冻干人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法
专利汇可以提供冻干人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及冻干一种人淋巴细胞表面 抗原 质控品，它是由经 固定剂 固定后的人淋巴细胞和保护剂组成的细胞浓度为400～600万/mL的细胞悬液，经冻干后呈灰白色絮状固体；其标示值为CD3+：37.2～69.1％，CD4+：17.9～33.7％，CD8+：12.4～23.9％，CD4+/CD8+：0.98～1.94。同时本发明还公开了该质控品的制备方法。本发明具有抗原保存良好，抗原性稳定的特点，可用作流式细胞仪法、免疫 荧光 法、免疫酶法、SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)花环法等方法检测淋巴细胞表面标志(CD系列)抗原性的 质量 控制 试剂 。，下面是冻干人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法专利的具体信息内容。
1、一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品，其特征在于：它是由经固定剂 固定后的人淋巴细胞和保护剂组成的细胞浓度为400～600万/mL的细胞悬液； 其标示值为CD3+：37.2～69.1％，CD4+：17.9～33.7％，CD8+：12.4～23.9％， CD4+/CD8+：0.98～1.94。
2、如权利要求1所述的一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品，其特征在 于：所述固定剂为体积浓度为70％～100％、pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克 氏乙醇、甲醇、丙酮溶液中的任意一种；该溶液是将质量浓度为100％的乙醇、 甲醇、丙酮中的任意一种与pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液按 1∶1.43～0的体积比配制而成的。
3、如权利要求1所述的一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品，其特征在 于：所述保护剂为质量浓度为0.15～2.5％、pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏 明胶溶液；该溶液是将0.15～2.5克明胶溶解于100mL pH值为7.0～7.4的无钙、 镁汉克氏平衡盐溶液中，经过滤后配制而成的。
4、一种如权利要求1所述的冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方 法，包括以下步骤：
(1)通过预试验选择合格供者，抽取静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH 值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀，叠加在淋巴细胞分离液上， 离心；
(2)取单个核细胞，用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤 后，离心，弃上清；用pH值为7.0～7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁汉 克氏平衡盐溶液悬浮；
(3)将悬浮液在36.5±0.5℃下孵育30～45min后取出细胞悬浮液，离心，弃 上清；
(4)将沉淀后的细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释 成400～600万/mL细胞悬液，然后滴加于固定剂中；在-20～30℃下搅拌固定 0.25～48h，得固定细胞悬液；
(5)将固定细胞悬液用尼龙丝网过滤后，离心，弃上清；再用pH值为7.0～7.4 的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或蒸馏水洗涤后弃上清，得到固定细胞沉淀；
(6)将保护剂加入固定细胞沉淀中，配成400～600万/mL细胞悬液，以每 瓶0.2～1.0mL的量分装于冻存管或安培瓶后，即刻置于-80～-20℃冰箱中冷冻 4～72h；
(7)将冷冻干燥机预冷至-38～-42℃，取出盛有细胞悬液的冻存管或安培瓶 放入冷冻干燥机中，冻干4～18h后取出，立即封口，并将冻存管或安培瓶置 -20℃～4℃下保存即可。
5、如权利要求4所述的一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方 法，其特征在于：所述步骤(1）中的静脉血采用肝素或乙二胺四乙酸抗凝剂抽 取。
6、如权利要求4所述的一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方 法，其特征在于：所述步骤(4)中的细胞悬液与固定剂的体积比为1∶5～20。
7、如权利要求4所述的一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方 法，其特征在于：所述步骤(5)中的尼龙丝网为200～450目。
8、一种如权利要求1所述的冻干人淋巴细胞表面抗原质控品在人淋巴细 胞表面抗原检测中的应用，其特征在于：使用时，在人淋巴细胞表面抗原质 控品中加入无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或含20％新生小牛血清的无钙、镁汉 克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液或蒸馏水中的任意一种，使其溶解，其中所 述无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为7.0～7.4。
技术领域
本发明涉及医学免疫学中的质控品，尤其涉及一种冻干人淋巴细胞表面 抗原质控品及其制备方法。
背景技术
目前，测定淋巴细胞表面标志物的方法很多，但无论何种方法，都是应 用免疫学抗原-抗体反应的原理，即被测表面标志的特异性单克隆抗体与淋巴 细胞反应，通过采用不同的方式(如荧光、染色或花环)显示阳性细胞而获 得结果的。
当前，测定淋巴细胞CD系列的单克隆抗体(McAb)已在世界范围内进 行了规模化、商品化生产，各个实验室根据自身的实际情况选择不同的CD McAb生产厂家、不同的CD McAb品种和淋巴细胞亚群的测定方法。目前， 由于各实验室选用的检测方法不同，实验仪器型号不一，且中国人的淋巴细 胞亚群参考值尚无统一定论，因此在实际工作中暂时参照各自所选用的试剂 盒说明书中的参考值作为判断标准，从而致使淋巴细胞亚群检测结果的可靠 性、可比性差，检测质量难以保证。
目前《全国临床检验操作规程》(中华人民共和国卫生部医政司编，第三 版，东南大学出版社，2007：349；第二版1997：381-384和第一版1991：286-287) 中规定的用于细胞免疫检测的质量控制的试剂是使用液氮冻存的活淋巴细 胞，该试剂通过预试验选择合格供者，自静脉取空腹抗凝(肝素或乙二胺四 乙酸)血，分离淋巴细胞，洗涤2～3次，混悬于细胞冷冻保存液中获得，然 后进行小量分装后置液氮中保存，液氮罐置于冷库中，在每批试验中用作质 量控制。使用时，从液氮罐中取出一支细胞冻存管，迅速移入37℃水浴中复 苏，吸出细胞悬液于另一离心管中离心，弃上清，洗涤2～3次，根据用途加 入定量细胞悬浮液悬浮，调节到所需细胞浓度备用。但是在该技术中，细胞 须在液氮中冷冻保存，且液氮罐须置于冷库中，保存要求条件严格、设备条 件苛刻，使得保存费用很高；同时因为保存的是活的细胞，一旦操作过程和 实验条件稍有不当，细胞就很容易损伤和死亡，从而影响细胞抗原性和试验 结果，因此普通临床实验室常因无此条件和能力而无法进行此项试验，而有 条件者在实际使用时往往由于细胞分离、冻存、复苏过程技术要求高，操作 复杂，费时费力，且有效期短而难以得到有效推广。
由于淋巴细胞表面抗原属于不稳定抗原，在保存过程中极易丢失，因此 应用活的淋巴细胞质控品，无法解决实际工作中普遍应用的问题。
发明内容
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种用冷冻干燥的方法使淋巴 细胞表面抗原长期稳定存在的冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品， 其特征在于：它是由经固定剂固定后的人淋巴细胞和保护剂组成的细胞浓度 为400～600万/mL的细胞悬液；其标示值为CD3+：37.2～69.1％，CD4+： 17.9～33.7％，CD8+：12.4～23.9％，CD4+/CD8+：0.98～1.94。
所述固定剂为体积浓度为70％～100％、pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克 氏乙醇、甲醇、丙酮溶液中的任意一种；该溶液是将质量浓度为100％的乙醇、 甲醇、丙酮中的任意一种与pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液按 1∶1.43～0的体积比配制而成的。
所述保护剂为质量浓度为0.15～2.5％、pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏 明胶溶液；该溶液是将0.15～2.5克明胶溶解于100mL pH值为7.0～7.4的无钙、 镁汉克氏平衡盐溶液中，经过滤后配制而成的。
一种如上所述的冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法，包括以下 步骤：
(1)通过预试验选择合格供者，抽取静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH 值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀，叠加在淋巴细胞分离液上， 离心；
(2)取单个核细胞，用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤 后，离心，弃上清；用pH值为7.0～7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁汉 克氏平衡盐溶液悬浮；
(3)将悬浮液在36.5±0.5℃下孵育30～45min后取出细胞悬浮液，离心，弃 上清；
(4)将沉淀后的细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释 成400～600万/mL细胞悬液，然后滴加于固定剂中；在-20～30℃下搅拌固定 0.25～48h，得固定细胞悬液；
(5)将固定细胞悬液用尼龙丝网过滤后，离心，弃上清；再用pH值为7.0～7.4 的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或蒸馏水洗涤后弃上清，得到固定细胞沉淀；
(6)将保护剂加入固定细胞沉淀中，配成400～600万/mL细胞悬液，以每 瓶0.2～1.0mL的量分装于冻存管或安培瓶后，即刻置于-80～-20℃冰箱中冷冻 4～72h；
(7)将冷冻干燥机预冷至-38～-42℃，取出盛有细胞悬液的冻存管或安培瓶 放入冷冻干燥机中，冻干4～18h后取出，立即封口，并将冻存管或安培瓶置 -20℃～4℃下保存即可。
所述步骤(1)中的静脉血采用肝素或乙二胺四乙酸抗凝剂抽取。
所述步骤(4)中的细胞悬液与固定剂的体积比为1∶5～20。
所述步骤(5)中的尼龙丝网为200～450目。
一种如上所述的冻干人淋巴细胞表面抗原质控品在人淋巴细胞表面抗原 检测中的应用，其特征在于：使用时，在人淋巴细胞表面抗原质控品中加入 无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐 溶液或磷酸盐缓冲液或蒸馏水中的任意一种，使其溶解，其中所述无钙、镁 汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为7.0～7.4。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、由于本发明是经过固定剂固定后的冻干品，是表面抗原保存良好的无 生物活性的淋巴细胞，因此抗原性稳定，有效期长至2～5年，质量可靠。
2、由于本发明为冻干品并密封，其体积、重量小，可在低于25℃的常 温下或-20℃～4℃运输、保存，后者首选，无需特殊技术和条件，因此可大大 降低存储费用。
3、本发明使用中不需要特殊设备和条件，操作简单，可广泛适用于普通 临床实验室开展质控工作，从而促进和提高人淋巴细胞表面抗原活性检测的 质量和水平。
4、本发明产品价格低廉，易得到，运输存储方便。
5、本发明产品可用作流式细胞仪法、免疫荧光法、免疫酶法、SPA(金 黄色葡萄球菌A蛋白)花环法等方法检测淋巴细胞表面标志(CD系列)抗 原性的质量控制试剂(参考品)，以及用于有关淋巴细胞表面标志的其他检测 项目(受体)和方法的室内室外质控；同时还可用于检测淋巴细胞表面标志 McAb的亲和力、效价、型别等检测，评价淋巴细胞表面抗原McAb。
6、如对本发明产品经国际或国内质控相关专业部门——如WHO(世界 卫生组织)、IUIS(国际免疫学联合会)、中国卫生部临床检验中心实验室标 定抗原活性后，可提供国际或国内的一级、二级参考品，作为淋巴细胞表面 抗原质量控制统一标准参考品，用于淋巴细胞表面抗原质量控制、评价单克 隆抗体(McAb)质量和McAb质量控制。
具体实施方式
上述冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法如下：
(1)首先通过对身体健康、无传染性疾病和其它急、慢性疾病、无免疫系 统疾病的18～38岁的男性或女性细胞免疫功能——淋巴细胞CD3+、CD4+、 CD8+、CD4+/CD8+进行检测，将结果正常者确定为预试验合格供者。
然后对预试验合格供者采用肝素抗凝剂空腹抽取静脉血，以1∶1～3的体 积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液(无钙、镁Hank’S 液)，混匀，叠加在淋巴细胞分离液(来源：中国医学科学院血液病研究所) 上，以1500～2500rpm的转速离心15～30min。
(2)取单个核细胞(PBMC)，用5～10倍量的pH值为7.0～7.4的无钙、镁 Hank’S液洗涤2～3次后，以500～1500rpm的转速离心5～10min，弃上清；用 pH值为7.0～7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮。
(3)将盛有悬浮液的离心管(瓶)呈20度角斜放在36.5±0.5℃下孵育 30～45min，然后取出细胞悬浮液置另一试管中，以500～1500rpm的转速离心 5～10min，弃上清。
(4)将沉淀后的细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释 成400～600万/mL细胞悬液，然后滴加于体积浓度为70％～100％、、pH值为 7.0～7.4的无钙、镁汉克氏乙醇溶液中，细胞悬液与乙醇溶液的体积比为1∶ 5～20；在-20～30℃下磁力搅拌固定0.25～48h，得固定细胞悬液。
其中乙醇溶液是将100％的乙醇与pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平 衡盐溶液按1∶1.43～0的体积比配制而成的。
(5)将步骤(4)得到的固定细胞悬液用200～450目尼龙丝网过滤后移入5～50 mL离心管中，以500～2500rpm的转速离心5～10min，弃上清；再用pH值为 7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液或蒸馏水洗涤2～3次后弃上清，得固定细胞沉 淀。
(6)将0.15～2.5克明胶溶解于100mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平 衡盐溶液中，用100～200目尼龙丝网过滤后配制成0.15～2.5％、pH值为7.0～7.4 的无钙、镁汉克氏明胶溶液。
将该明胶溶液加入步骤(5)得到的固定细胞沉淀中，混匀后用血细胞计数 的方法计数细胞，配成400～600万/mL细胞悬液，得到加有冻干保护剂的固 定细胞悬液，然后以每瓶0.2～1.0mL的量分装于冻存管或安培瓶后，即刻置 于-80～-20℃冰箱中冷冻4～72h。
(7)将冷冻干燥机预冷至-38～-42℃，取出盛有细胞悬液的冻存管或安培瓶 迅速放入冷冻干燥机中(切忌冰冻物溶解)，冻干4～18h后取出，立即封口， 并将冻存管或安培瓶置-20℃～4℃下保存即可。
上述操作均在无菌环境下进行。
实施例2 一种人冻干淋巴细胞表面抗原质控品，它是由经无钙、镁汉 克氏甲醇溶液固定后的人淋巴细胞和无钙、镁汉克氏明胶溶液组成的细胞浓 度为400～600万/mL的细胞悬液，经冻干后呈灰白色絮状固体；采用流式细 胞仪法测定淋巴细胞亚群(CD)，得到其标示值为CD3+：37.2～69.1％，CD4+： 17.9～33.7％，CD8+：12.4～23.9％，CD4+/CD8+：0.98～1.94。
上述冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法如下：
(1)首先确定预试验合格供者，然后对预试验合格供者采用乙二胺四乙酸 抗凝剂空腹抽取静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、 镁汉克氏平衡盐溶液(无钙、镁Hank’S液)，混匀，叠加在淋巴细胞分离液 (来源：中国医学科学院血液病研究所)上，以1500～2500rpm的转速离心 15～30min。
(2)取单个核细胞(PBMC)，用5～10倍量的pH值为7.0～7.4的无钙、镁 Hank’S液洗涤2～3次后，以500～1500rpm的转速离心5～10min，弃上清；用 pH值为7.0～7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮。
(3)将盛有悬浮液的离心管(瓶)呈20度角斜放在36.5±0.5℃下孵育 30～45min，然后取出细胞悬浮液置另一试管中，以500～1500rpm的转速离心 5～10min，弃上清。
(4)将沉淀后的细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释 成400～600万/mL细胞悬液，然后滴加于体积浓度为70％～100％、、pH值为 7.0～7.4的无钙、镁汉克氏甲醇溶液中，细胞悬液与甲醇溶液的体积比为1∶ 5～20；在-20～30℃下磁力搅拌固定0.25～48h，得固定细胞悬液。
其中甲醇溶液是将100％的甲醇与pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平 衡盐溶液按1∶1.43～0的体积比配制而成的。
(5)将步骤(4)得到的固定细胞悬液用200～450目尼龙丝网过滤后移入5～50 mL离心管中，以500～2500rpm的转速离心5～10min，弃上清；再用pH值为 7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液或蒸馏水洗涤2～3次后弃上清，得固定细胞沉 淀。
(6)将0.15～2.5％、pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏明胶溶液加入步骤(5) 得到的固定细胞沉淀中，混匀后用血细胞计数的方法计数细胞，配成400～600 万/mL细胞悬液，得到加有冻干保护剂的固定细胞悬液，然后以每瓶 0.2～1.0mL的量分装于冻存管或安培瓶后，即刻置于-80～-20℃冰箱中冷冻 4～72h。
(7)将冷冻干燥机预冷至-38～-42℃，取出盛有细胞悬液的冻存管或安培瓶 迅速放入冷冻干燥机中(切忌冰冻物溶解)，冻干4～18h后取出，立即封口， 并将冻存管或安培瓶置-20℃～4℃下保存即可。
上述操作均在无菌环境下进行。
实施例3 一种冻干人淋巴细胞表面抗原质控品，它是由经无钙、镁汉 克氏丙酮溶液固定后的人淋巴细胞和无钙、镁汉克氏明胶溶液组成的细胞浓 度为400～600万/mL的细胞悬液，经冻干后呈灰白色絮状固体；采用流式细 胞仪法测定淋巴细胞亚群(CD)，得到其标示值为CD3+：37.2～69.1％，CD4+： 17.9～33.7％，CD8+：12.4～23.9％，CD4+/CD8+：0.98～1.94。
上述冻干人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法如下：
(1)首先确定预试验合格供者，然后对预试验合格供者采用乙二胺四乙酸 抗凝剂空腹抽取静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、 镁汉克氏平衡盐溶液(无钙、镁Hank’S液)，混匀，叠加在淋巴细胞分离液 (来源：中国医学科学院血液病研究所)上，以1500～2500rpm的转速离心 15～30min。
(2)取单个核细胞(PBMC)，用5～10倍量的pH值为7.0～7.4的无钙、镁 Hank’S液洗涤2～3次后，以500～1500rpm的转速离心5～10min，弃上清；用 pH值为7.0～7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮。
(3)将盛有悬浮液的离心管(瓶)呈20度角斜放在36.5±0.5℃下孵育 30～45min，然后取出细胞悬浮液置另一试管中，以500～1500rpm的转速离心 5～10min，弃上清。
(4)将沉淀后的细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释 成400～600万/mL细胞悬液，然后滴加于体积浓度为70％～100％、、pH值为 7.0～7.4的无钙、镁汉克氏丙酮溶液中，细胞悬液与丙酮溶液的体积比为1∶ 5～20；在-20～30℃下磁力搅拌固定0.25～48h，得固定细胞悬液。
其中丙酮溶液是将100％的丙酮与pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平 衡盐溶液按1∶1.43～0的体积比配制而成的。
(5)将步骤(4)得到的固定细胞悬液用200～450目尼龙丝网过滤后移入5～50 mL离心管中，以500～2500rpm的转速离心5～10min，弃上清；再用pH值为 7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液或蒸馏水洗涤2～3次后弃上清，得固定细胞沉 淀。
(6)将0.15～2.5％、pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏明胶溶液加入步骤(5) 得到的固定细胞沉淀中，混匀后用血细胞计数的方法计数细胞，配成400～600 万/mL细胞悬液，得到加有冻干保护剂的固定细胞悬液，然后以每瓶 0.2～1.0mL的量分装于冻存管或安培瓶后，即刻置于-80～-20℃冰箱中冷冻 4～72h。
(7)将冷冻干燥机预冷至-38～-42℃，取出盛有细胞悬液的冻存管或安培瓶 迅速放入冷冻干燥机中(切忌冰冻物溶解)，冻干4～18h后取出，立即封口， 并将冻存管或安培瓶置-20℃～4℃下保存即可。
上述操作均在无菌环境下进行。
实施例4 当该冻干人淋巴细胞表面抗原质控品应用于流式细胞仪法检 测淋巴细胞亚群(CD)时，在人淋巴细胞表面抗原质控品中加入100～1000μL、 pH＝7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液；或者在质控品中加入100～1000μL、摩尔 浓度为0.01mol/L、pH＝7.0～7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；或者在质控品中加 入100～1000μL的蒸馏水，溶解，然后再用250～450目的尼龙丝网过滤，备 用。
实施例5 当该冻干人淋巴细胞表面抗原质控品应用于免疫荧光法、 AP-AAP桥联酶免疫法检测淋巴细胞亚群(CD)时，在人淋巴细胞表面抗原 质控品中加入100～1000μL、pH＝7.0～7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁 Hank’S液；或者在质控品中加入100～1000μL、摩尔浓度为0.01mol/L、 pH＝7.0～7.4的含20％新生小牛血清的PBS；或者在质控品中加入100～1000μL 的含20％新生小牛血清的蒸馏水，溶解后备用。
实施例6 当该冻干人淋巴细胞表面抗原质控品应用于单克隆抗体SPA 花环法(McAb-A-E直接法或间接法)检测淋巴细胞亚群(CD)时，在人淋 巴细胞表面抗原质控品中加入100～1000μL、pH值为7.0～7.4的无钙、镁 Hank’S液；或者在质控品中加入100～1000μL的蒸馏水，溶解后备用。
应该理解，这里讨论的实施例和实施方案只是为了说明，对熟悉该领域 的人可以提出各种改进和变化，这些改进和变化将包括在本申请的精神实质 和范围以及所附的权利要求范围内。
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