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一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法

阅读:333发布:2020-05-12

专利汇可以提供一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种核苷磷 酸化 酶的 发酵 工艺及其应用方法,它是核苷 磷酸 化酶的 种子 接种到培养基上,经过发酵培养,制得含有核苷磷酸化酶的发酵液;培养基包 碳 源、氮源、 硫酸 铵、磷酸二氢 钾 、磷酸氢二铵、 硫酸镁 、 柠檬酸 和消泡剂,在发酵培养过程中控制好 温度 为、空气流量、罐压、溶 氧 水 平、pH值和发酵周期。它的应用方法是将核苷磷酸化酶加入到含有胞苷、肌苷、 鸟 苷和腺苷的一种或多种的底物水溶液或者发酵液中,控制好底物浓度、核苷磷酸化酶加入量、转化温度、pH值和转化时间。该工艺技术控制简易,容易工业化放大,且发酵终点 生物 量大;转化胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷效率高。,下面是一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法专利的具体信息内容。

1.一种核苷磷酸化酶的发酵工艺,它是核苷磷酸化酶的种子接种到培养基上,经过发酵培养,制得含有核苷磷酸化酶的发酵液;其特征在于:所述的培养基包含如下组分:
5-30g/L,氮源5-35g/L,硫酸铵0.5-1.5g/L,磷酸二氢2-20g/L,磷酸氢二铵2-20g/L,硫酸镁0.5-1.5g/L,柠檬酸0.2-1.0g/L,消泡剂0.1-0.2ml/L。
2.根据权利要求1所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺,其特征在于:所述的碳源是指葡萄糖、甘油、果糖中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺,其特征在于:所述的氮源是指大豆蛋白胨、酵母粉、玉米浆、黄豆粉的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺,其特征在于:所述的酵母粉是指啤酒或者面包酵母粉。
5.根据权利要求4所述的核苷磷酸化酶的发酵工艺,其特征在于:在核苷磷酸化酶的发酵培养过程中,发酵温度为35-39℃,空气流量0.5-1VVM,罐压0.03-0.05MPa,溶平10-
40%,pH值6.0-7.5,发酵周期20-35小时。
6.权利要求1至5任意一项所述的工艺制备的核苷磷酸化酶在转化胞苷、肌苷、苷和腺苷中的应用方法,它是将核苷磷酸化酶加入到含有胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷的一种或多种的底物水溶液或者发酵液中,底物浓度为30-200g/L,核苷磷酸化酶相对底物加入量为
0.25-2.5ml/g,转化温度35-39℃,pH值6.0-7.0,转化时间1-6小时。

说明书全文

一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药技术领域,尤其是一种核苷磷酸化酶的发酵工艺及其应用方法。

背景技术

[0002] 核苷磷酸化酶,是核苷补救代谢途径中的关键酶,能够可逆地催化嘌呤核苷、嘧啶核苷磷酸化的酶,属于N-解和转移酶家族,广泛存在于真核或者原核细胞中。
[0003] 随着全球滋病感染群体日益增多,作为“鸡尾酒”疗法中的拉米夫定、替诺福韦需求量急剧增加,作为拉米夫定、替诺福韦的关键中间体的胞嘧啶和腺嘌呤,开发廉价、大规模生产这两个游离基的工艺成为关注的焦点。传统的化学合成法,工艺路线长、有机溶剂使用量大,存在着生产成本高、安全险大的缺点。生物酶法催化核苷生产游离碱基,是一种绿色、低成本的生产工艺,但目前这一类的技术报道都停留在实验室阶段,同时存在着底物浓度低、催化效率慢的缺点。
[0004] 本发明通过对核苷磷酸化酶发酵配方、工艺控制进行研究,获得高生物量的核苷磷酸化酶发酵液,并通过研究其转化条件,解决上述技术难题。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种核苷磷酸化酶的发酵工艺,该工艺技术控制简易,容易工业化放大,且发酵终点生物量大。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种核苷磷酸化酶在转化胞苷、肌苷、苷和腺苷中的应用方法,该方法转化率高。
[0007] 本发明的技术方案是这样实现的:
[0008] 一种核苷磷酸化酶的发酵工艺,它是核苷磷酸化酶的种子接种到培养基上,经过发酵培养,制得含有核苷磷酸化酶的发酵液;其特征在于:
[0009] 所述的培养基包含如下组分:源5-30g/L,氮源5-35g/L,硫酸铵0.5-1.5g/L,磷酸二氢2-20g/L,磷酸氢二铵2-20g/L,硫酸镁0.5-1.5g/L,柠檬酸0.2-1.0g/L,消泡剂0.1-0.2ml/L。
[0010] 进一步,所述的碳源是指葡萄糖、甘油、果糖中的一种或多种。
[0011] 进一步,所述的氮源是指大豆蛋白胨、酵母粉、玉米浆、黄豆粉的一种或多种。
[0012] 进一步,所述的酵母粉是指啤酒或者面包酵母粉。
[0013] 进一步,在核苷磷酸化酶的发酵培养过程中,发酵温度为35-39℃,空气流量0.5-1VVM,罐压0.03-0.05MPa,溶水平10-40%,pH值6.0-7.5,发酵周期20-35小时。
[0014] 上述工艺方法制备的核苷磷酸化酶在转化胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷中的应用方法,它是将核苷磷酸化酶加入到含有胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷的一种或多种的底物水溶液或者发酵液中,底物浓度为30-200g/L(底物水溶液中含有的胞苷、肌苷、鸟苷和腺苷合计浓度),核苷磷酸化酶相对底物加入量为0.25-2.5ml/g,转化温度35-39℃,pH值6.0-7.0,转化时间1-6小时。
[0015] 本发明和现有技术相比的优点为:
[0016] (1)发酵配方中无特殊来源的培养基,且原料价格低廉。
[0017] (2)发酵工艺控制简易,容易工业化放大,且发酵终点生物量大。
[0018] (3)由于发酵终点生物量大,在转化过程中底物浓度高,加入酶的比例低,且转化时间短。

具体实施方式

[0019] 为使本发明的技术方案更加清楚,下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
[0020] 实施例1:将核苷磷酸化酶的种子接种到如下培养基中,葡萄糖10g/L,大豆蛋白胨5g/L,黄豆粉10g/L,玉米浆10g/L,硫酸铵0.8g/L,磷酸二氢钾10g/L,磷酸氢二铵5g/L,硫酸镁0.5g/L,柠檬酸0.5g/L,消泡剂0.15ml/L,在温度37℃,空气流量:0-18小时0.8VVM,18-28小时0.6VVM,罐压0.04MPa,溶氧水平10-20%,pH6.5,培养28小时发酵结束。测得菌体生物量75g/L。
[0021] 实施例2:将核苷磷酸化酶的种子接种到如下培养基中,葡萄糖5g/L,甘油5g/L,酵母粉10g/L,黄豆粉5g/L,玉米浆20g/L,硫酸铵0.8g/L,磷酸二氢钾10g/L,磷酸氢二铵5g/L,硫酸镁0.5g/L,柠檬酸0.5g/L,消泡剂0.20ml/L,在温度39℃,空气流量:0-16小时0.8VVM,16-28小时0.6VVM,罐压0.04MPa,溶氧水平15-25%,pH6.2,培养28小时发酵结束。测得菌体生物量88g/L。
[0022] 实施例3:将核苷磷酸化酶的种子接种到如下培养基中,果糖5g/L,甘油10g/L,酵母粉10g/L,大豆蛋白胨5g/L,玉米浆15g/L,硫酸铵1.0g/L,磷酸二氢钾5g/L,磷酸氢二铵15g/L,硫酸镁1.0g/L,柠檬酸1.0g/L,消泡剂0.20ml/L,在温度35℃,空气流量:0-10小时
0.6VVM,10-25小时0.8VVM,25-32小时1.0VVM,罐压0.04MPa,溶氧水平10-25%,pH6.8,培养
32小时发酵结束。测得菌体生物量105g/L。
[0023] 实施例4:取例1中的酶发酵液200ml,加入到胞苷浓度50g/L、鸟苷浓度100g/L的1L水溶液中,调节pH至6.5,在37℃转化4小时,取样进HPLC检测转化液各组分纯度,胞苷0.13%,鸟苷纯度0.13%,两种底物的转化率超过99.5%。
[0024] 实施例5:取例1中的酶发酵液100ml,加入到腺苷浓度70g/L、肌苷浓度100g/L的1L水溶液中,调节pH至6.5,在37℃转化5小时,取样进HPLC检测转化液各组分纯度,腺苷0.22%,肌苷纯度0.05%,两种底物的转化率超过99.2%。
[0025] 实施例6:取例2中的酶发酵液150ml,加入到胞苷浓度100g/L、腺苷浓度100g/L的1L水溶液中,调节pH至6.2,在39℃转化3.5小时,取样进HPLC检测转化液各组分纯度,胞苷
0.22%,腺苷纯度0.11%,两种底物的转化率超过99.3%。
[0026] 实施例7:取例3中的酶发酵液50ml,加入到腺苷浓度50g/L、鸟苷浓度100g/L的1L水溶液中,调节pH至6.8,在35℃转化3小时,取样进HPLC检测转化液各组分纯度,腺苷0.08%,鸟苷纯度0.10%,两种底物的转化率超过99.5%。
[0027] 实施例8:取例3中的酶发酵液150ml,加入到肌苷发酵液88g/L、鸟苷发酵液47g/L的1L混合液中,调节pH至6.8,在35℃转化5小时,取样进HPLC检测转化液各组分纯度,肌苷0.18%,鸟苷纯度0.11%,两种底物的转化率超过99.5%。
[0028] 实施例9:取例2中的酶发酵液150ml,加入到鸟苷发酵液38g/L、腺苷发酵液41g/L的1L混合液中,调节pH至6.2,在39℃转化4.5小时,取样进HPLC检测转化液各组分纯度,鸟苷0.27%,腺苷纯度0.16%,两种底物的转化率超过99.3%。
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