技术领域
[0001] 本
发明属于细胞培养领域，尤其涉及一种促进人脐带间充质干细胞增殖的方法和应用。
背景技术
[0002] 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)也称为多潜能间充质基质细胞，它为一种非造血成体干细胞，组织分布广，具有自我更新和分化能
力。MSCs首先从骨髓中分离得到，随后从其他组织和器官也能获得，这些组织和器官包括毛囊、
牙齿根、脑骨膜、软骨膜、真皮、脐血、脐带、胎盘、脂肪肌肉、
肺、肝和脾脏。多项研究已经表明，体外培养的MSCs特异性表达造血细胞不表达的113种转录产物和17种蛋白。根据国际细胞
治疗协会(ISCT)下属间充质和组织干细胞委员会所提出的定义人MSCs最低标准：a)在标准培养条件下，MSCs必须具有对塑料底物的黏附性；b)CD105、CD73、CD90呈阳性，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA-DR呈阴性；c)在体外标准分化条件下，MSCs能分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。
[0003] 近来，脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UCMSCs)越来越受到研究者的重视。脐带间充质干细胞具有自我更新和分
化成不同细胞的能力。脐带间充质干细胞来源于脐带。脐带是
胎儿分娩后的废弃物，来源广泛，不存在伦理学问题。另外,由于胎血屏障的存在,脐带受病毒污染的几率明显降低且取材过程无痛苦。更重要的是，脐带间充质干细胞连续多次传代仍可保持干细胞特性，易于长期培养并可冻存，增殖能力高，且安全有效。
[0004] 但是目前脐带间充质干细胞存在扩增周期长，产量低等问题。因此，亟需发明一种新的方法以促进脐带间充质干细胞的增殖。
发明内容
[0005] 本发明公开了一种促进人脐带间充质干细胞增殖的方法，本发明首次公开了采用大鼠结肠
成纤维细胞与人脐带间充质干细胞共培养的方式以促进人脐带间充质干细胞增殖。
[0006] 与
现有技术相比，该方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，培养至P18代后仍然保持良好的增殖能力，且能很好保持脐带间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性，能够用于脐带间充质干细胞的大规模培养。
[0007] 具体的，本发明的技术方案如下：
[0008] 本发明一方面公开了一种促进人脐带间充质干细胞增殖的方法，包括以下步骤：
[0009] S1：从人脐带组织中分离得到人脐带间充质干细胞；
[0010] S2：从大鼠体内分离得到大鼠结肠成纤维细胞；
[0011] S3：将所述人脐带间充质干细胞与所述大鼠结肠成纤维细胞用transwell培养小室和细胞培养板进行共培养，上室接种大鼠结肠成纤维细胞，下室接种人脐带间充质干细胞。
[0012] 优选的，S3中共培养的培养基为：以DMEM/F12培养基溶液为
基础培养液，加入体积分数为5％-10％的胎
牛血清。在本发明的一些具体
实施例中，以DMEM/F12培养基溶液为基础培养液，加入体积分数为10％的胎牛血清。
[0013] 优选的，所述共培养的培养基中添加有0.1-0.3μg/mL的表皮生长因子。在本发明的一些具体实施例中，共培养的培养基中添加0.2μg/mL的表皮生长因子。
[0014] 优选的，所述共培养的培养基中添加有100u/mL的青霉素和
链霉素。
[0015] 脐带是由包膜、华通氏胶、脐静脉、脐动脉脐构成。脐带间充质干细胞存在于华通氏胶中。由于存在数量少，用胶原酶消化后获取的细胞量很少。另外，一般的胶原酶消化法获取细胞时，胶原酶对细胞的伤害较大，培养出来的细胞状态差。贴
块方法培养人脐带间充质细胞是普遍采用的方法。
[0016] 优选的，所述S1包括：
[0017] S11：将人脐带组织块切割成2-3mm3小块，植入T75培养瓶中，
密度20-25块/瓶；
[0018] S12：将组织块进行培养，直至组织块中爬出人脐带间充质干细胞；
[0019] S13：去除组织块，用胰酶消化得到人脐带间充质干细胞。
[0020] 优选的，所述S2包括：
[0021] S21：处死老鼠后，剪取自肛
门向近端结肠5-10cm；
[0022] S22：用PBS反复漂洗后，剪成体积为1-3mm3的块状；
[0023] S23：将块状进行消化6个5-10分钟，弃第1个5-10分钟的上清液，收集第2-6个5-10分钟的上清液，终止消化后离心；
[0024] S24：弃上清液，加入培养基制备细胞悬液，将细胞悬液进行贴壁培养，得到大鼠结肠成纤维细胞。
[0025] 优选的，在S3中，所述人脐带间充质干细胞和所述大鼠结肠成纤维细胞的起始细胞接种密度比例为(1：5)-(1：3)。
[0026] 更优选的，所述人脐带间充质干细胞和所述大鼠结肠成纤维细胞的起始细胞接种密度比例为1：4。
[0027] 本发明第二个方面公开了上述的方法得到的人脐带间充质干细胞。该方法得到的人脐带间充质干细胞细胞活性好，且具有良好的干细胞特性。
[0028] 本发明第三个方面公开了上述的方法在干细胞领域中的应用。具体的，上述方法可应用于间充质干细胞领域。
[0029] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
[0030] 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
[0031] 本发明开创性的通过将人脐带间充质干细胞与所述大鼠结肠成纤维细胞用transwell培养小室和细胞培养板进行共培养，且添加表皮生长因子，以促进人脐带间充质干细胞增殖。该方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，培养至P18代后仍然保持良好的增殖能力，且能很好保持脐带间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性，不仅可以用于脐带间充质干细胞的大规模培养，还可以用于科研领域。
具体实施方式
[0032] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0033] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品
说明书选择。本发明所用
试剂和原料均市售可得。
[0034] 实施例1
[0035] 本实施例公开了一种促进人脐带间充质干细胞增殖的方法，包括以下步骤：
[0036] S1：从人脐带组织中分离得到人脐带间充质干细胞；
[0037] S2：从大鼠体内分离得到大鼠结肠成纤维细胞；
[0038] S3：将所述人脐带间充质干细胞与所述大鼠结肠成纤维细胞用transwell培养小室和细胞培养板进行共培养，上室接种大鼠结肠成纤维细胞，下室接种人脐带间充质干细胞。
[0039] 具体的，技术方案如下：
[0040] 一、制备人脐带间充质干细胞
[0041] 从医院得到废弃的新生儿脐带，在24小时以内将人脐带组织块切割成2-3mm3小块，植入T75培养瓶中，密度20-25块/瓶；
[0042] 将组织块进行培养，培养至组织块中爬出人脐带间充质干细胞；组织块培养基为DMEM/F12培养基+10％胎牛血清；
[0043] 去除组织块，用胰酶消化得到人脐带间充质干细胞，即为P0代。将得到的人脐带间充质干细胞进行细胞鉴定，证实得到的细胞为人脐带间充质干细胞。
[0044] 将得到的人脐带间充质干细胞细胞进行传代处理，并进行细胞液氮冻存以备用。
[0045] 二、制备大鼠结肠成纤维细胞
[0046] S21：处死老鼠后，剪取自肛门向近端结肠5-10cm，用PBS漂洗后，放置于75％酒精内浸泡30s；
[0047] S22：用PBS反复漂洗7-10分钟后，快速剪成体积为1-3mm3的块状；
[0048] S23：将块状进行消化6个5-10分钟，弃第1个5-10分钟的上清液，收集第2-6个5-10分钟的上清液，终止消化后离心；
[0049] 消化液为0.25％胰蛋白酶，采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。
[0050] S24：弃上清液，加入培养基制备细胞悬液，将细胞悬液进行贴壁培养，得到大鼠结肠成纤维细胞。贴壁培养的培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
[0051] 三、共培养
[0052] 将上述人脐带间充质干细胞和上述鼠结肠成纤维细胞用transwell培养小室和细胞培养板进行共培养，上室接种大鼠结肠成纤维细胞，下室接种人脐带间充质干细胞。
[0053] 细胞培养板为12孔板，人脐带间充质干细胞的接种密度为2×105个/mL，大鼠结肠成纤维细胞的接种密度为8×105个/mL。共培养的培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，且添加0.2μg/mL的表皮生长因子，共培养4天后弃去transwell培养小室，消化细胞培养板上的人脐带间充质干细胞，终止消化后收集细胞，采用台盼蓝溶液技术，得到的人脐带间充质干细胞的细胞密度为1×106个/mL。
[0054] 对照组1：与上述方法的唯一区别在于，不采用大鼠结肠成纤维细胞共培养，得到的人脐带间充质干细胞的细胞密度为6×105个/mL。
[0055] 对照组2：与上述方法的唯一区别在于，共培养的培养基中不添加表皮生长因子，得到的人脐带间充质干细胞细胞密度为8×105个/mL。
[0056] 通过对比可知，本发明的共培养方法可以大大促进人脐带间充质干细胞的增殖。
[0057] 将共培养得到的人脐带间充质干细胞进行细胞传代培养，发现传至P18代仍具有很强的细胞活性。
[0058] 实施例1
[0059] 对实施例1中共培养得到的人脐带间充质干细胞进行细胞免疫表型鉴定，鉴定结果为：HLA-ABC：89.1％，HLA-DR：0.18％，CD45:10.8％，CD73：89％，CD105：80％，说明得到的细胞是人脐带间充质干细胞。
[0060] 实施例3
[0061] 对实施例1中共培养得到的人脐带间充质干细胞进行诱导成脂分化，发现诱导一周左右，细胞形态发生变化，由长梭形变成短梭形，且呈现细胞聚集现象，镜下可见成小片方形状的细胞聚集团。两周左右可见胞质内折光性强的脂滴，对其进行油红O
染色，可见被染红的脂滴。
[0062] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
