猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
阅读：590发布：2020-05-08
专利汇可以提供猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒 疫苗 及其制备方法。本发明采用细胞连续传代的方法及细胞悬浮培养技术提供了一种免疫保护率高、 稳定性 好、产量高、安全可靠的用于紧急 预防 接种的猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，为PEDV和PDCoV的防控提供有效手段。，下面是猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株，其特征在于，保藏号为CCTCC NO:V202007。
2.猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株，其特征在于，保藏号为CCTCC NO:V202008。
3.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株和/或权利要求2所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株在疫苗制备中的应用。
4.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株和/或权利要求2所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株以及药学上可接受的载体。
5.猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，其特征在于，所述二联弱毒疫苗是将权利要求1所述猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株、权利要求2所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株分别接种至易感细胞进行培养，收获的病毒液按比例混合后，加入冻干保护剂混匀，然后冷冻干燥得到的。
6.根据权利要求5所述的二联弱毒疫苗，其特征在于，收获的猪流行性腹泻病毒KQ2018
6
F120株的病毒液、猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株的病毒液病毒滴度不低于10 TCID50/
0.1mL；
优选地，两种病毒液按等体积混合。
7.根据权利要求5或6所述的二联弱毒疫苗，其特征在于，所述冻干保护剂为明胶和蔗糖；
优选地，冻干保护剂由明胶和蔗糖加水配制而成，其中明胶8g/L，蔗糖48g/L。
8.权利要求5-7任一项所述二联弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株、猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株分别接种培养好的ST细胞，继续培养，待细胞病变达80％以上时收获病毒，取自然沉淀的病毒上清液，过滤后浓缩，作为制苗用病毒液；
2)收获的病毒液按比例混合后，加入冻干保护剂混匀，进行冷冻干燥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，细胞培养条件为：37℃，pH7.2，DO值50％，转速75rpm。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，用于悬浮培养ST细胞的培养基为含
100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的MEM培养基。
猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备
方法
技术领域
背景技术
[0002] 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属于尼多目、冠状病毒属，病毒核酸是具有感染性的线性单股正链无节段RNA。猪流行性腹泻病毒 (PEDV)是猪病毒性腹泻爆发的主要病原之一。
[0003] 猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)属于尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科δ冠状病毒属成员，病毒核酸为单股正链无节段RNA。PDCoV是2012 年新发现的一种感染猪的新型肠道冠状病毒，可感染不同日龄的猪只并表现出腹泻、呕吐、脱水等临床症状，发病仔猪中的死亡率为30％～40％。该病于2014年在美国猪场爆发，同年在我国内陆爆发，随后几年在世界范围内蔓延，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前针对PDCoV已经建立了一系列检测方法，检测结果显示PDCoV既存在单独感染，也存在与其它猪肠道冠状病毒混合感染的情况，然而当前针对PDCoV 致病机制的研究较少，对该病的认识不够全面，缺少商品化疫苗，仍缺少有效的疫苗防控该病的发生。
[0004] PEDV和PDCoV均属于冠状病毒科病毒，抗原形态相似，这两种病毒引起的疾病在流行病学和病理剖检上也极其相似，但是彼此又没有共同的抗原性，在免疫学和血清学上相互没有交叉反应。由此可见，同时防控两种疾病显得尤为重要。目前因 PEDV、PDCoV等混合感染而引起的疾病是全球养猪业面临的一大难题，国内尚无 PEDV和PDCoV二联弱毒疫苗的相关研究。弱毒疫苗具有免疫途径多、免疫剂量小、免疫持续时间长、无需佐剂以及免疫动物体后，免疫细胞能够很快到达呼吸道黏膜和消化道黏膜与病原发生相应作用而起到免疫保护作用，拒绝病原的继续感染和侵害，同时，其免疫调节作用对病原也起到杀灭作用等优点。因此研制一种免疫效果好、安全可靠的猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联细胞弱毒疫苗，对于阳性猪场净化以及国内PEDV和PDCoV的防控具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种免疫效果好、安全可靠的猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法。
[0006] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株，其为猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202007，保藏日期2019年12月19日。
[0007] 第二方面，本发明提供一种猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株，其为猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202008，保藏日期2019年12 月19日。
[0008] 其中，猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒种毒分离于湖北某猪场，其病变图和 PCR鉴定图如图1所示，PCR引物针对PEDV S蛋白基因，目的片段为651bp，上游引物为PEDV-F：5'-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3'，下游引物序列为PEDV-R：5'- CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3'。在分离得到猪流行性腹泻病毒后，经贴壁vero细胞传代120代即为所述猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒。
[0009] 猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒种毒分离于河南某猪场，其病变图和PCR鉴定图如图2所示，PCR引物针对PDCoV N蛋白基因，目的片段为329bp，上游引物为 PDCoV-F：5'-CCAAACGCAACCCCAACAATCC-3'，下游引物序列为PDCoV-R：5'- CTTCTCAGTGTCTGCAGAGCCG-3'。在分离得到猪流行性腹泻病毒后，经贴壁ST 细胞传代120代即为所述猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒。
[0010] 第三方面，本发明提供所述猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株和/或所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株在疫苗制备中的应用。
[0011] 第四方面，本发明提供一种组合物，其包含所述猪流行性腹泻病毒和/或所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株以及药学上可接受的载体。
[0012] 第五方面，本发明提供一种猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，所述二联弱毒疫苗是将所述猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株、所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株分别接种至易感细胞(如ST细胞)进行培养，收获的病毒液按比例混合后，加入冻干保护剂混匀，然后冷冻干燥得到的。
[0013] 收获的猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株的病毒液、猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株的病毒液病毒滴度均不低于106TCID50/0.1mL。
[0014] 优选地，两种病毒液按等体积混合。
[0015] 优选地，所述冻干保护剂为明胶和蔗糖。
[0016] 更优选地，冻干保护剂由明胶和蔗糖加水配制而成，其中明胶8g/L，蔗糖48g/L。
[0017] 将冻干保护剂按体积比1：7的比例加入PEDV和PDCoV的病毒混合液中。
[0018] 第六方面，本发明提供所述二联弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0019] 1)在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株、猪德尔塔冠状病毒KQ2018 F120株分别接种培养好的ST细胞，继续培养，待细胞病变达 80％以上时收获病毒，取自然沉淀的病毒上清液，过滤后浓缩，作为制苗用病毒液；
[0020] 2)收获的病毒液按比例混合后，加入冻干保护剂混匀，进行冷冻干燥。
[0023] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0024] (一)本发明选用流行毒株的细胞传代致弱毒来制备疫苗，保证了疫苗的高免疫保护力。
[0025] (二)本发明制备的弱毒株稳定性好，PEDV和PDCoV弱毒株经克隆纯化后都保持了良好的稳定性，克隆纯化选取1mm以内的小空斑，在制备二联弱毒苗时，对种毒进行3次噬斑直径和形态特点的检测，保持了小空斑的特点。
[0026] (三)本发明提供的弱毒株安全性高，制备的猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒二联细胞弱毒疫苗无毒力返强现象。
[0027] (四)本发明选用悬浮ST细胞制备制苗用病毒液，为高效率生产疫苗提供了保障。
[0029] 图1为本发明猪流行性腹泻病毒接种到Vero细胞上的病变图片和病毒分离株PCR 检测结果。图中，A为未接种的空白细胞对照；B为接种后的细胞病变；C为猪流行性腹泻病毒分离株PCR检测结果，图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阴性对照。
[0030] 图2为本发明猪德尔塔冠状病毒接种到ST细胞上的病变图片和病毒分离株PCR 检测结果。图中，A为未接种的空白细胞对照；B为接种后的细胞病变；C为猪德尔塔冠状病毒分离株PCR检测结果，图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阴性对照。
具体实施方式
[0031] 本发明提供的猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，可采用以下方法制备得到：
[0032] I种毒繁殖
[0033] 将生长良好布满单层的贴壁ST细胞，弃去原培养液，按原培养液1％的体积比分别接种所述的猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒或猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒，吸附2h后更换成含青霉素、链霉素各100IU/mL的DMEM维持液，加入终浓度为 10ug/mL的胰酶，于
37℃、5％CO2浓度培养箱中培养24～72h，细胞病变达到80％以上时收获病毒，于-80℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低106TCID50/0.1mL时，作为猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒抗原种毒，-80℃冰箱保存备用。PEDV弱毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202007，保藏日期2019年12月19日。PDCoV弱毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202008，保藏日期 2019年
12月19日。
37℃、5％CO2浓度培养箱中培养24～72h，细胞病变达到80％以上时收获病毒，于-80℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低106TCID50/0.1mL时，作为猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒抗原种毒，-80℃冰箱保存备用。PEDV弱毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202007，保藏日期2019年12月19日。PDCoV弱毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202008，保藏日期 2019年
12月19日。
[0034] II制苗用病毒液的制备
[0035] 包括细胞扩大培养、病毒接种、病毒液收获、病毒效价测定、无菌及外源检测。
[0036] 1、种子罐中细胞扩大培养：摇瓶中悬浮ST细胞密度达到7×106～10×106个/mL且活细胞率达95％以上时，将细胞转接于种子罐中。转接前，对种子罐的溶氧(DO) 电极、pH电极、温度电极进行校准，罐体进行高压灭菌。根据种子罐体积泵入总体积20％的培养液，以0.5×106～1×106个/mL的密度接种悬浮ST细胞，培养条件为37℃， pH为7.2，DO为50％，转速为75rpm。
[0037] 2、病毒接种：当生物反应器中悬浮ST细胞密度达到7×106～10×106个/mL时，用培养液将细胞密度稀释至2×106～3×106个/mL，加入终浓度为10ug/mL的胰酶，将 PEDV、PDCoV病毒液作为种毒，按1％的培养体积比接种猪流行性腹泻细胞传代致弱毒株或猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒株，37℃继续培养，pH为7.2，DO为50％，转速为75rpm。
[0038] 3、病毒液收获、病毒效价测定、无菌及外源检测：接毒后24～72h，细胞病变达 80％以上时收获病毒，吸取自然沉淀的病毒上清液，通过0.65μm的滤器，再通过300 KDa的膜包进行浓缩，然后取样进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低106 TCID50/0.1mL时，作为制苗用病毒液，备用。
[0039] III疫苗的配制和冻干
[0040] 制备的各项指标都合格的猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒制苗用病毒液按体积比1：1的比例进行混合，再与冻干保护剂以体积比为7：1的比例混匀后，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联细胞弱毒疫苗，于-20℃保存。
[0041] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0042] 以下实施例中，冻干保护剂由明胶和蔗糖加水配制而成，其中明胶8g/L，蔗糖48g/L。
[0043] 实施例1猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗的制备方法[0044] 1.种毒繁殖
[0045] 将生长良好布满单层的贴壁ST细胞，弃去原培养液，按原培养液1％的体积比分别接种所述的猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒或猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒，吸附2h后更换成含青霉素、链霉素各100IU/mL的DMEM维持液，加入终浓度为 10ug/mL的胰酶，于
37℃、5％CO2浓度培养箱中培养24～72h，细胞病变达到80％以上时收获病毒，于-80℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低106TCID50/0.1mL时，作为猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒抗原种毒，-80℃冰箱保存备用。
37℃、5％CO2浓度培养箱中培养24～72h，细胞病变达到80％以上时收获病毒，于-80℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低106TCID50/0.1mL时，作为猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒抗原种毒，-80℃冰箱保存备用。
[0046] 2.制苗用病毒液的制备
[0047] 包括细胞扩大培养、病毒接种、病毒液收获、病毒效价测定、无菌及外源检测。
[0048] 2.1种子罐中细胞扩大培养：摇瓶中悬浮ST细胞密度达到7×106～10×106个/mL且活细胞率达95％以上时，将细胞转接于种子罐中。转接前，对种子罐的溶氧(DO) 电极、pH电极、温度电极进行校准，罐体进行高压灭菌。根据种子罐体积泵入总体积20％的培养液，以0.5×106～1×106个/mL的密度接种悬浮ST细胞，培养条件为37℃， pH为7.2，DO为50％，转速为75rpm。
[0049] 2.2病毒接种：当生物反应器中悬浮ST细胞密度达到7×106～10×106个/mL时，用培养液将细胞密度稀释至2×106～3×106个/mL，加入终浓度为10ug/mL的胰酶，将弱毒株PEDV、PDCoV病毒液作为种毒，按1％的培养体积比接种猪流行性腹泻细胞传代致弱毒株或猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒株，37℃继续培养，pH为7.2，DO为 50％，转速为75rpm。
[0050] 2.3病毒液收获、病毒效价测定、无菌及外源检测：接毒后24～72h，细胞病变达80％以上时收获病毒，吸取自然沉淀的病毒上清液，通过0.65μm的滤器，再通过 300KDa的膜包进行浓缩，然后取样进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低106TCID50/0.1mL时，作为制苗用病毒液，备用。
[0051] 3.疫苗的配制和冻干
[0052] 制备的各项指标都合格的猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒制苗用病毒液按体积比1∶1的比例进行混合，再与冻干保护剂以体积比为7：1的比例混匀后，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联细胞弱毒疫苗，于-20℃保存。
[0053] 实施例2弱毒病毒株的毒力返强试验
[0054] 试验方法：将猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒病毒株和猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒病毒株各2mL(106TCID50/mL)口服接种未吃初乳的3日龄人工饲养仔猪，第1组5头仔猪分别口服2mL，按种后72h剖杀，观察胃肠道组织有无眼观异常，并制备小肠组织滤液(各个体混合液)，取小肠组织液2mL口服接种第2组3日龄仔猪， 72h后剖杀，以上述同样的方法观察并接种第3组仔猪，依次类推，共连续接种5代(共 5组)。
[0055] 试验结果：在3日龄仔猪连续传代5代，试验仔猪临床观察和胃肠道大体剖检均未发现明显病变，表明该疫苗毒株无毒力返强。
[0056] 实施例3二联弱毒疫苗的安全性试验
[0057] 选取某猪场21～28日龄的仔猪，并对其进行主要病原和相关抗体检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒检测为阴性和猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒中和抗体阴性(PEDV、PDCoV中和抗体效价不高于1：2)仔猪，共计20头。
[0058] 将试验猪随机分成4组，每组5头。组1和组2分别肌肉注射实施例1制备的二联弱毒疫苗各1头份/头，组2免疫2周后再肌肉注射1头份/头，组3肌肉注射2头份/头，组4 不进行注射免疫为对照组。观察4周。
[0059] 实验结果，免疫组1、2、3组与对照组相比，采食、饮水未见异常，注射部位未见不良反应，猪只均100％健活。
[0060] 实施例4二联弱毒疫苗的免疫保护效力试验
[0061] 选取产前35～42d猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒中和抗体阴性(PEDV、 PDCoV中和抗体效价不高于1：2)的妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头，组1肌肉注射实施例1制备的二联弱毒疫苗，组2肌肉注射相同量的生理盐水作为对照组，分别于免疫后第1、2、3、4和5周采血，检测中和抗体水平；待母猪产仔后，分别随机选取组1中3日龄和7日龄的仔猪各10头，组2中3日龄和7日龄仔猪各10头；均口服猪流行性腹泻病毒HB201503株(猪流行性腹泻病毒湖北株的分离鉴定及其s1基因进化分析，桂锐等，《湖北农业科学》，2016年)和猪德尔塔冠状病毒CHN-HN-2014株(参见CN107815440A)各2mL(106TCID50/mL)，观察仔猪攻毒后的临床表现。
[0062] 实验结果表明，在免疫后2周中和抗体水平迅速升高，且中和抗体水平可以维持到母猪产仔。免疫猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联细胞弱毒疫苗的母猪所产下仔猪，3日龄和7日龄攻毒后，10头免疫仔猪哺乳、精神、粪便均未见异常，100％健活；注射生理盐水的对照组所产下仔猪，3日龄和7日龄攻毒后，10头免疫仔猪全部表现为典型的猪流行性腹泻症状，全部死亡。实验数据见表1～表3。
[0063] 表1母猪免疫二联弱毒疫苗后针对猪流行性腹泻病毒的中和抗体水平[0064] 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周中和抗体水平 1：8 1：16 1：32 1：32 1：16
[0065] 表2母猪免疫二联弱毒疫苗后针对猪德尔塔冠状病毒的中和抗体水平[0066] 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周
中和抗体水平 1：16 1：32 1：32 1：32 1：16
中和抗体水平 1：16 1：32 1：32 1：32 1：16
[0067] 表3免疫母猪所产仔猪的攻毒保护率
[0068]
[0069] 本发明采用细胞连续传代的方法及细胞悬浮培养技术提供了一种免疫保护率高、稳定性好、产量高、安全可靠的用于紧急预防接种的猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，为PEDV和PDCoV的防控提供有效手段。
[0070] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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