技术领域
[0001] 本
发明涉及一种酿酒酵母及酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法。
背景技术
[0002] 氨基葡萄糖(Glucosamine，或2-amino-2-deoxy-D-glucose)，它的英文缩写为GlcN，它是一种取代后的化合物，氨基取代葡萄糖2号位C上的羟基，第一个确认结构的氨基单糖就是氨基葡萄糖，它是一种非常重要的功能性单糖。GlcN的分子式为C6H13O5N，分子量179.17g/mL。GlcN在很多有
机体中都发现过，含量比较多的包括细菌、丝状
真菌、酵母菌，甚至在
植物体内和动物体内都有发现。氨基葡萄糖是甲壳素的重要组成成分，也是壳聚糖的重要组成成分，还是糖蛋白的重要组成成分。研究还表明在蛋白聚糖中氨基葡萄糖也起着重要的作用，这些物质都可以由氨基葡萄糖通过一定的氨基化作用获得。另外，作为一种生理必须物质，在人体结缔组织中也有存在，而且是人体软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分。由于氨基葡萄糖用途十分广泛，市场前景广阔。
[0003] 1876年，氨基葡萄糖被第一次从甲壳素的
水解产物中分离出来，1939年，沃尔特·霍沃思确定了氨基葡萄糖的立体结构，从此，氨基葡萄糖被人们更好的认识和研究。目前，美国是氨基葡萄糖的最大消费国，中国随着收入水平及保健意识的提高，氨基葡萄糖的消费也呈逐年快速增长的趋势。
[0004] 氨基葡萄糖在医药工业方面的应用：
[0005] 氨基葡萄糖的
硫酸盐为
治疗抗
风湿性关节炎的
原料药，近年来，由于发现其具有吸收体内产生的自由基、抗衰老、促进减肥、抑菌以及能调节人体内分泌等多种生理功能，故广泛被用于
食品添加剂和保健食品的生产中。GlcN可能通过刺激软骨蛋白聚糖的
生物合成而对关节炎有特殊的疗效，此外，GlcN还可增加软骨特异性Ⅱ型胶原的合成，GlcN还具有护肝的作用。研究发现GlcN的另一种衍生物乙酰氨基葡萄糖GlcNAc可以诱导K562细胞向巨噬细胞的方向分化，在作用浓度和作用时间上与传统的药物相比有明显的优势，而且因其毒
副作用较小，因而很可能成为新型细胞分化诱导药物而应用于临床。
[0006] 氨基葡萄糖在食品工业方面的应用：
[0007] 由于GlcN对人体没有毒性，日本和美国均将其作为食品配料广泛使用。日本乳业组织自2004年10月就开始销售添加GlcN的乳饮料“GLUCOSAMINE POWER”(家庭装)，2005年卡尔皮公司又推出
[0008] 添加GlcN的绿茶饮料“FINESUPPORT GLUCOSAMINE”，其他如宝酒造的“氨基葡萄糖豆乳”，协同乳业、博佳、爱尔泰等的添加GlcN的柑桔饮料亦纷纷涌入市场。陈忻等研究了GlcN
盐酸盐的抗菌作用，结果发现，GlcN盐酸盐对供试食品中常见的细菌、霉菌、酵母菌均有明显的抑制作用，其中细菌最为敏感，而且随着GlcN盐酸盐浓度增加，其抑菌作用逐渐增强。说明GlcN在成为新型的天然食品
防腐剂方面具有广阔的前景。
[0010] GlcNAc是透明质酸的
单体，是生物体内多种重要多糖的基本组成单位，也是一种新型生化药品、药物中间体和高档化妆品的添加剂。它可增强人体免疫功能、治疗多种
炎症。GlcNAc在人体内是合成双歧因子和透明质酸的重要前体，与透明质酸相比，由于其是小分子量的单体，极易被
皮肤吸收，且应用于化妆品能提供营养、保湿和抗自由基，因而常被用于高档化妆品的生产，在化妆品中添加量一般为0.1％～5％。目前国内市场上已有多种含GlcNAc的护肤产品，最高添加量达4％，效果良好。
发明内容
[0011] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0012] 本发明还有一个目的是提供一种酿酒酵母及酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法，其对自制工程菌株
发酵工艺进行了优化，提高了氨基葡萄糖的产量。
[0013] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae H158-1C，所述酿酒酵母被保藏在中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11735，保藏时间为：2015年11月25日。
[0014] 一种利用酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：
[0015] 步骤一、
种子培养：将所述酿酒酵母接种在含有硫酸卡那霉素的斜面培养基上，在
温度30～37℃下，培养24～28h后，接种至种子培养基上，在温度30～37℃和转速1100～2000r/min下培养至OD600值＝2～3时，得到种子培养液；
[0016] 步骤二、种子发酵：将步骤二制备得到种植培养液接种至发酵培养基上，在温度35～40℃、转速为200～220r/min下发酵18～20h，得到发酵液；
[0017] 其中，接种至发酵培养基上的种子培养液的体积为发酵培养基体积的1％～5％；
[0018] 发酵培养基在接种前添加终浓度为70μg/mL的硫酸卡那霉素，残留控制在2.0％；
[0019] 当菌体的OD600＝0.6时，向发酵培养基中加入5g/L的乳糖；
[0020] 在种子发酵2～10h且菌体的OD600＝2～3时，向发酵培养基中开始指数流加葡萄糖，且控制细胞比生长速度为0.2h-1；
[0021] 在种子发酵中的溶
氧量调节策略为：在种子发酵0～2h、3～8、9～12和13～18h时，分别控制溶氧量为20％、30％、40％和30％，每次通气的通气量为10vvm，气体温度为35℃～37℃；
[0022] 步骤三、对步骤二中的制备得到发酵液提纯结晶，即得到氨基葡萄糖。
[0023] 优选的是，所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法中，所述步骤一中，斜面培养基包含：胰蛋白胨10～15g/L、酵母粉5～10g/L、NaCl 10～15g/L、琼脂粉20～25g/L和硫酸卡那霉素40～50mg/L；
[0024] 斜面培养基的pH值6.5～7.5，且在0.1Mpa灭菌25～30min。
[0025] 优选的是，所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法中，所述步骤一中，种子培养基包含：D-氨基葡萄糖盐酸盐50～60g/L、
碳酸
钙25～30g/L、
磷酸二氢
钾10～15g/L、七水合
硫酸镁15～20g/L、
硝酸钠l0～15g/L、酵母膏10～15g/L和玉米浆1～3ml/L；
[0026] 种子培养基的pH值为6.5～7.5，且在0.1Mpa灭菌25～30min。
[0027] 优选的是，所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法中，所述步骤二中，发酵培养基包括：葡萄糖50～90g/L、乳糖10～20g/L、碳酸钙10～15g/L、磷酸二氢钾15～20g/L、七水合硫酸镁5～7g/L、硝酸钠5～8g/L、酵母膏5～10g/L和玉米浆3～5ml/L；
[0028] 发酵培养基的pH值6.5～7.5，且在0.1Mpa灭菌25～30min。
[0029] 优选的是，所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法中，所述步骤二中，发酵培养基在接种种子培养液前添加终浓度为50～70μg/mL的硫酸卡那霉素，且硫酸卡那霉素的残留量为20μg/mL。
[0030] 优选的是，所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法中，所述步骤三具体为：
[0031] 将步骤二中制备得到的发酵液在转速为7500～8000rpm下离心15～20min，取上清液，在90～100℃下加热15～20min后，在转速在12000～13000rpm下离心20～25min，取上层清液，得到原液，
[0032] 用
硅藻土对原液脱色，采用温度30～35℃的硫酸铵为洗脱液，当硫酸铵溶液浓度为0.7～1.0mol/L时，停止洗脱，得到初始过滤液，初始过滤液采用苯乙烯系强酸性阳离子
树脂吸附过滤，进样流速为3.19BV/h，洗脱流速为3.8BV/h时，采用与初始滤液等体积的无水
乙醇洗脱，得到最终滤液，最终滤液在4℃下静置6～10h，抽滤，即得到氨基
葡萄糖酸晶体。
[0033] 本发明至少包括以下有益效果：第一、本发明为微生物发酵法制备氨基葡萄糖，是一种重要的氨基己糖，能够有效作用于软骨组织治疗风湿性关节炎，并被视为天然无害的食品及保健品配料，市场应用前景广阔；第二、本发明对自制工程菌株发酵工艺进行了优化，确定了通过对发酵过程实行乳糖流加策略及分阶段溶氧控制策略，显著提高氨基葡萄糖产量，氨基葡萄糖的胞内和胞外产量不低于134.7g/L，纯化的吸附率不低于95％，洗脱率不低于98％，氨基葡萄糖的纯度在98％以上，达到国内领先水平。
[0034] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解
附图说明
[0035] 图1为本发明所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的
流程图。
具体实施方式
[0036] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照
说明书文字能够据以实施。
[0037] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0039] 一种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae H158-1C，其分类命名为酿酒酵母，所述的酿酒酵母被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11735，保藏时间为：2015年11月25日；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0040] 实施例2、
[0041] 如图1所示，本发明提供一种利用实施例1中所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0042] 步骤一、种子培养：将所述酿酒酵母接种在含有硫酸卡那霉素的斜面培养基上，在温度30℃下，培养24h后，接种至种子培养基上，在温度为30℃和转速1100r/min下培养至OD600值＝2时，得到种子培养液；
[0043] 步骤二、种子发酵：将步骤二制备得到种植培养液接种至发酵培养基上，在温度35℃、转速为200r/min下发酵18h，
[0044] 其中，接种至发酵培养基上的种子培养液的体积为发酵培养基体积的1％；
[0045] 发酵培养基在接种前添加终浓度为70μg/mL的硫酸卡那霉素，残留控制在2.0％；
[0046] 当菌体的OD600＝0.6时，向发酵培养基中加入5g/L的乳糖；
[0047] 在种子发酵2h且菌体的OD600＝2时，向发酵培养基中开始指数流加葡萄糖，且控制细胞比生长速度为0.2h-1；
[0048] 在种子发酵中的溶氧量调节策略为：在种子发酵0～2h、3～8、9～12和13～18h时，分别控制溶氧量为20％、30％、40％和30％，每次通气的通气量为10vvm，气体温度为35℃；
[0049] 步骤三、对步骤二中的发酵液提纯结晶，即得到氨基葡萄糖。
[0050] 其中，
[0051] 步骤一中，斜面培养基包含：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉20g/L和硫酸卡那霉素40mg/L；斜面培养基的pH值6.5，且在0.1Mpa灭菌30min。
[0052] 步骤一中，种子培养基包含：D-氨基葡萄糖盐酸盐50g/L、碳酸钙25g/L、磷酸二氢钾10g/L、七水合硫酸镁15g/L、硝酸钠l0g/L、酵母膏10g/L和玉米浆1ml/L；种子培养基的pH值为6.5，且在0.1Mpa灭菌25min。
[0053] 步骤二中，发酵培养基包括：葡萄糖50g/L、乳糖10g/L、碳酸钙10g/L、磷酸二氢钾15g/L、七水合硫酸镁5g/L、硝酸钠5g/L、酵母膏5g/L和玉米浆3ml/L；发酵培养基的pH值
6.5，且在0.1Mpa灭菌25min。
[0054] 步骤二中，发酵培养基在接种种子培养液前添加50μg/mL的硫酸卡那霉素，且硫酸卡那霉素的残留量为20μg/mL。
[0055] 步骤三具体为：
[0056] 将种子发酵工艺中制备得到的发酵液在转速为7500rpm下离心15min去除细胞菌体，取上清液，在90℃下加热15min后，在转速为12000rpm下离心20min，去除上清液中的杂蛋白，取上层清液，得到原液；
[0057] 用
硅藻土对原液脱色，采用温度30℃的硫酸铵为洗脱液，当硫酸铵溶液浓度为0.7mol/L时，停止洗脱，得到初始过滤液，初始过滤液采用苯乙烯系强酸性阳离子树脂吸附过滤，进样流速为3.19BV/h，洗脱流速为3.8BV/h时，采用与初始滤液等体积的无水乙醇洗脱，得到最终滤液，最终滤液在4℃下静置6h，抽滤，即得到氨基葡萄糖酸晶体，氨基葡萄糖酸晶体的纯度在98％以上。
[0058] 实施例3、
[0059] 本发明提供一种利用实施例1中所述的酿酒酵母生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0060] 步骤一、种子培养：将所述酿酒酵母接种在含有硫酸卡那霉素的斜面培养基上，在温度37℃下，培养28h后，接种至种子培养基上，在温度为37℃和转速2000r/min下培养至OD600值＝3时，得到种子培养液；
[0061] 步骤二、种子发酵：将步骤二制备得到种植培养液接种至发酵培养基上，在温度40℃、转速为220r/min下发酵20h，
[0062] 其中，接种至发酵培养基上的种子培养液的体积为发酵培养基体积的5％；
[0063] 发酵培养基在接种前添加终浓度为70μg/mL的硫酸卡那霉素，残留控制在2.0％；
[0064] 当菌体的OD600＝0.6时，向发酵培养基中加入5g/L的乳糖；
[0065] 在种子发酵10h且菌体的OD600＝3时，向发酵培养基中开始指数流加葡萄糖，且控制细胞比生长速度为0.2h-1；
[0066] 在种子发酵中的溶氧量调节策略为：在种子发酵0～2h、3～8、9～12和13～18h时，分别控制溶氧量为20％、30％、40％和30％，每次通气的通气量为10vvm，气体温度为37℃；
[0067] 步骤三、对步骤二中的发酵液提纯结晶，即得到氨基葡萄糖。
[0068] 其中，
[0069] 步骤一中，斜面培养基包含胰蛋白胨15g/L、酵母粉10g/L、NaCl 15g/L、琼脂粉25g/L和硫酸卡那霉素50mg/L；斜面培养基的pH值7.5，且在0.1Mpa灭菌30min。
[0070] 步骤一中，种子培养基包含：D-氨基葡萄糖盐酸盐60g/L、碳酸钙30g/L、磷酸二氢钾15g/L、七水合硫酸镁20g/L、硝酸钠15g/L、酵母膏15g/L和玉米浆3ml/L；
[0071] 种子培养基的pH值为7.5，且在0.1Mpa灭菌30min。
[0072] 步骤二中，发酵培养基包括：葡萄糖90g/L、乳糖20g/L、碳酸钙15g/L、磷酸二氢钾20g/L、七水合硫酸镁7g/L、硝酸钠8g/L、酵母膏10g/L和玉米浆5ml/L。
[0073] 步骤二中，发酵培养基在接种种子培养液前添加50μg/mL的硫酸卡那霉素，且硫酸卡那霉素的残留量为20μg/mL。
[0074] 步骤三具体为：
[0075] 将种子发酵工艺中制备得到的发酵液在转速为8000rpm下离心20min去除细胞菌体，取上清液，在100℃下加热15min后，在转速为13000rpm下离心25min，去除上清液中的杂蛋白，取上层清液，得到原液；
[0076] 用硅藻土对原液脱色，采用温度35℃的硫酸铵为洗脱液，当硫酸铵溶液浓度为1.0mol/L时，停止洗脱，得到初始过滤液，初始过滤液采用苯乙烯系强酸性阳离子树脂吸附过滤，进样流速为3.19BV/h，洗脱流速为3.8BV/h时，采用与初始滤液等体积的无水乙醇洗脱，得到最终滤液，最终滤液在4℃下静置10h，抽滤，即得到氨基葡萄糖酸晶体；氨基葡萄糖酸晶体的纯度在98％以上。
[0077] 实施例4、
[0078] 一、筛选酿酒酵母
[0079] 发酵菌株：将酿酒酵母在新鲜的平板培养基上活化，取一环菌接入10ml的发酵培养基30℃，转速为120rm条件下培养，每24h取样，采用纸层析检测D-氨基葡萄糖的消耗和D-氨基葡萄糖酸的生成情况，以筛选出能有效氧化底物并积累氨基葡萄糖酸的目的菌株，经多次重复筛选后，氨基葡萄糖总产量在发酵24h±4h达到25g±1/L，命名为酿酒酵母基因工程菌(Saccharomyces Cerevisiae)H158-1C(菌株保藏编号：CGMCC No：11735)。
[0080] 二、制备氨基葡萄糖
[0081] 种子培养：在超净
工作台无菌条件下，用接种环从保藏的构建的酿酒酵母158-1C的斜面试管中挑取一环，在含有硫酸卡那霉素的斜面培养基表面划线，置于35～37℃恒温
培养箱中倒置培养24～28h，种子培养采用250mL的三
角瓶，装入50mL的种子培养基，将酿酒酵母挑取到三角瓶中，35℃，1600r/min，培养11h，OD600值＝3时，得到种子培养液，取出备用。
[0082] 种子发酵：种子培养液按1％～2％(v/v)的接种量接至500mL三角瓶中(含50mL发酵培养基)，于37℃，210r/min，当菌体OD600达到0.6时，加入5g/L的乳糖，发酵培养基使用前添加终浓度为70μg/mL的硫酸卡那霉素，残留控制在2.0％，培养20h。葡萄糖流加方式：0～2h，不流加葡萄糖；2～10h且OD600＝2.5左右开始指数流加葡萄糖，控制细胞比生长速率μset为0.2h-1。溶氧调节策略：0～2h，DO(溶氧量)值20％；3～8h，DO值30％；9～12h，DO值40％；13～18h，DO值30％，发酵过程中控制通气量为1.0vvm，温度36℃，恒速流加。
[0083] 提纯结晶：将种子发酵工艺中制备得到的发酵液在转速为7700rpm下离心18min去除细胞菌体，取上清液，在95℃下加热18min后，在转速为12500rpm下离心23min，去除上清液中的杂蛋白，取上层清液，得到原液，
[0084] 用硅藻土对原液脱色，采用温度33℃的硫酸铵为洗脱液，当硫酸铵溶液浓度为0.8mol/L时，停止洗脱，得到初始过滤液，初始过滤液采用苯乙烯系强酸性阳离子树脂吸附过滤，进样流速为3.19BV/h，洗脱流速为3.8BV/h时，采用与初始滤液等体积的无水乙醇洗脱，得到最终滤液，最终滤液在4℃下静置8h，抽滤，即得到氨基葡萄糖酸晶体。吸附率＝
95.43％，洗脱率＝98.47％；氨基葡萄糖酸晶体的纯度在98％以上。
[0085] 其中，斜面培养基包含：胰蛋白胨13g/L、酵母粉7g/L、NaCl13g/L、琼脂粉23g/L和硫酸卡那霉素45mg/L；斜面培养基的pH值7，且在0.1Mpa灭菌30min。
[0086] 种子培养基包含：D-氨基葡萄糖盐酸盐55g/L、碳酸钙27g/L、磷酸二氢钾13g/L、七水合硫酸镁17g/L、硝酸钠13g/L、酵母膏13g/L和玉米浆2ml/L；种子培养基的pH值为7，且在0.1Mpa灭菌28min。
[0087] 发酵培养基包括：葡萄糖70g/L、乳糖15g/L、碳酸钙13g/L、磷酸二氢钾18g/L、七水合硫酸镁6g/L、硝酸钠7g/L、酵母膏8g/L和玉米浆4ml/L；发酵培养基的pH值7，且在0.1Mpa灭菌28min。
[0088] 检测：
[0089] 胞内GlcN的检测方法：取发酵液5.0mL加入5mL离心管中，5000r/min离心8min，弃去上清，菌体用无菌水洗3次，用10mL 6mol/L盐酸于100℃水浴处理3h，用10mol/L的NaOH中和至pH7.0，
冰上冷却至室温，定容至50mL，取0.5mL加入乙酰丙
酮试剂1.0mL，90℃水浴处理1h，冷却至室温，慢慢加入96％(v/v)乙醇10mL，然后加入DMAB(二甲胺基甲
硼烷)试剂1.0mL(DMAB试剂：称取1.6g DMAB溶于30m L浓盐酸和30mL96％的乙醇中)，混合均匀。混合后室温放置1h，530nm处比色，根据标准曲线计算胞内GlcN产量。
[0090] 胞外GlcN的检测方法：取发酵液5.0mL加入5mL离心管中，8000r/min离心8min，取0.5mL离心上清液加入乙酰丙酮试剂1.0mL，90℃水浴处理1h，冷却至室温，慢慢加入96％(v/v)乙醇10mL，然后加入DMAB试剂1.0mL，混合均匀。混合后室温放置1h，530nm处比色，根据标准曲线计算胞外GlcN产量。
[0091] 胞外氨基葡萄糖产量＝7.21±0.08g/L，胞内氨基葡萄糖产量＝128.51±0.09g/L。
[0092] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的
修改，因此在不背离
权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
