非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法
专利汇可以提供非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 技术领域，它确立了非洲 猪瘟 病毒焦 磷酸 测序方法，含有三个技术要点：①确立了核酸检测所需要的引物序列；②确立了检测反应种类；③确立了检测反应体系和反应条件。该非洲 猪瘟病毒 磷酸测序方法可以用于非洲猪瘟病毒科学研究，也可以用于动物的临床诊断检测。，下面是非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法专利的具体信息内容。
1.非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法，其特征在于先进行引物设计，设计非洲猪瘟病毒的特异性引物及焦磷酸测序引物，再制备标准品，用特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若特异性引物扩增片段长度为250bp，则制备焦磷酸测序单链模板，进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中是否含有非洲猪瘟病毒。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法，其特征在于所述的引物设计：
选取西尼罗病毒E基因序列，根据MEGA软件的核苷酸序列比对结果，设计上游引物、下游引物和测序引物，上游引物、下游引物扩增片段长度为250bp，引物序列分别为：
上游引物(ASFV-250F)：5'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3'；
下游引物(ASFV-250R-Bio)：5'Bio-GATACCACAAGATCAGCCGT-3'，5’进行生物素标记；
测序引物(ASFV-250-Seq)：5'-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-3'。
3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法，其特征在于所述的用特异性引物进行PCR扩增，以定量保存的标准品为模板进行PCR扩增：Super Mix混合液20μL、ASFV-
250F(10(M)1μL、ASFV-250R-Bio(10(M)1μL、标准品模板3μL，总体系25μL。95℃预变性5min；
94℃变性30s，55℃退火30S，72℃延伸30s，扩增45个循环；最后72℃补充延伸7min。结果用
1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物胶回收后进行浓度测定。
4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法，其特征在于所述的PCR扩增产物电泳检测：取1.5g琼脂糖于100ml电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入核酸染料Gold View至终浓度为0.5μg/ml，制成1.5％的琼脂糖凝胶胶；将5μL PCR产物与适量加样缓冲液混合，点样，5V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；凝胶成像仪观察电泳结果。PCR产物经凝胶成像观察无杂带，大小正确约250bp，可用于后期测序检测。PCR产物胶回收后进行浓度测定。
5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法，其特征在于所述的制备焦磷酸测序单链模板是将PCR产物45μL转移至加有Sepharose beads 3μLl和Binding Buffer
47μL的96孔PCR板中，常温混匀10min。打开真空泵，依次将Vacuum Prep Tool在超纯水中清洗30S、在96孔PCR板中抓取Sepharose beads，随后分别在70％乙醇、Denaturation Buffer、Washing Buffer中清洗5～10s，再将其放人预先加入0.3μmol/L测序引物和Annealing Buffer(共45μL)的PSQ96孔板中充分震荡摇动释放Sepharose beads。将样品置于80℃烘箱2min，再冷却至室温。
6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法，其特征在于所述的焦磷酸测序反应是在28℃下于焦磷酸测序仪PyroMark ID上检测，根据指示图及提示将酶混合物、底物混合物和四类核苷酸(A、T、C和G)分别加入试剂舱固定位置。设定程序，将试剂舱和PSQ96孔板放入PSQ TM 96MD Sys tem仪器中进行测序反应。根据PSQTM 96MA System仪器的软件说明在试剂舱中分别加入的底物APS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、荧光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)；然后将试剂舱和PSQ 96板放入，进行Pyrosequencing反应。加样使用600mbar/8msec的加样压力和时间，每轮反应时间65s；引物链随着不同三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号。
7.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法，其特征在于所述的根据PCR扩增结果和焦 磷酸测序结果判定样品中是否含有非洲猪瘟病毒，若PCR产物经电泳检测未见
250bp扩增片段，则样品中不含非洲猪瘟病毒，若PCR产物经电泳检测出现250bp扩增片段，则进行焦磷酸测序分析；若测序结果与序列相符则被检样品中含有非洲猪瘟病毒。
非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法
技术领域
背景技术
发明内容
附图说明：
图1是PCR扩增引物特异性实验结果电泳图，图中， M：2000 bp ladder marker；1：PCR扩增结果；2：阴性对照。图2、图3是焦磷酸测序结果图。
具体实施方式
下游引物（ASFV-250R-Bio）：5' Bio- GATACCACAAGATCAGCCGT -3'，5’进行生物素标记；
测序引物（ASFV-250-Seq）：5'- CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG -3'
具体包括下列步骤：
1.PCR扩增
以定量保存的标准品为模板进行PCR扩增： Super Mix混合液20μL、ASFV-250F（10 (M）
1 μL、ASFV-250R-Bio（10 (M）1 μL、标准品模板3μL，总体系25µL。95ºC预变性5 min； 94ºC变性30s，55ºC退火30S，72ºC延伸30s，扩增45个循环；最后72℃补充延伸7min。结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物胶回收后进行浓度测定。
96孔PCR板中抓取Sepharose beads，随后分别在70％乙醇、Denaturation Buffer、Washing Buffer中清洗5～10 s，再将其放人预先加入0.3 µmol／L测序引物和Annealing Buffer(共
45µL)的PSQ96孔板中充分震荡摇动释放Sepharose beads。
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