专利汇可以提供一种用于均一体系细胞荧光检测钙流方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及细胞 荧光 检测领域,本发明主要提供一种可适用于FLIPR的不需要洗脱细胞外荧光物质的方法。为了实现上述发明目的,本发明采用在细胞装载 荧光染料 后加入淬灭剂Amaranth,提出一种用于均一体系细胞荧光检测 钙 流方法。本发明的优点如下:(1)实现了细胞在测量前不用置换液体;(2)本发明非常经济实惠,整个检测过程成本占 现有技术 成本的10%-20%;(3)本发明整个操作过程简单,可用于高通量筛选。,下面是一种用于均一体系细胞荧光检测钙流方法专利的具体信息内容。
1.一种用于均一体系细胞荧光检测钙流的方法,其特征在于:包括如下步骤:
a. 称取Amaranth粉末,溶解在FLIPR缓冲液(1xHank’s缓冲液+20 mM HEPES, pH 7.4)中,得到25 mg/ml溶液;
b. 取10 μl Fluo-4AM (2 mM) 和10 μl pluronic acid (20% in DMSO)混匀,加入到
10.5 ml FLIPR缓冲液中,再加入10.5 μl小牛血清,
c. 如果细胞像CHO一样有阴离子泵(organic anion transporter,还需要在FLIPR缓冲液中加入probenecid (终浓度 2.5 mM)
d. 在96孔板的每孔加入100 ul荧光染料溶液,放回培养箱温浴0.5h-48h后再加入100 μl Amaranth溶液,这也是与现有技术的不同之处(以F8NW NO Wash Calcium Assay Kit为例),目的是为了减小淬灭剂Amaranth对细胞的毒性。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:还包括前期准备步骤和后续FLIPR分析步骤。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述前期准备步骤如下:准备细胞板:将CHO-M5以每孔60000个细胞的密度种在96孔板中(孔板类型为四周黑色,底部透明),培育
16-24小时。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述前期准备步骤如下:准备细胞板:将HEK-M4细胞以80000个/孔的密度种在96孔板中(孔板类型为四周黑色,底部透明),培育16-
24小时。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述后续FLIPR分析步骤如下:细胞为CHO细胞,将孔板中的培养基全部吸出,加入100 μl的荧光染料溶液,37℃孵育0.5h-48h后,再次吸出孔板里的液体,加入100μl的FLIPR缓冲液(含Amaranth),然后根据实验需求加入药物后进行FLIPR分析。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述后续FLIPR分析步骤如下:细胞为CHO细胞,将孔板中的培养基全部吸出,加入100 μl的荧光染料溶液,37℃孵育1h后,再次吸出孔板里的液体,加入100μl的FLIPR缓冲液(含Amaranth),然后根据实验需求加入药物后进行FLIPR分析。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述后续FLIPR分析步骤如下:细胞为HEK细胞,直接在细胞孔板中加入100μl的荧光染料溶液,37℃孵育0.5h-48h后,根据实验需求加入药物后进行FLIPR分析。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述后续FLIPR分析步骤如下:细胞为HEK细胞,直接在细胞孔板中加入100μl的荧光染料溶液,37℃孵育1h后,根据实验需求加入药物后进行FLIPR分析。
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