一种小牛血去蛋白提取物及其制备方法和应用
阅读：1018发布：2020-11-17
专利汇可以提供一种小牛血去蛋白提取物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种小 牛 血去蛋白提取物及其制备方法，该方法包括：取 小牛 全血 ，加入1.5~2倍全血量的纯化 水 ，不断搅拌，并加热至体系 温度 达到80℃，对小牛血进行灭活；灭活后的小牛血降至室温，并向体系中加入80%～90%(v/v) 乙醇 ，搅拌均匀，静置36小时，分离1/3~1/2上清液，母液再次加入80%～90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置12小时，分离全部上清液；合并两次得到的上清液，并对上清液进行减压浓缩，浓缩液倒入澄清 过滤器 进行过滤；滤液用稀 盐酸 调pH呈弱酸性，然后向弱酸性滤液中加入针用 活性炭 进行脱色；依次使用 钛 棒过滤、微孔滤 膜过滤 、富士滤器 超滤 ，即得小牛血去蛋白提取物。本发明的方法具有操作简便，便于工艺化大生产，条件温和的特点。，下面是一种小牛血去蛋白提取物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1. 一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1)取小牛全血，加入I. 5^2倍全血量的纯化水，不断搅拌，并加热至体系温度达到80°C，对小牛血进行灭活； (2)灭活后的小牛血降至室温，并向体系中加入80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置，分离1/3〜1/2上清液，母液再次加入80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置，分离全部上清液； (3)合并步骤（2)两次得到的上清液，并对上清液进行减压浓缩，浓缩液倒入澄清过滤器进行过滤； (4)滤液用稀盐酸调pH呈弱酸性，然后向弱酸性滤液中加入针用活性炭，进行脱色； (5)依次使用钛棒过滤、微孔滤膜过滤、富士滤器超滤，即得小牛血去蛋白提取物。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤（I)中，加入体积为1.5〜2倍全血量的纯化水，不断搅拌，并加热小牛全血与水的混合物体系达到80°C，并保温30min、0min,以通过加热对小牛血进行灭活。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中，向小牛全血与水的混合物体系中加入体积为小牛全血量4飞倍的80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置36h，分离1/3〜1/2上清液，母液再次加入体积为小牛全血量4飞倍的80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置12h，分离全部上清液。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中，对上清液采用单效浓缩器进行减压浓缩，真空压力控制在O. 06Mpa〜O. 08Mpa,蒸汽压力控制在O. OlMPa以下，上清液浓缩温度控制在40°C〜50°C，浓缩液与上清液的体积比控制在1:200〜250，浓缩液倒入澄清过滤器进行过滤。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)中，滤液采用质量浓度为9. 5^10. 5%的稀盐酸调节pH至4. O〜5. O之间，按滤液体积O. 5 °Γθ. 9%的量加入针剂用活性炭，搅拌，加热至80°C并保温30min。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤（5)中，先用钛棒滤炭后，再用装有O. 22 μ m微孔滤膜的平板滤器过滤，上述滤液再用富士滤器超滤，即得小牛血去蛋白提取物。
7. 一种小牛血去蛋白提取物，其特征在于，所述小牛血去蛋白提取物通过权利要求1-6任一项所述的方法制得。
8. —种权利要求7所述小牛血去蛋白提取物在注射液、冻干粉针、胶囊剂、外用制剂或眼用制剂中的应用。
一种小牛血去蛋白提取物及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 小牛血去蛋白提取物由Jaeger KH于20世纪60年代研制成功，主要由无机离子钾、氯、钠等及小分子多肽、氨基酸、核苷酸、酮酸等物质组成，能够促进细胞对葡萄糖和氧的摄取和利用，促进线粒体呼吸，促进组织的复原和再生，能保护大脑神经细胞，减轻脑缺血再灌注损伤，改善大脑中氧和能量供应，消除氧自由基、促进神经细胞修复等作用。特别对中风、颅脑外伤等器质性精神障碍有特殊的疗效，对创伤、溃疡、灼伤等损伤组织也有 促进愈合的作用。小牛血去蛋白提取物进口制剂如瑞士素高公司生产的素高捷疗眼膏、奥地利奈科明的爱维治已进入中国市场，国产制剂生产商也有数家，如锦州奥鸿药业有限责任公司、黑龙江江世药业有限公司、吉林康乃尔药业有限公司等等，其中制剂原料有来自血清、全血、红细胞三种形式。
[0003] 专利96120777、200510132478. O公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，离心分离留上清，将上清液中的乙醇浓缩，浓缩液用超滤截留，即得到小牛血去蛋白提取液。该方法采用低温离心方式进行分离，对工艺设备要求较高，同时能耗也较大。
[0004] 专利200710194950. 2公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：采幼牛静脉血，离心得到血清，加热除蛋白，滤液浓缩后加乙醇进行醇沉，过滤并浓缩滤液，得到醇沉后的滤液，滤液调酸性并加入活性炭脱色，过滤收集滤液，滤液调至碱性，冷冻除蛋白，过滤得到的滤液用纤维膜超滤除高分子物质，反复2〜5次，过滤即得到小牛血去蛋白提取物。该方法冷冻除蛋白的条件为-50〜0°C，时间为12〜72小时，且需反复2〜5次，工序较长，能耗较大。
[0005] 专利200610080520. 3公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，离心分离留上清，上清液以截留分子量为5000道尔顿的中空纤维柱超滤，然后分别过葡聚糖G-15凝胶柱、Sephadex-50凝胶柱,特征性收集280nm处有特异吸收的懼分,最后采用微孔滤膜过滤和紫外线灭活。该方法采用葡聚糖G-15凝胶柱、Sephadex-50凝胶柱分离纯化，分离效率偏低，产业化存在一定难度。
[0006] 专利200810094486. 4公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：小牛血清用96%乙醇进行醇沉，离心后留上清浓缩后用截留分子量100000D的中空纤维柱粗滤，滤液依次用甲苯、乙酸乙酯、正丁醇萃取，保留水层，水层溶液浓缩后用BI0-GEL-P2凝胶层析分离；即为小牛血清去蛋白提取液。该方法采用有机溶剂萃取和柱层析结合的方式进行分离纯化，不仅会导致效率不高，同时甲苯二类溶剂会影响产品的安全性。
[0007] 专利200710117951. 7公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：小牛血清先用纱布粗滤，去除纤维蛋白后，以500(Tl0000rpm离心2min,然后依次用滤纸过滤、O. 2 μ m滤膜精滤、10000^20000分子量的超滤器进行超滤、5000-8000分子量的超滤器进行超滤，将超滤液浓缩后调PH值至6. 5^7. 5，灭菌后冷冻f 2d，缓化放置3〜15d，调pH值至5. 5飞.5，再用6000分子量的超滤器进行超滤，经O. 2 μ m滤膜精滤和灭菌。该方法生产周期长，会影响生产效率；灭菌冷冻后缓化3〜15天对工作厂地大小和环境有较高要求，将制约生产产能和生产效率。
[0008] 专利200810148841. I公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：小牛血全血依次经过酸沉、冷冻、融化、收集离心后上清液，上清液依次再经过碱沉、冷冻、融化、离心，离心上清液再进行酸沉，上清液依次进行反渗透浓缩、中空纤维柱超滤。该方法需要冷冻至-20°C，再在40°C条件下融化，整个生产周期长，生产效率不高。
[0009] 专利200910246717. 3,200510076914. 7制备方法中均加入了枸椽酸钠，并在低温保存后收集上清液，上清液加入胃蛋白酶酶解，并过活性碳柱或者壳聚糖改性活性碳柱。该 制备方法采用了酶解工艺，容易产生杂质，同时上清液过活性炭柱无法控制产品的无菌。
[0010] 专利201010291699. 3公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：小牛血进行反复低温冷冻、升温后再加入注射用水，离心得上清液，上清液冷却至_5°C，搅拌加入-1(T-2(TC的冷丙酮，低温环境下静置后离心得上清液；上清液浓缩后依次调节pH值3. 5〜4. 5,7. 5〜8. 5离心得上清液，上清液然后pH值6. 5〜7. 5后，然后再分别利用50KD，IOKD和5KD超滤膜逐级超滤澄清。该制备方法需在低温条件下进行，对工艺设备要求较高，同时该工艺存在多次调PH值工序的问题，耗时较长。
[0011] 专利200410062657. 7公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括：小牛血离心得红细胞，加水冻溶，破坏红细胞膜，释放出内容物，离心，得到去除部分大分子量蛋白质的上清液，对上清液进行巴氏消毒，然后进行超滤、纳滤脱盐、反渗透浓缩，最后医用活性炭脱色。该方法采用超虑、纳滤、反渗透浓缩技术，其中纳滤对液体中分子量为数百的有机小分子具有分离性能，而小牛血去蛋白提取物分子量一般控制在5000道尔顿，其工艺会损失部分活性成分。
发明内容
[0012] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种制备小牛血去蛋白提取物的方法，应用该方法制备的提取物总固体含量、呼吸活力、刺激指数均符合药用要求，蛋白质、高分子量物质也能得到有效控制，从而保证了小牛血制剂的原料质量，减低小牛血制剂临床使用的风险，该制备方法同时具备操作简便，易于产业化的特点。
[0013] 为了实现上述目的，采用如下技术方案制备小牛血去蛋白提取物：(1)取小牛全血,加入体积为I. 5^2倍全血量的纯化水，不断搅拌,并加热至体系（小牛全血与水的混合物)温度达到80°C，对小牛血进行灭活；
(2)灭活后的小牛血降至室温，并向体系中加入80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置，分离1/3〜1/2上清液，母液再次加入80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置，分离全部上清液；
(3)合并步骤（2)两次得到的上清液，并对上清液进行减压浓缩，浓缩液倒入澄清过滤器进行过滤；(4)滤液用稀盐酸调pH呈弱酸性，然后向弱酸性滤液中加入针用活性炭，进行脱色；
(5)依次使用钛棒过滤、微孔滤膜过滤、富士滤器超滤，截留分子量约5000道尔顿，即得小牛血去蛋白提取物。
(2)灭活后的小牛血降至室温，并向体系中加入80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置，分离1/3〜1/2上清液，母液再次加入80%〜90%(v/v)乙醇，搅拌均匀，静置，分离全部上清液；
(3)合并步骤（2)两次得到的上清液，并对上清液进行减压浓缩，浓缩液倒入澄清过滤器进行过滤；(4)滤液用稀盐酸调pH呈弱酸性，然后向弱酸性滤液中加入针用活性炭，进行脱色；
(5)依次使用钛棒过滤、微孔滤膜过滤、富士滤器超滤，截留分子量约5000道尔顿，即得小牛血去蛋白提取物。
[0014] 所述步骤（I)加入I. 5〜2倍全血量的纯化水，不仅可以减低体系的粘度，便于搅拌，此外，纯化水的加入降低细胞外溶液的浓度，在渗透压的作用下，细胞发生吸水溶胀，在外力搅拌作用下利于细胞破裂而释放内容物，可提高小牛全血利用率。搅拌过程中加热使体系温度达到80°C，并保温30mirT40min，以杀灭小牛全血中的病毒，同时使部分蛋白变性。
[0015] 所述步骤（2)向体系中加入80%〜90% (v/v)乙醇量为小牛全血量的4飞倍，搅拌均匀，静置36h，分离1/3〜1/2上清液，母液再次加入小牛全血量4飞倍80%〜90% (v/v)乙醇，搅拌均匀，静置12h，分离全部上清液；所述步骤（3)对上清液采用单效浓缩器进行减压浓缩，真空压力控制在O. 06Mpa〜O. 08Mpa，蒸汽压力控制在O. OlMPa以下，上清液浓缩温度控制在40°C〜50°C，浓缩液与上清液的体积比控制在1:20(Γ250，浓缩液倒入澄清过滤器进行过滤。
[0016] 所述步骤（4)滤液采用质量浓度为9. 5^10. 5%的稀盐酸调节pH至4. O〜5. O之间，按滤液体积O. 5 °/Γθ. 9%的量加入针剂用活性炭，搅拌，加热至80°C并保温30min。
[0017] 所述步骤（5)先用钛棒滤炭后，再用装有0.22 μ m微孔滤膜的平板滤器过滤，上述滤液再用富士滤器超滤，截留分子量约5000道尔顿，即得小牛血去蛋白提取物。
[0018] 小牛血去蛋白提取物广泛应用于注射液、冻干粉针、胶囊剂、外用制剂或眼用制剂等制剂，采用本发明技术方案制备的小牛血去蛋白提取物所制备的小牛血去蛋白提取物注射液和注射用小牛血去蛋白提取物的呼吸活力、总固体含量、游离氨基酸等检测项目均符合药品注册标准，尤其是本发明技术方案生产的小牛血去蛋白提取物制备的注射用小牛血去蛋白提取物在不加任何制剂辅料即可制备出成型性良好的合格产品，可降低了辅料对制剂造成的安全隐患，可提高制剂的安全性。
[0019] 本发明能够达到以下技术效果：本发明通过对醇沉工艺、脱色工艺、过滤材料组合使用来实现小牛血去蛋白提取物的制备，避免了现有提取技术中萃取、柱层析等不利于产业化的操作步骤，具有操作简便，便于工艺化大生产，条件温和的特点，减少了小牛血活性成分的破坏，可有效提高提取物的内在质量；小牛血去蛋白提取物采用小牛全血作为提取原料，并通过加适量纯化水使细胞溶胀，加速细胞的破裂释放内容物，在满足制剂质量要求的前提下，提高了小牛全血利用率；此外，本发明制备的小牛血去蛋白提取物制备注射用冻干粉针剂时可以不添加甘露醇等任何赋形剂即可达到理想的制备效果，可消除辅料的安全隐患。
附图说明
附图说明
[0020] 图I为小牛血去蛋白提取物制备工艺流程图。
具体实施方式
[0021] 应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。
[0022] 在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法为常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。
[0023] 如图I所示，一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤： (1)取小牛全血（濉溪县汇丰生物科技有限公司），加入体积为I. 5〜2倍全血量的纯化水（不仅可以减低体系的粘度，便于搅拌，此外，纯化水的加入降低细胞外溶液的浓度，在渗透压的作用下，细胞发生吸水溶胀，在外力搅拌作用下利于细胞破裂而释放内容物，可提高小牛全血利用率），不断搅拌，并加热至体系（小牛全血与水的混合物）温度达到80°C，并保温30mirT40min，以杀灭小牛全血中的病毒，同时使部分蛋白变性；(2)灭活后的小牛血降至室温，并向体系（小牛全血与水的混合物）中加入体积为小牛全血量4〜5倍的80%〜90% (v/v)乙醇，搅拌均匀，静置36h，分离1/3〜1/2上清液，母液再次加入体积为小牛全血量4飞倍80%〜90%(v/v)的乙醇，搅拌均匀，静置12h，分离全部上清液；
(3)合并步骤（2)两次得到的上清液，并对上清液采用单效浓缩器进行减压浓缩，真空压力控制在O. 06Mpa〜O. 08Mpa,蒸汽压力控制在O. OlMPa以下，料液浓缩温度控制在400C〜50°C，浓缩液与上清液的体积比控制在1:200^250,浓缩液倒入澄清过滤器进行过滤；
(4)滤液用质量浓度为9. 5^10. 5%的稀盐酸调节pH至4. O〜5. O之间，按滤液体积O. 59Π). 9%的量加入针剂用活性炭，搅拌，加热至80°C并保温30min，进行脱色；
(5)先用钛棒滤炭后，再用装有O. 22 μ m微孔滤膜的平板滤器过滤，上述滤液再用FVRG75型富士滤器超滤，截留分子量约5000道尔顿，即得小牛血去蛋白提取物。
(3)合并步骤（2)两次得到的上清液，并对上清液采用单效浓缩器进行减压浓缩，真空压力控制在O. 06Mpa〜O. 08Mpa,蒸汽压力控制在O. OlMPa以下，料液浓缩温度控制在400C〜50°C，浓缩液与上清液的体积比控制在1:200^250,浓缩液倒入澄清过滤器进行过滤；
(4)滤液用质量浓度为9. 5^10. 5%的稀盐酸调节pH至4. O〜5. O之间，按滤液体积O. 59Π). 9%的量加入针剂用活性炭，搅拌，加热至80°C并保温30min，进行脱色；
(5)先用钛棒滤炭后，再用装有O. 22 μ m微孔滤膜的平板滤器过滤，上述滤液再用FVRG75型富士滤器超滤，截留分子量约5000道尔顿，即得小牛血去蛋白提取物。
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0025] 实施例I :取小牛全血（濉溪县汇丰生物科技有限公司）2000ml，加纯化水3000ml，升温至80°C，不断搅拌并保温30min以灭活，冷却至常温后加入80%〜90%(v/v)乙醇8000ml，搅拌3h后，静置36h，分离约4000ml上清液，向母液再加入80%〜90%(v/v)乙醇8000ml，搅拌3h后，静置12h，分离上清液。上清液采用单效浓缩器进行减压浓缩，真空压力控制在O. 06Mpa左右，蒸汽压力控制在O. OlMPa以下，上清液浓缩温度控制在40°C左右，浓缩至浓缩液约50ml，即浓缩液与上清液的体积比控制约1:200，将浓缩液倒入澄清过滤器过滤，向滤液中加入质量浓度为9. 5^10. 5%的稀盐酸，调节pH至4. O,按浓缩液体积O. 5%加针剂用活性炭，不断搅拌，加热至80°C并保温30min，浓缩液先用钛棒滤炭，再用O. 22 μ m微孔滤膜的平板滤器进行过滤，最后采用富士滤器超滤，截留分子量约5000道尔顿，即得小牛血去蛋白提取物。
[0026] 实施例2 ：取小牛全血（濉溪县汇丰生物科技有限公司）2000ml，加纯化水4000ml，升温至80°C，不断搅拌并保温30min以灭活，冷却至常温后加入80%〜90%(v/v)乙醇10000ml，搅拌3h后，静置36h,分离约7000ml上清液，向母液再加入80%〜90%(v/v)乙醇10000ml,搅拌3h后，静置12h，分离上清液。上清液采用单效浓缩器进行减压浓缩，真空压力控制在O. OSMpa左右，蒸汽压力控制在O. OlMPa以下，上清液浓缩温度控制在50°C左右，浓缩至浓缩液约60ml,即浓缩液与上清液的体积比控制约1:250，将浓缩液倒入澄清过滤器过滤，向滤液中加入质量浓度为9. 5^10. 5%的稀盐酸，调节pH至5. 0，按浓缩液体积O. 9%加针剂用活性炭，不断搅拌，加热至80°C并保温30min，浓缩液先用钛棒滤炭，再用O. 22 μ m微孔滤膜的平板滤器进行过滤，最后采用富士滤器超滤，截留分子量约5000道尔顿，即得小牛血去蛋白提取物。
[0027] [0025]实施例 3 ：小牛血去蛋白提取物脱色采用活性碳吸附，为了达到理想的脱色效果，对活性炭使用量、溶液的PH值范围进行了考察，采用质量浓度为9. 5^10. 5%的稀盐酸使溶液呈弱酸性，然后向弱酸性溶液中加入针用活性炭，不断搅拌下加热至80°C并保温30min，对比例的试验条件见表I，其试验结果见表2。
[0028] 表I对比例的试验条件表2对比例I〜对比例5的试验结果
实施例4 ：赋形剂甘露醇对注射用小牛血去蛋白提取物成型性的考察取小牛血去蛋白提取物1000ml，加注射用水配制成每Iml约含40mg总固体的溶液，溶液分成四组，一组不加甘露醇，另外三组均加赋形剂甘露醇，甘露醇加入量为溶液总量(W/V)的1%、2%、4%，将分装好药液的西林瓶放入冻干柜内冻干，均采用实施例5所述的制备方法制备冻干粉针。结果见表3。
实施例4 ：赋形剂甘露醇对注射用小牛血去蛋白提取物成型性的考察取小牛血去蛋白提取物1000ml，加注射用水配制成每Iml约含40mg总固体的溶液，溶液分成四组，一组不加甘露醇，另外三组均加赋形剂甘露醇，甘露醇加入量为溶液总量(W/V)的1%、2%、4%，将分装好药液的西林瓶放入冻干柜内冻干，均采用实施例5所述的制备方法制备冻干粉针。结果见表3。
[0029] 表3甘露醇对注射用小牛血去蛋白提取物成型性的考察结果实施例5 ：
取按实施例2制备的小牛血去蛋白提取物溶液300ml，并制备成每Iml约含40mg总固体的溶液，每支约IOml溶液装入30ml的西林瓶中，将分装好药液的西林瓶放入冻干柜内冻干，先将冻干机冻干箱温度降至-40°C，再将样品放入箱内进行预冻，预冻时间：T4h，保证样品完全冻结，开启真空，进行升华干燥，此时温度维持在-20°C '40°C，持续时间为7〜10h，然后以每小时5°C升高温度至30°C，并于30°C保温8〜12h，且加塞及扎盖。
取按实施例2制备的小牛血去蛋白提取物溶液300ml，并制备成每Iml约含40mg总固体的溶液，每支约IOml溶液装入30ml的西林瓶中，将分装好药液的西林瓶放入冻干柜内冻干，先将冻干机冻干箱温度降至-40°C，再将样品放入箱内进行预冻，预冻时间：T4h，保证样品完全冻结，开启真空，进行升华干燥，此时温度维持在-20°C '40°C，持续时间为7〜10h，然后以每小时5°C升高温度至30°C，并于30°C保温8〜12h，且加塞及扎盖。
[0030] 实施例6 ：分别取实施例I和实施例2制备的小牛血去蛋白提取物进行吸光度、高分子量、呼吸活力以及刺激指数检测和分析。结果见表4。
[0031] 表4小牛血去蛋白提取物质量分析结果以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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