一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法
阅读：269发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于抑制缺 氧 下精子生成减少技术领域，公开了一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，使用VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象，通过低氧的诱导构建缺氧性精子生成减少模型；分离实验小鼠的曲精小管精母细胞作为研究对象，低氧体外刺激，运用western blot、免疫细胞化学、qPCR技术验证VHA抑制精母细胞表达DR5的调节作用和分子机制。本发明提供的一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，明确了缺氧抑制VHA在缺氧性精子生成减少中的作用及其对抑制DR5的表达的分子机制，为 治疗 缺氧性精子生成减少提供必要的理论依据和新的治疗策略。，下面是一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法专利的具体信息内容。
1.一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法包括以下步骤：
步骤一，利用VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠为对象，通过低氧的诱导构建缺氧性精子生成减少模型，比较两种小鼠的曲精小管病损情况，DR5表达水平；
步骤二，运用VHA阻断剂为手段，将C57BL/6小鼠分为两组，一组行VHA阻断剂处理，另一组以生理盐水作为对照，比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及DR5的表达水平，确定VHA在缺氧性精子生成减少中的作用；
步骤三，分离VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管精母细胞为对象，低氧体外刺激，运用western blot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组精母细胞表达DR5的能力，体外佐证缺氧性精子生成减少模型中，VHA抑制精母细胞表达DR5的调节作用和分子机制；
步骤四，体外低氧单独或联合VHA单抗刺激小鼠曲精小管原代精母细胞系和小鼠精母细胞株，比较两刺激组间DR5的表达水平，明确VHA对DR5的调节作用；
步骤五，在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA对DR5的抑制作用后，探寻其可能抑制机制，通过芯片提示VHA基因敲除小鼠体内JNK信号途径活化程度显著高于野生型小鼠的结果，实验佐证VHA调节性抑制DR5表达是依赖JNK信号途径予以完成；
步骤六，在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA作用后，使用VHA激动剂体内促进VHA表达。
2.如权利要求1所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤一-步骤二中，所述明确VHA在缺氧性精子生成减少中作用的方法包括：
(1)比较缺氧性精子生成减少病人和健康对照者精液VHA表达水平及曲精小管损伤程度；
(2)建立低氧诱导的WT小鼠和VHA基因敲除小鼠缺氧性精子生成减少模型；
(3)观察WT小鼠和VHA基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化；
(4)分析VHA阻断剂在低氧诱导缺氧性精子生成减少中的作用。
3.如权利要求2所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述比较缺氧性精子生成减少病人和健康对照者精液VHA表达水平及曲精小管损伤程度包括：收集精液，采用ELISA活性检测方法检测并比较健康对照者及缺氧性精子生成减少病人精液VHA表达水平和精液中溶酶体膜相关糖蛋白水平及免疫印迹方法和免疫组织化学方法检测其曲精小管局部DR5表达水平，明确VHA在缺氧性精子生成减少发病中的重要作用。
4.如权利要求2所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述建立低氧诱导的WT小鼠和VHA基因敲除小鼠缺氧性精子生成减少模型包括：16至18g雄性小鼠采用10％氧浓度，每组共20只小鼠；分别于0、3、5、15天后分析小鼠的曲精小管病损指标，初步断定模型的建立是否成功。
5.如权利要求2所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述观察WT小鼠和VHA基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化包括：低氧诱导VHA基因敲除小鼠和WT小鼠后开始观察小鼠的活动状况，并于0、3、5、15天四个时相点将两组小鼠处死，分别收集两组小鼠低氧诱导不同时间的小鼠附睾曲精小管组织和性腺组织，ELISA检测两组小鼠不同时间点自噬性溶酶体指标，观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、TUNNEL染色镜下曲精小管和性腺病理改变，包括组织坏死程度，生殖细胞凋亡。
6.如权利要求2所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述分析VHA阻断剂在低氧诱导缺氧性精子生成减少中的作用包括：将野生型小鼠分为两组，一组体内注射VHA阻断剂，另一组体内注射生理盐水后同时对两组小鼠进行低氧诱导，比较两组小鼠刺激0、3、5、15天四个时相点曲精小管病损程度。
7.如权利要求1所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤三-步骤四中，所述体外明确VHA对DR5调节作用的方法包括：
(1)分离野生型小鼠及VHA基因敲除小鼠曲精小管精母细胞：小鼠曲精小管精母细胞的分离及培养、流式细胞技术检测小鼠曲精小管精母细胞上VHA的表达、体外检测低氧诱导野生型及VHA基因敲除小鼠原代细胞DR5的表达水平；
(2)体外检测低氧和VHA刺激性单抗诱导细胞系后DR5表达水平：分别用单独低氧和低氧+VHA单抗刺激细胞系，比较两刺激组细胞：
1)qPCR检测两刺激组细胞内DR5mRNA的转录水平；
2)WB检测两刺激组细胞内DR5蛋白表达水平。
8.如权利要求7所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述小鼠曲精小管精母细胞的分离及培养方法为：将10只8周龄体重为20-25g的野生型和VHA基因敲除雌性小鼠眼眶放血处死，分别附睾注射不含小牛血清的DMEM培养液
5ml-8ml，轻柔小鼠附睾部2-3min，无菌条件下，打开附睾，用注射器抽取附睾液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中培养并用显微镜观察细胞生存状态；
所述流式细胞技术检测小鼠曲精小管精母细胞上VHA的表达的方法为：收集小鼠曲精小管精母细胞，将得到的细胞用anti-FcγR处理，4℃30分钟，封闭非特异性抗体结合位点，按照抗体使用说明书要求，加入ATP与Trx荧光抗体于细胞悬液中，4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤两遍，洗去多余抗体，最后用100ulPBS重悬，标记好的细胞用FACSCanto II流式细胞仪检测，所得数据用FlowJo软件对细胞表型进行分析；
所述体外检测低氧诱导野生型及VHA基因敲除小鼠原代细胞DR5的表达水平具体包括：
用低氧刺激两组小鼠的曲精小管精母细胞，分别于0h，12h，24h：
(1)qPCR检测低氧刺激细胞后，细胞内DR5m RNA的转录水平；
(2)WB检测刺激后细胞DR5蛋白表达水平。
9.如权利要求1所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤五中，所述体外佐证VHA对DR5调节作用的分子机理具体包括：
(1)比较低氧诱导VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠不同时间点小鼠附睾曲精小管组织中JNK信号活化程度：
用低氧分别对VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠进行诱导，在0h，12h，24h时间点处死小鼠后分离小鼠附睾曲精小管组织，WB检测比较两组小鼠诱导不同时间点JNK信号通路的活化程度，筛选出缺氧性精子生成发病中JNK信号通路具体活化的信号途径，进而从体内明确VHA/(P)RR通路对JNK信号途径的调节作用；
(2)检测低氧诱导VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管精母细胞后，JNK信号活化程度：
采用曲精小管精母细胞的分离方法分离VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代细胞，并用低氧对其进行诱导，比较低氧诱导两组细胞后不同时间点细胞JNK信号通路的活化水平；
(3)比较低氧和VHA单抗诱导细胞系JNK信号表达水平：
分别用单独低氧或联合VHA单抗刺激细胞系，比较两刺激组细胞不同时间点JNK信号途径的活化情况；
(4)评价低氧诱导缺氧性精子生成减少模型中，JNK各信号通路阻断剂对DR5产生的影响：
选取精母细胞系作为研究对象，ELISA、WB实验比较低氧、VHA单抗、低氧+VHA、低氧+VHA+JNK刺激组刺激细胞后，细胞产生DR5的能力。
10.如权利要求1所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，其特征在于，步骤六中，所述体内分析VHA激动剂抑制DR5表达对缺氧性精子生成减少可能的治疗效果包括：野生型小鼠作分为两组，一组通过尾静脉注射的方式注射VHA激动剂，另一组用IgG作为对照，而后对两组小鼠进行低氧诱导；
(1)比较两组小鼠在低氧诱导后附睾曲精小管病损状况：
分别在两组小鼠低氧诱导后的0h，12h，24h处死小鼠，分离其附睾组织，石蜡包埋并切片，H/E染色显示两组小鼠附睾组织坏死程度，免疫组化染色显示其生殖细胞凋亡程度及TUNEL染色镜下附睾曲精小管病理改变，包括组织坏死程度，生殖细胞凋亡；
(2)观察两组小鼠低氧诱导后DR5表达情况：
在低氧诱导两组小鼠的0h，12h，24h处死小鼠，分别收集性腺、附睾组织，qPCR及免疫组化分析两组小鼠附睾组织中DR5的表达情况，比较其曲精小管中DR5的水平，明确VHA激动剂是否存在治疗作用。
一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于抑制缺氧下精子生成减少技术领域，尤其涉及一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法。
背景技术
[0002] 目前，最接近的现有技术：近年来移居青藏铁路沿线的人口越来越多，高原缺氧(乏氧性缺氧)环境对男性移居者生殖功能有显著负面影响，大量关于人类与大鼠精子生成数量减少现象已有报道。全世界研究高原男性生殖比较多的地区是南美洲安第斯山脉沿线、欧洲的阿尔卑斯山脉沿线和我国青藏高原沿线，一是这个领域比较冷门，业内在这方面的文献报道少，关注的少；二是大部分文献都是从局部缺氧角度来研究精子生成减少，例如在一些男科疾病如精索静脉曲张、睾丸扭转等就是缺血性缺氧方式，从全身缺氧方式研究精子生成减少的报道很少。以上资料只是表明缺氧引起精子生成减少(hypoxic spermatogenesis reduction,HSR)，但具体机制不清楚。
[0003] 综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中针对缺氧引起精子生成减少(hypoxic spermatogenesis reduction,HSR)的具体机制以及低氧诱导精母细胞凋亡的确切调控机制均尚不清楚。
[0004] 解决上述技术问题的难度：临床病人精液采集涉及病人隐私，需要通过严苛的医学伦理委员会审查，而且作为实验的对照组要招募志愿者，相关手续繁琐。
[0005] 解决上述技术问题的意义：对于防治全身性缺氧特别是高原男性人群精子生成减少提供了新策略和新靶点，VHA有望成为临床上干预精子生成减少的新靶标。
发明内容
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法。
[0007] 本发明是这样实现的，一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，所述VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法包括以下步骤：
[0008] 步骤一，结合临床缺氧性精子生成减少病人精液VHA下调结果，利用VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象，通过低氧的诱导构建缺氧性精子生成减少模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况，DR5表达水平，初步了解VHA在缺氧性精子生成减少模型中的作用。
[0009] 步骤二，运用VHA阻断剂作为研究手段，将C57BL/6小鼠分为两组，一组行VHA阻断剂处理，另一组以生理盐水作为对照，比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及DR5的表达水平，确定VHA在缺氧性精子生成减少中的重要作用。
[0010] 步骤三，分离VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管精母细胞作为研究对象，低氧体外刺激，运用western blot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组精母细胞表达DR5的能力，体外佐证缺氧性精子生成减少模型中，VHA抑制精母细胞表达DR5的调节作用和分子机制。
[0011] 步骤四，体外低氧单独或联合VHA单抗刺激小鼠曲精小管原代精母细胞系和小鼠精母细胞株，比较两刺激组间DR5的表达水平，深入明确VHA对DR5的调节作用。
[0012] 步骤五，在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA对DR5的抑制作用后，探寻其可能抑制机制，通过芯片提示VHA基因敲除小鼠体内JNK信号途径活化程度显著高于野生型小鼠的结果，实验佐证VHA调节性抑制DR5表达是依赖JNK信号途径予以完成。
[0013] 步骤六，在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA作用后，使用VHA激动剂体内促进VHA表达，分析比较VHA对缺氧性精子生成减少的治疗意义和可能的治疗效果。
[0014] 进一步，步骤一-步骤二中，所述明确VHA在缺氧性精子生成减少中作用的方法包括：
[0015] (1)比较缺氧性精子生成减少病人和健康对照者精液VHA表达水平及曲精小管损伤程度。
[0016] (2)建立低氧诱导的WT小鼠和VHA基因敲除小鼠缺氧性精子生成减少模型。
[0017] (3)观察WT小鼠和VHA基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化。
[0018] (4)分析VHA阻断剂在低氧诱导缺氧性精子生成减少中的作用。
[0019] 进一步，步骤(1)中，所述比较缺氧性精子生成减少病人和健康对照者精液VHA表达水平及曲精小管损伤程度具体包括：
[0020] 在拉萨军区总院泌尿外科的帮助下，本发明已经收集100例缺氧性精子生成减少患者治疗前精液。采用ELISA活性检测方法检测并比较健康对照者及缺氧性精子生成减少病人精液VHA表达水平和精液中溶酶体膜相关糖蛋白(LAMP)水平及免疫印迹方法(Western Blot)和免疫组织化学方法(immunohistochemistry)检测其曲精小管局部DR5表达水平，明确VHA在缺氧性精子生成减少发病中的重要作用。
[0021] 进一步，步骤(2)中，所述建立低氧诱导的WT小鼠和VHA基因敲除小鼠缺氧性精子生成减少模型具体包括：
[0022] VHA基因敲除小鼠(C57BL/6)由研究小组前期从法国Laboratory of Hereditary Kidney Diseases引进。野生型对照(WT)小鼠(C57BL/6)购买自第三军医大学实验动物研究中心。16至18g(6至8周龄)雄性小鼠低氧处理(采用10％氧浓度)，每组共20只小鼠。分别于0、3、5、15天后分析小鼠的曲精小管病损指标，根据这些指标初步断定模型的建立是否成功。
[0023] 进一步，步骤(3)中，所述观察WT小鼠和VHA基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化具体包括：
[0024] 低氧诱导VHA基因敲除小鼠和WT小鼠后开始观察小鼠的活动状况，并于0、3、5、15天四个时相点将两组小鼠处死，分别收集两组小鼠低氧诱导不同时间的小鼠附睾曲精小管组织和性腺组织，ELISA检测两组小鼠不同时间点自噬性溶酶体指标(VHA、LAMP)，观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、TUNNEL染色镜下曲精小管和性腺病理改变，包括组织坏死程度，生殖细胞凋亡。
[0025] 步骤(4)中，所述分析VHA阻断剂在低氧诱导缺氧性精子生成减少中的作用具体包括：
[0026] 将野生型小鼠分为两组，一组体内注射VHA阻断剂，另一组体内注射生理盐水后同时对两组小鼠进行低氧诱导，比较两组小鼠刺激0、3、5、15天四个时相点曲精小管病损程度。
[0027] 进一步，步骤三-步骤四中，所述体外明确VHA对DR5调节作用的方法包括：
[0028] (Ⅰ)分离野生型小鼠及VHA基因敲除小鼠曲精小管精母细胞：小鼠曲精小管精母细胞的分离及培养、流式细胞技术检测小鼠曲精小管精母细胞上VHA的表达、体外检测低氧诱导野生型及VHA基因敲除小鼠原代细胞DR5的表达水平。
[0029] (Ⅱ)体外检测低氧和VHA刺激性单抗诱导细胞系(精母细胞)后DR5表达水平：分别用单独低氧和低氧+VHA单抗刺激细胞系(精母细胞)，比较两刺激组细胞：
[0030] 1)qPCR检测两刺激组细胞内DR5mRNA的转录水平；
[0031] 2)WB检测两刺激组细胞内DR5蛋白表达水平。
[0032] 进一步，步骤(Ⅰ)中，所述小鼠曲精小管精母细胞的分离及培养方法为：
[0033] 将10只8周龄体重约为20-25g的野生型和VHA基因敲除雌性小鼠眼眶放血处死，分别附睾注射不含小牛血清的DMEM培养液5ml-8ml，轻柔小鼠附睾部2-3min，无菌条件下，打开附睾，用注射器抽取附睾液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中培养并用显微镜观察细胞生存状态。
[0034] 所述流式细胞技术检测小鼠曲精小管精母细胞上VHA的表达的方法为：
[0035] 按照上述方法收集小鼠曲精小管精母细胞，将得到的细胞用anti-FcγR处理，4℃30分钟，封闭非特异性抗体结合位点，按照抗体使用说明书要求，加入适量的ATP与Trx(精母细胞标志)荧光抗体于细胞悬液中，4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤两遍，洗去多余抗体，最后用100ulPBS重悬，标记好的细胞用FACSCanto II流式细胞仪检测，所得数据用FlowJo软件对细胞表型进行分析。
[0036] 所述体外检测低氧诱导野生型及VHA基因敲除小鼠原代细胞DR5的表达水平具体包括：
[0037] 用低氧刺激两组小鼠的曲精小管精母细胞，分别于0h，12h，24h：
[0038] (1)qPCR检测低氧刺激细胞后，细胞内DR5m RNA的转录水平；
[0039] (2)WB检测刺激后细胞DR5蛋白表达水平
[0040] 进一步，步骤五中，所述体外佐证VHA对DR5调节作用的分子机理具体包括：
[0041] (1)比较低氧诱导VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠不同时间点小鼠附睾曲精小管组织中JNK信号活化程度：
[0042] 用低氧分别对VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠进行诱导，在0h，12h，24h时间点处死小鼠后分离小鼠附睾曲精小管组织，WB检测比较两组小鼠诱导不同时间点JNK信号通路的活化程度，筛选出缺氧性精子生成发病中JNK信号通路具体活化的信号途径，进而从体内明确VHA/(P)RR通路对JNK信号途径的调节作用。
[0043] (2)检测低氧诱导VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管精母细胞后，JNK信号活化程度：
[0044] 参照实验方法中第二部分第1节中的曲精小管精母细胞的分离方法分离VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代细胞，并用低氧对其进行诱导，比较低氧诱导两组细胞后不同时间点细胞JNK信号通路的活化水平。
[0045] (3)比较低氧和VHA单抗诱导细胞系(精母细胞)JNK信号表达水平：
[0046] 分别用单独低氧或联合VHA单抗刺激细胞系(精母细胞)，比较两刺激组细胞不同时间点JNK信号途径的活化情况。
[0047] (4)评价低氧诱导缺氧性精子生成减少模型中，JNK各信号通路阻断剂对DR5产生的影响：
[0048] 选取精母细胞系作为研究对象，ELISA、WB实验比较低氧、VHA单抗、低氧+VHA、低氧+VHA+JNK(各信号通路阻断剂)刺激组刺激细胞后，细胞产生DR5的能力。
[0049] 进一步，步骤六中，所述体内分析VHA激动剂抑制DR5表达对缺氧性精子生成减少可能的治疗效果包括：
[0050] 在明确VHA抑制DR5表达的分子基础上，拟进一步采用野生型小鼠作为研究对象，将其分为两组，一组通过尾静脉注射的方式注射VHA激动剂，另一组用IgG作为对照，而后对两组小鼠进行低氧诱导：
[0051] (1)比较两组小鼠在低氧诱导后附睾曲精小管病损状况：
[0052] 分别在两组小鼠低氧诱导后的0h，12h，24h处死小鼠，分离其附睾组织，石蜡包埋并切片，H/E染色显示两组小鼠附睾组织坏死程度，免疫组化染色显示其生殖细胞凋亡程度及TUNEL染色镜下附睾曲精小管病理改变，包括组织坏死程度，生殖细胞凋亡等。
[0053] (2)观察两组小鼠低氧诱导后DR5表达情况：
[0054] 在低氧诱导两组小鼠的0h，12h，24h处死小鼠，分别收集性腺、附睾组织，qPCR及免疫组化分析两组小鼠附睾组织中DR5的表达情况，比较其曲精小管中DR5的水平，明确VHA激动剂是否存在治疗作用，进一步佐证VHA在缺氧性精子生成减少中的保护作用。
[0055] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明课题组前期研究发现低张性缺氧抑制大鼠精子生成，缺氧诱导的四倍体精母细胞减少是抑制精子生成的重要途径，精母细胞的凋亡是精子生成减少的主要原因(Reproduction,2010,139:1031-8)，从而提出假说：高原低氧对生精细胞的影响主要通过促进精母细胞的凋亡，为理解缺氧性精子生成减少发病机制奠定了基础。
[0056] 本发明进一步在小鼠精母细胞系中研究发现，在1％氧浓度培养小鼠精母细胞48、60、72小时，HIF-1α表达逐渐显著升高，TUNEL检测和流式细胞检测显示小鼠精母细胞凋亡率显著上升，凋亡相关分子mRNA与蛋白表达显著升高，流式细胞检测和激光共聚焦检测线粒体外膜去极化且通透性增高。结果提示低张性缺氧诱导的精母细胞凋亡是由HIF-1α-死亡受体/线粒体途径所介导的。另外，缺氧诱导细胞凋亡的机制在肿瘤疾病中已有报道，其机制主要包括缺氧激活细胞线粒体凋亡途径和死亡受体途径，与本发明在精母细胞中观察一致。因此，缺氧与小鼠精母细胞凋亡之间存在着直接的因果关系，但是低氧诱导精母细胞凋亡的确切调控机制尚不清楚。
[0057] 本发明前期研究发现，正常精母细胞存在一定自噬，但持续缺氧后精母细胞的自噬被抑制。同时，本发明观察到一个有趣现象，随着精母细胞自噬逐渐被抑制，该细胞的凋亡逐渐升高，提示精母细胞中的自噬与凋亡之间存在密切关联。由于自噬与凋亡是细胞内两个重要且相互联系的病理生理学过程，它们共享类似物如Caspase、Bcl-2、IAPs等，并且自噬在调控凋亡相关疾病如癌症和神经退行性疾病的重要性已有报道，并且自噬对凋亡的调控研究成为目前的焦点。目前这方面研究的主要进展为：一方面，凋亡可以调控自噬，如凋亡关键分子caspase和Bcl-2可以抑制自噬；另一方面，自噬可以调控凋亡，如过表达自噬关键分子becline-1可以抑制凋亡。通过分析文献和本发明的实验结果，发明人作为第一作者撰写了综述，阐述了生理和病理条件如饥饿等，生精细胞中自噬通过抑制细胞凋亡而促进生精细胞存活。但是，持续缺氧可抑制生精细胞自噬，从而不能对缺氧诱导的生精细胞凋亡产生阻抑作用，最后导致生精细胞凋亡和生精上皮脱落。
[0058] 在前期研究中，发现HSR病人精液中，自噬性溶酶体标记分子VHA(vacuolar H+-ATPase)的表达较正常对照者显著降低(工作基础图9)，且与凋亡的严重程度密切关联，提示VHA在HSR中可能起着重要保护性作用。最先对VHA的认识是从囊泡运输开始，研究发现其在保护细胞修复各种理化损伤中起着重要作用，近来发现VHA通过降解受损细胞器与各种细胞凋亡类疾病如癌症、心脏疾病、神经退行性疾病发生密切相关，并且VHA阻断剂成为治疗癌症的重要手段。大量文献报道及本发明前期研究发现，当机体应激时，精母细胞中自噬相关分子如Beclin-1、LC3-I/II激活双层囊泡膜结构的自噬体，双层囊泡膜延长形成自噬囊泡的成熟自噬体，自噬体与溶酶体融合形成自噬性溶酶体，自噬性溶酶体释放VHA分子，VHA分解ATP逆浓度梯度泵入H+入溶酶体，调节受损细胞器pH值并水解受损细胞器，维持细胞稳态进而抑制细胞凋亡。
[0059] 本发明进一步采用自噬性溶酶体标记物VHAKO小鼠和C57BL/6WT小鼠为研究对象，通过低压舱模拟1％氧浓度环境，建立小鼠精子生成减少模型，比较VHAKO小鼠和WT小鼠生精上皮脱落情况，结果显示，低氧诱导VHAKO小鼠3天后，小鼠生精上皮出现明显结构的破坏，基底膜折叠，支持细胞形成脂滴，生殖细胞凋亡，表明阻断VHA分子能加重小鼠的生精上皮病损指标，导致更为严重的生殖损伤程度。这些病理改变与急进高原人群曲精小管病理改变极为相似，提示无论是小鼠缺氧性精子生成减少模型或是急进高原生殖功能低下病人，VHA的表达水平降低与缺氧性精子生成减少的发生及进展密切相关，但VHA保护性作用的具体分子机制不清。
[0060] 近年在缺氧性精子生成减少的研究发现，DR5(Death Receptor 5)是生殖细胞凋亡致使症状加重导致生殖功能损伤的重要原因。DR5是肿瘤坏死因子受体超家族成员，正常情况下只在精母细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞和活化的T细胞上微弱表达，但在缺氧或者理化因素的刺激下，精母细胞能大量活化并表达DR5分子。运用DR5敲除小鼠作为研究模型，发现在低氧诱导小鼠精子生成减少模型中精子数量较对照组显著提高，佐证了DR5在精子生成减少中的重要地位，同时在急进高原人群的精液中也检测到DR5的表达持续升高，特异性抑制DR5的水平可用于精子生成减少的临床治疗，则更加肯定DR5在精子生成减少中的关键作用。结合文献报道和本发明前期工作证实在低氧诱导的小鼠精子生成减少模型中，小鼠曲精小管内JNK信号途径被广泛激活，激活后的JNK信号途径又能活化DR5启动子c-Jun，促使DR5表达并启动下游凋亡途径，引发小鼠精母细胞凋亡，加速小鼠精子生成障碍。与此同时，本发明最近的研究亦证实：在低氧诱导的小鼠精子生成减少模型中，阻断VHA分子能导致小鼠曲精小管DR5表达增加，提示在缺氧性精子生成减少中，VHA能通过未知机制完成对DR5的调节进而参与缺氧性精子生成减少的发病。那么在缺氧性精子生成减少中，VHA是如何调控DR5或其他未知分子的表达并最终影响HSR的病理进程？其分子机理是什么？[0061] 围绕此问题，本发明用低氧诱导小鼠精子生成减少模型，microarray分别分析C57BL/6野生型小鼠前后及野生型和VHA KO小鼠24小时体内差异基因及各个信号通路的激活状况，Western-blot和芯片分析等结果提示低氧诱导VHAKO小鼠24小时后，曲精小管JNK信号途径的活化较诱导后的WT小鼠高近10倍，而低氧诱导C57BL/6小鼠曲精小管中JNK信号途径较诱导前显著活化，提示低氧诱导的精子生成减少模型中，JNK信号途径广泛激活，且VHA对JNK信号途径具有抑制作用。因此本课题拟假设：正常情况下，VHA抑制JNK/c-Jun通路活性，抑制DR5表达，进而抑制精母细胞凋亡；缺氧条件下，VHA表达受到抑制，从而上调JNK/c-Jun通路活性，促进DR5表达，促进精母细胞凋亡，引起缺氧性精子生成减少。为了验证此假设，本发明拟通过实验进行验证。
[0062] 本发明提供的一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，明确了缺氧抑制VHA在缺氧性精子生成减少中的作用及其对抑制DR5的表达的分子机制，为治疗缺氧性精子生成减少提供必要的理论依据和新的治疗策略。
[0063] 迄今为止，缺氧性精子生成减少的发病原因不明，VHA在其中作用的相关文献也未见报道，通过低氧诱导的VHA基因敲除小鼠及野生型小鼠这一缺氧性精子生成减少模型，将有助于进一步研究其在缺氧性精子生成减少中的重要作用和调节机制。
[0064] 目前精索静脉曲张的研究中，DR5作为死亡受体参与发病已经清楚，但在缺氧性精子生成减少中没有相关文献及实验证实其具体作用，也不知晓其具体调节机制。在本发明的预实验中已经佐证缺氧性精子生成减少病人精液VHA表达显著降低，且低氧诱导的缺氧性精子生成减少小鼠模型中，VHA基因敲除小鼠曲精小管病损程度较对照组严重，提示VHA在缺氧性精子生成减少中的保护作用。了解明确VHA在缺氧性精子生成减少中的作用及机制有助于对此疾病深入的了解，并为未来治疗此疾病提供更安全更有效的治疗途径和手段。附图说明
[0066] 图2是本发明实施例提供的技术路线图。
[0067] 图3是本发明实施例提供的缺氧激活细胞HIF-1α示意图；
[0068] 图中：图(a)为代表性Western blot检测结果；图(b)为统计学结果；*，p<0.05vs 21％氧浓度时细胞凋亡。
[0069] 图4是本发明实施例提供的TUNEL检测细胞凋亡示意图；
[0070] 图中：图(a)为代表性TUNEL检测结果；图(b)为统计学结果；*，p<0.05vs 21％氧浓度时细胞凋亡。
[0071] 图5是本发明实施例提供的流式细胞仪检测细胞凋亡示意图；
[0072] 图中：图(a)为代表性流式细胞仪检测结果；图(b)为统计学结果；*，p<0.05vs 21％氧浓度时细胞凋亡。
[0073] 图6是本发明实施例提供的缺氧激活精母细胞死亡受体凋亡途径示意图；
[0074] 图中：A.Westernblot检测两组精母细胞DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas蛋白水平；B.qPCR检测两组精母细胞DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas mRNA水平；C.Ac-IETD-p NA法检测两组精母细胞Caspase-8活性；*，p<0.05vs 21％氧浓度时DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas蛋白水平；*，p<0.05vs 21％氧浓度时DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas mRNA水平；*，p<0.05vs
21％氧浓度时Caspase-8活性。
21％氧浓度时Caspase-8活性。
[0075] 图7是本发明实施例提供的缺氧激活精母细胞线粒体凋亡途径示意图；
[0076] 图中：A.Western blot检测两组精母细胞p53、Bcl-2、Bax蛋白水平；B.qPCR检测两组精母细胞Bcl-2、Bax mRNA水平；C.Ac-DEVD-p NA与Ac-LEHD-p NA法分别检测两组精母细胞Caspase-3与Caspase-9活性；*，p<0.05vs 21％氧浓度时p53、Bcl-2、Bax蛋白水平；*，p<0.05vs 21％氧浓度时Bcl-2、Bax mRNA水平；*，p<0.05vs 21％氧浓度时Caspase-3与Caspase-9活性。
[0077] 图8是本发明实施例提供的氧引起精母细胞线粒体外膜去极化示意图；
[0078] 图中：A.流式细胞仪检测两组精母细胞线粒体外膜电位变化，FL1-H代表绿色荧光通道，FL2-H代表红色荧光通道；B.激光共聚焦检测两组精母细胞线粒体外膜电位变化，红色荧光表示JC-1探针处于聚合物状态，此时线粒体外膜电位高，绿色荧光表示JC-1探针处于单体状态，此时线粒体外膜电位低。
[0079] 图9是本发明实施例提供的缺氧抑制溶酶体生成示意图；
[0080] 图中：图(a)为代表性流式细胞仪检测结果；图(b)为统计学结果。
[0081] 图10是本发明实施例提供的缺氧抑制精母细胞自噬流示意图；
[0082] 图中：A.WB检测各组精母细胞自噬标记物Beclin-1、LC3-II、ATG5、m-TOR、p62、LAMP2、VHA蛋白水平；B.m-Cherry-GFP病毒转染各精母细胞后，激光共聚焦观察各组精母细胞自噬流。
[0083] 图11是本发明实施例提供的缺氧抑制HSR病人VHA活性示意图；
[0084] 图中：*，p<0.05vs正常受试者VHA活性。
[0085] 图12是本发明实施例提供的抑制VHA诱导小鼠曲精小管DR5表达示意图；
[0086] 图中：A.Western blot检测正常受试者与HSR组精液DR5蛋白水平；B.Western blot检测各组曲精小管DR5蛋白水平；C.H/E染色检测各组曲精小管病损情况；注：正常受试者精液采自海拔400米重庆市第三军医大学西南医院体检中心志愿者，HSR组精液采自海拔3680米拉萨总院泌尿外科。
[0087] 图13是本发明实施例提供的抑制DR5促进精子生成示意图；
[0088] 图中：*，p<0.05vs HSR组小鼠精子浓度。
[0089] 图14是本发明实施例提供的c-Jun作为转录因子参与调控DR5表达示意图；
[0090] 图中：A.1％氧浓度组精母细胞分别转染control siRNA与c-Jun si RNA后，Western检测两组细胞DR5蛋白水平；B.Chip检测各组细胞中DR5 mRNA水平，C.JASPAR网站预测c-Jun作为转录因子与DR5启动子结合位点；*，p<0.05vs21％氧浓度时DR5 mRNA水平。
[0091] 图15是本发明实施例提供的抑制VHA激活小鼠曲精小管JNK信号途径示意图；
[0092] 图中：A.基因芯片检测各组小鼠曲精小管JNK信号途径、NF-κB信号途径、MAPK信号途径与PI3K-Akt信号途径激活程度；B.WB检测各组小鼠曲精小管JNK3、c-Jun与c-Fos蛋白水平；q PCR检测各组小鼠曲精小管JNK3、c-Jun与c-Fos mRNA水平；*，p<0.05vs WT组小鼠曲精小管JNK3、c-Jun与c-Fos mRNA水平。
具体实施方式
[0093] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0094] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0095] 如图1所示，本发明实施例提供的一种VHA抑制DR5在缺氧下精子生成减少的检测方法包括以下步骤：
[0096] S101：结合临床缺氧性精子生成减少病人精液VHA下调结果，利用VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象，通过低氧的诱导构建缺氧性精子生成减少模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况，DR5表达水平，初步了解VHA在缺氧性精子生成减少模型中的作用。
[0097] S102：运用VHA阻断剂作为研究手段，将C57BL/6小鼠分为两组，一组行VHA阻断剂处理，另一组以生理盐水作为对照，比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及DR5的表达水平，确定VHA在缺氧性精子生成减少中的重要作用。
[0098] S103：分离VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管精母细胞作为研究对象，低氧体外刺激，运用western blot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组精母细胞表达DR5的能力，体外佐证缺氧性精子生成减少模型中，VHA抑制精母细胞表达DR5的调节作用和分子机制。
[0099] S104：体外低氧单独或联合VHA单抗刺激小鼠曲精小管原代精母细胞系和小鼠精母细胞株，比较两刺激组间DR5的表达水平，深入明确VHA对DR5的调节作用。
[0100] S105：在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA对DR5的抑制作用后，探寻其可能抑制机制，通过芯片提示VHA基因敲除小鼠体内JNK信号途径活化程度显著高于野生型小鼠的结果，实验佐证VHA调节性抑制DR5表达是依赖JNK信号途径予以完成。
[0101] S106：在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA作用后，使用VHA激动剂体内促进VHA表达，分析比较VHA对缺氧性精子生成减少的治疗意义和可能的治疗效果。
[0102] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0103] 缺氧性精子生成减少(Hypoxic spermatogenesis reduction,HSR)是以曲精小管结构破坏、生精上皮脱落、精子密度降低为特征的综合病症，是严重危害人类生殖健康的疾病之一。对其研究时本发明发现HSR病人精液中，VHA(囊泡氢离子—腺苷三磷酸酶)表达较正常对照组失代偿性降低且与疾病严重程度密切关联，表明VHA在缺氧性精子生成减少发病中起重要作用；缺氧诱导小鼠缺氧性精子生成减少模型中亦证实阻断VHA能加重小鼠曲精小管病损，致使更高曲精小管损伤程度及DR5(死亡受体5)表达；芯片结果提示缺氧诱导VHAKO小鼠24小时后，曲精小管JNK信号途径活化程度较诱导后WT小鼠高近10倍，表明保护性因子VHA能通过抑制性活化JNK信号途径，抑制DR5表达，进而减轻缺氧性精子生成减少疾病程度。本研究基于HSR病理变化作为研究基础，有望找出HSR的发病机制、对HSR临床治疗提供新思路。
[0104] (一)研究内容
[0105] 1、项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题
[0106] 1.1研究目标
[0107] 1)结合临床缺氧性精子生成减少病人精液VHA下调的结果，使用VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠作为研究对象，通过低氧的诱导构建缺氧性精子生成减少模型，分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况，DR5表达水平，初步了解VHA在缺氧性精子生成减少模型中的作用。
[0108] 2)运用VHA阻断剂作为研究手段，将C57BL/6小鼠分为两组，一组行VHA阻断剂处理，另一组以生理盐水作为对照，比较两处理组小鼠在低氧诱导后，曲精小管的病损程度及DR5的表达水平，进一步确定VHA在缺氧性精子生成减少中的重要作用。
[0109] 3)分离VHA基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管精母细胞作为研究对象，低氧体外刺激，运用western blot、免疫细胞化学、qPCR技术，比较刺激后两组精母细胞表达DR5的能力，体外佐证缺氧性精子生成减少模型中，VHA抑制精母细胞表达DR5的调节作用和分子机制。
[0110] 4)体外低氧单独或联合VHA单抗刺激小鼠曲精小管原代精母细胞系和小鼠精母细胞株，比较两刺激组间DR5的表达水平，进一步深入明确VHA对DR5的调节作用。
[0111] 5)在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA对DR5的抑制作用后，进一步探寻其可能抑制机制，通过芯片提示VHA基因敲除小鼠体内JNK信号途径活化程度显著高于野生型小鼠的结果，实验佐证VHA调节性抑制DR5表达是依赖JNK信号途径予以完成。
[0112] 6)在明确缺氧性精子生成减少模型中VHA作用后，使用VHA激动剂体内促进VHA表达，分析比较VHA对缺氧性精子生成减少的治疗意义和可能的治疗效果。
[0113] 1.2研究内容
[0114] 1)现象研究
[0115] 比较缺氧性精子生成减少病人和健康对照者精液VHA和DR5表达水平；建立低氧诱导C57BL/6和VHA基因敲除小鼠缺氧性精子生成减少模型，观察野生型小鼠和VHA基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化及VHA阻断剂在缺氧性精子生成减少中的作用；
[0116] 2)机制研究
[0117] 分离并收集VHA基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代精母细胞系和小鼠精母细胞株，低氧单独或联合VHA单抗刺激小鼠曲精小管原代精母细胞系和小鼠精母细胞株，结合芯片结果，体外运用western blot、免疫细胞化学、qPCR等技术佐证缺氧性精子生成减少模型中，VHA对DR5调节作用的潜在分子机制；
[0118] 3)治疗研究
[0119] 在明确缺氧性精子生成减少VHA调节机制的基础上，运用VHA激动剂，体内佐证VHA在缺氧性精子生成减少中可能的治疗效应。
[0120] 1.3拟解决关键问题
[0121] 1.3.1关键理论问题：
[0122] 1)VHA在缺氧性精子生成减少中抑制DR5表达，减轻疾病发生进展的作用及机制；
[0123] 2)佐证缺氧性精子生成减少中VHA的重要作用，明确VHA激动剂的治疗意义。
[0124] 1.3.2关键技术问题：
[0125] 1)VHA单基因敲除小鼠及缺氧性精子生成减少模型的建立；
[0126] 2)VHA单基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代精母细胞的分离及培养；
[0127] 3)western blot、免疫细胞化学、qPCR等技术的应用。
[0128] 2、拟采取的研究方案及可行性分析
[0129] 2.1技术路线(如图2所示)
[0130] 2.2实验方案
[0132] 第一部分：明确VHA在缺氧性精子生成减少中的重要作用
[0133] 1.1比较缺氧性精子生成减少病人和健康对照者精液VHA表达水平及曲精小管损伤程度
[0134] 在拉萨军区总院泌尿外科的帮助下，本发明已经收集100例缺氧性精子生成减少患者治疗前精液。采用ELISA活性检测方法检测并比较健康对照者及缺氧性精子生成减少病人精液VHA表达水平和精液中溶酶体膜相关糖蛋白(LAMP)水平及免疫印迹方法(Western Blot)和免疫组织化学方法(immunohistochemistry)检测其曲精小管局部DR5表达水平，明确VHA在缺氧性精子生成减少发病中的重要作用。
[0135] 1.2建立低氧诱导的WT小鼠和VHA基因敲除小鼠缺氧性精子生成减少模型[0136] VHA基因敲除小鼠(C57BL/6)由研究小组前期从法国Laboratory of Hereditary Kidney Diseases引进。野生型对照(WT)小鼠(C57BL/6)购买自第三军医大学实验动物研究中心。16至18g(6至8周龄)雄性小鼠低氧处理(采用10％氧浓度)，每组共20只小鼠。分别于0、3、5、15天后分析小鼠的曲精小管病损指标，根据这些指标初步断定模型的建立是否成功。
[0137] 1.3观察WT小鼠和VHA基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化
[0138] 低氧诱导VHA基因敲除小鼠和WT小鼠后开始观察小鼠的活动状况，并于0、3、5、15天四个时相点将两组小鼠处死，分别收集两组小鼠低氧诱导不同时间的小鼠附睾曲精小管组织和性腺组织，ELISA检测两组小鼠不同时间点自噬性溶酶体指标(VHA、LAMP)，观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、TUNNEL染色镜下曲精小管和性腺病理改变，包括组织坏死程度，生殖细胞凋亡等。
[0139] 1.4分析VHA阻断剂在低氧诱导缺氧性精子生成减少中的作用
[0140] 将野生型小鼠分为两组，一组体内注射VHA阻断剂，另一组体内注射生理盐水后同时对两组小鼠进行低氧诱导，比较两组小鼠刺激0、3、5、15天四个时相点曲精小管病损程度。
[0141] 第二部分：体外明确VHA对DR5的调节作用
[0142] 2.1分离野生型小鼠及VHA基因敲除小鼠曲精小管精母细胞：
[0143] 2.1.1小鼠曲精小管精母细胞的分离及培养
[0144] 将10只8周龄体重约为20-25g的野生型和VHA基因敲除雌性小鼠眼眶放血处死，分别附睾注射不含小牛血清的DMEM培养液5ml-8ml，轻柔小鼠附睾部2-3min，无菌条件下，打开附睾，用注射器抽取附睾液，在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中培养并用显微镜观察细胞生存状态。
[0145] 2.1.2流式细胞技术检测小鼠曲精小管精母细胞上VHA的表达
[0146] 按照上述方法收集小鼠曲精小管精母细胞，将得到的细胞用anti-FcγR处理，4℃30分钟，封闭非特异性抗体结合位点，按照抗体使用说明书要求，加入适量的ATP与Trx(精母细胞标志)荧光抗体于细胞悬液中，4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤两遍，洗去多余抗体，最后用100ulPBS重悬，标记好的细胞用FACSCanto II流式细胞仪检测，所得数据用FlowJo软件对细胞表型进行分析。
[0147] 2.1.3体外检测低氧诱导野生型及VHA基因敲除小鼠原代细胞DR5的表达水平[0148] 用低氧刺激两组小鼠的曲精小管精母细胞，分别于0h，12h，24h：
[0149] (1)qPCR检测低氧刺激细胞后，细胞内DR5m RNA的转录水平；
[0150] (2)WB检测刺激后细胞DR5蛋白表达水平
[0151] 2.2体外检测低氧和VHA刺激性单抗诱导细胞系(精母细胞)后DR5表达水平[0152] 分别用单独低氧和低氧+VHA单抗刺激细胞系(精母细胞)，比较两刺激组细胞：
[0153] (1)qPCR检测两刺激组细胞内DR5mRNA的转录水平；
[0154] (2)WB检测两刺激组细胞内DR5蛋白表达水平
[0155] 第三部分：体外佐证VHA对DR5调节作用的分子机理
[0156] 3.1比较低氧诱导VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠不同时间点小鼠附睾曲精小管组织中JNK信号活化程度
[0157] 用低氧分别对VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠进行诱导，在0h，12h，24h时间点处死小鼠后分离小鼠附睾曲精小管组织，WB检测比较两组小鼠诱导不同时间点JNK信号通路的活化程度，筛选出缺氧性精子生成发病中JNK信号通路具体活化的信号途径，进而从体内明确VHA/(P)RR通路对JNK信号途径的调节作用。
[0158] 3.2检测低氧诱导VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管精母细胞后，JNK信号活化程度
[0159] 参照实验方法中第二部分第1节中的曲精小管精母细胞的分离方法分离VHA基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代细胞，并用低氧对其进行诱导，比较低氧诱导两组细胞后不同时间点细胞JNK信号通路的活化水平。
[0160] 3.3比较低氧和VHA单抗诱导细胞系(精母细胞)JNK信号表达水平
[0161] 分别用单独低氧或联合VHA单抗刺激细胞系(精母细胞)，比较两刺激组细胞不同时间点JNK信号途径的活化情况。
[0162] 3.4评价低氧诱导缺氧性精子生成减少模型中，JNK各信号通路阻断剂对DR5产生的影响
[0163] 选取精母细胞系作为研究对象，ELISA、WB实验比较低氧、VHA单抗、低氧+VHA、低氧+VHA+JNK(各信号通路阻断剂)刺激组刺激细胞后，细胞产生DR5的能力
[0164] 第四部分：体内分析VHA激动剂抑制DR5表达对缺氧性精子生成减少可能的治疗效果
[0165] 在明确VHA抑制DR5表达的分子基础上，拟进一步采用野生型小鼠作为研究对象，将其分为两组，一组通过尾静脉注射的方式注射VHA激动剂，另一组用IgG作为对照，而后对两组小鼠进行低氧诱导：
[0166] 4.1比较两组小鼠在低氧诱导后附睾曲精小管病损状况
[0167] 分别在两组小鼠低氧诱导后的0h，12h，24h处死小鼠，分离其附睾组织，石蜡包埋并切片，H/E染色显示两组小鼠附睾组织坏死程度，免疫组化染色显示其生殖细胞凋亡程度及TUNEL染色镜下附睾曲精小管病理改变，包括组织坏死程度，生殖细胞凋亡等。
[0168] 4.2观察两组小鼠低氧诱导后DR5表达情况
[0169] 在低氧诱导两组小鼠的0h，12h，24h处死小鼠，分别收集性腺、附睾组织，qPCR及免疫组化分析两组小鼠附睾组织中DR5的表达情况，比较其曲精小管中DR5的水平，明确VHA激动剂是否存在治疗作用，进一步佐证VHA在缺氧性精子生成减少中的保护作用。
[0170] 3、可行性分析
[0171] 3.1理论上的可行性：
[0172] 缺氧性精子生成减少(如精索静脉曲张)是一种伴随生殖细胞凋亡的疾病，大量文献报道并佐证新型死亡受体DR5的表达异常与此疾病的进展密切相关，体内干预或阻断DR5后能够明显增加小鼠缺氧性精子生成减少的精子密度，降低附睾曲精小管病损程度，提示死亡受体在精索静脉曲张中的重要地位，VHA为囊泡H+-ATP酶，它极有可能也参与缺氧性精子生成减少的发生。本发明的预实验证实缺氧性精子生成减少病人体内的VHA较健康对照者显著降低，并在低氧诱导小鼠缺氧性精子生成减少模型中求证，VHA基因敲除小鼠曲精小管组织损伤程度显著高于野生型小鼠，提示VHA在缺氧性精子生成减少中的保护作用，因此运用VHA激动剂有可能延缓HSR的病理进程；同时，芯片结果提示低氧诱导VHA基因敲除小鼠后体内JNK信号途径的活化程度明显高于野生型小鼠，提示VHA对JNK信号途径的调节作用，而在之前本发明的研究中发现在缺氧性精子生成减少中，JNK信号途径又是激活DR5的关键信号通路，所以本发明有理由相信缺氧抑制VHA表达，从而上调JNK/c-Jun信号通路，促进DR5表达，进而达到恶化生殖的作用，这一设想在理论层面上可行，理应获得预期结果。
[0173] 3.2技术上的可行性：
[0174] 1、本发明前期在低氧诱导的小鼠精子生成减少模型中已经证实JNK信号途径能结合下游死亡受体DR5并启动凋亡途径，影响疾病进程，那么在同为缺氧性精子生成减少病人中或许也存在此调控机制，此外本发明前期的结果也证实缺氧性精子生成减少病人精液中VHA表达水平显著降低，且低氧诱导缺氧性精子生成减少模型中VHA基因敲除小鼠曲精小管组织损伤程度显著高于野生型小鼠，提示VHA在缺氧性精子生成减少中的保护作用；
[0175] 2、项目申请者熟悉缺氧性精子生成减少中JNK信号途径的活化和对DR5的调节机制，课题所需的病理生理学和分子生物学技术又是本研究所常用的技术及方法，尤其在小鼠曲精小管精母细胞的分离培养等关键实验技术上较为熟练，与此同时本项目立足现有的工作基础，立题依据充分，课题组人员组成既有从事生殖低下研究的人员，又有长期从事分子生物学的实验室研究及技术人员，还有长期从事病理研究的技术人员。既有博士、硕士，又有各种技术人员，人员搭配合理，能保证研究顺利完成。
[0176] 4、本项目的特色与创新之处；
[0177] 1)迄今为止，缺氧性精子生成减少的发病原因不明，VHA在其中作用的相关文献也未见报道，通过低氧诱导的VHA基因敲除小鼠及野生型小鼠这一缺氧性精子生成减少模型，将有助于本发明进一步研究其在缺氧性精子生成减少中的重要作用和调节机制。
[0178] 2)目前精索静脉曲张的研究中，DR5作为死亡受体参与发病已经清楚，但在缺氧性精子生成减少中没有相关文献及实验证实其具体作用，也不知晓其具体调节机制。在本发明的预实验中已经佐证缺氧性精子生成减少病人精液VHA表达显著降低，且低氧诱导的缺氧性精子生成减少小鼠模型中，VHA基因敲除小鼠曲精小管病损程度较对照组严重，提示VHA在缺氧性精子生成减少中的保护作用。了解明确VHA在缺氧性精子生成减少中的作用及机制有助于本发明对此疾病深入的了解，并为未来治疗此疾病提供更安全更有效的治疗途径和手段。
[0179] (二)研究基础与工作条件
[0180] 1、研究基础
[0181] 1.1课题组工作积累
[0182] 1.1.1缺氧病理生理学研究
[0183] 课题组单位为第三军医大学高原军事医学系病理生理学与高原病理学教研室，是教育部重点实验室、军队重点实验室。进行长达60余年的缺氧(高原)病理生理学研究，对缺氧病理生理学有较深入的了解，承担并圆满完成了国家、军队、重庆市多项缺氧方面的课题。获得“高原病发病机制和防治措施研究”国家科学技术进步一等奖在内的各种奖项。因此，申请人工作单位在缺氧机制研究方面具有坚实理论和实验基础，支撑申请课题的所有条件。
[0184] 1.1.2低氧诱导精母细胞凋亡的研究
[0185] 本课题组2000年以来，一直从事缺氧生殖方面的研究，在缺氧对男性生殖功能的影响，特别是生精上皮细胞脱落、精母细胞凋亡方面进行了研究，发现低张性缺氧抑制大鼠精子生成，缺氧诱导的四倍体精母细胞减少是抑制精子生成的重要途径，精母细胞的凋亡是精子生成减少的主要原因(Reproduction,2010,139:1031-8)，从而提出假说：高原低氧对生精细胞的影响主要通过促进精母细胞的凋亡，为理解高原男性生殖功能低下的发病机制奠定了基础。本发明进一步在小鼠精母细胞系中发现，低张性缺氧诱导的精母细胞凋亡是由HIF-1α-死亡受体/线粒体途径所介导的。同时，通过文献分析和本发明的前期实验结果，本人作为第一作者撰写了综述，提出以下假说：在生理和病理条件下，如缺氧、饥饿、环境化学成分和辐射等，生精细胞中自噬被活化，通过抑制细胞凋亡而对生精细胞提供保护性作用。但是，长期缺氧使细胞自噬受到抑制，从而不能对缺氧引起的细胞凋亡产生抑制作用，最后导致生精细胞大量凋亡、数目减少。
[0186] 本申请课题拟在前期研究基础上，进一步深入探索缺氧条件下自噬调控精母细胞凋亡的分子机制，因此本发明上述的前期工作基础对本发明拟进行的课题研究提供了坚实理论和实验基础。
[0187] 1.2本申请课题相关的前期实验结果
[0188] ①缺氧诱导精母细胞凋亡
[0189] 与21％氧浓度+48h组精母细胞、21％氧浓度+60h组精母细胞、21％氧浓度+72h组精母细胞分别比较，1％氧浓度+48h组精母细胞、1％氧浓度+60h组精母细胞、1％氧浓度+72h组精母细胞HIF-1α蛋白水平显著增高(p<0.05)，凋亡率分别显著增加(p<0.05)，且凋亡严重程度呈时间依赖性(Yin et al.未发表)。
[0190] 图3是缺氧激活细胞HIF-1α。精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养24h、48h、60h和72h，Western blot分别检测各组细胞HIF-1α蛋白水平。图3(a)为代表性Western blot检测结果，图3(b)为统计学结果。*，p<0.05vs 21％氧浓度时细胞凋亡。
[0191] 图4是TUNEL检测细胞凋亡。精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养24h、48h、60h和72h，TUNEL法分别检测各组细胞凋亡情况。图4(a)为代表性TUNEL检测结果，图4(b)为统计学结果。*，p<0.05vs 21％氧浓度时细胞凋亡。
[0192] 图5是流式细胞仪检测细胞凋亡。精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养24h、48h、60h和72h，流式细胞仪分别检测各组细胞凋亡率。图5(a)为代表性流式细胞仪检测结果，图5(b)为统计学结果。*，p<0.05vs 21％氧浓度时细胞凋亡。
[0193] ②缺氧激活精母细胞死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径
[0194] 与21％氧浓度+48h组精母细胞比较，1％氧浓度+48h组精母细胞死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径关键分子DR5、TRAIL、Fas、Bax mRNA和蛋白水平显著升高(p<0.05)，p53蛋白水平显著升高；c-FLIP、DcR2、Bcl-2mRNA和蛋白水平显著降低(p<0.05)；Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性显著升高(p<0.05)(Yin et al.未发表)。
[0195] 图6是缺氧激活精母细胞死亡受体凋亡途径，精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养48h，*，p<0.05vs 21％氧浓度时DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas蛋白水平，*，p<0.05vs 21％氧浓度时DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas mRNA水平，*，p<0.05vs 21％氧浓度时Caspase-8活性。
[0196] 图7是缺氧激活精母细胞线粒体凋亡途径。精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养48h，*，p<0.05vs 21％氧浓度时p53、Bcl-2、Bax蛋白水平，*，p<0.05vs 21％氧浓度时Bcl-2、Bax mRNA水平，*，p<0.05vs 21％氧浓度时Caspase-3与Caspase-9活性。
[0197] 图8是缺氧引起精母细胞线粒体外膜去极化。精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养48h，JC-1标记的荧光探针染色两组精母细胞。
[0198] 与正常受试者比较，HSR组病人精液中VHA活性失代偿性显著降低(p<0.05)；与21％氧浓度+12h组精母细胞、21％氧浓度+24h组精母细胞、21％氧浓度+48h组精母细胞、
21％氧浓度+60h组精母细胞分别比较，1％氧浓度+12h组精母细胞、1％氧浓度+24h组精母细胞、1％氧浓度+48h组精母细胞、1％氧浓度+60h组精母细胞自噬标记物Beclin-1、LC3-II、ATG5、LAMP2、VHA表达显著降低(p<0.05)，p62与m TOR表达显著升高(p<0.05)，溶酶体占细胞比值显著减少(p<0.05)，自噬性溶酶体显著减少(Yin et al.未发表)。
21％氧浓度+60h组精母细胞分别比较，1％氧浓度+12h组精母细胞、1％氧浓度+24h组精母细胞、1％氧浓度+48h组精母细胞、1％氧浓度+60h组精母细胞自噬标记物Beclin-1、LC3-II、ATG5、LAMP2、VHA表达显著降低(p<0.05)，p62与m TOR表达显著升高(p<0.05)，溶酶体占细胞比值显著减少(p<0.05)，自噬性溶酶体显著减少(Yin et al.未发表)。
[0199] 图9是缺氧抑制溶酶体生成，精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养12h、24h、48h和60h，1μg/μl吖啶橙分别检测各组精母细胞溶酶体所占细胞百分比。图9(a)为代表性流式细胞仪检测结果，图9(b)为统计学结果。
[0200] 图10是缺氧抑制精母细胞自噬流，精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养12h、24h、48h和60h。
[0201] 图11是缺氧抑制HSR病人VHA活性，ELLISA检测正常受试者与HSR病人精液VHA活性。*，p<0.05vs正常受试者VHA活性。注：正常受试者精液采自海拔400米重庆市第三军医大学西南医院体检中心志愿者，HSR组精液采自海拔3680米拉萨总院泌尿外科。
[0202] ④抑制VHA，小鼠曲精小管DR5表达增加
[0203] 与正常受试者比较，HSR组精液DR5蛋白水平显著增高(p<0.05)；与WT+1％氧浓度0天组和WT+1％氧浓度3天组小鼠曲精小管比较，VHA KO+1％氧浓度0天与VHA KO+1％氧浓度3天组小鼠曲精小管病损情况分别显著加重，DR5表达分别显著增加(p<0.05)；与HSR组小鼠精子浓度比较，DR5组小鼠精子浓度显著增高(p<0.05)。(Yin et al.未发表)。
[0204] 图12是抑制VHA诱导小鼠曲精小管DR5表达，野生型WT组小鼠在21％氧浓度下分别处理0d与3d，VHAKO组小鼠在1％氧浓度下分别处理0d与3d。注：正常受试者精液采自海拔400米重庆市第三军医大学西南医院体检中心志愿者，HSR组精液采自海拔3680米拉萨总院泌尿外科
[0205] 图13是抑制DR5促进精子生成，野生型WT组小鼠在21％氧浓度下分别处理3d，HSR组与DR5 KO组小鼠分别在1％氧浓度下分别处理3d，各组小鼠分别用3％乌拉坦麻醉并取附睾检测精子浓度。*，p<0.05vs HSR组小鼠精子浓度。注：DR5基因敲除小鼠(C57BL/6)由研究小组前期从美国Mayo Clinic引进。
[0206] ⑤c-Jun作为转录因子结合到DR5启动子
[0207] 在缺氧条件下，干扰c-Jun抑制精母细胞DR5表达；染色质免疫共沉淀(Chip)结果表明c-Jun结合到DR5启动子并直接调控DR5表达。
[0208] 图14是c-Jun作为转录因子参与调控DR5表达。精母细胞系GC-2分别在21％和1％氧浓度下培养48h，*，p<0.05vs21％氧浓度时DR5 mRNA水平。
[0209] ⑥抑制VHA激活小鼠曲精小管JNK信号途径
[0210] 芯片结果提示缺氧诱导VHA单基因敲除小鼠24小时后，小鼠曲精小管JNK信号途径激活程度较野生型小鼠明显增高，并且JNK3、c-Jun和c-Fos mRNA和蛋白水平显著增加(p<0.05)(Yin et al.未发表)。
[0211] 图15是抑制VHA激活小鼠曲精小管JNK信号途径。野生型WT组小鼠在21％氧浓度下处理24h，HSR与VHAKO组小鼠在1％氧浓度下处理24h，*，p<0.05vs WT组小鼠曲精小管JNK3、c-Jun与c-Fos mRNA水平。
[0212] 2、工作条件
[0213] 1.试剂及细胞：所需试剂、VHA基因敲除小鼠及小鼠精母细胞均有市售。
[0214] 2.已具备本实验研究所需的所有实验技术
[0215] 1)细胞培养技术、分子生物学实验技术已为本室所熟悉。
[0216] 2)本室长期从事缺氧对男性生殖功能的影响，特别是生精上皮细胞脱落、精母细胞凋亡方面的研究，熟悉高原缺氧的研究现状，对低氧环境的模拟等有丰富的经验。
[0217] 3)本室拥有设备完善的常氧及低氧细胞培养室、分子生物学实验室，具备完成所需的实验设备，本实验所需的部分实验设备还可由本校中心仪器室和友邻科室提供。
[0218] 3.主要仪器及实验平台：
[0219] 1)本研究室一直致力于高原医学研究，为教育部重点实验室。拥有总面积约2000m2的实验室，完善的细胞培养室，操作方便的缺氧操作小室。拥有多种先进仪器；CO2培养箱、低氧细胞培养箱、超低温高速离心机、-70℃冰箱、荧光显微镜、凝胶成像系统、冰冻切片机、低温高速离心机、超声细胞破碎仪、实时定量PCR扩增仪、紫外透射观察仪及照相装置、杂交炉、电泳仪、紫外分光光度计、核酸蛋白检测仪、万分之一电子天平及高精度p H计等实验室常规设备，拥有先进的全天候不间断低氧缺氧舱群。
[0220] 2)我校中心实验室可提供使用的仪器有：激光共聚焦、FACSart plus流式细胞仪，TECBUSA-6803型真彩色微机图像分析系统等。
[0221] 3)目前我校有全军分子免疫学开放实验室及防原医学国家重点实验室，其仪器设备先进、技术力量强，可供使用。本课题所需仪器均可得到保证。
[0222] 4)本实验室有国外多名留学人员和实验室建立密切联系，对于国内难以获得的实验材料，同意给予帮助。
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