一种猪瘟病毒检测方法
专利汇可以提供一种猪瘟病毒检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 猪瘟 病毒检测方法,属于分子 生物 学领域。本发明该方法通过设计的可检测 猪瘟病毒 的通用引物，并将PT-PCR技术与核酸胶体金 免疫层析 技术相结合，建立的适用于猪瘟病毒的快速检测方法。本发明设计和优化了一种检测猪瘟病毒的通用引物，并与核酸胶体金层析 试纸 条技术联用在短时间内即可完成不同种锦紫苏类病毒的PCR产物的检测，不需要 电泳 和溴化乙锭的 染色 ，更为快速实用，简单，灵敏，且安全无污染。，下面是一种猪瘟病毒检测方法专利的具体信息内容。
1.一种猪瘟病毒检测方法，主要包括以下步骤：
将患病仔猪组织病料充分研磨制成悬浮溶液，反复冻溶3次，离心取上清，按现有市场上的RNA提取试剂盒说明书要求，抽提RNA作为模板进行RT-PCR扩增待检测液；
取一定量待检测液，加入10×One step RNA PCR buffer，MgCl2，DNTP Mixture，RNase Inhibitor，AMV-Optimized Taq，AMV RTase，正向引物，反向引物,用灭菌DEPC水补足，所述正向引物，反向引物分别标记了地高辛、荧光素；
采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物、层析试纸条，在检测点加入荧光素单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体；
将步骤（2）中所得PCR产物与胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物混合后插入试纸条，如果检测点和质控点均显色则为锦紫苏类病毒阳性结果，仅质控点显色则为阴性结果。
2.如权利要求1所述的猪瘟病毒检测方法，其特征在于：所述正向引物序列为
5’-ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3’，反向引物序列为5’-CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC -3’，正向引物的5’端标记地高辛，反向引物的5’端标记荧光素。
3. 如权利要求1所述的猪瘟病毒检测方法，其特征在于，所述胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物的制备方法如下：
（1）取纯化好的兔抗地高辛多克隆抗体300 μg，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金液18 mL，室温搅拌30 min；
（2）加入10%牛血清白蛋白1 mL，室温搅拌5 min；
（3）加入10%聚乙二醇0.4 mL，室温搅拌5 min；
（4）12，000 r/min，离心30 min，去上清，加入2 mL保存液（取四硼酸钠0.1 g，BSA 0.25 g，溶于250 mL蒸馏水）悬浮沉淀；
（5）加入8 mL稀释液（取Na2HPO4·12H2O 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP40 5 g，硼酸 2.1 g，PEG
1 g，10% BSA 50 mL，溶于1000 mL蒸馏水），取小量进行检定，其余置4℃保存。
4. 如权利要求3所述的猪瘟病毒检测方法，其特征在于，所述的胶体金溶液的制备法如下：
（1）取1%氯金酸0.6 mL，加30 mL超纯水加热煮沸；
（2）加37℃预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min，补水至总体积31.5 mL。
5.（3）冷却后，用0.2 mol/L K2CO3调pH至8.0-9.0，用0.45 μm滤膜过滤，4℃保存。
一种猪瘟病毒检测方法
技术领域
背景技术
但是PCR产物的检测常规方法是采用琼脂糖凝胶电泳进行，电泳后需要进行溴化乙锭染色后在紫外光下观察，溴化乙锭对人具有中等毒性和致癌性，易造成环境污染，这也严重限制了此方法的推广。
发明内容
（1）将患病仔猪组织病料充分研磨制成悬浮溶液，反复冻溶3次，离心取上清，按现有市场上的RNA提取试剂盒说明书要求，抽提RNA作为模板进行RT-PCR扩增待检测液；
（2）取一定量待检测液，加入10×One step RNA PCR buffer，MgCl2，DNTP Mixture，RNase Inhibitor，AMV-Optimized Taq，AMV RTase，正向引物，反向引物,用灭菌DEPC水补足，所述正向引物，反向引物分别标记了地高辛、荧光素；
（3）采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物、层析试纸条，在检测点加入荧光素单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体；
（4）将步骤（2）中所得PCR产物与胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物混合后插入试纸条，如果检测点和质控点均显色则为锦紫苏类病毒阳性结果，仅质控点显色则为阴性结果；
所述的通用引物为：
正向引物（F-primer）序列为5’-ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3’，
反向引物（R-primer）序列为5’-CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC -3’；
正向引物的5’端标记地高辛，反向引物的5’端标记荧光素。
（2）加37℃预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min，补水至总体积31.5 mL。
（2）加入10%牛血清白蛋白1 mL，室温搅拌5 min；
（3）加入10%聚乙二醇0.4 mL，室温搅拌5 min；
（4）12，000 r/min，离心30 min，去上清，加入2 mL保存液（取四硼酸钠0.1 g，BSA 0.25 g，溶于250 mL蒸馏水）悬浮沉淀；
（5）加入8 mL稀释液（取Na2HPO4·12H2O 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP40 5 g，硼酸 2.1 g，PEG
1 g，10% BSA 50 mL，溶于1000 mL蒸馏水），取小量进行检定，其余置4℃保存。
1、阴性结果；2、阳性结果
具体实施方式：
1.PCR引物的设计：
正向引物（F-primer）序列为5’-ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3’，
反向引物（R-primer）序列为5’-CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC -3’；
正向引物的5’端标记地高辛，反向引物的5’端标记荧光素。
4.PCR产物的胶体金核酸免疫层析检测：
(1)需用的溶液配制
1%氯金酸：取氯金酸1 g加2 mL蒸馏水溶解后补加蒸馏水至100 mL。
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