一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其
应用
技术领域
背景技术
[0002] TORCH指可导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体，它是一组病原
微生物的英文名称缩写，其中T(Toxopasma)是弓形虫，O(Others)是其他病原微生物，如梅毒螺旋体、带状疱疹病毒、细小病毒B19、柯萨奇病毒等，R(Rubella.Virus)是
风疹病毒，C(Cytomegalo.Virus)是巨细胞病毒，H(Herpes.Virus)是单纯疱疹病毒I/II型。这组微生物感染有着共同的特征，即可造成母婴感染。这些微生物可经过胎盘直接传播给
胎儿，引起宫内感染，造成孕妇流产、死胎、畸胎或早产，新生儿出生后多器官损害、严重智
力障碍；也可通过产道感染胎儿，导致出生后发育障碍，生活不可自理。主要特点是孕妇感染后无症状或症状轻，难以发现，是一种隐形杀手。
[0003] 其中单纯疱疹病毒(HSV)有二个血清型，即HSVI型和HSVII型，HSVI型主要感染腰部以上部位，引起口咽部疱疹、疱疹性
角膜结膜炎、疱疹性甲沟炎或疱疹性脑炎等，儿童易感染；HSVII型主要感染生殖器。我国的HSV感染发病率迅速上升，近年HSVI型的感染显著增多，约占该病的10％-40％。
[0004] HSVI型和HSVII型病毒核苷酸序列有50％同源性。由于HSVI型和HSVII型之间可以交叉感染，两型病毒的生物学特征及其各自引发的
疾病和疾病的严重程度存在差异，如果检测结果不分型，则HSV阳性率会非常高，因为HSVI型有95％的人会感染且大多数为隐性感染，即HSV检测结果为阳性而没有任何症状，而HSVII型阳性率为3％-5％。另外，单纯疱疹病毒不同型感染，其
治疗方案和
预后也不同。因此，临床上提供分型诊断显得越来越重要。
[0005] 目前，我国临床上对TORCH病原体的检测仍以ELISA酶联免疫诊断技术为主。该方法是检测母体血清中的特异性IgM、IgG
抗体。IgM阳性作为初次感染的诊断指标，IgG阳性看作是既往感染。目前潍坊市康华生物技术有限公司首次注册获得了TORCH相关检测试剂盒：TORCH-IgM(TOX-IgM、RV-IgM、CMV-IgM、HSVI-IgM、HSVII-IgM)五项联合检测试剂(胶体金法)和TORCH-IgG(TOX-IgG、RV-IgG、CMV-IgG、HSVII-IgG)四项联合检测试剂(胶体金法)。
[0006] 随着现代核酸技术的发展，建立在基因
水平上的实时荧光定量PCR技术由于其高灵敏性和高特异性，在临床检测中得到广泛应用。然而，由于弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒I/II型(HSVI/HSVII)等病原体的核苷酸序列具有重复序列多、GC含量较高及特异性短
片段少，而特异性长片段的相互干扰严重等特点，一次性同时检测五种病原体难度很大；并且目前使用的PCR仪最多只有五个荧光检测通道，如果五个荧光通道全部用来检测TORCH五种病原体，除了对体系设计要求较高外，同时没有多余的检测通道用于内部质控检测，无法真实有效地监控待测样本核酸
质量及核酸提取过程。
发明内容
[0007] 有鉴于此，本发明提出了一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用。
发明人经过长期大量的实验研究，摸索出合适的引物对和荧光探针序列、比例及工具酶和其浓度配比，使得可以在两个PCR反应管中一次性上机同时检测来自TORCH五种病原体的核酸，各种核酸扩增反应之间不会相互干扰，具有高准确度和高灵敏度，操作方便快捷，大大降低检测成本。
[0008] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0009] 第一方面，本发明提供了一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒，包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述五种病原体分别为弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型，所述第一PCR反应液包括其中三种病原体核酸的引物对和荧光探针，该三种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团，所述第二PCR反应液包括另外两种病原体核酸的引物对和荧光探针，该两种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记所述第一荧光基团和第二荧光基团，且所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团的荧光检测
波长互不相同，所述五种病原体核酸的荧光探针3’端分别标记能够淬灭相应5’端荧光基团发射的荧光
信号的淬灭基团，所述五种病原体核酸的引物对具体如下：
[0010] TOX上游引物5’-CTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTG-3’(SEQ ID NO.1)，
[0011] TOX下游引物5’-GGAGCCGAAGTGCGTTTTCT-3’(SEQ ID NO.2)；
[0012] RV上游引物5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’(SEQ ID NO.3)，
[0013] RV下游引物5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’(SEQ ID NO.4)；
[0014] CMV上游引物5’-AAGGTCTTTGCCCAGTACATTCT-3’(SEQ ID NO.5)，
[0015] CMV下游引物5’-AATAGCCTCTTCCTCATCTGACTC-3’(SEQ ID NO.6)；
[0016] HSVI上游引物5’-CCTTCTTCTTGGCCTTGTGTT-3’(SEQ ID NO.7)，
[0017] HSVI下游引物5’-CCGGGAGATGATACGGTACAT-3’(SEQ ID NO.8)；
[0018] HSVII上游引物5’-TCGAGGAGGTGGTCTTGATGCG-3’(SEQ ID NO.9)，[0019] HSVII下游引物5’-GCGGGAGTACATGCGGGAGC-3’(SEQ ID NO.10)。
[0020] 荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAM、VIC、HEX、NED、TAMRA、CY3、ROX和CY5等常规标记基团，优选的，所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团分别为荧光基团FAM、HEX和CY5，所述五种病原体核酸的荧光探针具体如下：
[0021] TOX荧光探针5’-CTCCAAGCACAGGCGAGCTTGC-3’(SEQ ID NO.11)，
[0022] TOX荧光探针5’端标记荧光基团CY5，3’端标记能够淬灭CY5荧
光信号的淬灭基团；
[0023] RV荧光探针5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’(SEQ ID NO.12)，
[0024] RV荧光探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记能够淬灭FAM荧光信号的淬灭基团；
[0025] CMV荧光探针5’-CCAGTACATTCTGGGGGCCGATC-3’(SEQ ID NO.13)，[0026] CMV荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；
[0027] HSVI荧光探针5’-TCTTGGCCTTGTGTTCCGTGCG-3’(SEQ ID NO.14)，[0028] HSVI荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；
[0029] HSVII荧光探针5’-TCTTGATGCGCTCCACGGACGCGTTG-3’(SEQ ID NO.15)，[0030] HSVII荧光探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记能够淬灭FAM荧光信号的淬灭基团。
[0031] 在以上技术方案的
基础上，优选的，所述试剂盒还包括内标，该内标为含沙眼衣原体色
氨酸合成酶β亚基编码基因的假病毒，其核酸
碱基序列如
序列表中SEQ ID NO.19所示。
[0032] 进一步，优选的，所述第二PCR反应液还包括所述内标的引物对和荧光探针，所述内标的荧光探针5’端标记第三荧光基团，所述内标的荧光探针3’端标记能够淬灭第三荧光基团发射的荧光信号的淬灭基团，所述内标的引物对具体如下：
[0033] 内标上游引物5’-ACGAGCCTTTTATACATTAGCCA-3’(SEQ ID NO.16)；
[0034] 内标下游引物5’-TGTGAAGACTCCAATGCAGGA-3’(SEQ ID NO.17)。
[0035] 更 进 一 步 ，优 选 的 ，所 述 内 标 的 荧 光 探 针 碱 基 序 列 为 5’-CCACCGATGAAGAGGCGTTACGAGC-3’(SEQ ID NO.18)，所述第三荧光基团为荧光基团CY5，内标荧光探针5’端标记荧光基团CY5，3’端标记能够淬灭CY5荧光信号的淬灭基团。
[0036] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品包括分别含所述五种病原体特异性基因片段的假病毒，所述阳性质控品可以为包含分别装有含TOX特异性基因片段的假病毒、CMV特异性基因片段的假病毒、RV特异性基因片段的假病毒、HSVI特异性基因片段的假病毒和HSVII特异性基因片段的假病毒的五个独立封装的产品，也可以为由分别含TOX、CMV、RV、HSVI和HSVII特异性基因片段的假病毒组成的假病毒
混合液产品，以假病毒作为阳性质控品能更准确有效监控核酸提取过程；所述阴性质控品为DPEC水、不含所述五种病原体核酸的缓冲液、小
牛血清或人源血清，优选
小牛血清或人源血清。
[0037] 经过大量实验研究，对PCR反应液各组分浓度进行了优化，优选的，所述五种病原体核酸的引物浓度均为0.2-0.5μM，所述五种病原体核酸的荧光探针浓度均为0.1-0.3μM，每种病原体核酸的引物与该病原体核酸的荧光探针的浓度比均为(1-4):1。所述第一PCR反应液和第二PCR反应液均还包括逆转录酶、RNA酶
抑制剂、Taq DNA聚合酶和dNTPs，逆转录酶浓度为1-3U/μL，RNA酶抑制剂浓度为0.2-1U/μL，Taq DNA聚合酶浓度为0.1-0.3U/μL，dNTPs浓度为0.1-4mM。
[0038] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述第一PCR反应液和第二PCR反应液均还包括UNG酶和dUTP，UNG酶浓度为0.004-0.1U/μL，dUTP浓度为0.1-4mM。
[0039] 第二方面，本发明还提供了第一方面所述的任一同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒的应用，包括将所述第一PCR反应液和第二PCR反应液分别加至两个PCR反应管中，然后在两个PCR反应管中分别加入待测样品的核酸提取物，通过荧光定量PCR方法一次性上机同时检测待测样品中是否含有TORCH五种病原体核酸。
[0040] 本发明的同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用相对于
现有技术具有以下有益效果：
[0041] (1)本发明能够仅利用两个PCR反应管一次性上机同时检测来自TORCH五种病原体的核酸，包括弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型的检测，尤其是可以对单纯疱疹病毒进行分型，各种核酸扩增反应之间不会相互干扰，具有高准确度和灵敏度；
[0042] (2)荧光定量PCR技术主要包括核酸提取和扩增两个部分，其中核酸提取也是至关重要的第一步，临床中所采集的样本多种多样，这些样本中不仅含有内源性物质(如血红蛋白、乳
铁蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、脂类、粘蛋白、多糖等)，通常还含有外源物质(如抗凝剂等)和常用的治疗药物(如干扰素、利巴韦林等)等，这些物质都会影响核酸的提取与检测，本发明首次在TORCH五种病原体荧光检测中引入假病毒内标，可真实有效地监控待测样本核酸的提取过程，以对整个PCR反应过程、试剂/设备交叉污染等环节进行合理的质量控制，防止样本检测假阴性，提高检测结果的可靠性，另外，由于假病毒是核酸片段与
包装蛋白形成的
复合体，它能耐受核酸酶，在血液等物质中可以长期稳定的存在，易于保存；
[0043] (3)本发明试剂盒还提供了UNG酶和dUTP，在PCR扩增反应前加入UNG酶，就可以破坏反应液中含有dU的PCR产物，但对天然核酸不起作用，随后将UNG酶灭活，再进行扩增，这样就可以有效地防止实验室内扩增产物形成的
气溶胶的污染，从而防止样本检测
假阳性。
附图说明
[0044] 为了更清楚地说明本发明
实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0045] 图1为实施例2中阴性质控品和阳性质控品的检测结果图，其中a图显示③⑤号PCR反应管的检测结果，b图显示④⑥号PCR反应管的检测结果。
[0046] 图2为实施例2中弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型与单纯疱疹病毒II型样本的检测结果图。
具体实施方式
[0047] 下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0048] 下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可以参考《分子克隆实验指南》(第四版)。实施例中所用的引物和荧光探针委托宝
生物工程(大连)有限公司合成，所用的pSE380质粒载体购自Invitrogen公司。
[0049] 实施例1
[0050] 本实施例提供一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒，它包括第一PCR反应液、第二PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品。所述TORCH五种病原体分别为弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型。
[0051] 所述第一PCR反应液包括分别用于检测风疹病毒、巨细胞病毒和弓形虫核酸的引物对和荧光探针，第二PCR反应液包括分别用于检测单纯疱疹病毒II型、单纯疱疹病毒I型和内标核酸的引物对和荧光探针，具体如下：
[0052] RV上游引物5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’，
[0053] RV下游引物5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’，
[0054] RV荧光探针5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’，
[0055] RV荧光探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记能够淬灭FAM荧光信号的淬灭基团；
[0056] CMV上游引物5’-AAGGTCTTTGCCCAGTACATTCT-3’，
[0057] CMV下游引物5’-AATAGCCTCTTCCTCATCTGACTC-3’，
[0058] CMV荧光探针5’-CCAGTACATTCTGGGGGCCGATC-3’，
[0059] CMV荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；
[0060] TOX上游引物5’-CTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTG-3’，
[0061] TOX下游引物5’-GGAGCCGAAGTGCGTTTTCT-3’，
[0062] TOX荧光探针5’-CTCCAAGCACAGGCGAGCTTGC-3’，
[0063] TOX荧光探针5’端标记荧光基团CY5，3’端标记能够淬灭CY5荧光信号的淬灭基团；
[0064] HSVII上游引物5’-TCGAGGAGGTGGTCTTGATGCG-3’，
[0065] HSVII下游引物5’-GCGGGAGTACATGCGGGAGC-3’，
[0066] HSVII荧光探针5’-TCTTGATGCGCTCCACGGACGCGTTG-3’，
[0067] HSVII荧光探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记能够淬灭FAM荧光信号的淬灭基团；
[0068] HSVI上游引物5’-CCTTCTTCTTGGCCTTGTGTT-3’，
[0069] HSVI下游引物5’-CCGGGAGATGATACGGTACAT-3’，
[0070] HSVI荧光探针5’-TCTTGGCCTTGTGTTCCGTGCG-3’，
[0071] HSVI荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；
[0072] 内标上游引物5’-ACGAGCCTTTTATACATTAGCCA-3’，
[0073] 内标下游引物5’-TGTGAAGACTCCAATGCAGGA-3’，
[0074] 内标荧光探针5’-CCACCGATGAAGAGGCGTTACGAGC-3’，
[0075] 内标荧光探针5’端标记荧光基团CY5，3’端标记能够淬灭CY5荧光信号的淬灭基团；
[0076] 各上下游引物浓度均为0.2μM，各荧光探针浓度均为0.1μM。
[0077] 第一PCR反应液和第二PCR反应液均还包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、UNG酶、dUTP和dNTPs。其中逆转录酶浓度为1U/μL，RNA酶抑制剂浓度为0.2U/μL，Taq DNA聚合酶浓度为0.1U/μL，UNG酶浓度为0.004U/μL，dUTP和dNTPs浓度均为0.1mM。
[0078] 所述内标为含沙眼衣原体
色氨酸合成酶β亚基编码基因的假病毒，内标核酸碱基序列如序列表中SEQ ID NO.19所示。所述阳性质控品是由分别含TORCH五种病原体特异性基因片段的假病毒组成的假病毒混合液，所述阴性质控品为人源血清。本发明是利用装甲RNA(Armored RNA)技术，即由MS2
噬菌体外壳蛋白包裹重组RNA的技术，用以制备内标和阳性质控品(即外标)的假病毒。根据NCBI公布的序列，对TORCH五种病原体核酸基因序列进行比对分析，选择高度保守基因序列，并选取沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因序列作为内标序列，不会对TORCH五种病原体检测产生干扰，分别扩增这些基因的特异性保守区域，然后分别与pSE380-MS2重组质粒连接，转入宿主大肠杆菌BL21中进行表达，表达产物即为包裹有目的RNA的假病毒颗粒，
破碎菌种BL21提取表达产物，三氯甲烷法纯化得到含有目的RNA的假病毒颗粒，即TORCH五种病原体RT-PCR检测的外标及内标。
[0079] 实施例2
[0080] 以临床医院收集的已灭活的弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型与单纯疱疹病毒II型阳性的血清样本混合物作为待测样本，采用实施例1所述试剂盒检测待测样本中TORCH五种病原体核酸。
[0081] S1、核酸提取
[0082] 吸取200μL待测样本加入5μL内标后进行核酸提取；取阳性质控品和阴性质控品各25μL，分别加入5μL内标后补加生理盐水至200μL进行核酸提取。
[0083] 采用百泰基因的病毒核酸提取试剂盒(鄂汉械备20170246号)提取待测样本(含内标)、阳性质控品(含内标)和阴性质控品(含内标)中核酸，具体操作方法参见该试剂盒
说明书。
[0084] S2、上样
[0085] 准备6个PCR反应管，分别编号①②③④⑤⑥，向①③⑤管中分别加入40μL第一PCR反应液，向②④⑥管中分别加入40μL第二PCR反应液，5000r/min离心数秒，将PCR反应液沉至管底。然后再向①②管中分别加入10μL步骤S1得到的待测样本(含内标)的核酸；③④管中分别加入10μL阳性质控品(含内标)的核酸；⑤⑥管中分别加入10μL阴性质控品(含内标)的核酸。盖紧各PCR反应管，短暂离心片刻后上机检测。
[0086] S3、荧光定量PCR反应
[0087] (1)将各PCR反应管放入PCR扩增仪样品槽中，按对应顺序设置检测样品名称。
[0088] (2)荧光检测通道选择：选择FAM通道检测RV和HSVII，选择HEX通道检测CMV和HSVI，选择CY5通道检测TOX和内标。
[0089] (3)荧光定量PCR反应条件如下表：
[0090]
[0091] (4)质量控制
[0092] 第一PCR反应液中，RV阴性质控品FAM检测通道检测结果应为阴性且无Ct值，CMV阴性质控品HEX检测通道检测结果应为阴性且无Ct值，TOX阴性质控品CY5检测通道检测结果应为阴性且无Ct值；
[0093] RV阳性质控品FAM检测通道检测结果应为有扩增曲线且Ct值≤30.00，CMV阳性质控品HEX检测通道检测结果应为有扩增曲线且Ct值≤30.00，TOX阳性质控品CY5检测通道检测结果应为有扩增曲线且Ct值≤30.00。
[0094] 第二PCR反应液中，HSVII阴性质控品FAM检测通道检测结果应为阴性且无Ct值，HSVI阴性质控品HEX检测通道检测结果应为阴性且无Ct值，内标CY5检测通道检测结果应为阳性，有扩增曲线且Ct值≤36.00；；
[0095] HSVII阳性质控品FAM检测通道检测结果应为有扩增曲线且Ct值≤30.00，HSVI阳性质控品HEX检测通道检测结果应为有扩增曲线且Ct值≤30.00，内标CY5检测通道检测结果应为阳性，有扩增曲线且Ct值≤36.00。
[0096] S4、结果分析
[0097] 阴性质控不起线、阳性质控和内标扩增Ct值在规定范围之内，说明整个核酸提取过程和PCR反应过程均是正常的，样本检测结果判定可靠。如果扩增曲线呈S型且Ct值≤36.00，则结果为阳性；反之，扩增曲线不呈S型或Ct值＞36.00，则结果为阴性(如图1和图2所示)。实验结果表明，采用本发明试剂盒能有效监控核酸提取过程和PCR反应过程，能在两个反应管中同时检测出TORCH五种病原体，检测结果准确可靠。
[0098] 因此，本发明一次实验即可快速检测TORCH五种病原体(弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型与单纯疱疹病毒II型)，首次引入假病毒内标质控检测TORCH病原体，检测结果准确性和重复性好，且能够有效防止实验室气溶胶污染，杜绝假阳性的出现。
[0099] 以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
