技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体一种合成达玛烯二醇的大肠杆菌工程菌及构建方法。
背景技术
[0002] 人参作为一种名贵中药材，在
疾病治疗和在保健方面，一直都是研究和应用热点。人参皂苷是一类三萜类化合物，是人参中的有效活性成分，根据三萜皂
苷元的不同可分为达玛烷型皂苷、齐墩果烷型皂苷。其中达玛烷型人参皂苷如Rb1，Rg3，Rh2，CK以及皂苷元原人参二醇，具有保护心血管，抗疲劳，抗衰老，抗癌，保肝和增强免疫
力的药理作用。人参皂苷的传统生产主要原材料为人参。到目前为止，我国野生人参资源已经濒临灭绝，人参种植易受病虫害的影响，人参产品面临高农残的问题，严重影响我国人参类相关产品的品质。
[0003] 近年来，随着人参皂苷合成途径的逐渐解析，鲨烯合成酶、2,3-
氧化鲨烯合成酶、达玛烯二醇合成酶、原人参二醇合成酶、糖基转移酶等一系列人参皂苷合成途径关键基因的成功挖掘，利用
微生物从头生产原人参二醇、Rh2、CK和Rg3的报道逐渐出现。但是这些报道均采用
酵母作为底盘细胞，由于酵母内源的麦
角甾醇合成途径调控复杂，为工程化改造带来困难。
[0004] 大肠杆菌是微生物研究和应用的模式微生物，
发酵操作和基因操作成熟。目前，大肠杆菌已成功用于类胡萝卜素、紫杉醇、青蒿酸等药物前体的生物合成，但还没有生物合成达玛烯二醇的报道。
[0005] 达玛烯二醇是达玛烷型人参皂苷的关键前体化合物。
发明内容
[0006] 本发明的目的是克服
现有技术中的不足，提供一种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供第二种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株。
[0009] 本发明的第四个目的是提供第二种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法。
[0010] 本发明的第五个目的是提供三种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株。
[0011] 本发明的第六个目的是提供三种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法。
[0012] 本发明的第七个目的是提供四种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株。
[0013] 本发明的第八个目的是提供四种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法。
[0014] 本发明的技术方案概述如下：
[0015] 一种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株(菌株1)，所述它含有截短C端26个
氨基酸残基的鲨烯合成酶基因、2,3-氧化鲨烯合成酶基因、截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因和达玛烯二醇合成酶基因。
[0016] 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0017] (1)将截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达质粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点得到质粒1；将2,3-氧化鲨烯合成酶基因插入到质粒1的BamHI和SacI酶切位点，得到质粒2；将截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒3；将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒3的SacI和HindIII位点，得到质粒5；
[0018] (2)将质粒5转化进入大肠杆菌，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株，命名为菌株1；
[0019] 所述截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.1所示；所述2,3-氧化鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.2所示；所述截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因序列以SEQ ID NO.3所示；所述达玛烯二醇合成酶基因序列以SEQ ID NO.5所示。
[0020] 一种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株(菌株3)，所述它含有截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因、2,3-氧化鲨烯合成酶基因、截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因、达玛烯二醇合成酶基因、法尼基焦
磷酸合成酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因。
[0021] 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0022] (1)将截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因插入大肠杆菌表达质粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点得到质粒1；将2,3-氧化鲨烯合成酶基因插入到质粒1的BamHI和SacI酶切位点，得到质粒2；将截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒3；将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒3的SacI和HindIII位点，得到质粒5；
[0023] (2)将质粒5转化进入大肠杆菌，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株1；
[0024] 所述截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.1所示；所述2,3-氧化鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.2所示；所述截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因序列以SEQ ID NO.3所示；所述达玛烯二醇合成酶基因序列以SEQ ID NO.5所示。
[0025] (3)将法尼基焦磷酸合成酶基因插入到质粒pCDFDuet1的BamhI和SacI酶切位点，得到质粒7；将异戊烯焦磷酸异构酶基因插入到质粒7的SacI和HindIII酶切位点中，得到质粒8；将质粒8转化到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株1中，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株，命名为菌株3；
[0026] 所述法尼基焦磷酸合成酶基因的序列以SEQ ID NO.6所示；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因的序列以SEQ ID NO.7所示。
[0027] 一种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株(2)，它含有截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因、2,3-氧化鲨烯合成酶基因、截短C端33个氨基酸残基的
酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因和达玛烯二醇合成酶基因。
[0028] 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0029] (1)将截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因插入大肠杆菌表达质粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点得到质粒1；将2,3-氧化鲨烯合成酶基因插入到质粒1的BamHI和SacI酶切位点，得到质粒2；将截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒4；将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒4的SacI和HindIII位点，得到质粒6；
[0030] (2)将质粒6转化进入大肠杆菌，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株，命名为菌株2；
[0031] 所述截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.1所示；所述2,3-氧化鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.2所示；所述截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因序列以SEQ ID NO.4所示；所述达玛烯二醇合成酶基因序列以SEQ ID NO.5所示。
[0032] 一种合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株(4)，所述它含有截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因、2,3-氧化鲨烯合成酶基因、截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因、达玛烯二醇合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因。
[0033] 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0034] (1)将截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因插入大肠杆菌表达质粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点得到质粒1；将2,3-氧化鲨烯合成酶基因插入到质粒1的BamHI和SacI酶切位点，得到质粒2；将截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒4；将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒3的SacI和HindIII位点，得到质粒6；
[0035] (2)将质粒6转化进入大肠杆菌，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株2；
[0036] 所述截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.1所示；所述2,3-氧化鲨烯合成酶基因的序列以SEQ ID NO.2所示；所述截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因序列以SEQ ID NO.4所示；所述达玛烯二醇合成酶基因序列以SEQ ID NO.5所示。
[0037] (3)将法尼基焦磷酸合成酶基因插入到质粒pCDFDuet1的BamhI和SacI酶切位点，得到质粒7；将异戊烯焦磷酸异构酶基因插入到质粒7的SacI和HindIII酶切位点中，得到质粒8；将质粒8转化到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株2中，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株，命名为菌株4；
[0038] 所述法尼基焦磷酸合成酶基因的序列以SEQ ID NO.6所示；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因的序列以SEQ ID NO.7所示。
[0039] 本发明成功构建了合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株。与其他宿主菌相比，大肠杆菌合成达玛烯二醇的途径调控简单，易于进行代谢工程改造，为达玛烷型皂苷的大肠杆菌发酵生产奠定了
基础。
附图说明
[0040] 图1.本发明使用的质粒的遗传图谱。
[0041] A:将截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因插入大肠杆菌表达质粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点得到质粒1。
[0042] B:将2,3-氧化鲨烯合成酶基因插入到质粒1的BamHI和SacI酶切位点，得到质粒2。
[0043] C:将截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因序列插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒3。
[0044] D:将截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因序列插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒4。
[0045] E:将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒3的SacI和HindIII位点，得到质粒5。
[0046] F:将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒4的SacI和HindIII位点，得到质粒6。
[0047] G：将法尼基焦磷酸合成酶基因插入到质粒pCDFDuet1的BamhI和SacI酶切位点，得到质粒7。
[0048] H：将异戊烯焦磷酸异构酶基因插入到质粒7的SacI和HindIII酶切位点中，得到质粒8。
[0049] 图2.大肠杆菌胞内代谢产物HPLC分析图谱。
[0050] A:导入pET28a(+)空质粒的对照菌株重组菌5发酵提取物HPLC分析。
[0051] B：菌株1发酵提取物HPLC分析。
[0052] C：菌株2发酵提取物HPLC分析。
[0053] D：达玛烯二醇标准品HPLC分析。
[0054] E：达玛烯二醇标准品质谱图。
[0055] F：菌株1合成达玛烯二醇质谱图。
[0056] G：菌株2合成达玛烯二醇质谱图。
[0057] 图3.构建菌株达玛烯二醇含量分析。
具体实施方式
[0058] 下面通过具体
实施例对本发明作进一步的说明。
[0059] 下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] 说明：
[0062] 1.截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因简称为：ScERG9。
[0063] 2. 2,3-氧化鲨烯合成酶基因简称为：McSE。
[0064] 3.截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因简称为：ATR1。
[0065] 4.截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因简称为：ScCPR。
[0066] 5.达玛烯二醇合成酶基因简称为：DS。
[0067] 6.法尼基焦磷酸合成酶基因简称为：ispA。
[0068] 7.异戊烯焦磷酸异构酶基因简称为：idi。
[0069] 实施例1达玛烯二醇合成表达载体的构建
[0070] (1)相关基因的获取
[0071] 以酿酒酵母W303-1a(美国，ATCC)基因组为模板，以序列SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9为引物，扩增得到截短C端26个氨基酸残基的鲨烯合成酶基因ScERG9(SEQ ID NO.1)。
[0072] 根据荚膜甲基球菌中2,3-氧化鲨烯合成酶的氨基酸序列，进行针对大肠杆菌的密码子优化，并由金斯瑞生物科技有限公司合成出2,3-氧化鲨烯合成酶基因McSE，(SEQ ID NO.2)。
[0073] 根据截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1的氨基酸序列，进行针对大肠杆菌的密码子优化，并由金唯智生物科技有限公司合成出截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因ATR1(SEQ ID NO.3)。
[0074] 以酿酒酵母W303-1a基因组为模板，以序列SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19为引物，扩增得到截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因ScCPR(SEQ ID NO.4)。
[0075] 根据人参中达玛烯二醇合成酶的氨基酸序列，进行针对大肠杆菌的密码子优化，并由金唯智生物科技有限公司合成出达玛烯二醇合成酶基因DS(SEQ ID NO.5)。
[0076] 以大肠杆菌BL21(DE3)(美国，ATCC)基因组为模板，以序列SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23为引物，扩增得到大肠杆菌法尼基焦磷酸合成酶基因ispA(SEQ ID NO.6)。
[0077] 以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以序列SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27为引物，扩增得到大肠杆菌异戊烯焦磷酸异构酶基因idi(SEQ ID NO.7)。
[0078] (2)达玛烯二醇合成表达载体的构建
[0079] 按顺序
[0080] 将ScERG9插入大肠杆菌表达质粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点得到质粒1。
[0081] 具体步骤为：以酿酒酵母W303-1a(美国，ATCC)基因组为模板，以序列SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11为引物，扩增得到ScERG9。
[0082] 将该基因
片段与质粒pET28a(+)用XbaI和BamHI内切酶进行酶切、连接，得到质粒1(图1A)。
[0083] 将2,3-氧化鲨烯合成酶基因插入到质粒1的BamHI和SacI酶切位点，得到质粒2。
[0084] 具体步骤为：以2,3-氧化鲨烯合成酶基因序列(SEQ ID NO.2)为模板，以序列SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13为引物扩增McSE基因。将该基因片段与质粒1用BamHI和SacI内切酶进行酶切、连接，得到质粒2(图1B)。
[0085] 将截短C端45个氨基酸残基的拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因序列插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒3。
[0086] 具体步骤为：以拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1ATR1基因序列(SEQ ID NO.3)为模板，以序列SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17为引物扩增ATR1基因。将该基因片段与质粒2用HindIII和XhoI内切酶进行酶切、连接，得到质粒3(图1C)。
[0087] 将截短C端33个氨基酸残基的酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因序列插入到质粒2的HindIII和XhoI酶切位点，得到质粒4。
[0088] 具体步骤为：以酿酒酵母中细胞色素-NADPH-还原酶基因序列(SEQ ID NO.4)为模板，以序列SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21为引物扩增ScCPR基因。将该基因片段与质粒2用HindIII和XhoI内切酶进行酶切、连接，得到质粒4(图1D)。
[0089] 将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒3的SacI和HindIII位点，得到质粒5。
[0090] 具体步骤为：以达玛烯二醇合成酶基因序列(SEQ ID NO.5)为模板，以序列SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15为引物扩增DS基因。将该基因片段与质粒3用SacI和HindIII内切酶进行酶切、连接，得到质粒5(图1E)。
[0091] 将达玛烯二醇合成酶基因插入到质粒4的SacI和HindIII位点，得到质粒6。
[0092] 具体步骤为：以达玛烯二醇合成酶基因序列(SEQ ID NO.5)为模板，以序列SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15为引物扩增DS基因。将该基因片段与质粒4用SacI和HindIII内切酶进行酶切、连接，得到质粒6(图1F)。
[0093] (3)法尼基焦磷酸合成酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因过表达载体的构建[0094] 1)将法尼基焦磷酸合成酶基因(SEQ ID NO.6)插入pCDFDuet1质粒的BamHI和SacI酶切位点，得到质粒7。
[0095] 具体步骤为：以法尼基焦磷酸合成酶基因(SEQ ID NO.6)为模板，以序列SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25为引物扩增ispA基因。将该基因片段与质粒pCDFDuet1用BamHI和SacI内切酶进行酶切、连接，得到质粒7(图1G)。
[0096] 将异戊烯焦磷酸异构酶基因(SEQ ID NO.7)插入质粒7的SacI和HindIII酶切位点，得到质粒8。具体步骤为：以异戊烯焦磷酸异构酶基因(SEQ ID NO.6)为模板，以序列SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29为引物扩增idi基因。将该基因片段与质粒7用SacI和HindIII内切酶进行酶切、连接，得到质粒8(图1H)。
[0097] 上述PCR扩增条件：95℃，10min；95℃，30S；55℃，30S，30个循环；72℃，1.5min；72℃，10min。
[0098] 实施例2达玛烯二醇大肠杆菌生产菌株的构建
[0099] 将质粒5转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株，命名为菌株1。
[0100] 质粒5的大肠杆菌转化方法为：将质粒5加入50ul大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，
冰浴30min，42℃热击90s转化。加入1ml LB培养基，37℃复壮1h，收集菌体涂于卡那霉素抗性筛选LB平板中，37℃培养过夜。过夜培养后挑去菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子，进行测序验证，测序正确的阳性转化子，命名为菌株1。
[0101] 实施例3合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建
[0102] 将质粒6转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株，命名为菌株2。
[0103] 质粒6的大肠杆菌转化方法同实施例2。
[0104] 为了进行重组菌株的对照，便于代谢产物的对比分析，按照上述转化方法构建了含有pET28a(+)空质粒的大肠杆菌，命名为菌株5。
[0105] 实施例4合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建
[0106] 将质粒7转化进入菌株1，得到菌株3；
[0107] 质粒7转化进入菌株1的方法为：质粒7加入50ul菌株1的感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s转化。加入1ml LB培养基，37℃复壮1h，收集菌体涂于卡那霉素和
链霉素抗性筛选LB平板中，37℃培养过夜。过夜培养后挑去菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子，进行测序验证，测序正确的阳性转化子，命名为菌株3.
[0108] 实施例5合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株的构建
[0109] 将质粒8转化进入菌株2，得到菌株4；
[0110] 质粒8转化进入菌株2的方法为：质粒8加入50ul菌株2的感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s转化。加入1ml LB培养基，37℃复壮1h，收集菌体涂于卡那霉素和链霉素抗性筛选LB平板中，37℃培养过夜。过夜培养后挑去菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子，进行测序验证，测序正确的阳性转化子，命名为菌株4.
[0111] 空白对照菌株的构建
[0112] 为了进行重组菌株的对照，便于代谢产物的对比分析，按照上述转化方法构建了含有pET28a(+)空质粒的大肠杆菌重组菌株5。
[0113] pET28a(+)转化进入菌株1的方法为：将pET28a(+)加入50ul大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s转化。加入1ml LB培养基，37℃复壮1h，收集菌体涂于卡那霉素抗性筛选LB平板中，37℃培养过夜。过夜培养后挑去菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子，命名为菌株5.
[0114] 实施例6重组菌株的发酵过程和
代谢物提取与测定
[0115] (1)重组菌的发酵过程与代谢物提取
[0116] 取保存的重组菌株1、菌株2和菌株5转接于4mL含卡那霉素的液体LB试管中，37℃，200rpm过夜培养后，测量OD600，将菌浓度稀释至OD600为0.05，按3％的接种量接种于30mL摇瓶培养基(含卡那霉素)中，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入
0.2mM的IPTG诱导基因的表达，培养24h后，分别取20mL发酵液分两次离心，去上清，加入
2mL丙
酮，在冰上用超声细胞
破碎仪破碎菌体，提取产物。
[0117] 取保存的重组菌株3、菌株4转接于4mL含卡那霉素和链霉素的液体LB试管中，37℃，200rpm过夜培养后，测量OD600，将菌浓度稀释至OD600为0.05，按3％的接种量接种于30mL摇瓶培养基(含卡那霉素和链霉素)中，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入0.2mM的IPTG诱导基因的表达，培养24h后，分别取20mL发酵液分两次离心，去上清，加入2mL丙酮，在冰上用超声细胞破碎仪破碎菌体，提取产物。
[0118] (2)代谢产物的HPLC测定和GC-MS测定
[0119] HPLC测定
[0120] 液相色谱条件：进样量20μL，色谱柱为大连依利特公司的C18柱，规格为5μ，250mm*4.6mm，流动相为甲醇：乙腈＝4:6，流速：1mL/min，紫外检测
波长为203nm，柱温为
30℃。标准曲线定量分析。
[0121] GC-MS测定
[0122] 进样体积1uL，
溶剂延时12min，色谱柱：HP-5ms(30m×0.25×0.5um)；色谱条件：80℃，1min；20℃min-1到300℃保温18min；MS扫描离子范围:100-500Da。
[0123] (3)测定结果
[0124] A：含有pET28a(+)空质粒的大肠杆菌重组菌株5中未检测到达玛烯二醇(图2-A)。
[0125] B：菌株1、菌株2中均测到了达玛烯二醇(图2-B、图2-C、图2-D、图2-E、图2-F、图2-G)。
[0126] C：重组菌株1、重组菌株2、重组菌株3和重组菌株4中达玛烯二醇的含量分别为：1.64mg/L，0.97mg/L，8.63mg/L和6.47mg/L(图3)。
