技术领域
[0001] 本
发明涉及一种诱导成纤维细胞为软骨细胞样细胞的方法，属于细胞
生物学技术和再生医学领域。
背景技术
[0002] 软骨组织（Cartilage tissue）是一种富含蛋白多糖、胶原和透明质酸等物质的组织，由软骨细胞和软骨基质构成，在体内主要起
支撑和减少摩擦的作用。但软骨组织缺乏血管，因此，软骨组织一旦受到损伤便很难修复，即便是微小的软骨组织损伤，也很难自然修复。
[0003] 目前，临床上用于软骨组织损伤修复的方法主要有软骨和软骨下骨去除、微骨折和软骨下骨钻孔、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植、软骨或骨膜移植等（刘效仿，等. 中华创伤骨科杂志，2014,16(6):537-539）。这些方法在一定程度上均能够对软骨组织损伤进行修复，但均存在明显缺点，如微骨折和软骨下骨钻孔方法能够使干细胞到达损伤部位，但因局部环境和机械应
力不同，干细胞很难向软骨细胞分化；自体骨软骨移植安全、有效，但会给患者带来新的创伤；异体骨软骨移植避免了自体骨软骨移植给患者带来的新的创伤，但存在供体来源限制、免疫排斥反应和
疾病传播
风险等。
[0004] 软骨组织工程技术的发展为软骨组织损伤的
治疗提供了一种新的思路和策略（Vacanti CA, et al., Plast Reconstr Surg, 1991, 88(5): 753-759; Cao Y, et al., Transplant Proc, 1994, 26(6): 3390-3392）。在软骨组织工程中，
种子细胞是其最基本的要素之一。目前，用于软骨组织工程的细胞主要有自体或异体软骨细胞、基因修饰细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞等。自体软骨细胞移植不存在免疫排斥反应，无需诱导分化培养即可直接使用，是最佳的软骨组织工程种子细胞，但取材受限，
细胞增殖能力低，体外培养易于失去原有表型（Marlovits S, et al., J Bone Joint Surg, 2004, 86(5):286-295）；同种异体软骨细胞是自体软骨细胞移植较好的替代细胞，避免了自体软骨细胞采集造成的新的创伤，但供体来源受限，存在疾病传播风险；基因修饰细胞可通过基因工程技术将细胞因子基因导入软骨细胞内，使其在软骨损伤部位表达细胞因子，促进软骨损伤修复（Sellers RS, et al., J Bone Joint Surg, 2002, 79(6):1452-1463），但基因导入可能存在潜在安全风险；胚胎干细胞的分化潜能最为全面，但其免疫原性也最差，在体内易形成畸胎瘤，且涉及严重的伦理争议；间充质干细胞的组织分布虽较为广泛，但其数量比例较低以及分化能力常受限制（Covas D, et al., Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2003, 36(9): 1179-1183; Kestendjieva S, et al., Cell biology international, 2008, 32(7): 724-732; Yamazaki H, et al., Stem Cells,
2007, 25(1): 78-87）。
[0005] 重编程技术以及谱系重编程技术（Lineage reprogramming）的发展为软骨细胞的来源开辟了新的途径。所谓重编程技术是将成熟的成
体细胞先转变为诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells, iPSCs），然后再进一步分化为其它类型的细胞，而谱系重编程技术则是不经过多能干细胞阶段，直接将成体细胞直接转分化为另一类型的细胞。目前，科学家已利用诱导多能干细胞分化出了骨和软骨组织（Hong SG, et al., Cell Reports, 2014 , 7 (4) :1298-1309），但是，目前重编程和谱系重编程技术最为有效的方法是基于载体的转录因子介导方法，由于该方法涉及基因导入，所以存在潜在的安全隐患，因此在临床应用上需严格限制。
[0006] 综合以上分析，软骨组织损伤修复仍存在诸多问题，特别是用于损伤修复的种子细胞来源问题，仍需寻找一种获得方法相对简单、安全性相对较好的成体细胞分化为软骨细胞的方法。基于此，本发明尝试建立了一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞为软骨细胞样细胞的方法（鉴于学术严谨性，诱导的软骨细胞和正常软骨细胞在表观遗传模式方面可能不完全相同，因此，本发明
专利将诱导后阿利新蓝阳性
染色的细胞称为软骨细胞样细胞）。本发明方法所有步骤均不涉及基因导入操作，产生的软骨细胞样细胞安全性较好，实验操作相对简单，实验的重复性也较好。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于针对现有软骨组织工程中软骨细胞来源及分化诱导方法中存在的问题，发明了一种实验操作相对简单、实验重复性相对较好、产生的软骨细胞样细胞安全性相对较好的、利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞为软骨细胞样细胞的方法。
[0008] 本发明所提供的诱导成纤维细胞为软骨细胞样细胞的方法包括以下步骤。
[0009] （1）诱导剂的制备：诱导剂为鲫鱼卵母细胞提取物，优选卵黄充满时相时期的鱼卵，在无菌和低温条件下，取出鱼卵后进行
研磨、过滤和蛋白浓度测定，制备出用于诱导成纤维细胞的鱼卵母细胞提取物。
[0010] （2）成纤维细胞的制备：无菌条件下将人或动物的
皮肤组织充分剪碎，在含有
氨苄青霉素和
链霉素的DMEM培养基中进行原代和传代培养，获得用于诱导的成纤维细胞。
[0011] （3）成纤维细胞的诱导：利用所述步骤（1）中制备的诱导剂对所述步骤（2）中制备的成纤维细胞进行诱导，使成纤维细胞表观重编程为诱导多能干细胞。
[0012] （4）诱导多能干细胞的鉴定：利用免疫组织化学方法，根据Sox2、Nanog和Oct4/3基因表达情况对成纤维细胞的诱导情况进行鉴定。
[0013] （5）诱导多能干细胞向软骨细胞样细胞的分化诱导：根据所述步骤（4）中诱导多能干细胞的鉴定结果，将所述步骤（3）中获得的诱导多能干细胞在成软骨细胞诱导培养基中进行定向诱导。
[0014] （6）软骨细胞样细胞的鉴定：利用阿利新蓝染色方法和HE染色方法鉴定所述步骤（5）中诱导多能干细胞向软骨细胞样细胞的分化情况。
[0015] 所述步骤（1）中制备的鱼卵母细胞提取液储存浓度为10mg/ml，储存条件为4℃。
[0016] 所述步骤（2）中用于培养成纤维细胞的培养基包含100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml的链霉素。
[0017] 所述步骤（3）中用于成纤维细胞诱导的鱼卵母细胞提取物终浓度为10 20μg/ml，~用于诱导的成纤维细胞为培养的第四代人或动物的成纤维细胞，成纤维细胞在添加鱼卵母细胞提取物的培养基中的诱导培养时间为72小时。
[0018] 所述步骤（4）中诱导多能干细胞的鉴定采用人抗Sox2、Nanog和Oct4/3
抗体。
[0019] 所述步骤（5）中成软骨细胞诱导培养基组份包括：高糖DMEM
基础培养基、10nM地塞米松（Dex）、100mg/ml丙
酮酸钠（Sodium pyruvate）、10ng/ml TGF-β3、50mg/ml
抗坏血酸（Ascorbic acid）、40mg/ml脯氨酸（Proline）和ITS添加物；ITS添加物组份为：终浓度分别为6.25mg/ml
牛胰岛素（Bovine insulin）、6.25mg/ml转
铁蛋白（Transferrin）、6.25mg/ml硒酸（Selenous acid）、5.33mg/ml亚油酸（Linoleic acid）、1.25mg/ml牛血清
白蛋白（Bovine serum albumin）。诱导多能干细胞在成软骨细胞诱导培养基中的诱导培养时间为21天，每3天更换一次培养基。
[0020] 所述步骤（6）中软骨细胞样细胞鉴定使用的阿利新蓝染液pH值为1.0。
[0021] 本发明的实质性特点和显著进步在于，本发明提供了一种非转基因介导的获得软骨细胞样细胞的方法，利用本方法可获得安全性相对较好的软骨细胞样细胞。本发明方法的另一显著特点在于本发明的方法不涉及载体构建和转基因操作，实验操作相对简单，实验设备和技术要求不高，在软骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
[0022] 图1是培养的人成纤维细胞。
[0023] 图2是诱导多能干细胞的Sox2、Nanog和Oct4/3免疫组化染色图。A图为Sox2染色图；B图为Nanog染色图；C图为Oct4/3染色图；D图为对照。
[0024] 图3是诱导多能干细胞在成软骨细胞诱导培养基中诱导培养后经阿利新蓝染色后的结果图。
[0025] 图4是诱导多能干细胞在成软骨细胞诱导培养基中诱导培养后经HE染色后的结果图。
具体实施方式
[0026] 下面结合附图和
实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例仅为了便于更好理解本发明而不局限于本发明范围。
[0027] 实施例1。
[0028] 诱导剂的制备。
[0029] 本实施例诱导剂用于成纤维细胞的重编程，诱导剂为鲫鱼鱼卵母细胞提取物，鲫鱼鱼卵优选卵黄充满时相时期，其制备方法为。
[0030] （1）将鲫鱼完全浸没于75％的酒精中浸泡15～20分钟，充分进行消毒，最大限度防止细菌等的污染。
[0031] （2）在
通风橱中以无菌的条件下取出鱼卵，然后置入预冷的研钵中，将研钵置于
冰上进行充分研磨。
[0032] （3）研磨完成后，加入预冷的生理盐
水，4℃条件下1000rpm离心10min，然后4℃条件下3000rpm离心10min，取上清液。
[0033] （4）使用0.22微米孔滤器对所述步骤（3）中获得的上清液进行过滤，滤液为制备的鱼卵母细胞提取物，利用考
马斯亮蓝法测定制备的鱼卵母细胞提取物的蛋白浓度。
[0034] （5）根据所述步骤（4）中利用考马斯亮蓝法测得的鱼卵母细胞提取物的蛋白浓度，用预冷的DMEM/F12培养基稀释成10mg/ml的鱼卵母细胞提取物储存液，4℃保存备用。
[0035] 实施例2。
[0036] 人皮肤成纤维细胞的制备。
[0037] 本实施例成纤维细胞来源于年龄20-25周岁、健康男性的包皮组织，其制备方法包括如下步骤。
[0038] （1）人皮肤组织的采集：选择年龄20-25周岁、健康男性的包皮组织，在无菌条件下剪取约1×1cm2备用。包皮组织由解放军昆明总医院泌尿外科提供，包皮组织使用经过了解放军昆明总医院医学伦理委员会的批准，包皮组织的采集和使用患者均知情同意。
[0039] （2）人皮肤成纤维细胞的制备：将所述步骤（1）中采集的皮肤组织用生理盐水反复冲洗后置于含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml
硫酸链霉素的1×PBS溶液中冲洗三次，剪弃脂肪和结缔组织，然后将皮肤组织剪碎成0.5 1mm3大小的组织
块，加入含有200U/ml胶原~酶、300U/ml透明质酸酶的DMEM培养基，置于4℃条件下过夜，然后按1:1的比例加入含有
0.25%胰酶和0.02%EDTA的1×PBS消化液，置于37℃、180rpm的空气摇床中孵育20min，孵育完成后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基10ml，以终止反应；1000rpm离心10min后弃上清、收集细胞，用DMEM培养基清洗2次后，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基调整细胞数量为每毫升约2×105个细胞接种于六孔培养板中，将细胞置于37℃、5%CO2、 90%湿度条件下培养，每2天更换一次培养基。通过鉴定、培养和传代后的成纤维细胞及形态特征如附图1所示，由附图1可知，通过传代培养，成纤维细胞聚集在一起，呈梭形排列。
[0040] 实施例3。
[0041] 人皮肤成纤维细胞的鱼卵母细胞提取物诱导。
[0042] 用所述实施例1中制备的诱导剂诱导所述实施例2中制备的人皮肤成纤维细胞，使人皮肤成纤维细胞在鱼卵母细胞提取物的诱导下表观重编程为诱导多能干细胞，其方法包括如下步骤。
[0043] （1） 成纤维细胞的诱导：当所述实施例2中制备的人皮肤成纤维细胞传代至第四代、且成纤维细胞生长至80%细胞融合时，加入蛋白浓度为10mg/ml的鱼卵母细胞提取液进行诱导培养72小时，使成纤维细胞表观重编程为诱导多能干细胞，诱导使用的鱼卵母细胞提取物终浓度为10 20ug/ml。~
[0044] （2）诱导多能干细胞的鉴定：当所述步骤（1）完成后即完成人皮肤成纤维细胞的表观重编程，免疫组织化学方法用来鉴定重编程细胞Sox2、Nanog和Oct4/3三个基因的表达情况。Sox2、Nanog和Oct4/3三个基因表达情况如附图2所示，由附图2所示，这三个基因在重编程细胞中均呈阳性表达，且细胞形态发生变化，呈现梭形、三
角形、多角形等形态特征，细胞核较大，呈扁圆形。
[0045] 以上说明，人皮肤成纤维细胞经鱼卵母细胞提取物诱导后呈现了干细胞的基本特征，即人皮肤成纤维细胞在鱼卵母细胞提取物的诱导下重编程为了诱导多能干细胞，该细胞具有向其它类型细胞分化的潜能。
[0046] 实施例4。
[0047] 诱导多能干细胞向软骨细胞样细胞的分化。
[0048] 诱导多能干细胞向软骨细胞样细胞的分化包括以下步骤。
[0049] （1）诱导多能干细胞向软骨细胞样细胞的定向诱导：将所述实施例3中诱导产生的诱导多能干细胞5×105个置于六孔培养板中，加入成软骨细胞诱导培养基，在95%湿度、37℃、5%CO2条件下培养21天，每3天更换一次培养基，使诱导多能干细胞向软骨细胞样细胞分化。成软骨诱导培养基组份包括：高糖DMEM基础培养基、10nM地塞米松（Dex）、100mg/ml
丙酮酸钠（Sodium pyruvate）、10ng/ml TGF-β3、50mg/ml抗坏血酸（Ascorbic acid）、40mg/ml脯氨酸（Proline）和ITS添加物；ITS添加物组份为：终浓度分别为6.25mg/ml牛胰岛素（Bovine insulin）、6.25mg/ml转铁蛋白（Transferrin）、6.25mg/ml硒酸（Selenous acid）、5.33mg/ml亚油酸（Linoleic acid）、1.25mg/ml牛血清白蛋白（Bovine serum albumin）。
[0050] （2）诱导细胞的鉴定：将所述步骤（1）中诱导好的细胞加入2ml、4%多聚甲
醛固定30min，固定完成后，用
石蜡进行包埋，包埋完成后进行脱蜡和脱
水处理，然后进行阿利新蓝染色和HE染色。
[0051] 阿利新蓝染色方法：将石蜡包埋的组织进行脱蜡和脱水处理后，加入pH值为1.0的阿利新蓝染液，孵育30min后用流水冲洗5min，然后用蒸馏水冲洗后置于
显微镜下观察阿利新蓝的染色情况。
[0052] HE染色方法：采用常规HE染色方法进行，将石蜡包埋的组织进行脱蜡和脱水处理后使用苏木精和伊红染料分别染色，使用酒精脱水、二
甲苯透明、树胶封固后置于显微镜下观察HE染色情况。
[0053] 阿利新蓝和HE染色结果分别如附图3和附图4所示，由附图3可见，诱导细胞可被阿利新蓝染成蓝色，说明诱导细胞能够分泌酸性粘多糖，具有软骨组织的成份特征；由附图4可见，HE染色结果可见大量的软骨细胞样细胞。
[0054] 通过以上实施例可以说明，利用本发明的方法可以将成纤维细胞诱导为软骨细胞样细胞。
