一种酿酒酵母及其应用
阅读：762发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种酿酒酵母及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种酿酒 酵母 （Saccharomycescerevisiae）及其应用，该 酿酒酵母 的保藏编号为CCTCCNo.M2012215，经 发酵 培养后谷胱甘肽产量高，有效解决 微 生物 中酵母合成产率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的问题，拓宽富含谷胱甘肽干酵母的应用范围，提高了产品附加价值。，下面是一种酿酒酵母及其应用专利的具体信息内容。
一种酿酒酵母及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是微生物细胞内最丰富的非蛋白巯基化合物，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，同时具有γ-谷氨酰基和巯基。GSH广泛存在于自然界的生物体中。在生物体内，GSH有着多种重要的生理功能，主要为三个方面，如抗氧化、增强免疫和解毒。第一，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境，GSH起着至关重要的作用。第二，增强免疫，在高等真核细胞中，GSH可以迅速增强机体的免疫力。第三，作为解毒剂，GSH长被用于与其它物质组合构成治疗或保健药物。近年来，日本科学家发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效。谷胱甘肽在医学、食品、化妆品等领域具有广泛的市场前景。
[0003] 谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中发酵法是最具潜力的方法。日本在20世纪80年代已经实现了GSH的工业化生产，我国发酵法生产谷胱甘肽起步较晚，目前仍停留在实验室试验阶段，GSH发酵过程中发酵水平不高以及下游分离纯化相关技术未取得实质性突破，使得谷胱甘肽的工业化生产在我国一直未能实现。 [0004] 由于谷胱甘肽在水溶液中极易被氧化，因此微生物细胞合成的谷胱甘肽一般存在于细胞中。酵母是谷胱甘肽合成最具潜力的微生物，且酵母富含蛋白质，在食品和医药工业中具有广泛的用途。生产谷胱甘肽含量高的酵母既能作为食品和医药工业的原料，同时也可以提供丰富的功能性成分谷胱甘肽，对改善人体机能具有非常重要的作用。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种合成谷胱甘肽能力较强的菌株和富含谷胱甘肽的干酵母产品，有效解决微生物中酵母合成产率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的问题，拓宽富含谷胱甘肽干酵母的应用范围，提高产品附加价值。
[0006] 为了实现本发明，发明人通过大量试验反复进行菌种选育研究，并终于获得了一株合成谷胱甘肽能力较强的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCCG，已于2012年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2012215。
[0009] 代谢特性：代谢过程能积累产生谷胱甘肽
[0010] 本发明的涉及的高产谷胱甘肽的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCTCC No.M2012215是按照如下方法获得的：
[0011] 亲本为亲株A：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC1251，亲株B：热带假丝酵母Candida tropicalis CICC31709，实验室保藏菌株。
[0012] 原生质体的制备：将待融合的亲株A和亲株B在斜面培养基上活化两次（斜面培养基：葡萄糖 20 g/L， 蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，琼脂 20 g/L，pH6.0，0.1MPa灭菌15min），活化后接入摇瓶培养基（摇瓶培养基：葡萄糖 20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO4 1 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCl2 0.1 g/L，酵母粉0.2 g/L，0.1MPa灭菌15min）培养至对数生长期，5000rpm下离心收集细胞，将细胞悬浮于1 mL无菌脱壁预处理液（0.05 mol/L EDTA溶液与0.1% β-巯基乙醇混合，用0.1mol/L柠檬酸缓冲液配制（0.1mol/L 柠檬酸4.7ml，0.1mol/L 柠檬酸钠15.3ml混合，pH5.8），0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，）中，
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使细胞数为10 个/mL，30℃振荡处理15 min，5000rpm下离心收集细胞；用1%（W/V）蜗牛酶加1%（W/V）纤维素酶 (1%蜗牛酶和1%纤维素酶的配制方法：用0.1mol/L柠檬酸缓冲液加0.7mol/L KCl的高渗溶液配制，然后通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌)复合酶酶解悬浮预处理过的细胞，30℃振荡处理40～60 min；当原生质体形成率达到90%以上后，加入4 mL无菌Tris-HCl高渗缓冲液 （Tris-HCl高渗缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH 7.4（50mL0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与42mL 0.1 mol/L盐酸均匀混合后加水稀释至100 mL），0.5mol/L 蔗糖，0.05 mol/L CaCl2，然后通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌）停止酶解，将离心管上下倒置两次，摇匀后在转速3000 rpm离心5 min收集酶解后的细胞，将收集的细胞用2 mL无菌Tris-HCl高渗缓冲液悬浮，得亲株A、亲株B的原生质体。
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使细胞数为10 个/mL，30℃振荡处理15 min，5000rpm下离心收集细胞；用1%（W/V）蜗牛酶加1%（W/V）纤维素酶 (1%蜗牛酶和1%纤维素酶的配制方法：用0.1mol/L柠檬酸缓冲液加0.7mol/L KCl的高渗溶液配制，然后通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌)复合酶酶解悬浮预处理过的细胞，30℃振荡处理40～60 min；当原生质体形成率达到90%以上后，加入4 mL无菌Tris-HCl高渗缓冲液 （Tris-HCl高渗缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH 7.4（50mL0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与42mL 0.1 mol/L盐酸均匀混合后加水稀释至100 mL），0.5mol/L 蔗糖，0.05 mol/L CaCl2，然后通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌）停止酶解，将离心管上下倒置两次，摇匀后在转速3000 rpm离心5 min收集酶解后的细胞，将收集的细胞用2 mL无菌Tris-HCl高渗缓冲液悬浮，得亲株A、亲株B的原生质体。
[0013] 原生质体融合： 上述方法制得的原生质体，以1∶1的比例各取亲株A、亲株B的原生质体液0.1 mL混合后加入0.8 mL 无菌Tris-HCl高渗缓冲液，离心去上清液；然后，加入2 mL促融剂溶液（促融剂配置方法：PEG6000（聚乙二醇） 30 g，溶于100 mL Tris-HCl高渗缓冲液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌），轻摇混合，30℃静置保温1 h；3000 rpm离心，收集沉淀，用液体高渗基本培养基（液体高渗基本培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2， 蔗糖 170， 0.1MPa灭菌15min）洗涤两次，将沉淀再悬于液体高渗基本培养基中；取0.1 mL液体高渗基本培养基菌悬液于4 mL高渗基础培养基软琼脂（上层）（高渗基础培养基软琼脂（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2， 蔗糖 170，琼脂 10 0.1MPa灭菌15min）中，摇匀迅速倒入底层为高渗基础固体培养基（高渗基础固体培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2， 蔗糖 170，琼脂 20 0.1MPa灭菌15min）的平板上，30℃培养4～5天。挑出平板上的单菌落，接入基础固体培养基（基础固体培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，琼脂 20 0.1MPa灭菌15min）的斜面试管，保藏备用。
[0014] 融合子的筛选：将上述保藏菌株接入到在淀粉选择平板（淀粉选择平板培养基：淀粉 20，(NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，琼脂
20 0.1MPa灭菌15min）上，经过两次淀粉选择平板的筛选，得到融合较好的菌株R2和R7（实验室编号，下同）。
20 0.1MPa灭菌15min）上，经过两次淀粉选择平板的筛选，得到融合较好的菌株R2和R7（实验室编号，下同）。
[0015] 通过摇瓶发酵（摇瓶发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min）试验，R7的谷胱甘肽（GSH）产量比R2高，选用R7作为下一步试验菌株。同时，对R7进行稳定性检验，经斜面连续传代
10次，R7的GSH合成能力基本不变，说明本试验获得的融合子R7有较好的遗传稳定性。 [0016] 对融合菌株R7采用亚硝酸诱变，筛选有硫酸锌抗性的GSH高产突变株。将菌株R7接种于摇瓶发酵培养基（摇瓶发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl o
0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min）中，在30C，150转/分钟条件下培养至对数生长期，离心收集菌体，以3倍体积的无菌水洗涤，将菌体制成细胞量约
7
为10 个/ml的菌悬液；取菌悬液1ml，加入1mol/L pH4.5醋酸缓冲液（1mol/L pH4.5醋酸缓冲液制备方法：称取醋酸6.12g，加蒸馏水定容至100ml。称取醋酸钠8.2g，加蒸馏水定容至100ml。将醋酸钠溶液缓缓加入到醋酸溶液中，搅拌均匀，调节pH至4.5，两者之比大约为1∶1。）及0.1mol/L亚硝酸钠溶液，于30℃保温20min；加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠缓冲液（称取磷酸氢二钠（Na2HPO42H2O）1.246g，加蒸馏水定容至100ml。）20ml，使pH下降至6.8左右，以终止反应；将诱变后的菌悬液稀释后涂布在7.5mmol/L浓度的硫酸锌平板上，挑选平板上生长的菌落保藏，即为硫酸锌抗性突变菌株。对所有硫酸锌抗性突变菌株进行初筛（将硫酸锌抗性突变株接入斜面培养基（斜面培养 (g/L)：葡萄糖 20， 蛋白胨 20，酵母膏 10，琼脂 20 pH6.0，0.1MPa灭菌15min），培养2~3天后将菌株接入摇瓶培养基（摇瓶培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min），培养24h后测各菌株的GSH含量，选取GSH含量提高的菌株进行复筛。）和复筛（将初筛菌株从斜面培养基上活化，再接至种子培养基（种子培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2
0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min），培养12h后，以10%的接种量接入发酵培养基（发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min）发酵，每株3瓶，培养48h后测各菌株的谷胱甘肽含量，根据谷胱甘肽含量确定谷胱甘肽高产菌株。）。经过初筛和复筛，编号为CCCG的突变株谷胱甘肽含量最高，经鉴定，该菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCCG，在中国典型培养物保藏中心的专利保藏编号为CCTCC:M2012215。
10次，R7的GSH合成能力基本不变，说明本试验获得的融合子R7有较好的遗传稳定性。 [0016] 对融合菌株R7采用亚硝酸诱变，筛选有硫酸锌抗性的GSH高产突变株。将菌株R7接种于摇瓶发酵培养基（摇瓶发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl o
0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min）中，在30C，150转/分钟条件下培养至对数生长期，离心收集菌体，以3倍体积的无菌水洗涤，将菌体制成细胞量约
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为10 个/ml的菌悬液；取菌悬液1ml，加入1mol/L pH4.5醋酸缓冲液（1mol/L pH4.5醋酸缓冲液制备方法：称取醋酸6.12g，加蒸馏水定容至100ml。称取醋酸钠8.2g，加蒸馏水定容至100ml。将醋酸钠溶液缓缓加入到醋酸溶液中，搅拌均匀，调节pH至4.5，两者之比大约为1∶1。）及0.1mol/L亚硝酸钠溶液，于30℃保温20min；加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠缓冲液（称取磷酸氢二钠（Na2HPO42H2O）1.246g，加蒸馏水定容至100ml。）20ml，使pH下降至6.8左右，以终止反应；将诱变后的菌悬液稀释后涂布在7.5mmol/L浓度的硫酸锌平板上，挑选平板上生长的菌落保藏，即为硫酸锌抗性突变菌株。对所有硫酸锌抗性突变菌株进行初筛（将硫酸锌抗性突变株接入斜面培养基（斜面培养 (g/L)：葡萄糖 20， 蛋白胨 20，酵母膏 10，琼脂 20 pH6.0，0.1MPa灭菌15min），培养2~3天后将菌株接入摇瓶培养基（摇瓶培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min），培养24h后测各菌株的GSH含量，选取GSH含量提高的菌株进行复筛。）和复筛（将初筛菌株从斜面培养基上活化，再接至种子培养基（种子培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2
0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min），培养12h后，以10%的接种量接入发酵培养基（发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5， KH2PO4 1， NaCl 0.1 ，MgSO4 0.5，CaCl2 0.1， 酵母膏 0.2，0.1MPa灭菌15min）发酵，每株3瓶，培养48h后测各菌株的谷胱甘肽含量，根据谷胱甘肽含量确定谷胱甘肽高产菌株。）。经过初筛和复筛，编号为CCCG的突变株谷胱甘肽含量最高，经鉴定，该菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCCG，在中国典型培养物保藏中心的专利保藏编号为CCTCC:M2012215。
[0017] 利用本发明的菌株可以富含谷胱甘肽的食品、药品或化妆品。例如，利用本发明的菌株制备富含谷胱甘肽干酵母的方法如下：
[0018] 1）将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCTCC:M2012215接种到种子培养基中，28-32℃培养36-48小时，摇床转速180-200 rmp/min。
[0019] 2）摇瓶水平上发酵：将步骤1）的菌液接种至发酵培养基中，接种量8%-10%（V/V），28-32℃培养56-64小时，在培养18-20小时时，一次性添加前体氨基酸和 ATP (谷氨酸8-12mmol/L,半胱氨酸8-12 mmol/L,甘氨酸5-7 mol/L，ATP 1.6-1.7 mg/L)，得到还原型大于98%，胞内含量4%-4.5%的还原型谷胱甘肽。
[0020] 3）放大到30L发酵罐：通过分阶段控制流加发酵培养基策略，利用糖蜜和葡萄糖两种碳源，发酵温度28-32℃，搅拌转速100-600 rmp/min，通气量5-30 L/min，在生物量达到一定时，一次性添加前体氨基酸和 ATP (谷氨酸25-35 mmol/L,半胱氨酸5-35 mmol/L，甘氨酸15-20 mol/L，ATP 3-8 mg/L)，调节转速和通气量，分阶段控制发酵罐的溶氧水平。并流加20 mL/h-50 mL/h碳源，继续发酵20-24小时。
[0021] 4）富含谷胱甘肽的干酵母生产：将3）中得到的发酵液，在3000-5000 rmp条件下，离心3-5min分钟，并用蒸馏水反复洗涤离心，得到干净菌体，再配置成一定浓度的酵母液，在喷雾干燥塔中，控制进风温度130-150℃，得到到干物质含量在90%-95%、胞内谷胱甘肽含量在3.5-4.5%的酵母干菌体。
[0022] 所述以硫酸锌抗性为筛选标记所选用的抗性标记不仅仅局限于硫酸锌，同时包括氯化锌，硝酸锌等锌盐中的一种或几种的组合。
[0023] 所述对融合子R7进行亚硝酸诱变，其中亚硝酸包含亚硝酸和亚硝酸的各种盐的一种或者几种。
[0024] 所述筛选到一株具有硫酸锌抗性的突变株酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CCTCC:M2012215，所获得的抗性包含所有的锌盐。
[0025] 所述摇瓶水平上发酵，一次性添加前体氨基酸和 ATP，其中的最佳组合为谷氨酸10mmol/L,半胱氨酸10mmol/L,甘氨酸6mol/L，ATP1.67mg/L。
[0026] 所述通过分阶段控制流加发酵培养基策略，利用糖蜜和葡萄糖两种碳源，包含两者中的一种或者两者的各种组合配比，以及各种流加策略。
[0027] 所述放大到30L发酵罐，一次性添加前体氨基酸和 ATP的最适组合为谷氨酸30mmol/L,半胱氨酸30mmol/L，甘氨酸18mol/L，ATP 5mg/L。
[0028] 所述分阶段控制发酵罐的溶氧水平，包含的手段为调节转速和通气量中的一种或者两种。
[0029] 所述流加少量碳源，继续发酵20-24小时，其中少量碳源为如下的一种或几种的组合：含糖量29%的糖蜜（6 L），含糖量29%的葡萄糖（4 L），硫酸铵264 g和磷酸二氢铵40g。
[0030] 所述在喷雾干燥塔中，控制进风温度，为130-150℃。
[0031] 具体地，本领域技术人员可参考以下具体发酵过程进行发酵培养：
[0032] （1）菌株：
[0033] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCTCC:M2012215。
[0034] （2）培养基：
[0035] 每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母粉5g，琼脂20g，所述斜面培养基pH 5.8-6.2；
[0037] 每1L所述发酵罐水平上发酵培养基含有：水9L，酵母粉100g，所述发酵液pH5.5-6.0；
[0038] 流加发酵培养基：含糖量29%的糖蜜（6 L），含糖量29%的葡萄糖（4 L），硫酸铵264 g，磷酸二氢铵40 g；
[0039] （1）种子扩大培养：
[0040] 斜面种子活化12-16小时后接入装入种子培养基的三角瓶中培养，装液量25-30 mL，12-18小时即得一级种子；之后再按5-10%（10%为体积比）的接种量将一级种子接入相同发酵培养基培养12-18小时制备二级种子，培养温度28-32℃，转速180-200rpm/min；
[0041] （2）发酵具体包括以下步骤：
[0042] 将二级种子按5-10%的接种量接入发酵罐中，在全自动发酵罐中，至少发酵44h，发酵温度28-32℃，搅拌转速100-600rmp，通气量5-30L/min，在生物量达到一定时，一次性添加前体氨基酸，(谷氨酸30mmol/L,半胱氨酸30mmol/L,甘氨酸18mol/L，ATP 5mg/L)，调节转速和通气量，分阶段控制发酵罐的溶氧水平。并继续流加20mL/h-50mL/h碳源，得到还原型大于98%，胞内含量4%-4.5%的还原型谷胱甘肽。
[0043] 本发明涉及的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCTCC No.M2012215具有如下优点和显著的进步：
[0044] （1）酵母的胞内谷胱甘肽含量高达35-45mg/g，有效解决微生物中酵母合成产率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的问题，拓宽富含谷胱甘肽干酵母的应用范围。对面团改良效果好，解决了单独添加谷胱甘肽的改良面团存在的成本高及极易被氧化等问题，提高了产品附加价值。
[0045] （2）在摇瓶水平上发酵培养后的谷胱甘肽产量为175 mg/L-600 mg/L，在30 L发酵罐上采用变速流加发酵培养后的谷胱甘肽产量为1500 mg/L-2000 mg/L，在60立方发酵罐上采用变速流加发酵培养后的谷胱甘肽产量为1000 mg/L-2000 mg/L。
[0046] （3）发酵培养后的酵母无需进行谷胱甘肽的提取和纯化，还原型谷胱甘肽直接和酵母细胞一齐使用，通过细胞保护作用减少谷胱甘肽的氧化。由于不需要进行谷胱甘肽的提取和纯化，因此不存在谷胱甘肽的损失问题，产品的活性损失也小。
具体实施方式
[0047] 以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0048] 实施例一：菌种的选育
[0049] （1）菌株
[0050] 酿 酒 酵 母Saccharomyces cerevisiaeCICC1251，热 带 假 丝 酵 母Candida tropicalisCICC31709
[0051] （2）培养基
[0052] 每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂20g，所述斜面培养基pH自然；
[0053] 每1L所述种子培养基含有：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，所述斜面培养基pH自然；
[0054] 每1L所述摇瓶上发酵培养基含有：葡萄糖20g，酵母粉5g，(NH4)2SO47.5g， KH2PO43 g，MgSO4 0.15g。所述发酵培养基pH5.5-6.0；
[0055] 每1L所述基本培养基含有：葡萄糖 20g,(NH4)2SO4 5g，KH2PO4 1g，NaCl 0.1g，MgSO40.5g，CaCl20.1 g，酵母粉0.2g，琼脂20g，0.1MPa灭菌15min；
[0056] 每1L所述高渗基本培养基含有：基本培养基中加入蔗糖使其终浓度为170g/L；
[0057] 每1L所述选择培养基含有：基本培养基中以2%的可溶性淀粉为唯一碳源。
[0058] （3）实验中所用到的溶液
[0059] ①0.1mol/L柠檬酸缓冲液(CB)
[0060] 0.1mol/L 柠檬酸4.7 mL，0.1mol/L 柠檬酸钠15.3 mL混合，pH5.8。
[0061] ②脱壁预处理剂
[0062] 0.05mol/L EDTA溶液与0.1% β-巯基乙醇混合，用CB配制，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
[0063] ③酶液
[0064] 1% 蜗牛酶，1% 纤维素酶，均用CBK溶液配制，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
[0065] ④ Tris-HCl高渗缓冲液（CTC）
[0066] 0.5mol/L 蔗糖， 0.01mol/L（pH 7.4），0.05mol/L CaCl2。
[0067] ⑤ 促融剂（PTC）
[0068] PEG6000 30 g，溶于100mL CTC溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌
[0069] （4）种子培养
[0070] 斜面种子活化12-16小时后，接入装入25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中培养12-18小时，转速200rpm/min即得一级种子。
[0071] （5）发酵培养
[0072] 将一级种子接入25 mL/250mL摇瓶中，在28℃-30℃、转速180 rmp-200 rmp的条件下培养60 h。
[0073] （6）原生质体形成过程
[0074] 对Log酵母进行酶解前预处理：用EDTA加0.1%β-巯基乙醇悬浮菌体，30℃保温15min预处理，再加入1%蜗牛酶+1%纤维素酶复合酶处理60min，原生质体形成率为76.24%。对假丝酵母不进行预处理，直接加入1%蜗牛酶+1%纤维素酶复合酶处理90min去除细胞壁，原生质体形成率为91.67%。
[0075] （7）原生质体的制备与再生
[0076] 将待融合的菌株活化两次，活化后接入摇瓶培养基培养至对数生长期，收集对数7
生长期的细胞；将细胞的浓度调整为10 个/mL；将细胞悬浮于1 mL脱壁预处理液中，30℃振荡处理15 min，离心，收集细胞；用适当的酶液悬浮预处理过的细胞，30℃振荡处理40～
60 min，随时用显微镜观察原生质体的形成情况；原生质体形成率达到90%以上后，加入4 mLCTC溶液停止酶解，将离心管上下倒置两次，摇匀后在转速3000 rpm，离心时间5 min的条件下收集酶解后的细胞，将收集的细胞用2 mLCTC溶液悬浮；将酶解后的细胞悬液适当稀释后，涂布于高渗基本培养基平板；培养3~4天，记录菌落数。计算原生质体的再生率。
生长期的细胞；将细胞的浓度调整为10 个/mL；将细胞悬浮于1 mL脱壁预处理液中，30℃振荡处理15 min，离心，收集细胞；用适当的酶液悬浮预处理过的细胞，30℃振荡处理40～
60 min，随时用显微镜观察原生质体的形成情况；原生质体形成率达到90%以上后，加入4 mLCTC溶液停止酶解，将离心管上下倒置两次，摇匀后在转速3000 rpm，离心时间5 min的条件下收集酶解后的细胞，将收集的细胞用2 mLCTC溶液悬浮；将酶解后的细胞悬液适当稀释后，涂布于高渗基本培养基平板；培养3~4天，记录菌落数。计算原生质体的再生率。
[0077] （8）原生质体融合
[0078] 上述方法制得的原生质体，以1∶1的比例各取原生质体液0.1 mL混合后加入0.8mLCTC，离心去上清液；然后，加入2 mL促融剂PTC溶液，轻摇混合，30℃静置保温1h；接着离心，用液体高渗培养基洗涤两次，将沉淀再悬于其中；最后，取0.1 mL处理液于高渗基础培养基软琼脂（上层）4 mL中，摇匀迅速倒入底层为高渗基础培养基的平板上，30℃培养
4～5天。
4～5天。
[0079] （9）融合子的筛选
[0080] 将上述融合子接入到在淀粉选择平板上，经过两次淀粉选择平板的筛选，得到融合较好的菌株R2和R7。经过发酵试验，R2 GSH产量为67.93 mg/L,R7的GSH产量为76.59 mg/L。因此，选用R7作为下一步试验菌株。同时，对R7进行稳定性检验，经斜面连续传代10次，R7的GSH含量下降了5.89%，GSH产量下降7.73%，说明本试验获得的融合子R7有较好的遗传稳定性。
[0081] （10）诱变选育
[0082] 对融合菌株R7采用亚硝酸诱变，选用添加硫酸锌的平板筛选GSH高产突变株。将待诱变的菌悬液，稀释后涂布在7.5 mmol/L浓度的硫酸锌平板上。对菌株进行初筛和复筛，再经过发酵试验，其中突变株CCCG的GSH产量最高，为125.36 mg/L。经鉴定，为酿酒酵母。专利保藏编号：CCTCC:M2012215。将该菌株作为以后的试验菌株。
[0083] 实施例二: 在摇瓶水平上发酵培养
[0084] （1）菌株
[0085] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCCG，保藏号CCTCC:M2012215。
[0086] （2）培养基
[0087] 每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母膏 5g，琼脂20g，所述斜面培养基pH5.8-6.2；
[0088] 每1L所述种子培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母膏 5g，所述斜面培养基pH5.8-6.2；
[0089] 每1L所述摇瓶上发酵培养基含有：葡萄糖25.95g，酵母粉11.47g，硫酸铵10.16g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.2g，所述发酵培养基pH5.5-6.0；
[0090] （3）种子培养
[0091] 斜面种子活化12-16小时后，接入装入25mL种子培养基的250mL三角瓶中培养12-18小时，转速200rpm即得一级种子；
[0092] （4）发酵培养
[0093] 将一级种子接入25mL/250mL摇瓶中，在28℃-30℃、转速180rmp-200rmp的条件下培养50-60h。
[0094] （5）胞内谷胱甘肽的提取
[0095] 取一定体积的菌液于离心管中，5000rpm离心10min收集菌体，蒸馏水洗涤两次后，用蒸馏水悬浮，摇匀后放入冰箱冰冻过夜，将冰冻的菌体在95～100℃条件下水浴10min，取出后在冰水中速冷，5000rpm离心10min，上清液作为测试样品。
[0096] （6）细胞干重的测定
[0097] 一定的发酵液离心后用蒸馏水洗涤2次，得到的新鲜细胞在105℃烘干至恒重。
[0098] （7）谷胱甘肽含量的测定
[0099] 采用碘量法。
[0100] （8）结果：
[0101] 发酵时间：50-60小时；细胞干重：5-15 g/L；
[0102] 胞内谷胱甘肽含量：35-40 mg/g；谷胱甘肽产量：175 mg/L-600 mg/L；
[0103] 实施例三: 在30 L发酵罐上采用变速流加发酵培养
[0104] （1）菌株
[0105] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCCG，保藏号CCTCC:M2012215。
[0106] （2）培养基
[0107] 每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉5g，琼脂20g，所述斜面培养基pH 5.8-6.2；
[0108] 每1 L所述种子培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母粉 5g，所述斜面培养基pH 5.8-6.2；
[0109] 每1L所述摇瓶上发酵培养基含有：葡萄糖25.95g，酵母粉11.47g，硫酸铵10.16 g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.2g，所述发酵培养基pH5.5-6.0；
[0110] 每1L所述发酵罐水平上发酵培养基含有：水9L，酵母粉100g，所述发酵培养基pH5.5-6.0；
[0111] 流加发酵培养基：含糖量29%的糖蜜（6 L），含糖量29%的葡萄糖（4 L），硫酸铵264 g，磷酸二氢铵40 g；
[0112] （3）种子培养
[0113] 斜面种子活化12-16小时后，接入装入25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中培养12-18小时即得一级种子；之后再按10%（10%为体积比）的接种量将一级种子接入相同发酵培养基培养12-18小时制备二级种子，培养温度28-32 ℃，恒温培养振荡器，转速200rpm/min；
[0114] （4）发酵培养基
[0115] 变速流加发酵：将准备好的二级种子按10%的接种量接入装有9 L底水的全自动发酵罐中，发酵温度28-32 ℃，搅拌转速100-600 rmp，通气量5-30 L/min。通过控制碳源和氮源的流加速度（碳源流加速度10 mL/h-600 mL/h，氮源流加速度10 mL/h-50 mL/h），同时发酵液中酒精的含量控制在0.1%-0.5%（W/V），使菌体在较短时间内达到较高水平。在生物量达到一定时，一次性添加前体氨基酸，维持一定的转速和通气量，并流加20 mL/h-50 mL/h碳源到发酵结束。
[0116] （5）胞内谷胱甘肽的提取
[0117] 取一定体积的菌液于离心管中，5000 rpm离心10 min收集菌体，蒸馏水洗涤两次后，用蒸馏水悬浮，摇匀后放入冰箱冰冻过夜，将冰冻的菌体在95～100 ℃条件下水浴10 min，取出后在冰水中速冷，5000 rpm离心10 min，上清液作为测试样品。
[0118] （6）细胞干重的测定
[0119] 一定的发酵液离心后用蒸馏水洗涤2次，得到的新鲜细胞在105℃烘干至恒重。
[0120] （7）谷胱甘肽含量的测定
[0121] 采用碘量法。
[0122] （8）结果：
[0123] 发酵时间：44-50小时；细胞干重：40-50 g/L；
[0124] 胞内谷胱甘肽含量：35-40 mg/g；谷胱甘肽产量：1500 mg/L-2000 mg/L；
[0125] 实施例四:在60立方发酵罐上采用变速流加发酵培养
[0126] （1）菌株
[0127] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CCCG，保藏号CCTCC:M2012215。
[0128] （2）培养基
[0129] 每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖 20 g，蛋白胨 20 g，酵母粉 5 g，琼脂20 g，所述斜面培养基pH 5.8-6.2；
[0130] 每1L所述一级种子培养基含有：葡萄糖 20 g，蛋白胨 20 g，酵母粉 5 g，所述斜
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