一种抗癌药物组合物及其制备方法
阅读：1024发布：2020-11-25
专利汇可以提供一种抗癌药物组合物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种抗癌药物组合物，它的活性成分由NDV粒子和NA组成,且NDV活性为106~107PFU/ml，NA活性为0.01~0.02u/ml。本发明所述的抗癌药物组合物具有抗 肿瘤 谱广、 治疗 作用显著，且无明显毒 副作用 ；又有免疫作用，而且对癌细胞具有直接杀伤作用的优点。本发明还提供所述抗癌药物组合物的制备方法。，下面是一种抗癌药物组合物及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种抗癌药物组合物，其特征在于：它的活性成分由NDV粒子和NA组成，且NDV活
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性为10~10PFU/ml，NA活性为0.01~0.02u/ml。
2.权利要求1所述的抗癌药物组合物，其特征在于：所述的抗癌药物组合物呈冻干制剂。
3.权利要求2所述的抗癌药物组合物，其特征在于：所述的冻干制剂进一步含有保护剂；所述的保护剂按占组合物总重量的百分比计包括明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖
10%、尿素0.5%和L-精氨酸0.2%。
4.权利要求1所述的抗癌药物组合物，其特征在于：它是瓶装冻干制剂，由活性成分和
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保护剂组成，所述的活性成分由NDV和NA组成；每瓶中，NDV活性为10~10PFU/ml，NA活性为0.01~0.02u/ml；所述的保护剂按占组合物总重量的百分比计包括明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素0.5%和L-精氨酸0.2%。
5.权利要求1所述的抗癌药物组合物，其特征在于：所述的NDV是按照以下方法制备得到的NDV：
a）原代NDV病毒的分离
选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒；
b）NDV毒种的传代
将步骤a）分离得到的NDV病毒以常规方法在9-11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代，直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液；
c）NDV病毒扩增
用步骤b）得到的NDV10代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤：
c1）按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液1；
c2）在步骤c1）得到的细胞悬液1内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养2天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液2；
c3）将步骤b）得到的NDV悬液以1/50~1/25的体积比加入步骤c2）得到的细胞悬液2中，36℃静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为
1:640~1:1280，滴度为6LogPFU/ml~7LogPFU/ml。
6.权利要求5所述的抗癌药物组合物，其特征在于：步骤c2）所述的细胞生长液配方如下，以100mL计：Eagle（MEM）60mL、0.5%水解乳蛋白溶液30mL、小牛血清5-10mL、pH值
7.2的2%NaHCO3 2mL和卡那霉素100U/mL；或199培养基90mL、小牛血清5-10mL、pH值7.2的2%NaHCO3 2mL和卡那霉素100U/mL。
7.权利要求5所述的抗癌药物组合物，其特征在于：步骤c2）所述的细胞维持液配方如下，以100mL计：Eagle（MEM）90mL、小牛血清3-5mL、pH值7.4-7.6的2%NaHCO3 3-5mL和卡那霉素100U/mL；或0.5%水解乳蛋白溶液90mL、小牛血清3-5mL、pH值7.4-7.6的2%NaHCO3
3-5mL和卡那霉素100U/mL；或199培养基90mL、小牛血清3-5mL、pH值7.4-7.6的2%NaHCO3
3-5mL和卡那霉素100U/mL。
8.权利要求1所述的抗癌药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
1）制备NDV悬液
1.1）选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒；分离得到的NDV病毒以常规方法在9-11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代，直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液；
1.2）NDV病毒扩增
用步骤1）得到的NDV10代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤：
1.2.1）按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液1；
1.2.2）在步骤1.2.1）得到的细胞悬液1内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养2天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液2；
1.2.3）将步骤1.1）得到的NDV悬液以1/50~1/25的体积比加入步骤1.2.2）得到的细胞悬液2中，36℃静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为1:640~1:1280，滴度为6LogPFU/ml~7LogPFU/ml，备用；
2）制备抗癌药物组合物
将步骤1）得到的NDV悬液中加入市售的NA，每3000mLNDV悬液中加入30~60U的NA，充分摇匀，然后将NDV和NA的混悬液用0.22μm微孔的滤膜过滤，得到滤液，然后将该滤液按照常规方法制备成药物学上可接受的各种剂型。
9.权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤2）所述的药物学上可接受的各种剂型是冻干粉剂，制备方法是在步骤2）得到的滤液中再进一步加入所述比例的保护剂，然后送到冻干室，立即分装小瓶，分为1ml/瓶，加胶塞；装入冻干机，按照冻干曲线操作；冻干完成后，轧紧胶塞和外加铝盖，即得到所述的抗癌药物组合物的冻干粉剂。
一种抗癌药物组合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药物组合物，具体涉及一种抗癌药物组合物，及其制备方法。
背景技术
[0002] 肿瘤，尤其是恶性肿瘤，治疗最主要的方法包括手术、放疗和化疗，但目前这些方法的疗效均不理想，一是局部治疗不彻底易复发；二是易发生远处转移；三是通常导致机体免疫功能降低。同时，这些治疗方法的创伤大，毒副作用大，病人难以接受。
[0003] 近几十年来，由于免疫学及其它相关学科的发展，出现肿瘤免疫治疗方法。但尚无统一标准，方法甚多，经验不多，疗效差异甚大。不过免疫治疗最大的优势在于能够阻止或逆转因外科手术、放疗和化疗所致的免疫抑制；引导产生或增强抗瘤免疫，打破免疫耐受，调整免疫反应功能。
[0004] 目前肿瘤免疫治疗的要点包括：1、肿瘤负荷量小，106~107的癌细胞有效。2、适应的剂量，攻击者对靶细胞的比例100：1，小者无作用，大者又抑制免疫细胞。3、联合治疗。
[0005] 肿瘤免疫治疗的方法包括：1、特异性免疫治疗，包括（1）被动免疫治疗（抗体治疗），（2）主动免疫治疗（瘤苗），（3）继承免疫（细胞治疗）；2、非特异性免疫治疗的制剂（目前应用比较多），包括：（1）微生物（细菌、病毒），（2）局部变态反应（二硝基氯苯）；3、细胞因子（白介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、淋巴因子、单核因子等）；4、抗瘤基因(Rb、P53、MCC、APC、DCC、MTSL)；5、调整基因(转移基因、抗转移基因、MHC基因)；6、其它(胸腺素等)。
[0006] 以上肿瘤免疫制剂有的处于研究阶段，有的已用于临床。存在的问题包括：1、寒颤与发烧；2、单独使用疗效差；3、致敏。
[0007] 上世纪六十年代中期，人们逐渐筛选到的有利用价值的病毒包括：风疹病毒、腮腺病毒、单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒、腺相关病毒、细小病毒B19等，它们对肿瘤细胞具有直接溶解作用。采用肿瘤局部或静脉注射的方式能够在一定程度达到杀伤或清除肿瘤的效果，即病毒的介入增强了肿瘤细胞免疫原性(抗原性)。但是，尽管机体在病毒治疗的初级阶段能够产生极其明显的抗肿瘤效应，然而随着病毒对肿瘤溶解作用的发挥，机体很快建立了针对病毒的免疫反应。而且大量病毒对机体产生的神经毒性反应导致的持续的寒颤和高烧无法回避。
[0008] 在上述背景下，本发明的研发人利用新城疫病毒（NDV）只感染人肿瘤细胞，不感染人正常细胞，且以“出芽”方式增殖的细胞非溶解性株对人体没有神经毒性作用等特点，采用新的制备方法研制出一种新型的抗癌生物制剂，获得了优异的效果。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于：提供一种抗癌的药物组合物，具有抗肿瘤谱广、治疗作用显著,且无明显毒副作用；又有免疫作用，而且对癌细胞具有直接杀伤作用的优点。
[0010] 本发明的另一个目的在于：提供所述抗癌药物组合物的制备方法。
[0011] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0013] 本发明所述的抗癌药物组合物优选呈冻干制剂。
[0015] 本发明所述的NDV，优选按照以下方法制备得到的NDV：
[0016] a）原代NDV病毒的分离
[0018] 分离得到的NDV成熟的病毒粒子呈圆形，直径100毫微米，囊膜上纤突长约8毫微6
米，病毒粒子内部为卷曲的核衣壳，直径17毫微米，核酸分子量7.5×10D，构型单链(单股)；RNA基因数14，多肽数6。NDV的化学组成(干物质)包括蛋白质65%、RNA4%、脂质25%、碳水化合物6%；NDV的核酸碱基组成为：腺嘌呤24%、鸟嘌呤24%、胞嘌呤23%、尿嘌呤29%；
NDV的多肽种类包括：糖蛋白G1 74KD、囊膜衣壳蛋白NP56KD、核衣壳糖蛋白G256KD、囊膜内膜蛋白M41KD；
米，病毒粒子内部为卷曲的核衣壳，直径17毫微米，核酸分子量7.5×10D，构型单链(单股)；RNA基因数14，多肽数6。NDV的化学组成(干物质)包括蛋白质65%、RNA4%、脂质25%、碳水化合物6%；NDV的核酸碱基组成为：腺嘌呤24%、鸟嘌呤24%、胞嘌呤23%、尿嘌呤29%；
NDV的多肽种类包括：糖蛋白G1 74KD、囊膜衣壳蛋白NP56KD、核衣壳糖蛋白G256KD、囊膜内膜蛋白M41KD；
[0019] b）NDV毒种的传代
[0020] 将步骤a）分离得到的NDV病毒以常规方法在9-11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代，直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液；
[0021] c）NDV病毒扩增
[0022] 用步骤b）得到的NDV10代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤：
[0023] c1）按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液1；
[0024] c2）在步骤c1）得到的细胞悬液1内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养2天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液2；
[0025] c3）将步骤b）得到的NDV悬液以1/50~1/25的体积比加入步骤c2）得到的细胞悬液2中，36℃静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为1:640~1:1280，滴度为6LogPFU/ml~7LogPFU/ml。
[0026] 步骤c2）所述的细胞生长液是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下（以100mL计）：Eagle（MEM）60mL、0.5%水解乳蛋白溶液30mL、小牛血清5-10mL、2%NaHCO3 2mL（pH值至7.2）、卡那霉素100U/mL；或用199培养基90mL代替上述Eagle（MEM）和0.5%水解乳蛋白液。
[0027] 步骤c2）所述的细胞维持液也是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下（以100mL计）：Eagle（MEM）90mL（或0.5%水解乳蛋白液90mL）、小牛血清3-5mL、2%NaHCO3 3-5mL（pH值7.4-7.6）、卡那霉素100U/mL；或用199培养基90mL代替Eagle或0.5%水解乳蛋白液。
[0028] 本发明所述的神经氨酸酶可以通过多种现有方法提取或合成得到，也可以通过市购获得。
[0029] 本发明还提供所述的抗癌药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0030] 1）制备NDV悬液
[0031] 1.1）选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒；分离得到的NDV病毒以常规方法在9-11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代，直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液；
[0032] 1.2）NDV病毒扩增
[0033] 用步骤1）得到的NDV10代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤：
[0034] 1.2.1）按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液；
[0035] 1.2.2）在步骤1.2.1）得到的细胞悬液内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养2天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液；
[0036] 所述的细胞生长液是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下（以100mL计）：Eagle（MEM）60mL、0.5%水解乳蛋白溶液30mL、小牛血清5-10mL、2%NaHCO3 2mL（pH值至7.2）、卡那霉素100U/mL；或用199培养基90mL代替上述Eagle（MEM）和0.5%水解乳蛋白液。
[0037] 所述的细胞维持液也是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下（以100mL计）：Eagle（MEM）90mL（或0.5%水解乳蛋白液90mL）、小牛血清3-5mL、2%NaHCO3 3-5mL（pH值7.4-7.6）、卡那霉素100U/mL；或用199培养基90mL代替Eagle或
0.5%水解乳蛋白液。
0.5%水解乳蛋白液。
[0038] 1.2.3）将步骤1.1）得到的NDV悬液以1/50~1/25的体积比加入步骤1.2.2）得到的细胞悬液中，36℃静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为1:640~1:1280，滴度为6LogPFU/ml~7LogPFU/ml，备用；
[0039] 2）制备抗癌药物组合物
[0040] 将步骤1）得到的NDV悬液中加入市售的NA，每3000mLNDV悬液中加入30~60U的NA，充分摇匀，然后将NDV和NA的混悬液用0.22μm微孔的滤膜过滤（这样既可以防止有细胞碎片和杂菌混入滤液中，又不会把NDV粒子滤去，以达纯化NDV目的），得到滤液，然后将该滤液按照常规方法制备成药物学上可接受的各种剂型。
[0041] 步骤2）所述的药物学上可接受的各种剂型，优选冻干粉剂，制备方法是在步骤2）得到的滤液中再进一步加入所述比例的保护剂，然后送到冻干室，立即分装小瓶，分为1ml/瓶，加胶塞；装入冻干机，按照冻干曲线操作；冻干完成后，轧紧胶塞和外加铝盖，即得到本发明所述的抗癌药物组合物的冻干粉剂，本发明人将其称为“双联生物抗癌冻干粉剂”，该冻干粉剂于-30℃以下贮存。
[0042] 本发明所述的抗癌药物组合物中，鸡新城疫病毒（NDV）具有只感染人肿癌细胞和提高机体非特异性免疫的作用，神经氨酸酶（NA）能去除肿瘤细胞表面糖蛋白末端唾液酸，提高免疫原性。本发明将二者结合，显著提高了抗癌疗效。
[0043] 由于鸡新城疫病毒缺乏自身所需的完整酶系统，增殖时必须靠宿主细胞合成核酸(RNA)和蛋白质，甚至直接利用宿主细胞的某些成份，这就决定了它在细胞内专性寄生的特性，而人和动物的肿瘤组织恰好为其所寄生的活细胞组织，所以该病毒能直接破坏癌细胞。同时，该病毒对肿瘤组织还有以下四种作用：1、机体产生抗病毒免疫反应时，该病毒能使机体或致敏淋巴结与感染的肿瘤细胞表面抗原起反应，破坏肿瘤细胞；2、该病毒是一种干扰素诱导剂，进入机体后，产生内源性干扰素，干扰素抑制肿瘤细胞增殖，引起肿瘤细胞行为的改变，使肿瘤细胞恶性变型逆转；同时产生肿瘤坏死因子，使肿瘤细胞破坏。3、间接和直接干扰肿瘤病毒；4、增强机体对肿瘤的非特异性免疫力。此外，当病毒进入癌细胞后，溶酶体膜的通透性增高，溶酶体渗出于癌细胞浆内，引起癌细胞自溶。
[0044] 新城疫病毒具有导向癌细胞作用的机理：1、新城疫病毒具有对增殖旺盛的肿瘤细胞特异的感染性；2、病毒粒子的胺基与肿瘤细胞膜中增高的环磷鸟甙的磷酸基易结合；3、带正电荷的病毒粒子与带负电荷的肿瘤细胞相吸引，形成静电结合；4、病毒粒子膜中含有脂质体，是天然的导向介质。
[0045] 总之，NDV可以提高机体免疫力，激活机体自然杀伤细胞活性和淋巴细胞及巨噬细胞的作用，但这些细胞无法识别表面含有唾液酸的癌细胞，无法发挥间接杀伤作用。
[0046] 本发明药物组合物中的神经氨酸酶（NA），能去除肿瘤细胞表面糖蛋白末端唾液酸，从而消除了识别抗原的空间障碍，使瘤细胞表面抗原外露而提高其免疫原性，也有利于发挥机体免疫活细胞的攻击作用。加之能使细胞表面电荷减少，硬度降低和变形增加，从而易为巨噬细胞所吞噬。但肿瘤患者的免疫力低下，虽然免力细胞可以识别，却无力消灭，所以NA的单独抗癌效果不佳，只能作佐剂。
[0047] 本发明的抗癌药物组合物使新城疫病毒NDV和霍乱弧菌提取的神经氨酸酶NA联合，二者协同作用，能够导向靶细胞（肿瘤细胞）直接杀伤，又能够去除靶细胞（肿瘤细胞）表面伪装膜唾液酸，使癌细胞表面抗原外露，利于机体免疫活细胞的攻击，由此显著提高了抗癌效果。本发明的抗癌药物组合物治疗荷瘤小鼠的肿癌抑制率可达到55~85%。
[0048] 总之，本发明的抗癌药物组合物在治疗肿瘤方面具有以下显著特点：
[0049] 1、直接杀伤肿瘤细胞。
[0050] 2、间接杀伤瘤细胞(免疫作用)(1)特异性，NDV感染肿瘤细胞，提高了肿瘤细胞的免疫原性。(2)多价性，NDV与肿瘤结合，形成内源性多价疫苗，更易获得有效的抗肿瘤反应。(3)NDV进入人体后，激活机体免疫细胞释放白细胞介素-2、干扰素(α、β、γ)肿瘤坏死因子、集落刺激因子。(4)NDV进入人体后，激活机体内自然杀伤细胞活性(NK细胞、LAK细胞、K细胞)。(5)NDV进入人体后，激活机体T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞的抗肿瘤作用。
[0051] 3、安全性，由于该病毒属于一种禽类副黏膜病毒，其基因组不与人细胞DNA整合，没有人工转基因的风险，且不能在人正常细胞中复制，对人无感染性。
[0052] 4、神经氨酸酶，对多种肿瘤细胞膜具有吸附作用，增强肿瘤细胞表面抗原性，发挥机体免疫细胞识别肿瘤细胞而杀灭。
[0053] 5、协同性，这种制剂治疗肿瘤可增强化学治疗药物向肿瘤组织内渗透，提高病灶局部药物浓度。长期配合化疗、减少化学药物用药剂量，降低化疗对人体的毒副作用。
[0054] 6、控制癌瘤转移和复发。
[0055] 此外，现有技术中，本发明的发明人曾研制过同类的抗癌药物组合物，但它们都是由多种成份组成，各成份之间是否会发生反应，形成新的物质，目前还无法确定。而且这些现有技术中的鸡新城疫病毒（NDV）都是利用鸡胚尿囊液培养得到的，收集的病毒液中含有尿酸和鸡胚血红蛋白，无法除去，形成无法克服的毒副作用；而且这种培养方式只能在实验室进行，必然导致生产量少，成本高，易污染。本发明的制备方法采用了不同于以往的“鸡胚原代单层细胞培养法”生产鸡新城疫病毒（NDV），克服了现有技术的弊端和局限性。而且本发明的药物组合物去掉了有可能导致不确定反应发生的多种成份，由此也简化了工艺、降低了成本，避免了各成份之间的不确定反应的发生。
[0056] 总之，与现有技术相比，本发明抗癌组合物突出的有益效果表现在NDV组分的纯度得到了显著的提高，由此使得组合物对小鼠多种恶性肿瘤的抑瘤率，比现有的多种复杂成分的抗癌制剂，平均提高了18-25%。
具体实施方式
[0057] 实施例1.
[0058] 一种双联生物抗癌冻干粉剂，由活性成分和保护剂组成，每瓶的活性成分是NDV6
和NA组成，NDV的活性为10PFU/ml，NA的活性为0.01u/ml；每瓶的保护剂是由以下重量百分比的组分组成：明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素0.5%和L-精氨酸0.2%。
和NA组成，NDV的活性为10PFU/ml，NA的活性为0.01u/ml；每瓶的保护剂是由以下重量百分比的组分组成：明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素0.5%和L-精氨酸0.2%。
[0059] 所述的双联生物抗癌冻干粉剂，由以下具体方法制备：
[0060] 一、鸡新城疫病毒(NDV)：制备方法和检定
[0061] （一）原代鸡新城疫病毒的选择和培养
[0062] 首先选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡。然后，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒。
[0063] 选择健康母鸡孵育的鸡胚，最好为9~10日龄的鸡胚，将上述分离的鸡新城疫病毒接种于鸡胚的尿囊腔中。置于37~38℃下培养48~72小时，至胚尿囊腔内含大量病毒。
[0064] 从鸡胚尿囊腔中抽出尿囊液，利用血凝集试验方法，测定血凝效价（HA）；利用血凝集抑制试验方法，进行病毒定性。-30℃保存，供扩增用毒种。
[0065] 经上述分离得到的鸡新城疫病毒（NDV），成熟的病毒粒子呈圆形，直径100毫微米，囊膜上纤突长约8毫微米，病毒粒子内部为卷曲的核衣壳，直径17毫微米，核酸分子量6
7.5×10D，构型单链(单股)。RNA，基因数14，多肽数6。NDV的化学组成(干物质)蛋白质65%、RNA4%、脂质25%、碳水化合物6%。NDV核酸碱基组成：腺嘌呤24%、鸟嘌呤24%、胞嘌呤23%、尿嘌呤29%。NDV多肽种类：糖蛋白G1 74KD、囊膜衣壳蛋白NP56KD、核衣壳糖蛋白G2
56KD、囊膜内膜蛋白M41KD。
7.5×10D，构型单链(单股)。RNA，基因数14，多肽数6。NDV的化学组成(干物质)蛋白质65%、RNA4%、脂质25%、碳水化合物6%。NDV核酸碱基组成：腺嘌呤24%、鸟嘌呤24%、胞嘌呤23%、尿嘌呤29%。NDV多肽种类：糖蛋白G1 74KD、囊膜衣壳蛋白NP56KD、核衣壳糖蛋白G2
56KD、囊膜内膜蛋白M41KD。
[0066] （二）扩增（鸡胚单层原代细胞培养法），用NDV10代以内的生产用毒种。
[0068] 2、取鸡胚：9-10日龄来亨鸡胚蛋，用1:1000新洁尔灭溶液擦洗2次，气室朝上放蛋架上送入无菌室，用5%碘酒涂擦气室部蛋壳，稍候干，用75%酒精消毒，待干后无菌操作剥去气室部蛋壳，除去卵膜，以镊子取鸡胚入大平皿中，去头和内脏，在另一平皿内用洗液洗一次。
[0069] 3、剪胚：将上述鸡胚放入广口瓶内，盖上剪胚布，用剪剪碎至1-2mm大小，加入适量0.1%LE液(在大罐内用2.6克/万mL(w/v)碳酸氢钠校好pH为7.0-7.2)，轻轻摇洗，倒入三角瓶中，静止2-3分钟，倾去上清，再洗第二次，倾去上清。
[0070] 4、消化：向三角瓶中加入已预温至37℃胰酶溶液(以1:4比例，将胰酶溶液与欧氏液混合，用2%碳酸氢钠溶液3.5-4.0%(V/V)，较pH7.4-7.6，每个鸡胚加4-6mL，计算加量)，37-38℃水浴箱中消化25-30分钟，中间至少振摇一次。弃上清胰酶，再用pH7.2的0.1%LE液洗三次，倾去洗液。
[0071] 5、分散吹打：加入pH7.2的0.1%LE适量，用吹打管吹打三次。每次约30-40下，分散后的细胞，加入LE液400mL，摇匀，静置让大块组织下沉。将三次吹打所得的细胞悬液收集于2000mL毒素瓶中，用抽滤法将细胞悬液抽入瓶内已扎有8层纱布囊的大立瓶中。
[0072] 6、校正大罐中0.1%LE的pH：将大罐中已灭菌有0.1%LE液加入终浓度为2.6g/万mLNaHCO3(事先按比例称好，溶于2000mL蒸馏水中，单独0.105 MPa30分钟灭菌，用时无菌手续加入大罐)使pH为7.2±0.1，并打样作无菌试验。
[0073] 7、细胞培养：在装有步骤5得到的细胞悬液的玻璃瓶内按一次培养的总量(3000ml×X瓶)加入细胞生长液，分成容量为500ml的Y瓶。混匀后(取5-10mL灭菌中管检查支原菌)分装于l万mL大瓶中呈细胞悬液500mL，塞上橡皮塞，扎上牛皮纸，振摇后放置37℃定温室(或培养箱)，静止培养2天。所述的细胞生长液配方如下（以100mL计）：Eagle（MEM）60mL、0.5%水解乳蛋白溶液30mL、小牛血清5-10mL、2%NaHCO3 2mL（pH值至
7.2）、卡那霉素100U/mL；或用199培养基90mL代替上述Eagle（MEM）和0.5%水解乳蛋白液。
7.2）、卡那霉素100U/mL；或用199培养基90mL代替上述Eagle（MEM）和0.5%水解乳蛋白液。
[0074] 8.洗换：细胞培养两天后形成单层。即可用无菌手续倾去生长液，加入2000ml已预温的欧氏液，(pH7.2~7.4)将细胞瓶滚动2~3圈，使洗液尽可能洗涤残余牛血清，再重复洗一次，并用洗液浸泡过夜，或者将培养瓶倒立，用洗液加适当压力冲洗(但不能使细胞脱落)，冲洗残余牛血清。加入细胞维持液，得到细胞悬液。所述的细胞维持液配方如下（以100mL计）：Eagle（MEM）90mL（或0.5%水解乳蛋白液90mL）、小牛血清3-5mL、2%NaHCO3 3-5mL（pH值7.4-7.6）、卡那霉素100U/mL；或用199培养基90mL代替Eagle或0.5%水解乳蛋白液。
[0075] 9、接种：步骤（一）得到的NDV尿囊液以1/50~1/25(V/V)的比例接种于步骤8得到的细胞悬液中，每大瓶换入量不超过3000ml，塞好橡皮塞，扎好牛皮纸，继续放36℃静止培养。2~3天后，观察病变，+++以上者，收入2~10℃冷库即得生产用NDV。
[0076] 注①FL细胞长成单层后，吸出生长液，反复用洗液冲洗，清除残余牛血清。以后加入细胞维持液和NDV毒种(100ml维持液加1:320，4mL；1:640，2mL)。
[0077] ②每100ml生长液中加鸡胚1~1.5个
[0078] ③细胞长成单层2-7天，NDV复制培养2-3天。
[0079] （三）检定
[0080] NDV悬液血凝效价和滴度及无菌试验检定合格指标。
[0081] 血凝效价（HA）1:640~1:1280
[0082] 滴度6LogPFU/ml~7LogPFU/ml
[0083] 无菌试验阴性
[0084] 二、双联生物抗癌制剂成品制备
[0085] （一）NDV悬液和NA混悬液制备
[0086] 在3000ml步骤一得到的NDV悬液（滴度6LogPFU/ml~7LogPFU/ml，血凝效价（HA）1:640~1:1280）中加入市售的神经氨酸酶（NA）30~60单位（U），得到NDV和NA的混悬液，然后用0.22μm滤膜过滤除菌和细胞碎片。
[0087] （二）冻干保护剂的制备
[0088] 冻干保护剂占NDV和NA混悬液的总重量的百分比浓度分别为：。
[0089] 明胶1% 味精1% 人白蛋白1%
[0090] 蔗糖10% 尿素0.5% L-精氨酸0.2%
[0091] （三）半成品的制备
[0092] 过滤后的NDV和NA混悬液与冻干保护剂按比例配制成半成品。
[0093] （四）成品的制备
[0094] 半成品送到冻干室，立即分装小瓶（1ml），加胶塞；装入冻干机，按照冻干曲线操作；冻干完成后，轧紧胶塞和外加铝盖。贴标签、装盒，-30℃以下贮存。NDV滴度在6 7
10PFU~10PFU，NA的活性为0.01~0.02u。
10PFU~10PFU，NA的活性为0.01~0.02u。
[0095] 【成品检定】
[0096] 1检定用物品、液体的制备
[0097] 干烤灭菌：10mL、5mL、1mL吸管，吹打管(尖端弯曲)。
[0098] 制备细胞生长液（以100mL计）：
[0099] Eagle（MEM）60mL
[0100] 0.5%水解乳蛋白溶液30mL
[0101] 小牛血清5-10mL
[0102] 2%NaHCO3 2mL，pH值至7.2
[0103] 卡那霉素100U/mL
[0104] （或用199培养基90mL，代替Eagle（MEM）和水解乳蛋白液）。制备细胞维持液（以100mL计）：
[0105] Eagle（MEM）90mL（或0.5%水解乳蛋白液90mL）。
[0106] 小牛血清3-5mL
[0107] 2%NaHCO3 3-5mL，pH值7.4-7.6
[0108] 卡那霉素100U/mL
[0109] （或用199培养基90mL代替Eagle或0.5%水解乳蛋白液）。
[0110] DiFFCO酶粉110单位，加1000mLPBS，完全溶解后除菌过滤，分装安瓶10mL/支，-20℃保存，无菌试验合格，活力单位测定后备用，超过3个月，复测活力。
[0111] 2.检定方法和标准
[0112] 冻干后抽样18-30瓶分别置于4℃和37℃存放一周进行成品检定。
[0113] 2.1物理检定方法和标准
[0114] 方法：肉眼观察
[0115] 标准：冻干型呈乳酪色固体；用1mL生理盐水溶解速溶，溶解后呈橙黄色的澄清液体，无异物和沉淀，不混浊。
[0116] 2.2pH值测定方法和标准
[0118] 标准：pH值应为7.0±0.5
[0119] 2.3热原质试验（发热试验）
[0120] 方法：按照《生物制品热原质试验规程》进行。家兔注射剂量=（人用剂量÷50）×20×家兔体重（kg)。
[0121] 结果 家兔注射实施例1得到的抗癌制剂的剂量=(1mL÷50)×20×家兔体重（2-3kg），每只家兔平均体温升高＜1℃ 3只总和升高＜2.5℃
[0122] 2.4支原菌检查
[0123] 方法：将0.2-0.4%琼脂猪胃消化液半固体培养基水浴煮沸10-15分钟，冷却至56℃；加入血清和酵母浸液，摇匀，冷却至37℃。种入实施例1的抗癌制剂0.5-1.0毫升，
37℃培养14天判定结果。
37℃培养14天判定结果。
[0124] 标准：无菌生长。
[0125] 2.5无菌试验
[0126] 方法：
[0128] （2）移种 中管酪素2管，每管接种大管酪素培养液0.4mL，37℃培养七天。中管猪肝斜2管，每管接种大管酪素培养液0.4mL，37℃培养七天。中管马丁2管，每管接种大管马丁培养液0.4mL，22℃培养七天。
[0129] 标准：各管均无菌生长
[0130] 2.6 安全试验
[0131] 2.6.1 豚鼠试验
[0132] 用体重300-400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射双联生物抗癌制剂0.5mL，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
[0133] 2.7 异常毒性试验
[0134] 腹腔注射5只体重17-22g小鼠和体重250-350g的豚鼠，每只小鼠注射实施例1得到的抗癌制剂1mL（1个人用剂量的6倍），每只豚鼠注射双联生物抗癌制剂5mL（1人个用剂量5倍）；动物至少存活7天以上，应无任何异常中毒反应。
[0135] 2.8 血凝效价测定（HA）
[0136] 2.8.1 试验准备
[0137] 双联生物抗癌制剂
[0138] 红细胞：采自健康公鸡血液（每次可采5-10mL）。
[0139] 以生理盐水洗涤3-5次，每次以3000r/min离心5-10分钟，将血浆和白细胞等充分洗去，将沉淀的红细胞用生理盐水稀释成1%悬浮液。
[0140] 灭菌的生理盐水或pH6.5-7.2磷酸盐缓冲液。
[0141] 2.8.2 试验操作
[0142] 2.8.2.1 红细胞凝集试验
[0143] 取圆底小试管9支，第一管加生理盐水0.9毫升，以后各管均加0.5毫升。在第一管中加入双联生物抗癌制剂0.1毫升，用吸管稀释混匀后，再吸出0.5毫升加入第二管中，在第二管内用吸管稀释混匀后，再吸出0.5毫升加入第三管中，依此稀释到第八管。由第八管吸出0.5毫升弃去。第九管不加双联生物抗癌制剂，只加生理盐水。这样，则双联生物抗癌制剂的稀释倍数分别为1:10、1:20、1:40……1:1280。然后向各个不同倍数的双联生物抗癌制剂管中加入1%红细胞悬液0.5毫升，充分振荡后，置于20℃-30℃条件下，15分钟后检查结果，并记录。
[0144] 2.8.2.2.判定标准和注意事项
[0145] 1）判定时，应首先检查对照各管是否正确，如正确则证明操作无误。
[0146] 2）红细胞凝集，红细胞分散在管底四周呈颗粒状凝集者，为阳性“+”。
[0147] 3）双联生物抗癌制剂红细胞凝集要求1-7管出现阳性。
[0148] 4）无凝集，红细胞集中管底呈圆盘状，为阴性。
[0149] 5）双联生物抗癌制剂的凝集效价为1：640~1：1280。。
[0150] 2.9水分测定
[0151] 2.9.1费休氏试剂配制：
[0152] 于干燥的1000mL玻璃容器内，加入碘42.33g，无水吡啶133.3mL（吡啶200mL，加苯40mL，加热蒸馏，收集114-116℃馏出的吡啶，含水量应在0.1%以下），加塞，摇振到碘全部溶解。加无水甲醇333.3mL（甲醇1000mL，加金属镁15g，二氯化汞0.4或碘0.5g，回流2-4小时，然后蒸馏，收集46-64℃馏出的甲醇，含水量应在0.05%以下）。称定重量，将瓶置于水浴，用封闭装置导入经浓硫酸脱水的二氧化硫，到重量增加32克为止，注意避光保存。
[0153] 2.9.2标准水的制备：
[0154] 于经干燥处理50mL容量瓶中，精密称取0.4g双蒸馏水，用无水甲醇稀释到刻度，密封保存，取标准水1mL与无水甲醇5mL分置于经干燥处理的带塞玻璃中，用费休氏试剂滴定到呈棕黄色为止。称取水重为Amg的1mL标准水所需费氏试剂为BmL，5mL无水甲醇所需费氏试剂为CmL。
[0155] 每mL费休氏试剂相当于水的mg为 1mL标准水之含水量（mg）=N×B
[0156] 2.9.3水分测定：
[0157] 称取干燥制品0.1g-0.5g于干燥带塞玻璃瓶中，加无水甲醇5mL，不断振摇，用费休氏试剂滴定到棕色，经振摇1分钟不褪色为终点。并取无水甲醇5mL为对照（空白对照）取标准水1mL于干燥带塞玻璃瓶中，用费休氏试剂滴定到终点。
[0158] 费休氏试剂效价
[0159] 水分测定计算公式：
[0160]
[0161]
[0162] 注：（1）新配制的费休氏试剂极不稳定，应放一周后使用。另外此试剂异常灵敏，受空气湿度影响甚大，故滴定操作应在相对湿度低于30%的条件下进行。
[0163] （2）所用仪器均应干燥无水，全部操作尤其是标准水的吸取和滴定等应迅速准确，以免延时，吸水，影响结果。
[0164] 2.10 滴度测定（PFU-空斑法）
[0165] 2.10.1 材料与用具准备：
[0166] 细胞：鸡胚原代细胞；
[0167] 小牛血清；
[0168] 100mL小方瓶，大克氏瓶，聚苯乙烯6孔板；
[0169] 1mL、10mL吸管、镊子、0号橡皮塞等。
[0170] 2.10.2各种溶液的配制
[0171] 2.10.2.1 0.25%的胰蛋白酶消化液
[0172] Hanks液 75mL
[0173] 1%的胰蛋白酶 25mL
[0174] 7.5%的NaHCO3 2mL
[0175] 2.10.2.2 0.5%水解乳蛋白溶液（LH）
[0176]
[0177] 将上述液体混合后，以0.05-0.06MPa 20分钟消毒灭菌，4℃保存。
[0178] 2.10.2.3 10×E-MEM母液
[0179] E-MEM粉剂 9.4g
[0180] 双馏水 100mL
[0181] 将上述液体混匀后，定量分装，0.05-0.06MPa 20分钟消毒灭菌4℃保存。
[0182] 2.10.2.4 3%的谷氨酰胺
[0183] L-谷氨酰胺 3g
[0184] 双馏水 100mL
[0185] 将上述液体混匀后，除菌过滤，定量分装后加盖胶塞4℃保存
[0186] 2.10.2.5 7.5%NaHCO3
[0187] NaHCO3（AR）7.5g
[0188] 双馏水 100mL
[0189] 将上述液体混匀后，除菌过滤，定量分装后加盖胶塞4℃保存
[0191] 甲基纤维素 1.5g
[0192] 双馏水 100mL
[0193] 0.05-0.06MPa 20分钟消毒灭菌后放4℃保存
[0194] 2.10.2.7 双联生物抗癌制剂稀释液
[0195] 0.5%LH 96mL
[0196] 小牛血清（NCS） 2mL
[0197] 7.5%NaHCO3 2mL
[0198] 2.10.2.8 覆盖物配制
[0199]
[0200] 2.10.2.9 结晶紫染色液
[0201] （1）结晶紫母液 5%结晶紫
[0202] 结晶紫 25g
[0203] 无水酒精475mL
[0204] 将上液体混匀过滤去掉残渣
[0205]
[0206] 2.10.3 FL细胞的制备与培养
[0207] 2.10.3.1 细胞扩增：FL细胞发育良好的细胞1瓶，弃掉细胞营养液，加0.25%的胰蛋白酶Hanks液每小瓶4mL，置室温（22°-37℃左右）1-3分钟，吸弃消化液（一定要吸净），取10mL吸管（吸10mL营养液）吹打细胞，使其细胞分散后加入营养液，以1:3的比例（每小瓶加入20-30mL营养液）混均分装3小瓶37℃培养2-7天。
[0208] 2.10.3.2 接种6孔板：将其发育良好细胞瓶1:3的比例制备成细胞悬液（方法同上）接种在6孔聚苯乙烯板上每孔4mL，在37℃的2.5%CO2孵箱培养48小时，细胞长满形成单层后接种双联生物抗癌制剂冻干前原液和冻干后溶液。
[0209] 2.10.4 接种双联生物抗癌制剂冻干前原液和冻干后溶液
[0210] 2.10.4.1 每批双联生物抗癌制剂原液取样1份（不得少于50mL）10倍稀释，即-1 -6 -4 -5 -610 -10 ，取10 、10 、10 三个稀释度的双联生物抗癌制剂原液接种于6孔板，每个稀释度接种两孔，0.2mL/孔。
[0211] 2.10.4.2 每批冻干双联生物抗癌制剂至少取三瓶样品复原后（每瓶加入稀释液-1 -6 -4 -5 -61mL）混匀为原倍，10倍稀释，即10 -10 ，取10 、10 、10 三个稀释度的双联生物抗癌制剂原液接种于6孔板，每个稀释度接种两孔，0.2mL/孔。
[0212] 2.10.4.3 将4.1和4.2项已接种孔板的双联生物抗癌制剂，同时放入37℃吸附90分钟，每隔30分钟轻轻摇动一次。
[0213] 2.10.5 覆盖和染色
[0214] 吸附90分钟后，用甲基纤维素覆盖，4mL/孔，置37℃的2.5%CO2孵箱中培养，5天后吸出覆盖物，结晶紫染色（每孔加入染色使用液5mL，放置室温10-20分钟）后，流水冲洗染色液，再进行空斑计数。
[0215] 2.10.6 空斑计数及判定
[0216] 例：空斑形成试验计算表
[0217] 2.10.6.1 以出斑数为10倍数稀释度进行计算。
[0218]
[0219] 2.10.6.22 2.5斑/孔×（1mL÷0.2mL）=112.5个斑/mL
[0220] 2.10.6.3 实施例1的抗癌制剂的滴度（活性或效力）为112.5×10-5即对数值为7.0LogPFU/mL，查112.5的对数为2.0，故2.0+5=7.0，所以，实施例1的抗癌制剂为106PFU/mL~107PFU/ml。
[0221] 2.10.6.4 标准取10-3、10-4、10-5。
[0222] 要求取10-4、10-5、10-6。
[0223] 2.11 效力稳定性试验
[0224] 方法：空斑法。
[0225] 标准：
[0226] 实施例1的抗癌制剂置4℃X月后效力：
[0227] 3个月 6个月 12个月
[0228] ≥7.0LogPFU/1.0mL ≥7.0LogPFU/1.0mL ≥6.0LogPFU/1.0mL
[0229] 注：保存一年的实施例1的抗癌制剂与同一制剂第一次滴定效力相比，下降未超过1个滴度合格。
[0230] 2.12 残余牛血清蛋白含量检测
[0231] 标准：残余牛血清蛋白含量≤50ng/mL.
[0232] 2.13 保存与效期
[0233] 4℃以下暗处保存，运输应在冷藏条件下进行。实施例1的抗癌制剂效期由其第一次滴定之日起为一年。
[0234] 实施例2.
[0235] 一种双联生物抗癌冻干粉剂，由活性成分和保护剂组成，每瓶的活性成分是NDV和NA，其中NDV活性为107PFU/ml，NA活性为0.02u/ml；每瓶的保护剂是由以下重量百分比的组分组成：明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素0.5%和L-精氨酸0.2%。
[0236] 其制备方法中，除了NDV和NA混悬液制备时两者比例不同外，其他与实施例1大致相同。
[0237] 应用效果试验
[0238] I.瘤内注射本发明实施例1的制剂对肿瘤模型抑瘤率的效果试验
[0239] 【材料与方法】
[0240] 1.受试药物：本发明实施例1制备的冻干粉制剂。棕瓶分装，含1mg/瓶。使用时用生理盐水溶解后注射。
[0241] 2.瘤株：人源肺癌（A-549）、胰腺癌（PANC-1）、鼠源肠癌（C26）、人源肝癌（7402）、肾癌细胞系（Ren-Ca），由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
[0242] 3.动物：Balb/C-nu裸鼠、Balb/C近交系鼠，由中国医学科学院实验动物研究所购得；Balb/C-nu裸鼠雄性，体重15-17g，Balb/C近交系鼠雌性，体重17-18g。
[0243] 4.肿瘤移植：上述各瘤株氮复苏后，经3-4次传代培养，按常规方法接种后形成13
厘米大小实体肿瘤，断颈处死小鼠，70%酒精浸泡1分钟，无菌条件下剥离肿瘤，剪切成1mm大小的组织块，选择新鲜无坏死的肿瘤组织，接种于健康裸鼠右侧腋窝皮下，其中鼠源肠癌
6
（C26）瘤株制备成细胞悬液后，以2×10 细胞/只的剂量接种；肾癌细胞系（Ren-Ca）剪切
7 6
后的肿瘤组织制成细胞浓度为1×10/mL的细胞悬液，接种量为0.1ml（1×10/mL）。
厘米大小实体肿瘤，断颈处死小鼠，70%酒精浸泡1分钟，无菌条件下剥离肿瘤，剪切成1mm大小的组织块，选择新鲜无坏死的肿瘤组织，接种于健康裸鼠右侧腋窝皮下，其中鼠源肠癌
6
（C26）瘤株制备成细胞悬液后，以2×10 细胞/只的剂量接种；肾癌细胞系（Ren-Ca）剪切
7 6
后的肿瘤组织制成细胞浓度为1×10/mL的细胞悬液，接种量为0.1ml（1×10/mL）。
[0244] 5.实验分组、给药方式及给药剂量：
[0245] 5.1人源肺癌（A-549）、胰腺癌（PANC-1）、鼠源肠癌（C26）、人源肝癌（7402）小鼠各分为2组：
[0246] 生理盐水组（10只）——瘤内注射生理盐水0.1ml；
[0247] 试验组（10只）——瘤内注射50mg/kg体重，将本发明实施例1制备的冻干粉剂溶于生理盐水的溶液准确注射到瘤床或肿瘤中心。
[0248] 5.2肾癌细胞系（Ren-Ca）小鼠分为2组：
[0249] 生理盐水组（10只）——瘤内注射生理盐水0.1ml；
[0250] 实验组（10只）——瘤内注射8mg/kg体重，将本发明实施例1制备的冻干粉剂溶于生理盐水的溶液准确注射到瘤床或肿瘤中心。
[0251] 人源肝癌（7402）小鼠各组于接种肿瘤后一周，肿瘤平均体积达到80mm3次日开始给药，每天1次，共25次；其余各组均自接种肿瘤后次日开始给药，每天1次，共16次。
[0252] 6.检测指标：
[0253] 肿瘤抑制率%：终止治疗后次日，各组动物断颈处死，剥离肿瘤体称重。按以下公式计算肿瘤抑制率：
[0254] 肿瘤抑制率%=（生理盐水组平均瘤重-实验组平均瘤重）/生理盐水组平均瘤重×100%
[0255] 【实验结果】：
[0256] 表1.瘤内注射本发明实施例1的抗癌制剂的抑瘤活性
[0257]
[0258] 从上述实验可得，本发明实施例1制备的抗癌药物冻干粉剂对上述各种肿瘤模型均具有较高的抑瘤率。其中，人源肺癌肿瘤抑制率已接近常用化疗药物环磷酰胺的抑瘤效果，但毒性远远低于环磷酰胺；人源肝癌肿瘤实验中观察到肿瘤内注射后肿瘤明显滞长，实体肿瘤表面可见区域性液化现象；肾癌瘤内注射后，小鼠的肿瘤生长缓慢或表现滞长。
[0259] II.本发明实施例1的抗癌制剂对小鼠肝癌（H22）模型的抑瘤率和生命延长率的影响
[0260] 实验动物：健康km小鼠，雌雄各半，共24只，体重18-22g，SPF级，由中国医学科学院放射研究所实验动物中心提供。
[0261] 肿瘤模型：小鼠肝癌（H22）
[0262] 实验方案及疗效评价：
[0263] 1.接种：选择肿瘤生长旺盛且无溃破、健康情况良好的荷瘤小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒和酒精消毒小鼠皮肤。切开皮肤，无菌条件下在超净台内剥离肿瘤；将肿瘤切成直径2mm左右的小块，按1:2的比例加入无菌生理盐水，用组织匀浆器制成细胞悬7
液，将浓度配制成1×10 个细胞/毫升，于km小鼠腋窝皮下接种0.2ml，接种肿瘤前用碘酒和酒精消毒接种部位的皮肤。
液，将浓度配制成1×10 个细胞/毫升，于km小鼠腋窝皮下接种0.2ml，接种肿瘤前用碘酒和酒精消毒接种部位的皮肤。
[0264] 2.分组：接种后次日将实验动物随机分组，分为生理盐水组和实验组，每组12只，雌雄各半。22 7
[0265] 另取接种后第8天的H 腹水型瘤株，抽取瘤液，配制成1×10 个细胞/毫升，于km小鼠腋窝皮下接种0.2ml，用于观察每日小鼠死亡情况，并记录死亡时间。
[0266] 3.给药：三组均腹腔注射给药，剂量为25mg/kg体重，每日1次，连续给药10天。
[0267] 4.疗效评价：抑瘤率观察组停药24小时后处死小鼠，称体重、瘤重，计算抑瘤率（计算方法同上），抑瘤率如果＞30%，且P值＜0.05，则证明该药物对肿瘤有一定疗效；存活期观察组的小鼠，生命延长率计算公式如下：
[0268] 生命延长率%=（实验组存活天数-生理盐水组存活天数）/生理盐水组存活天数×100%。
[0269] 5.实验结果
[0270] 表2.腹腔注射实施例1的冻干粉抗癌制剂对小鼠肝癌（H22）的抑瘤作用
[0271]
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