ICOS+CXCR3+调节性T细胞在制备预防重症肺炎药物中的应用
阅读：780发布：2020-05-12
专利汇可以提供ICOS+CXCR3+调节性T细胞在制备预防重症肺炎药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞在制备 预防 重症 肺 炎药物中的应用。预防肺炎的药物包括ICOS+CXCR3+调节性T细胞和药学上可接受的载体。本发明具有预防保护效果良好、时间持久等优点。，下面是ICOS+CXCR3+调节性T细胞在制备预防重症肺炎药物中的应用专利的具体信息内容。
1.一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，其特征在于：用于制备预防重症肺炎的药物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
其中，所述预防肺炎的药物包括ICOS+CXCR3+调节性T细胞和药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
其中，所述预防肺炎的药物制剂为注射剂。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
其中，所述ICOS+CXCR3+调节性T细胞的分离方法为：
步骤一、分离小鼠脾脏单个核细胞，获得小鼠脾脏单个核细胞悬液；
步骤二、在所述小鼠脾脏单个核细胞悬液中，磁珠分选CD4T细胞，获得CD4T细胞悬液；
步骤三、在所述CD4T细胞悬液中，流式分选ICOS+CXCR3+调节性T细胞。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：
其中，所述步骤一的具体过程为：
脱颈椎处死小鼠，浸泡于75％酒精内消毒，然后取出固定于小鼠解剖板上；
从小鼠会阴部剪口并划向头部，剥开外皮固定，在腹部包膜处剪口，取出脾脏，加入预冷的PBS缓冲液，用毛玻片研磨组织碎片，经200目尼龙膜过滤制成单细胞悬液；
在4℃、1650rpm条件下，离心5分钟，弃上清；
将脾细胞轻轻弹起，加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀，室温静置2分钟；
补加10ml PBS缓冲液终止反应，在1650rpm、4℃条件下，离心5分钟，弃上清；
PBS缓冲液再次重悬洗涤细胞，离心，弃上清；
4mL细胞完全培养液重悬细胞，取10μl细胞悬液加入到90μl台盼蓝内，计数并调节细胞浓度至工作浓度1×106/mL。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：
其中，所述步骤二的具体过程为：
取脾脏细胞悬液，300g，4℃离心细胞，除尽上清；
按照每107个细胞加入90μl MACS缓冲液的比例，加入缓冲液后重悬细胞；
按照每107个细胞加入10μlCD4(L3T4)微珠的比例，将微珠加入细胞悬液；
轻轻吹打均匀，4℃孵育15分钟；
按每107个细胞加入2ml MACS缓冲液的比例，加入缓冲液洗涤细胞，然后取300g，4℃离心细胞，除尽上清；
加入500μl缓冲液重悬细胞，并转移至MACS缓冲液平衡过并已安置于磁铁架上的LS柱内；
用MACS缓冲液洗涤LS柱3次，每次5ml；
将LS柱从磁铁架上取下，置于15ml离心管上，在LS柱内加入5ml MACS缓冲液，用力用活塞快速将液体推出LS柱，收集流出液，即为纯化的CD4T细胞悬液；
取300g，4℃离心细胞，除尽上清，PBS重悬细胞至浓度为2×107个/mL，置于冰上备用。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：
其中，所述步骤三的具体过程为：将分离好的CD4T细胞用抗-CD25-APC、抗-CD4-FITC、抗-ICOS-PerCP-Cy5.5及抗-CXCR3-PE单克隆抗体进行染色标记，利用BD-ARIA分选收集ICOS+CXCR3+调节性T细胞。
8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：
其中，所述ICOS+CXCR3+调节性T细胞的体外扩增培养过程为：
将分离好的所述ICOS+CXCR3+调节性T细胞种于96孔U型板中，每孔5×104个细胞，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下用10％小牛血清的RPMI1640培养基200μl培养该细胞；
培养体系内还含有2mmol/L谷氨酰胺，25mmol/L HEPES，50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素，50μmol/L 2-巯基乙醇，100nmol/L的雷帕霉素，400U/mL白介素-2，以及小鼠T细胞扩增磁珠；
第一周磁珠数目是细胞数的4倍，之后与细胞的比例为1:1；
显微镜下观察细胞生长情况，约3天换液1次，1:3传代，用含有以上成分的新鲜RPMI1640补充培养基到200μl；
培养2～3周后的收集细胞。
+ +
ICOSCXCR3 调节性T细胞在制备预防重症肺炎药物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 重症肺炎是一种进展性肺部炎症，可由局部感染快速演变为全身性感染，严重脓毒症，感染性休克，多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。在所有住院的肺炎患者中，有10％-20％为重症肺炎患者而需入住重症监护室接受治疗。由于该病有较高的病死率，重症肺炎的治疗一直成为学界研究的热点。研究显示大部分肺炎患者的死亡发生在细菌清除后，提示单独通过抗感染治疗不足以降低肺炎患者的死亡率。究其原因可能是致病菌入侵导致的一系列免疫反应，产生瀑布效应，局部及全身持续的炎症反应导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。目前重症肺炎发病机制不详，病理变化主要包括细胞活化、炎症介质增多、白细胞和内皮细胞黏附增强、播散性炎症细胞活化。中性粒细胞的活化在整个病理过程中发挥重要作用。中性粒细胞被激活后黏附于组织细胞，从而引起组织损伤。中性粒细胞在肺内大量聚集，介导肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞广泛损伤致通透性增加，是肺水肿及微血栓形成的关键因素。肺内持续的炎症反应、毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞的损伤进一步加重病情变化。
在重症肺炎患者局部(肺部)及全身(血清)均能检测出高水平的促炎及抑炎因子。因此，基于肺炎肺损伤的病理生理机制寻求抗感染治疗以外的辅助治疗，在肺炎(尤其是重症肺炎)的治疗方面得到越来越多的关注。如何平衡体内细胞因子的产生以控制系统持续的炎症反应，成为重症肺炎患者辅助治疗的热点，理想的治疗应该能在不影响局部炎症反应消退的情况下，降低炎症反应的系统并发症。目前重症肺炎的治疗策略可以概括为生命体征的维持，抗感染治疗，免疫调节治疗，全身多器官的支持治疗。
在重症肺炎患者局部(肺部)及全身(血清)均能检测出高水平的促炎及抑炎因子。因此，基于肺炎肺损伤的病理生理机制寻求抗感染治疗以外的辅助治疗，在肺炎(尤其是重症肺炎)的治疗方面得到越来越多的关注。如何平衡体内细胞因子的产生以控制系统持续的炎症反应，成为重症肺炎患者辅助治疗的热点，理想的治疗应该能在不影响局部炎症反应消退的情况下，降低炎症反应的系统并发症。目前重症肺炎的治疗策略可以概括为生命体征的维持，抗感染治疗，免疫调节治疗，全身多器官的支持治疗。
[0003] 重症肺炎的常规治疗方法有：
[0004] (1)抗生素治疗：抗感染治疗是重症肺炎的核心内容，主要为抗生素治疗。与轻症肺炎的抗生素升级疗法不同，重症肺炎抗生素的使用需遵循早期、联合、降阶梯的原则。有效的抗生素治疗应该越早越好，推迟使用抗生素，对患者的预后不利，病死率增加。有研究显示，重症肺炎患者4小时内给予抗生素，与4小时后给予抗生素相比，病死率明显下降。Diaz-Martin等证实，重症患者联合使用抗生素较使用单一抗生素，病死率下降约15％。美国胸科协会(American Thoracic Society，ATS)指南建议静脉使用β-内酰胺类药物、大环内酯类或者喹诺酮类，如果患者对青霉素过敏，则建议选择喹诺酮类和氨曲南。若考虑为铜绿假单胞菌感染，治疗中应使用抗铜绿假单胞菌的β-内酰胺类药物加环丙沙星或左氧氟沙星。若考虑感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)，应首选利奈唑胺或者万古霉素。此外，若较长时间使用抗生素，还需要考虑其毒性作用。有报道指出，使用阿奇霉素可以增加心血管事件的死亡风险。
[0005] (2)激素治疗：糖皮质激素有较强的抗炎作用，在炎症早期可以减轻渗出、水肿、毛细血管扩张、白细胞浸润及吞噬反应，在后期可抑制毛细血管和纤维母细胞的增生。糖皮质激素一方面通过改变基因转录而抑制炎症过程的某些环节，如减少促炎因子、趋化因子、黏附分子、细胞内炎症受体的转录，抑制血管内多形核细胞的迁移；另一方面通过降低多种促炎酶类的表达而减少其炎性物质的产生，使得炎症反应下调。研究发现，糖皮质激素受体复合物通过直接与DNA上的糖皮质激素反应元件相互作用或通过抑制两个重要的转录因子活化蛋白-1和核因子-κB的活性来下调白细胞介素(interleukin，IL)-1、γ-干扰素、IL-2、IL-8等促炎细胞因子的基因转录，同时促进抗炎因子IL-10的产生，提示激素的保护作用可能与其调节促炎介质/抗炎介质的平衡有关。但是，糖皮质激素在发挥抗炎及免疫抑制作用的同时，可能增加二重感染的风险，并对机体的代谢产生影响。研究显示，地塞米松治疗患者发生脓肿的数量较对照组更多，且有发生高血糖的危险。激素治疗的另一常见不良反应为骨质疏松性骨折。来自英国的大规模回顾性队列对照研究显示，即使是短时间使用小剂量激素治疗，仍会显著增加骨折的风险。因此，激素虽然具有强大的抗炎作用，但作为重症肺炎的辅助治疗目前仍存在争议。
[0006] (3)血管活性药物治疗：微循环障碍是重症肺炎并发多器官功能障碍的病理基础，正确使用血管活性药物能改善和活跃微循环，改变重要器官的低灌注，对阻止重症肺炎及其并发症的发生发展，逆转病情起到及其重要的作用。临床使用较多的血管活性药物以多巴胺为主，根据病情及合并症情况，单用或联合使用多巴酚丁胺、酚妥拉明、东崀菪碱等血管活性药物，研究结果显示，小剂量多巴胺治疗婴幼儿重症肺炎，可促进肺部啰音消失，减轻咳喘症状，缩短病程，提高了婴幼儿的抢救成功率和治愈率。
发明内容
[0008] 为实现上述目的，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，用于制备预防重症肺炎的药物。
[0009] 进一步，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，还可以具有这样的特征：其中，预防肺炎的药物包括ICOS+CXCR3+调节性T细胞和药学上可接受的载体。
[0010] 进一步，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，还可以具有这样的特征：其中，预防肺炎的药物制剂为注射剂。
[0011] 进一步，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，还可以具有这样的特征：其中，ICOS+CXCR3+调节性T细胞的分离方法为：步骤一、分离小鼠脾脏单个核细胞，获得小鼠脾脏单个核细胞悬液；步骤二、在小鼠脾脏单个核细胞悬液中，磁珠分选CD4T细胞，获+ +得CD4T细胞悬液；步骤三、在CD4T细胞悬液中，流式分选ICOSCXCR3调节性T细胞。
[0012] 进一步，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，还可以具有这样的特征：其中，步骤一的具体过程为：脱颈椎处死小鼠，浸泡于75％酒精内消毒，然后取出固定于小鼠解剖板上；从小鼠会阴部剪口并划向头部，剥开外皮固定，在腹部包膜处剪口，取出脾脏，加入预冷的PBS缓冲液，用毛玻片研磨组织碎片，经200目尼龙膜过滤制成单细胞悬液；在4℃、1650rpm条件下，离心5分钟，弃上清；将脾细胞轻轻弹起，加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀，室温静置2分钟；补加10ml PBS缓冲液终止反应，在1650rpm、4℃条件下，离心5分钟，弃上清；PBS缓冲液再次重悬洗涤细胞，离心，弃上清；4mL细胞完全培养液重悬细胞，取
10μl细胞悬液加入到90μl台盼蓝内，计数并调节细胞浓度至工作浓度1×106/mL。
10μl细胞悬液加入到90μl台盼蓝内，计数并调节细胞浓度至工作浓度1×106/mL。
[0013] 进一步，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，还可以具有这样的特征：其中，步骤二的具体过程为：取脾脏细胞悬液，300g，4℃离心细胞，除尽上清；按照每107个细胞加入90μl MACS缓冲液的比例，加入缓冲液后重悬细胞；按照每107个细胞加入10μl CD4(L3T4)微珠的比例，将微珠加入细胞悬液；轻轻吹打均匀，4℃孵育15分钟；按每107个细胞加入2ml MACS缓冲液的比例，加入缓冲液洗涤细胞，然后取300g，4℃离心细胞，除尽上清；加入500μl缓冲液重悬细胞，并转移至MACS缓冲液平衡过并已安置于磁铁架上的LS柱内；用MACS缓冲液洗涤LS柱3次，每次5ml；将LS柱从磁铁架上取下，置于15ml离心管上，在LS柱内加入5ml MACS缓冲液，用力用活塞快速将液体推出LS柱，收集流出液，即为纯化的CD4T细胞悬液；取300g，4℃离心细胞，除尽上清，PBS重悬细胞至浓度为2×107个/mL，置于冰上备用。
[0014] 进一步，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，还可以具有这样的特征：其中，步骤三的具体过程为：将分离好的CD4T细胞用抗-CD25-APC、抗-CD4-FITC、抗-ICOS-PerCP-Cy5.5及抗-CXCR3-PE单克隆抗体进行染色标记，利用BD-ARIA分选收集ICOS++CXCR3调节性T细胞。
[0015] 进一步，本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞的用途，还可以具有这样的特征：其中，ICOS+CXCR3+调节性T细胞的体外扩增培养过程为：将分离好的ICOS+CXCR3+调节性T细胞种于96孔U型板中，每孔5×104个细胞，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下用10％小牛血清的RPMI1640培养基200μl培养该细胞；培养体系内还含有2mmol/L谷氨酰胺，25mmol/L HEPES，50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素，50μmol/L 2-巯基乙醇，100nmol/L的雷帕霉素，400U/mL白介素-2，以及小鼠T细胞扩增磁珠；第一周磁珠数目是细胞数的4倍，之后与细胞的比例为1:1；显微镜下观察细胞生长情况，约3天换液1次，1:3传代，用含有以上成分的新鲜RPMI1640补充培养基到200μl；培养2～3周后的收集细胞。
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明提供一种ICOS+CXCR3+调节性T细胞在制备预防重症肺炎药物中的应用，ICOS+CXCR3+调节性T细胞作为预防重症肺炎药物的活性成分，可以预防重症肺炎，且预防保护效果良好，时间持久，能够帮助使用者预防重症肺炎，从而避免患病后激素等药物治疗带来的各种副作用。目前ICOS+CXCR3+Treg细胞的基础研究扎实，技术推广程度高，技术可控，并安全性好，治疗费用的接受程度好，受益面广。因此ICOS+CXCR3+Treg细胞在制备治疗重症肺炎药物中的应用具有巨大的社会和经济效益。附图说明
[0017] 图1是ICOS+CXCR3+调节性T细胞和PBMC共同培养及PBMC单独培养的增殖情况图；
[0018] 图2是ICOS+CXCR3+调节性T细胞表面各分子表达情况图；
[0019] 图3是各组小鼠在不同时间感染流感嗜血杆菌后肺支气管肺泡灌洗液和肺部中的流感嗜血杆菌载量对比图；
[0020] 图4是各组小鼠在不同时间感染流感嗜血杆菌后肺支气管肺泡灌洗液中各肺部炎症细胞因子(IL-6、TNF-α、KC、MIP-2和MCP-1)的含量对比图；
[0021] 图5是各组小鼠在不同时间感染流感嗜血杆菌后肺部组织切片图。
具体实施方式
[0022] 调节性T细胞指CD4+CD25+T细胞，是由胸腺产生后输出至外周。ICOS和CXCR3是表达于调节性T细胞上的分子。
[0023] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0024] 实施例1
[0025] ICOS+CXCR3+调节性T细胞的体外分离和扩增培养
[0026] 一、ICOS+CXCR3+调节性T细胞的分离
[0027] 步骤一、分离小鼠脾脏单个核细胞，获得小鼠脾脏单个核细胞悬液。具体过程为：
[0029] 2)、脱颈椎处死小鼠，浸泡于75％酒精内消毒10分钟，取出固定于小鼠解剖板上。
[0030] 3)、用眼科剪从小鼠会阴部剪口并划向头部，剥开外皮固定，在腹部包膜处剪口，眼科剪、镊配合取出脾脏，加入适量预冷的PBS缓冲液，用毛玻片轻柔研磨组织碎片，经200目尼龙膜过滤制成单细胞悬液。
[0031] 4)、在4℃，1650rpm条件下，离心5分钟，弃上清。
[0032] 5)、将脾细胞轻轻弹起，加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀，室温静置2分钟。
[0033] 6)、补加10ml PBS缓冲液终止反应，在1650rpm，4℃条件下离心5分钟，弃上清。
[0034] 7)、PBS缓冲液再次重悬洗涤细胞，离心，弃上清。
[0035] 8)、4mL细胞完全培养液重悬细胞，取10μl细胞悬液加入到90μl台盼蓝内，计数并调节细胞浓度至工作浓度1×106/mL，即获得小鼠脾脏单个核细胞悬液。
[0036] 步骤二、在小鼠脾脏单个核细胞悬液中，磁珠分选CD4T细胞，获得CD4T细胞悬液。具体过程为：
[0037] 1)、取脾脏细胞悬液，300g，4℃离心细胞，除尽上清。
[0038] 2)、按照每107个细胞加入90μl MACS缓冲液的比例，加入缓冲液后重悬细胞。
[0039] 3)、按照每107个细胞加入10μl CD4(L3T4)微珠的比例，将微珠加入细胞悬液。
[0040] 4)、轻轻吹打均匀，4℃孵育15分钟。
[0041] 5)、按每107个细胞加入2ml MACS缓冲液的比例，加入缓冲液洗涤细胞，然后取300g，4℃离心细胞，除尽上清。
[0042] 6)、加入500μl缓冲液重悬细胞，并转移至MACS缓冲液平衡过并已安置于磁铁架上的LS柱内。
[0043] 7)、用MACS缓冲液洗涤LS柱3次，每次5ml。
[0044] 8)、将LS柱从磁铁架上取下，置于15ml离心管上，在LS柱内加入5ml MACS缓冲液，用力用活塞快速将液体推出LS柱，收集流出液，即为纯化的CD4T细胞悬液。
[0045] 9)、取300g，4℃离心细胞，除尽上清，PBS重悬细胞至浓度为2×107个/mL，置于冰上备用。
[0046] 步骤三、在CD4T细胞悬液中，流式分选ICOS+CXCR3+调节性T细胞。具体过程为：将分离好的CD4T细胞用抗-CD25-APC、抗-CD4-FITC、抗-ICOS-PerCP-Cy5.5及抗-CXCR3-PE单克隆抗体进行染色标记，利用BD-ARIA分选收集ICOS+CXCR3+调节性T细胞。
[0047] 二、ICOS+CXCR3+调节性T细胞的体外扩增培养
[0048] 将分离好的ICOS+CXCR3+调节性T细胞种于96孔U型板中，每孔约5×104个细胞，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下用10％小牛血清的RPMI1640培养基200μl培养该细胞。培养体系内还含有2mmol/L谷氨酰胺，25mmol/L HEPES，50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素，50μmol/L 2-巯基乙醇，100nmol/L的雷帕霉素，400U/mL白介素-2(IL-2)，以及小鼠T细胞扩增磁珠，第一周磁珠数目是细胞数的4倍，之后与细胞的比例为1:1。含有以上除外IL-2和T细胞扩增磁珠的细胞培养液也用于接下来的细胞培养试验中。显微镜下观察细胞生长情况，约3天换液1次，1:3传代，用含有以上成分的新鲜RPMI1640补充培养基到200μl。培养2～3周后的收集细胞。
[0049] 三、ICOS+CXCR3+调节性T细胞的检测
[0050] 1、ICOS+CXCR3+调节性T细胞的活性和纯度检测
[0051] ICOS+CXCR3+调节性T细胞悬液用10μl台盼蓝染色，镜下计数200个细胞，计算活细胞率。取细胞悬液100μl，加入CD4、CXCR3、ICOS及CD25抗体，利用流式细胞仪检测细胞纯度。活细胞率和细胞纯度均大于95％。
[0052] 2、ICOS+CXCR3+调节性T细胞抑制功能
[0053] 收集新鲜的及扩增的ICOS+CXCR3+调节性T细胞(Tregs)，计数，将1×105个以上细5
胞分别与被照射(3000rads)过的2×10异种(人)PBMCs共培养于96孔U型板中，以及将被照射(3000rads)过的2×105异种(人)PBMCs单独培养于另一96孔U型板中，37℃、5％CO2孵箱中共培养5d后，用WST-1细胞增殖试剂盒检测细胞的增殖程度，结果如图1所示，ICOS+CXCR3+调节性T细胞可显著抑制外周血单个核细胞增殖。
胞分别与被照射(3000rads)过的2×10异种(人)PBMCs共培养于96孔U型板中，以及将被照射(3000rads)过的2×105异种(人)PBMCs单独培养于另一96孔U型板中，37℃、5％CO2孵箱中共培养5d后，用WST-1细胞增殖试剂盒检测细胞的增殖程度，结果如图1所示，ICOS+CXCR3+调节性T细胞可显著抑制外周血单个核细胞增殖。
[0054] 实施例2
[0055] ICOS+CXCR3+调节性T细胞的给药方法
[0056] 一、使用前最终鉴定
[0057] 1、无菌试验
[0058] 如培养过程中未出现任何异常，常规在ICOS+CXCR3+调节性T细胞输注小鼠前两天，最后一次换液后，对每一培养皿中的上清液作无菌试验，培养细菌和霉菌。细胞上清不得有细菌、霉菌生长。
[0059] 2、外观及镜下观察
[0061] 3、活细胞比例
[0062] 输注当天对收集的细胞悬液抽样检查活细胞比例95％以上。
[0063] 4、染色体核型
[0064] ICOS+CXCR3+调节性T细胞输注前2天抽样进行染色体核型，结果正常。
[0065] 5、表面标志
[0066] 输注前2天抽样行表面标志测定：结果如图2所示，CD4、CD25、ICOS、CXCR3、CTLA-4表达阳性。
[0067] 二、ICOS+CXCR3+调节性T细胞的给药方法
[0068] 1、所用设备、材料及试剂的准备
[0070] 2、输注前操作
[0071] 当细胞达到1×106/20g小鼠体重，可做输注准备。即按1×106/20g小鼠体重，对小鼠进行输注。给药前，在超净工作台内取细胞，计数细胞浓度、活细胞比例、细胞表面标志、细胞染色体核型测定。
[0072] 3、输注操作
[0073] 1)、离心(常温170g，5分钟)，弃上清。
[0074] 2)、将细胞转移至离心管中，加入PBS，混匀后离心，弃上清。重复一次。
[0075] 3)、经过洗涤后，加入200μl PBS重悬细胞，取20μl细胞悬液计细胞数。
[0076] 4)、经尾静脉给小鼠输注细胞。
[0077] 5)、输注过程中观察小鼠反应，及时对症处理。
[0078] 实施例3
[0079] ICOS+CXCR3+调节性T细胞在制备预防重症细菌肺炎动物模型的药物中的应用[0080] 1、流感嗜血杆菌感染菌液制备
[0082] 2)、挑取多个单菌落接种于10ml sBHI液体培养基中，37℃摇床，130rpm，培养至OD600＝0.4-0.5。
[0083] 3)、室温，4000rpm，离心15分钟，收集细菌。
[0084] 4)、12ml PBS缓冲液重悬细菌，室温4000rpm离心15分钟，收集细菌。PBS缓冲液重悬，调节OD600＝1.0，此时细菌浓度约为3×109CFU/ml。
[0085] 5)、10倍梯度稀释，取10-6稀释度，吸取10μl菌液点于sBHI培养板，点样三次，待菌液完全被平板吸收后，于37℃CO2培养箱，倒置过夜培养，次日计数菌落，准确计算细菌浓度。
[0086] 2、小鼠流感嗜血杆菌感染模型
[0087] 按100μl/20g给小鼠腹腔注射麻醉剂，待小鼠麻醉后，让其仰卧于手心，用移液器随小鼠呼吸节律经右侧鼻翼缓缓滴入细菌30μl(约1×108CFU)。待小鼠不再抽噎，将其以侧卧方式安置于鼠笼内。确认小鼠苏醒后，方可离开。建立小鼠流感嗜血杆菌肺部感染。
[0088] 3、ICOS+CXCR3+调节性T细胞对小鼠感染的流感嗜血杆菌的预防
[0089] 取八组小鼠，其中，四组小鼠按照“ICOS+CXCR3+调节性T细胞的给药方法”输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞；另四组小鼠为空白对照组，不输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞。
[0090] 在输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞之后的第一天、第七天和第十四天分别对八组小鼠感染流感嗜血杆菌，感染方法按照“小鼠流感嗜血杆菌感染模型”的方法。各组小鼠感染流感嗜血杆菌后进行检测，结果如图3-4所示。
[0091] 图3分别为各组小鼠在不同时间感染流感嗜血杆菌后，肺支气管肺泡灌洗液和肺部中的流感嗜血杆菌载量对比图。如图3所示，输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞的各组小鼠，其+ +肺支气管肺泡灌洗液和肺部中的流感嗜血杆菌载量均低于未输注ICOSCXCR3 调节性T细胞的各组小鼠(空白对照组)。
[0092] 图4分别为各组小鼠在不同时间感染流感嗜血杆菌后，肺支气管肺泡灌洗液中各肺部炎症细胞因子(IL-6、TNF-α、KC、MIP-2和MCP-1)的含量对比图。如图4所示，输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞的各组小鼠，其肺支气管肺泡灌洗液中的各肺部炎症细胞因子了浓度，均低于未输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞的各组小鼠(空白对照组)。
[0093] 图5是各组小鼠在不同时间感染流感嗜血杆菌后，肺部组织切片图。如图5所示，输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞的小鼠，其肺部炎症细胞浸润显著低于未输注ICOS+CXCR3+调节性T细胞的小鼠。
[0094] 因此，以ICOS+CXCR3+调节性T细胞作为活性成分的药物制剂，可以预防重症肺炎，且预防保护效果良好，时间持久。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法 | 2020-05-08 | 269 |
| 一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用 | 2020-05-11 | 461 |
| 可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法 | 2020-05-11 | 395 |
| 检测电压门控钾离子通道抗体的电化学发光试剂盒、制法 | 2020-05-08 | 641 |
| 一种用于均一体系细胞荧光检测钙流方法 | 2020-05-11 | 449 |
| 一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒 | 2020-05-13 | 468 |
| 检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法 | 2020-05-08 | 275 |
| 一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法 | 2020-05-12 | 231 |
| 一种高层建筑用装配式管道井 | 2020-05-12 | 180 |
| 一种住宅工程用装配式管道风井 | 2020-05-12 | 963 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈