度150℃；离子源温度230℃；接口温度180℃；电子电离源；电子能量70 eV；质量扫描范围30～500 amu。

[0037] 结果如表5所示，孢汉逊酵母YLL16发酵后的果酒中香气成分更多，能够产生丰富的酯类物质，产生较少的杂醇和挥发性酸，酯类物质较丰富，包括乙酸乙酯、3-甲基乙酸丁酯、羊蜡酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、硝酸甲酯、丙烯酸乙烯酯、乙酸苯乙酯、丙酸乙酯、异氰酸甲酯、乳酸乙酯、(2S)-吡咯烷-2-羧酸乙酯和乙酸正丙酯。结果表明，孢汉逊酵母YLL16发酵的蜜桔果酒拥有更丰富的果香和酒香。

[0038] 表5蜜桔果酒中的香气成分分析结果挥发性化合物果汁商业活性干酵母孢汉逊酵母YLL16
醇类
2-甲基-1-丁醇 0.82% - -
苯乙醇 - 0.15% 0.10%
十一碳烯-4-醇 - - -
1-丁炔-3-醇 - - -
3-戊醇 - - -
叔丁醇 - - 0.14%
异戊醇 - - -
总醇 0.82% 0.15% 0.24%
酯类
甲氧基乙酸乙酯 0.74% - -
丁二醇二硝酸酯 - 9.62% -
乙酸乙酯 - 8.19% 10.21%
甲基乙酸酯 - 1.65% -
3-甲基乙酸丁酯 - 0.99% 5.43%
羊蜡酸乙酯 - 0.67% 0.23%
月桂酸乙酯 - 0.32% 0.08%
辛酸乙酯 - 0.30% 0.25%
己酸乙酯 - 0.18% -
(甲基硫代)甲基亚砜甲酯 - - -
硝酸甲酯 - - 3.24%
丙烯酸乙烯酯 - - 1.50%
硫酸二丁酯 - - -
乙酸苯乙酯 - - 0.96%
丙酸乙酯 - - 0.13%
异氰酸甲酯 - - 1.13%
乙酸异丁酯 - - -
乳酸乙酯 - - 20.47%
(2S)-吡咯烷-2-羧酸乙酯 - - 1.52%
乙酸正丙酯 - - 15.50%
总酯 0.74% 21.92% 60.65%
酸类
炔丙酸 - - -
乙酸 - 0.12% 0.11%
乙酰乙酸 - - -
DL-正缬氨酸 - - -
总酸 0.00% 0.12% 0.11%
酮类
乙烯酮 - - -
3-羟基-2-丁酮 - - -
二氢-4-甲基 2(3H)-呋喃酮 - - 1.00%
总酮 0.00% 0.00% 1.00%
烃类
柠檬烯 1.64% 0.98% 1.32%
乙烯氧乙烯 - - 5.93%
1,1,2,3,3-戊甲基环丁烷 - 10.26% -
正戊烷 - 1.96% -
1,2-二甲氧基乙烷 - - -
异丁烷 - - -
七甲基壬烷 - - -
总烃 1.64% 13.2% 7.25%
以上试验所涉及到的试验方法如下：
1、总酸：指示计法（(GB/T15038-2006)，以柠檬酸计。

[0039] 2、酒精度：酒精计法(GB/T15038-2006)。

[0040] 3、总糖的测定:浓硫酸-苯酚法。

[0041] 4、pH值：pH计测定。

[0042] 5、澄清度的测定：660 nm下分光光度计测定果酒的澄清度。

[0043] 6、果酒香气分析：采用气相色谱串联质谱联用仪（安捷伦7000 GC）分析发酵后蜜桔果酒的香气成分。

[0044] 7、感官评价：参照GB 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官评分标准打分（表3）。

[0045] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

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