一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用
阅读：1031发布：2020-06-08
专利汇可以提供一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 一条抑制 猪瘟 病毒感染 活性的多肽及其应用，该多肽序列为KRWWSHK(P8)。本发明以 牛 病毒性腹泻病毒E2蛋白 晶体结构 为模板，同源建模获得 猪瘟病毒 E2蛋白的三维结构，借助虚拟分子对接技术，最终获得一条具有高评分值的多肽序列，即为P8；人工合成P8序列采用ELISA及SPR试验鉴定其与E2蛋白相互作用的 亲和性 及特异性，结果显示P8与E2具有较高亲和性及特异性结合；然后通过qRT-PCR及IPMA试验验证其抑制病毒感染的活性，结果表明P8序列具有较好抑制猪瘟病毒感染PK-15细胞的活性。本发明可为进一步研究病毒受体及抗病毒药物设计提供可靠的理论依据及新的思路。，下面是一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用专利的具体信息内容。
一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着基因组学及蛋白质组学的迅猛发展，越来越多生物大分子的三维结构被解析，截止2017年1月，已经有超过12万个晶体结构被导入蛋白质数据库中。基于氨基酸序列分析的同源建模方法的进一步深入研究，对于某些在现有技术水平下无法解析其结构的生物大分子而言，也可通过建模的方式来分析其三维结构，这就大大拓展了基于结构分析的蛋白质研究范围。计算机辅助多肽设计技术的飞速发展，使得蛋白质与其配基多肽之间相互作用的研究更加精细与深入。计算机虚拟辅助设计可以实现氨基酸残基更加自由的突变，尤其是分子动力学的发展及新的更加精准的分子对接方法的出现，对于多肽筛选工作而言，不仅操作方便快捷，降低多肽筛选的强度及缩短研发周期，还大大地提升了筛选成功率。
[0003] 猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高致病力、高死亡率的接触性传染病。该病在我国一直流行，且以地区散发性为主；尽管各大养殖场对CSF给予极大的关注，但由于不科学的免疫程序、参差不齐的疫苗质量及猪群不规范的饲养条件等，致使当前CSF仍然严重威胁着我国的养猪业。E0、E1及E2是CSFV的三个囊膜糖蛋白，其中E2是病毒最主要的抗原蛋白，同时E2也在CSFV与宿主细胞的相互识别及吸附过程中起重要介导作用；因此，E2蛋白的深入研究，对于探讨CSF的感染机制及新型疫苗的设计都具有重要意义。
发明内容
[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽及其应用，该多肽与E2蛋白具有良好的亲和性及特异性结合，且对CSFV感染PK-15细胞具有较好的抑制活性。
[0005] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0006] 一条抑制猪瘟病毒感染活性的多肽，所述多肽的序列为KRWWSHK。
[0009] 检测试剂盒为用于酶联免疫吸附试验检测。
[0010] 一种多肽在制备抑制猪瘟病毒或者牛病毒性腹泻病毒感染药物方面的应用。
[0011] 与现有技术相比，本发明有益效果：
[0012] (1)本发明借助虚拟分子对接技术，设计靶向CSFV E2蛋白的多肽，其序列为KRWWSHK，即为P8。人工合成P8，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)及等离子体共振试验(SPR)鉴定其亲和性及特异性；之后通过荧光定量PCR(qRT-PCR)及免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)评价P8抑制CSFV感染PK-15细胞的活性，结果显示P8与E2蛋白具有良好的亲和性及特异性结合，平衡解离常数(KD)值为771nM。由此表明，借助本发明设计而成的多肽序列可以用于CSFV感染机理及抗病毒药物设计的研究。
[0013] (2)本发明以同源建模的CSFV E2结构为基础设计的多肽序列，结构简单、性质稳定、无免疫原性、易于合成及修饰，能够有效结合CSFV E2蛋白的活性位点，发挥一定的抑制病毒感染作用，结果显示，P8对CSFV感染PK-15细胞具有较好的抑制活性，抑制率高达75％以上，可为CSFV感染机理及抗病毒药物设计研究提供理论指导和新的思路。
[0014] (3)本发明设计而成的P8序列与人工表达纯化的CSFV E2蛋白具有良好的亲和性结合，除与BVDV E2蛋白反应较高外，与其它病毒蛋白均不发生交叉性反应，特异性较好。
[0015] (4)本发明与传统噬菌体多肽筛选相比，具有操作简单，筛选强度低，研发周期短，生产成本低等特点，通过计算机辅助实施分子对接，可为实现CSFV受体研究及E2蛋白结构功能解析提供较好的理论指导。附图说明
[0016] 图1为P8与CSFV E2蛋白的对接结果展示。
[0017] 图2为P8与人工表达CSFV E2蛋白的SPR亲和力鉴定结果。图中，曲线从上至下依次为317.47μM、158.73μM、79.36μM、9.92μM、4.96μM、2.48μM。
[0018] 图3为P8与人工表达CSFV E2蛋白的ELISA鉴定结果。
[0019] 图4为P8抑制CSFV感染PK-15细胞的qRT-PCR鉴定结果。
[0020] 图5为P8抑制CSFV感染PK-15细胞的IPMA鉴定结果。
具体实施方式
[0021] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0022] 实施例1、分子对接及虚拟肽库的筛选
[0023] 1、E2蛋白的准备
[0025] 2、虚拟多肽库的设计
[0026] 建立不同氨基酸残基的空间结构，借助计算机程序，实现对输入目标多肽进行批量生成，以满足分子对接计算机程序的自动调用和处理。虚拟多肽库均以直链形式生成，不对任何侧链和首尾氨基和羧基进行修饰。单一虚拟多肽库的生成以不超过四位氨基酸残基为宜。
[0027] 3、对接结果的评断
[0028] 分别计算多肽与蛋白结合的自由能，氢链，范德华力等力学参数进行综合评定，以此来判定筛选结果，并筛选得到多肽P8，其序列为KRWWSHK(Lys-Arg-Trp-Trp-Ser-His-Lys)(SEQ ID NO.1)，其与CSFV E2蛋白对接的相互作用位置结果见图1。
[0029] 实施例2、P8与人工表达E2蛋白的亲和力鉴定(SPR)
[0030] 1、将纯化的CSFV E2蛋白用PBS缓冲液稀释为1μg/mL(蛋白量计)，采用EDC/NHS活泼酯法，分别将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)、CSFV E2蛋白注入安装有氨基芯片的SPR传感器中，保证EDC/NHS和E2蛋白分别与氨基芯片相互作用5min，实施CSFV E2蛋白与氨基芯片的偶联。偶联完成后，该传感器就可以用于测量CSFV E2蛋白与P8之间的相互作用。
[0031] 2、向传感器中注入250μL PBS缓冲液(pH 7.4)，以最大流速(150μL/min)运行PBS缓冲液，达到信号基线，将PBS缓冲液的流速降至20μL/min，以获得较为稳定的基线。
[0032] 3、将合成的P8用PBS缓冲液稀释为不同的浓度，从低浓度开始依次向传感器中注入250μL多肽溶液，每次注入样品均采用20μL/min的流速并且与传感器相互作用5min，PBS缓冲液冲洗5min。在每一个浓度循环结束后，250μL 0.25％SDS溶液被注入用于解离结合在CSFV E2蛋白上的P8。最终以得到的不同浓度多肽溶液与CSFV E2蛋白相互作用的结合与解离曲线为依据，在TraceDrawerTM软件上对P8和CSFV E2蛋白进行亲和力分析。
[0033] 结果表明，P8与人工表达的CSFV E2蛋白具有较好的亲和性结合，两者之间相互作用的平衡解离常数KD值为7.71×10-7M，即771nM。(见图2)。
[0034] 实施例3、P8与人工表达E2蛋白的ELISA鉴定
[0035] 1、将人工表达纯化的CSFV E2蛋白以1μg/mL(蛋白量计)进行酶标板包被；以同样方式将不同病毒表达纯化的蛋白，即牛病毒性腹泻病毒E2蛋白(BVDV-E2)、乙脑病毒E2蛋白(JEV-E2)、圆环病毒Cap蛋白(PCV-Cap)、伪狂犬病毒gE蛋白(PRV-gD)，和质量分数2％的牛血清白蛋白(BSA)、PBS缓冲液进行酶标板包被，作为对照。其中，包被抗原均采用碳酸盐(CBS)缓冲液进行稀释，每孔50μL加入96孔酶标板中，置于4℃条件下过夜，用PBST缓冲液洗涤5次后，再用质量分数2％的BSA液进行封闭。
[0036] 2、将人工合成并在氨基端生物素化修饰的P8干粉使用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释成500ng/mL的浓度，以每孔50μL的体积加入到上述酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育30min。
[0037] 3、用PBST缓冲液洗涤5次，并甩干酶标板孔中的液体；使用PBST缓冲液将偶联辣根过氧化物酶的亲和素稀释1000倍，以每孔50μL的体积加入甩干的酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育30min。
[0038] 4、根据试验所需量，将TMB显色液以每孔100μL的体积加入到上述酶标板中，充分混匀30s之后，室温条件下，显色10min。
[0039] 5、将2M的硫酸液终止液以每孔50μL的体积加入上述酶标板中，充分混匀30s之后，在酶标仪器上，读取各孔在450nm处的吸光值，判定结果。
[0040] 结果表明，P8与人工表达CSFV E2蛋白具有较好的亲和性与特异性结合，除与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的交叉反应较高外，与其它病毒蛋白均不发生反应(见图3)。
[0041] 实施例4、P8抑制CSFV感染PK-15细胞的qRT-PCR鉴定
[0042] 1、选择生长状态良好的PK-15细胞，待细胞铺满单层或长至80％-90％时，将细胞6
浓度调整至5×10细胞/mL，加入24孔细胞培养板中，每孔300μL；放置在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h，待细胞长至80％-90％时，弃去培养基，用无菌PBS缓冲液轻轻清洗细胞2-3次。
浓度调整至5×10细胞/mL，加入24孔细胞培养板中，每孔300μL；放置在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h，待细胞长至80％-90％时，弃去培养基，用无菌PBS缓冲液轻轻清洗细胞2-3次。
[0043] 2、将梯度稀释的P8分别与MOI＝0.01CSFV病毒液等体积混合，放置4℃孵育1h，然后分别加入24孔细胞板中，每孔300μL，每个稀释度做3孔重复。放置在37℃、5％CO2细胞培养箱中吸附1h，弃去感染液，PBS缓冲液轻轻清洗3次后，每孔加入300μL含2％FBS的DMEM培养基，放置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养16h。同时设不加多肽的病毒接种对照组及PK-15细胞对照组。
[0044] 3、将24孔板取出，反复冻融3次后，分别收集各孔的样品，8000rpm，离心5min，取细胞裂解上清，用于qRT-PCR的检测。
[0045] 结果表明，P8能够较好地抑制CSFV感染PK-15细胞，在P8加入浓度为150μM(终浓度)时，P8对病毒感染的抑制活性最好，抑制率可高达为76.53％(见图4)。
[0046] 实施例5、P8抑制CSFV感染PK-15细胞的IPMA鉴定
[0047] 1、选择生长状态良好的PK-15细胞，待细胞铺满单层或长至80％-90％时，将细胞6
浓度调整至5×10细胞/mL，加入96孔细胞培养板中，每孔100μL；放置在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h，待细胞长至80％-90％时，弃去培养基，用无菌PBS缓冲液轻轻清洗细胞2-3次。
浓度调整至5×10细胞/mL，加入96孔细胞培养板中，每孔100μL；放置在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h，待细胞长至80％-90％时，弃去培养基，用无菌PBS缓冲液轻轻清洗细胞2-3次。
[0048] 2、将梯度稀释的P8分别与MOI＝0.01CSFV病毒液等体积混合，放置4℃孵育1h，然后分别加入96孔细胞板中，每孔100μL，每个稀释度做3孔重复。放置在37℃、5％CO2细胞培养箱中吸附1h，弃去感染液，PBS缓冲液轻轻清洗3次后，每孔加入100μL含2％FBS的DMEM培养基，放置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养16h。同时设不加多肽的病毒接种对照组及PK-15细胞对照组。
[0049] 3、待病毒培养时间结束后，取出96孔细胞培养板，加入4℃预冷的含1-3％(v/v)的H2O2的甲醇溶液，每孔100μL，室温条件下固定15min；弃去固定液，加入5％(v/v)脱脂奶，每孔300μL，放置在37℃温箱中封闭1h，PBST缓冲液洗涤5次。每孔加入100μL 500倍稀释的CSFV阳性血清，放置在37℃温箱中孵育1h，洗涤5次。每孔加入100μL 1000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，放置在37℃温箱中孵育30min，洗涤5次。每孔加入100μL AEC显色液进行显色反应，10min后，加入100μL双蒸水终止反应，在倒置显微镜下观察结果。
[0050] 结果表明，P8能够较好地抑制CSFV感染PK-15细胞，在多肽加入浓度为150μM(终浓度)时，P8对病毒感染的抑制活性最好，这与qRT-PCR的检测结果相一致(见图5)。
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