酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用
阅读：25发布：2020-05-13
专利汇可以提供酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种酿酒 酵母 菌株，其保藏编号为CGMCC NO:16756。本发明提供的 酿酒酵母 菌株CEC A10分离自甘肃祁连酒厂美乐 冰 葡萄汁15℃自然 发酵 过程中，属于我国本土酵母。酿酒酵母菌株CEC A10耐受性好、发酵活 力 高，其 酿造 的冰酒挥发酸含量低，香气复杂度好、感官评价高，对提升冰酒品质，凸显我国冰酒的地域特色具有重要意义。，下面是酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用专利的具体信息内容。
1.一种酿酒酵母菌株，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO:16756。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于：该酿酒酵母菌株26srDNA D1/D2区具有如SEQ ID:1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的酿酒酵母菌株在冰酒中的应用。
4.如权利要求3所述的酿酒酵母菌株在冰酒中的应用，其特征在于：以冰葡萄汁为原料，接种所述酿酒酵母菌株进行发酵，发酵温度为14～16℃。
5.如权利要求4所述的酿酒酵母菌株在冰酒中的应用，其特征在于：所述冰葡萄汁为威代尔冰葡萄汁。
6.如权利要求3所述的酿酒酵母菌株在冰酒中的应用，其特征在于：所述酿酒酵母菌株酿造的冰酒的挥发酸含量小于1g/L。
7.一种提高冰酒香气复杂度的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的酿酒酵母菌株发酵冰葡萄汁。
8.一种活性干酵母，其特征在于，由如权利要求1或2所述的酿酒酵母菌株制得。
酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 冰酒是一种低产量、高档次的浓甜型葡萄酒，其巨大的经济效益近年来引 起了人们广泛的关注。当环境温度≤8℃时，葡萄藤上的葡萄会自然冰冻，在压 榨过程中，大部分水分会以冰的形式保留在葡萄皮中，得到含有高浓度的糖、 酸和芳香化合物的葡萄汁，由此葡萄汁酿造而成的葡萄酒就是冰酒。酿造冰酒 的原料要求其可溶性固形物在38°Brix～42°Brix之间，最低不能低于35°Brix。
[0003] 酿酒酵母在冰酒酿造中起着关键性的作用，负责在这种高浓度的环境中把 糖转化成酒精(目标酒度11％v/v左右)，最后得到一款浓甜的葡萄酒(残糖可 高达214.7g/L)。酿酒酵母为了应对冰酒原料的高渗透环境，往往会代谢糖产生 过多的甘油和挥发酸，其中高水平的挥发酸会严重影响葡萄酒的香气质量，使 葡萄酒闻起来有醋酸味，有时还会有猫尿味，大大影响葡萄酒口感。OIV标准 规定冰酒的挥发酸不能高于2.1g/L。即使OIV对冰酒的挥发酸的限制范围较宽， 但是在生产过程中仍有挥发酸超标的现象。因此，要降低冰酒发酵过程中的不 良代谢物挥发酸，提高冰酒的香气质量，选择产挥发酸少的酿酒酵母非常重要。
[0004] 葡萄酒的风味在很大程度上取决于葡萄酒中的香气成分，而葡萄酒香气是 葡萄酒品质的重要体现。香气物质的种类、含量、感觉阈值以及物质间的相互 作用，都会影响最终呈现的风味和典型性。由于冰酒是由自然冷冻的葡萄汁酿 造而成，所以其香气物质的含量也要明显高于相同品种酿造的餐酒。目前在冰 酒中已经检测到360多种挥发性物质，包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯 类、呋喃类、内酯类等。但并不是这些物质都会对冰酒的香气组成有贡献，只 有少部分化合物(仅几十种)会对冰酒的香气有一定贡献。其中酯类化合物和 高级醇是其香气构成的关键成分，其种类和含量具有菌株的多样性。乙酸酯和 乙醇酯是冰酒中水果香气的重要呈味物质，主要包括有乙酸异戊酯、乙酸苯乙 酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等物质。产酯高的 酵母会赋予冰酒果香浓郁的发酵香味。高级醇对冰酒香气具有双重影响。含量 过低会使葡萄酒香气淡薄，酒体寡淡；含量过高会给葡萄酒带来异味，给人以 辛辣、腐臭感和不愉快的苦涩味。醇类化合物中，β-苯乙醇具有玫瑰花香和蜂蜜 香气，赋予了冰酒的典型香气。萜烯、内酯、酮、酚类等化合物也是冰酒香气 构成的重要组成部分，其中β-大马酮、1-辛烯-3-醇、乙烯基愈创木酚会带给冰 酒香甜的果香、蘑菇、丁香等风味，增加了冰酒香气的复杂性。研究发现，微 生物所产香气物质的含量和种类具有菌株多样性。选择能够酿造具有典型品种 香气，且香气复杂性高的冰酒酵母将会对冰酒质量的提升具有重大贡献。中国 是世界上重要的冰酒生产国之一。但是到目前为止，中国冰酒都是用国际商业 酿酒酵母菌株发酵完成。虽然利用国际上商业化的酿酒酵母菌株，可以有效控 制其发酵过程，避免一些风险，但是其酿制的冰酒通常缺乏典型的地域感官特 征。本土酿酒酵母对当地环境条件、酿酒厂条件和葡萄品种的适应性更好，因 此具有更强的竞争力，也更容易保持我国冰酒典型的地域特色。开发与利用本 土的酿酒酵母资源对提高我国冰酒的国际竞争力具有重要作用，已经迫在眉睫。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一株低产挥发酸、产香突出的野生型酿酒酵母及其 在冰酒中的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种酵母菌株，其保藏编号为CGMCC NO: 16756，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酵母菌株CEC A10， 保藏日期为2018年11月21日，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心。
[0007] 具体地：该酿酒酵母菌株26s rDNA D1/D2区具有如SEQ ID:1所示的核苷 酸序列。
[0008] 本发明还提供一种上述所述的酿酒酵母菌株在冰酒中应用。
[0009] 具体地，以冰葡萄汁为原料，接种所述酿酒酵母菌株进行发酵，发酵温度 为14～16℃。
[0010] 具体地，所述冰葡萄汁为威代尔冰葡萄汁。
[0011] 具体地，所述酿酒酵母菌株酿造的冰酒的挥发酸含量小于1g/L。
[0012] 本发明还提供一种提高冰酒香气复杂度的方法，采用上述所述的酿酒酵母 菌株发酵冰葡萄汁。
[0013] 本发明还提供一种活性干酵母，由上述所述的酿酒酵母菌株制得。
[0014] 本发明提供的酿酒酵母菌株CEC A10，具有以下优点：
[0015] (1)酿酒酵母菌株CEC A10具有良好的耐受性，能够耐受300mg/L的SO2， 16％(v/v)的酒精，较高的酸度(pH＝2.0)，45％的高糖，10℃的低温，而且 其低产硫化氢，发酵活力高。
[0016] (2)酿酒酵母菌株CEC A10与商业活性干酵母EC1118(法国LALVIN公 司生产，常用于冰酒的酿造)相比，其在15℃发酵温度下发酵速度较快，发酵 周期较短。而且其在高达412g/L糖的环境下，仍能产较低的挥发酸，含量仅有 0.87g/L，提高了冰酒的质量。
[0017] (3)酿酒酵母菌株CEC A10产香能力突出，其产生的乙酸异戊酯、丁酸乙 酯、2-甲基丁酸乙酯、癸酸乙酯、β-乙酸苯乙酯的含量均高于商业酵母，不仅赋 予了冰酒典型的玫瑰花香、蜂蜜香，还赋予了其浓郁的果香。与此同时，菌株 CEC A10产生的萜烯类、降异戊二烯类和酚类含量较高，有2099.02μg/L，大大 增加了冰酒的香气复杂性，赋予冰酒浓郁的坚果、蘑菇等复杂香气。
[0018] (4)酿酒酵母菌株CEC A10酿造的冰酒，酒体呈金黄色，澄清有光泽；具 有浓郁纯正协调的花香、果香，有丰富的干果、香料等香气，品种香气突出； 口感成熟和谐，层次感强。
[0019] 本发明提供的酿酒酵母菌株CEC A10分离自甘肃祁连酒厂美乐冰葡萄汁15℃ 自然发酵过程中，属于我国本土酵母。酿酒酵母菌株CEC A10耐受性好、发酵 活力高，其酿造的冰酒挥发酸含量低，香气复杂度好、感官评价高，对提升冰 酒品质，凸显我国冰酒的地域特色具有重要意义。
[0020] 本发明的酿酒酵母菌株CEC A10，保藏日期为2018年11月21日，保藏编 号为CGMCC NO:16756，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保 藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心地址 为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。附图说明
[0021] 图1为酿酒酵母菌株CEC A10在YEPD固体培养基上的菌落形态；
[0022] 图2为酿酒酵母菌株CEC A10在WLN固体培养基上的菌落形态；
[0023] 图3为酿酒酵母菌株CEC A10菌株和商业菌株EC1118的糖消耗曲线。
具体实施方式
[0024] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具 体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明 做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的 材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
[0025] 本发明中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEC A10分离自甘肃祁连酒 厂美乐冰葡萄汁15℃自然发酵过程中，属于我国本土酵母。菌株CEC A10的 26s rDNA D1/D2区具有如SEQ ID:1所示的核苷酸序列。另外，菌株CEC A10 在YEPD固体培养基上的生长形态如图1所示，在WLN培养基上的生长形态如 图2所示。
[0026] 实施例1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEC A10菌株的基本特性 研究[0027] 在本实施例中，测定酿酒酵母CEC A10的基本生长特性，包括SO2耐受性、 酒精耐受性、耐酸性、高糖耐受性、低温耐受性、产H2S特性和发酵活力。具 体方法如下：
[0028] 1.1SO2耐受性
[0029] 在试管中添加YEPD培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L， 自然pH值，固体培养基中加入20g/L琼脂)并加入杜氏管，灭菌之后加入H2SO3溶液，调整初始SO2浓度为100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L。 将活化后的菌株按接种量1×106cells/mL接种，28℃培养3d。每4h记录其产气 情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值。根据产气情况及菌液浓度了 解酵母SO2耐受性。
[0030] 1.2酒精耐受性
[0031] 在试管中添加YEPD液体培养基并加入杜氏管，灭菌之后分别加入无水乙 醇调整初始酒精浓度为10％、12％、14％和16％(v/v)。将活化好的菌株按接 种量1×106cells/mL接种，28℃培养3d。每4h记录其产气情况，3d后测定菌 液在波长600nm下的吸光值。根据产气情况及菌液浓度了解酵母酒精耐受性。
[0032] 1.3耐酸性
[0033] 将菌株活化后，接种于不同pH值(1.5、2.0、2.5、3.5)的带有杜氏管的 YEPD液体培养基中，接种量为1×106cells/mL。28℃培养3d，每4h记录其产 气情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值，根据产气情况及菌液浓度 了解酵母耐酸性。
[0034] 1.4高糖耐受性
[0035] 酵母菌株活化后，接种于含有不同糖浓度(30、35、40、45％，葡萄糖：果 糖＝1：1)的YEPD培养基中，接种量为1×106cells/mL。28℃培养3d，每4h 记录其产气情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值，根据产气情况及 菌液浓度了解酵母耐受性。
[0036] 1.5低温耐受性
[0037] 将酵母菌株活化后，接种于带有杜氏管的YEPD液体培养基中，接种量为 1×106cells/mL。然后分别置于10℃、12℃、15℃条件下培养3d，每4h记录 其产气情况，3d后测定菌液在波长600nm下的吸光值。根据产气情况及菌液 浓度了解酵母的低温耐受性。
[0038] 1.6产H2S特性
[0039] 酵母菌株接种于YEPD液体培养基中，28℃下培养24h。然后将菌液划线 于BIGGY固体培养基上，在28℃下培养5d，观察菌落颜色。根据菌落颜色 可分为以下六个等级：1-白色、2-浅棕褐色、3-棕褐色、4-浅褐色、5-褐色和6- 黑色，对应H2S产量从低产到高产。
[0040] 1.7发酵活力
[0041] 酵母菌株接种于YEPD液体培养基中，28℃下培养24h。然后接种于100 mL含有20％葡萄糖的YNB培养基(葡萄糖20g/L，酵母基础氮源6.70g/L， pH6.8，固体培养基中加入20g/L琼脂。)中，接种量为1×106cells/mL。在25℃ 下培养，发酵过程中每24h测定发酵体系重量，计算失重(即CO2的释放量)。 发酵活力表示为发酵24h-72h小时内CO2释放的速率(g CO2/L h)。
[0042] 结果显示，冰酒发酵过程中，酵母会受到很多严苛的环境，如原料的高糖、 高酸环境，起始较高的二氧化硫浓度，逐渐增高的酒精含量，以及要求的较低 的发酵温度等。研究酿酒酵母菌株CECA 10的基本特性(如表1所示)，发现该 酵母菌株在300mg/L的SO2，16％(v/v)的酒精，较高的酸度(pH＝2.0)，45％ 的高糖，10℃的低温下均能正常生长，说明该酵母具有良好的耐受性，能够应 对冰酒发酵过程中的各种不利条件。除此之外，该酵母低产硫化氢，发酵活力 高，具备良好的发酵性能。综上所述，酿酒酵母菌株CECA 10具备发酵冰酒的 基本性能。
[0043] 表1酿酒酵母菌株CEC A10的基本特性
[0044]
[0045] a：根据菌落颜色可分为以下六个等级：1-白色、2-浅棕褐色、3-棕褐色、4-浅褐色、5-褐色和 6-黑色，对应H2S产量从低产到高产。
[0046] 实施例2、酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)CEC A10与商业酵母 EC1118酿酒效果对比实验
[0047] 在本实施例中，将酿酒酵母菌株CEC A10和EC1118分别接种于1.5L的威 代尔冰葡萄汁(412.76±2.15g/L糖、总酸11.07±0.14g/L,pH值3.26±0.01)中， 14～16℃下静置发酵。酵母菌株接种于YEPD培养基中培养24小时，然后转接 于100mL的葡萄汁中培养，作为种子液。最终，酵母细胞按照6×106cells/mL 的接种量接种于装有1.5L威代尔冰葡萄汁的2L玻璃罐中，SO2的浓度为60 mg/L，用多层纱布封口覆盖，置14～16℃下发酵。发酵过程中，每24h监测葡 萄汁的糖浓度和酒精含量，待酒精含量达到11％(v/v)之后终止发酵。冰酒样品 放置在2℃下进行冷稳定，然后沉淀、过滤、装瓶。
[0048] 发酵结束后，参照国标(GB/T 15038-2006)的方法，测定冰酒的残糖、乙 醇、总酸、挥发酸和pH值等基本理化指标。采用气质联用色谱仪测定冰酒香气 物质含量并组织专业品酒小组进行感官品尝。
[0049] 香气物质含量测定方法：
[0050] 香气物质的提取：采用搅拌子吸附萃取方法提取酒样中的香气物质。取10 mL酒样置于15mL样品瓶中，加入2g NaCl，放入搅拌子，密闭样品瓶，置 于磁力搅拌器上，室温下进行萃取，转子转速1100rpm，萃取时间60min。萃 取结束后，用镊子取出搅拌棒，用蒸馏水冲洗直至搅拌棒上无残留样品，然后 用滤纸将水分吸干，最后放入热解析玻璃管，供气相色谱分析用。
[0051] 香气成分的GC/MS分析：用Agilent 6890气相色谱和Agilent 5975质谱联 用仪(Agilent，美国)检测，并配备有热解吸系统。热解吸程序为：不分流模式， 初始温度为30℃，然后按照60℃/s的速率升温到250℃，保留3min。然后采 用CIS4系统用液氮(-70℃)进行冷却，最后从-70℃以12℃/s的速率升到280℃， 保留5min。色谱柱为DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)，以He为载气，流 速设为1mL/min。升温程序为：40℃保持3min，随后以4℃/min的速率升至 160℃，然后在以7℃/min的速率升温至230℃并保持8min。连接杆温度设为 230℃。质谱条件：EI离子源，离子源温度为230℃，电子能量为70eV，全扫 描范围为30～400amu。标准品为HPLC或GC级别，纯度＞99％，购自Aldrich (美国)和Fluka(瑞士)。所有挥发性化合物均通过质谱比较、标准品保留时间和 NIST05库中的质谱谱图进行定性鉴别。
根据各标准品的标准曲线对所有挥发性 化合物进行定量。
根据各标准品的标准曲线对所有挥发性 化合物进行定量。
[0052] 感官评价：
[0053] 组织11名专业品评员分别对两个酵母菌株发酵的冰酒进行感官品尝。这11 名品评员来自西北农林科技大学葡萄酒学院的专业品酒小组(Wine Tasting Panel)。感官品尝按照GB/T 15038-2006进行，感官得分以平均值计。
[0054] 两个菌株的糖消耗曲线如图3所示。菌株CEC A10的耗糖速率明显快于商 业菌株EC1118，其发酵能力较强。CEC A10发酵周期也较短，接种24天后达 到目标酒度，但是商业菌株EC1118在发酵了26天后才达到目标酒度。两个菌 株发酵的威代尔冰酒的理化指标见表2。可以看出菌株CEC A10和商业菌株 EC1118都可以将威代尔冰葡萄汁发酵到理想的酒度，所得冰酒的各种指标含量 均符合相关国际标准，其中酒度，总酸的含量没有显著性差异。在冰酒中，由 于酵母对高渗透胁迫的应激反应，会代谢产生高含量的乙酸，高浓度的乙酸会 给冰酒的香气带来负面影响，严重影响冰酒的感官质量。因此选择产乙酸少的 酵母对于生产高质量的冰酒非常重要。本实施例中，菌株CEC A10产的挥发酸 含量非常低，只有0.87g/L，显著低于商业菌株EC1118，具有较高的应用价值。
[0055] 表2酵母菌株酒精发酵后冰酒的理化指标
[0056]
[0057] *表示同一列数据之间具有显著性差异(p＜0.05)。
[0058] 酿酒酵母的产香能力是影响葡萄酒香气质量的重要因素。分析二者所发酵 的冰酒中主要的33种香气物质的含量(表3)，发现菌株CEC A10所酿造的冰 酒中，有17种物质的含量都显著高于商业菌株酿造的冰酒，说明CEC A10产香 能力较强。其中，酯类物质中，乙酸异戊酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、癸酸 乙酯与苹果、香蕉等香气有关，说明CEC A10所酿造的冰酒具有浓郁的果香。β- 乙酸苯乙酯会赋予冰酒优雅的玫瑰花香和蜂蜜香味。高级醇是影响葡萄酒感官 品质的重要代谢物。在本实施例中，菌株CEC A10所产生的异戊醇、1-辛烯-3- 醇、1-庚醇和2-苯乙醇均远远高于商业对照，会赋予冰酒令人愉悦的坚果、蘑菇 和玫瑰等香味。CEC A10发酵酒样中萜烯类、降异戊二烯类和酚类含量较高， 有2099.02μg/L，增加了冰酒的香气复杂性。其中，β-大马酮的含量显著高于 商业菌株发酵的酒样，给冰酒带来浓郁的花香。由此可以看出酿酒酵母CEC A10 所酿造的冰酒不仅具有威代尔葡萄品种典型的香气，还具有浓郁的坚果、蘑菇 等复杂香气。
[0059] 表3酵母菌株酒精发酵后冰酒的香气物质含量
[0060]
[0061]
[0062] *表示同一行数据之间具有显著性差异(p＜0.05)。
[0063] 两个菌株发酵的威代尔冰酒的感官评定结果如表4所示。可以看出，两个 菌株发酵的冰酒在外观上没有显著差异，但在香气、口感和典型性上却大有不 同。CEC A10发酵的威代尔冰酒感官品质要显著优于商业菌株EC1118发酵的冰 酒。CEC A10具有发酵优质冰酒的潜力。
[0064] 表4不同酵母发酵的冰酒的感官品尝结果
[0065]
[0066]
[0068] 本发明提供的酿酒酵母菌株CEC A10分离自甘肃祁连酒厂美乐冰葡萄汁15℃ 自然发酵过程中，属于我国本土酵母。酿酒酵母菌株CEC A10耐受性好、发酵 活力高，其酿造的冰酒挥发酸含量低，香气复杂度好、感官评价高，对提升冰 酒品质，凸显我国冰酒的地域特色具有重要意义。
[0069] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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