一种猪瘟病毒抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备
阅读：774发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种猪瘟病毒抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供的一种 猪瘟 病毒 抗体 胶体金检测 试纸 条，其包括：同时包被 猪瘟病毒 E2蛋白、合成多肽及特定多肽三条带的 硝酸 纤维 膜，含有胶体金标记的猪蓝 耳 病毒N蛋白的玻璃纤维膜。本发明还提供了上述试纸条的制备方法及其在猪瘟病毒检测中的应用。本发明提供的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量对全国不同猪瘟病毒株免疫的猪血清能进行特异、灵敏的检测，达到快速筛检病猪，及时控制疫情的目的。，下面是一种猪瘟病毒抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备专利的具体信息内容。
1.一种猪瘟病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于：其包括：同时包被猪瘟病毒E2蛋白、合成多肽及特定多肽三条带的硝酸纤维膜，含有胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的玻璃纤维膜。
2. 根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维膜中，猪瘟病毒E2蛋白的浓度为0.15±0.01mg/ml，合成多肽的浓度为2.0±0.1 mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于：所述玻璃纤维膜中，胶体标记的猪瘟病毒E2蛋白的pH值为5.0～5.4，胶体金和猪蓝耳N蛋白的配比为以36ug蛋白/ml胶体金。
4.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于：还包括反应支持物（13）、免疫胶体金金标垫（12）和吸水垫（11），所述反应支持物（13）上依次相互搭接粘贴的免疫胶体金金标垫（12）、硝酸纤维膜（10）和吸水垫（11）。
5.根据权利要求5所述的一种猪瘟病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于：所述反应支持物（13）为PVC板；吸水垫（11）为滤纸；免疫胶体金金标垫（12）为聚酯膜、玻璃纤维或滤纸纤维。
6.权利要求1至5任一项所述的一种猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）通过对不同病毒株 E2 基因序列比较，找出各毒株之间主要抗原结构的差异；
2）通过简并引物对E2蛋白进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化；
3）硝酸纤维膜的制备：将E2蛋白稀释成0.15±0.01 mg/ml，将合成多肽的浓度稀释成
2.0±0.1 mg/ml和0.2±0.01 mg/ml喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线、对照线和质检线，且在37℃中干燥2小时，备用；
4） 玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整pH值为5.0～5.4，胶体金和猪瘟病毒E2的配比为以36μg/ml胶体金，经稳定剂处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；
5）在反应支持物上依次相互搭接粘贴免疫胶体金金标垫（12）、硝酸纤维膜和吸水垫，即得。
7.根据权利要求6所述的一种猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于： 所述简并引物为：
上游引物： 5’ cccggatccatgcaggtagcgtgcaaggaagattaca 3’；
下游引物：5’cccctcgagtcaaccagcggcgagttgttctg 3’。
8.权利要求1至5任一项所述的一种猪瘟病毒胶体金检测试纸条在猪瘟病毒中检测的应用。
一种猪瘟病毒抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备
[0001]
技术领域
背景技术
[0003] 猪瘟是一种急性、热性、高度接触性的传染病，主要症状是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞，其高度的发病率和死亡率给世界各国的养猪业造成了巨大的经济损失。我国也是猪瘟流行较严重的国家，每年因猪瘟死亡的猪占饲养总数的 3%~5%，造成了巨大的经济损失。由于它造成的经济损失惨重，所以兽医工作者一直在致力于猪瘟防制的研究。因此长期以来，猪瘟一直是疫病研究中的重点和热点。
[0004] 自80 年代以后，随着单克隆抗体和现代生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们相继研制了多种猪瘟病毒（CSFV）单抗，鉴定了 CSFV 的中和抗原表位，尤其是测定了 CSFV 不同毒株的基因组全序列，从而有可能在分子水平上阐明CSFV 本身的一些生物学特性以及猪瘟发生的分子机制。随着现代生物技术的发展，虽然猪瘟在其病原特性的分子生物学研究等方面已取得了很大进展，但仍有许多问题亟待解决。
[0005] 在我国，由于 C-株疫苗的长期使用，有效控制了猪瘟的急性发作和大流行。近年来猪瘟的发生又呈上升趋势，表现更加复杂，既有区域性大流行，又有零星散发；既有高死亡率的急性症状，又有持续感染的温和性症状。许多猪场的免疫猪群频繁发病，甚至将疫苗剂量加大数倍或数十倍，疫情依然不能控制，有些猪还因注射疫苗而引发猪瘟造成死亡，因此根除猪瘟是一项艰巨而长期的工作，对流行毒株的致病性和核酸序列进行分析研究，了解猪瘟病毒疫苗毒株与流行毒株之间的差异以及流行毒株的变异情况和致病特点，对于防制猪瘟是十分必要的。
[0006] 随着基因组学的不断发展，CSFV基因组结构及其编码的蛋白已被人们进一步认识和了解。在病毒基因组所编码的蛋白中，E2是3种囊膜糖蛋白中最重要的保护性抗原，产生 CSFV主要结构蛋白；而且 E2 基因也是猪瘟病毒中最易突变的基因，所以国内外对猪瘟的研究多集中在 E2 基因，E2蛋白是CSFV新型诊断抗原的首选蛋白。
[0007] 本发明对国内外CSFV E2 基因编码的抗原结构研究的基础上，通过已发表的不同病毒株 E2 基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结构的差异；同时通过简并引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化。抗原通过胶体金试纸条包被基因重组的E2对全国不同猪瘟病毒株免疫的猪血清都能进行特异、灵敏的检测，为猪瘟病毒的大批量现场检测，流行病学调查具有重要的意义；同时有效地促进猪重大疫病的监测与净化工作，对提高我国养猪业生产的整体技术水平和公共卫生安全，发挥巨大经济与社会效益。
发明内容
[0009] 本发明的另一目的是提供上述试纸条的制备方法。
[0011] 其中，所述猪瘟病毒E2蛋白为在对猪瘟病毒E2 基因编码的抗原结构研究的基础上，通过对已发表的不同病毒株 E2 基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结构的差异；同时通过简并引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化，再经杆状病毒表达载体表达制备获得。
[0012] 作为优选，所述硝酸纤维膜中，猪瘟病毒E2蛋白的浓度为0.15±0.01mg/ml，合成多肽的浓度为2.0±0.1 mg/ml。
[0013] 作为另一种优选，所述玻璃纤维膜中，胶体标记的猪瘟病毒E2蛋白的pH值为5.0～5.4，胶体金和猪蓝耳N蛋白的配比为以36μg蛋白/ml胶体金。
[0014] 作为另一种优选，还包括反应支持物（13）、免疫胶体金金标垫（12）和吸水垫（11），所述反应支持物（13）上依次相互搭接粘贴的免疫胶体金金标垫（12）、硝酸纤维膜（10）和吸水垫（11）。
[0015] 作为进一步优选，所述反应支持物（13）为PVC板；吸水垫（11）为滤纸；免疫胶体金金标垫（12）为聚酯膜、玻璃纤维或滤纸纤维。
[0016] 本发明还提供了上述猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：1）通过对不同病毒株 E2 基因序列比较，找出各毒株之间主要抗原结构的差异；
2）通过简并引物对E2蛋白进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化；
3）硝酸纤维膜的制备：将E2蛋白稀释成0.15±0.01 mg/ml，将合成多肽的浓度稀释成
2.0±0.1 mg/ml和0.2±0.01 mg/ml喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线、对照线和质检线，且在37℃中干燥2小时，备用；
4） 玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整pH值为5.0～5.4，胶体金和猪瘟病毒E2的配比为以36μg/ml胶体金，经稳定剂（含0.05％BSA，PH8.0,0.01MTris缓冲液）处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；
5）在反应支持物上依次相互搭接粘贴免疫胶体金金标垫（12）、硝酸纤维膜和吸水垫，即得。
2）通过简并引物对E2蛋白进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化；
3）硝酸纤维膜的制备：将E2蛋白稀释成0.15±0.01 mg/ml，将合成多肽的浓度稀释成
2.0±0.1 mg/ml和0.2±0.01 mg/ml喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线、对照线和质检线，且在37℃中干燥2小时，备用；
4） 玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整pH值为5.0～5.4，胶体金和猪瘟病毒E2的配比为以36μg/ml胶体金，经稳定剂（含0.05％BSA，PH8.0,0.01MTris缓冲液）处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；
5）在反应支持物上依次相互搭接粘贴免疫胶体金金标垫（12）、硝酸纤维膜和吸水垫，即得。
[0017] 其中，所述简并引物为：上游引物： 5’ cccggatccatgcaggtagcgtgcaaggaagattaca 3’；
下游引物：5’cccctcgagtcaaccagcggcgagttgttctg 3’。
下游引物：5’cccctcgagtcaaccagcggcgagttgttctg 3’。
[0018] 本发明还提供了上述猪瘟病毒胶体金检测试纸条在猪瘟病毒中检测的应用。
[0019] 有益效果：本发明提供的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量对全国不同猪瘟病毒株免疫的猪血清能进行特异、灵敏的检测，达到快速筛检病猪，及时控制疫情的目的。方便、快速、简捷，节省了大量的人力物力，不需要特殊仪器设备，不需要专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对猪瘟病毒的感染诊断起到辅助治疗作用。
[0020] 本发明在对猪瘟病毒E2 基因编码的抗原结构研究的基础上，通过对已发表的不同病毒株 E2 基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结构的差异；同时通过简并引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化。抗原通过胶体金试纸条包被基因重组的E2对全国不同猪瘟病毒株免疫的猪血清能进行特异、灵敏的检测，对猪瘟病毒的感染诊断起到辅助作用。附图说明
[0021] 图1为本发明所述猪瘟病毒抗体检测试纸条的主视图；图2为本发明所述猪瘟病毒抗体检测试纸条的右视图；
其中：1 卡体；2 检测窗孔；3加样孔；4透气孔；5质控线 C1；6猪瘟病毒重组蛋白的判断线T； 7指示体内抗体是否具有保护作用的指示线C2；8样品垫；9滤血膜；10硝酸纤维素膜（C1，T， C2）；11吸水垫；12免疫胶体金金标垫；13反应支持物。
其中：1 卡体；2 检测窗孔；3加样孔；4透气孔；5质控线 C1；6猪瘟病毒重组蛋白的判断线T； 7指示体内抗体是否具有保护作用的指示线C2；8样品垫；9滤血膜；10硝酸纤维素膜（C1，T， C2）；11吸水垫；12免疫胶体金金标垫；13反应支持物。
[0022] 图3为检测试纸条检测结果示意图。从左至右依次为：T、C1、C2三条线阳性；C1和C2两条线阴性、C1一条线阴性阴性，无效。
[0023] 图4为限制性内切酶BamHI和XhoI分别双酶切质粒pFastBac载体和PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0024] 图5为质粒DNA测序图：图6为猪瘟病毒遗传发生树。
具体实施方式
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员说熟知的常规手段。
[0026] 实施例1 猪瘟病毒E2蛋白的克隆及表达（1） 目的基因的获得
利用国际互联网（Internet）调出了猪瘟病毒基因库（GenBank）中库存的 14个国外猪瘟病毒的 E2 基因序列，加上国内所测的 E2 基因序列，利用计算机专用软件完成了猪瘟病毒遗传发生树的绘制。
利用国际互联网（Internet）调出了猪瘟病毒基因库（GenBank）中库存的 14个国外猪瘟病毒的 E2 基因序列，加上国内所测的 E2 基因序列，利用计算机专用软件完成了猪瘟病毒遗传发生树的绘制。
[0027] 对E2基因的蛋白质序列和基因序列进行比对，根据比对结果及本发明对国内外CSFV E2 基因编码的抗原结构研究基础上，通过简并引物对E2进行PCR。
[0028] 其中，简并引物为：上游引物： 5’ cccggatccatgcaggtagcgtgcaaggaagattaca 3’；
下游引物：5’cccctcgagtcaaccagcggcgagttgttctg 3’。
下游引物：5’cccctcgagtcaaccagcggcgagttgttctg 3’。
[0029] 扩增出目的片段N，扩增条件：94 ℃变性3 min，94 ℃ 45 S， 56 ℃复性90 S，72℃ 延伸80 S， 进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
[0030] （2）目的基因的克隆和阳性重组子的筛选使用限制性内切酶BamHI和XhoI分别双酶切质粒pFastBac载体和PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳后（图4），切取含有目的片段的凝胶，使用TaKaRa试剂盒回收并纯化目的片段。
使用T4 DNA Ligase将回收的载体片段和插入片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从平板上挑取单菌落，摇菌提取质粒DNA，酶切鉴定正确的质粒送测序进一步验证，测序图见图5。
使用T4 DNA Ligase将回收的载体片段和插入片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从平板上挑取单菌落，摇菌提取质粒DNA，酶切鉴定正确的质粒送测序进一步验证，测序图见图5。
[0031] （3）重组转移质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞大肠杆菌DH10Bac含有卡那霉素抗性的杆粒bMON14272和四环素抗性的辅助质粒pMON7124，因此在培养过程中需要加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素和10μg/mL的四环素。其感受态细胞的制备方法与前述大肠杆菌感受态细胞的制备方法相同。
[0032] 在重组转移质粒转化DH10Bac感受态细胞时，通过位点特异性转座作用，转移载体上的外源基因插入到bacmid的靶位点上，从而形成重组bacmid。转化操作如下：从-70℃取出DH10Bac感受态细胞，冰上解冻后，加入1μL重组转移质粒，轻轻吹打混匀。将混合物置冰浴30min，42℃水浴热击45s，立即冰浴2min，加入900 μL LB液体培养基，37℃，225 rpm振荡培养4 h。取培养物用新鲜的LB液体培养基稀释100倍后，吸取100μL涂布LB三抗平板（含50 μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环素， 40μg/mL IPTG，100μg/mL X-gal），37℃倒置培养48h。挑取白色单菌落在新的三抗平板（含50 μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素, 10μg/mL四环素, 40μg/mL IPTG, 100μg/mL X-gal）上划线，37℃倒置培养48h。
[0033] （4 ）重组bacmid的鉴定及其目的蛋白的表达纯化重组bacmid的提取参考Bac-to-Bac Baculovirus Expression System中的操作进行。
由于重组bacmid片段较大（超过135kb），一般不通过酶切进行鉴定。在重组bacmid上含有M13引物序列，可使用M13引物通过PCR鉴定重组bacmid。引物序列如下：
M13 Forward primer: 5´-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3´
M13 Reverse primer: 5´-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3´
扩增条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 45 s， 退火 50℃ 45 s，延伸72℃ 5 min，
30个循环，最后延伸72℃10 min。
由于重组bacmid片段较大（超过135kb），一般不通过酶切进行鉴定。在重组bacmid上含有M13引物序列，可使用M13引物通过PCR鉴定重组bacmid。引物序列如下：
M13 Forward primer: 5´-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3´
M13 Reverse primer: 5´-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3´
扩增条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 45 s， 退火 50℃ 45 s，延伸72℃ 5 min，
30个循环，最后延伸72℃10 min。
[0034] 在35 mm的培养皿中接种1×106的Sf9细胞，28℃培养过夜；弃去上层培养基， 加入1 ml不含血清的培养液洗涤细胞两次，再加入1 ml不含血清的培养基于28℃培养0.5 h以上；在细胞室中将1-2 mg 重组Bacmid DNA与10 ml cellfectin分别用无血清Grace稀释至50 ml， 5 min后将DNA加入稀释后的cellfectin中，每隔5 min轻轻混匀一次，45 min后在聚丙烯管中轻轻加入900 ml不含血清的Grace培养基，混匀。弃去35 mm培养皿中的培养基，加入含有转染混合物的Grace培养基, 28℃温箱培养；6 h后用含10%血清的Grace培养替换原有的培养基；3d后收集细胞上清（重组病毒）保存或进行再次感染进行蛋白纯化。裂解细胞，高速离心( 10 000 r/min-1) 取上清用Ni-NTA agarose 亲和层析纯化，按 Qiagen 公司操作手册进行。
[0035] 实施例2：猪蓝耳病毒抗体检测试剂条的研制（1）指示线多肽浓度的确定方法
选取50份免疫后猪血清样品，利用爱德士ELISA试剂盒检测，取五份阻断率在大于等
80%以上的样品；用PBS将样品梯度稀释，使样品阻断率分布在≧80%、70%-80%、60%-70%、
50%-60%、40%-50%、30%-40%、20%-30%、10%-20%的区间内。每个区间内的样品每份取100微升滴加胶体金试纸条，胶体金试纸条滴加数目应大于3条，15分钟后于金标读数仪下记录数据。当阻断大于70%的样品金标读数为13265左右，阻断率在30%至40%的样品金标读数为5700至7700、阻断率在10%至20%的样品阻断率在1900至3800。通过调整NC膜上抗原包被的浓度来使阻断率在30%至40%的样品金标读数在1870至3250的范围内。梯度稀释30份样本使其阻断率在40%，滴加调整后的金标试纸，15分钟后读数，读数在3200左右。调整NC膜上包被的多肽抗体的浓度，使15分钟显色读数在3200±16，此时抗体浓度为指示线的浓度。多肽抗体最后包被浓度0.4±0.05ug/ul 所显示条带的颜色即指示线的颜色，检测线的颜色深于此颜色代表猪体内抗体浓度起保护作用。
选取50份免疫后猪血清样品，利用爱德士ELISA试剂盒检测，取五份阻断率在大于等
80%以上的样品；用PBS将样品梯度稀释，使样品阻断率分布在≧80%、70%-80%、60%-70%、
50%-60%、40%-50%、30%-40%、20%-30%、10%-20%的区间内。每个区间内的样品每份取100微升滴加胶体金试纸条，胶体金试纸条滴加数目应大于3条，15分钟后于金标读数仪下记录数据。当阻断大于70%的样品金标读数为13265左右，阻断率在30%至40%的样品金标读数为5700至7700、阻断率在10%至20%的样品阻断率在1900至3800。通过调整NC膜上抗原包被的浓度来使阻断率在30%至40%的样品金标读数在1870至3250的范围内。梯度稀释30份样本使其阻断率在40%，滴加调整后的金标试纸，15分钟后读数，读数在3200左右。调整NC膜上包被的多肽抗体的浓度，使15分钟显色读数在3200±16，此时抗体浓度为指示线的浓度。多肽抗体最后包被浓度0.4±0.05ug/ul 所显示条带的颜色即指示线的颜色，检测线的颜色深于此颜色代表猪体内抗体浓度起保护作用。
[0036] （2）胶体金-抗原结合的制备经实验确定：
猪瘟病毒E2蛋白与胶体金最佳结合pH值为5.12，胶体金和猪瘟病毒E2蛋白的配比为
36ug/ml胶体金；经稳定剂（10% BSA、5%海藻糖）处理20分钟后离心收集的沉淀。
猪瘟病毒E2蛋白与胶体金最佳结合pH值为5.12，胶体金和猪瘟病毒E2蛋白的配比为
36ug/ml胶体金；经稳定剂（10% BSA、5%海藻糖）处理20分钟后离心收集的沉淀。
[0037] 合成多肽与胶体金最佳结合pH值为5.3，胶体金和合成多肽的配比分别为30μg/ml胶体金：经稳定剂（10% BSA、5%海藻糖）处理20分钟后离心收集的沉淀。
[0038] （3）抗原与抗体包被于NC膜将猪瘟病毒抗原配制成1.0mg/ml的检测带包被液，将多肽抗体配制成0.6mg/ml和0.2 mg/ml的对照带和质控带包被液。按照1.0μl/cm的包被密度进行包被，发现包被线条出现粗细不匀、断点、有缺口的地方，必须用笔划线做出标示，两条线之间的距离为0.5 cm。包被好的NC膜放置37℃烘箱干燥18-20小时，取出后用铝箔袋密封，室温保存备用。
[0039] （4）猪蓝耳病毒抗体检测试剂条的组成反应支持物13为13mm×300mmPVC板；吸水垫11为17mm×300mm；25mm×300mm的硝酸纤维素膜10依次包被质控线合成多肽、猪瘟病毒E2蛋白、对照带合成多肽；含有
30mm×300mm胶体金标记猪瘟病毒E2蛋白的玻璃纤维。
30mm×300mm胶体金标记猪瘟病毒E2蛋白的玻璃纤维。
[0040] 将已包被的NC膜金标垫和已切割的吸水垫，样本垫，塑料支撑垫按照相应的尺寸进行黏贴层压，组成试剂卡。将层压好的试剂卡按照4.0mm±0.05的规格进行切条，把切好的试剂条放入试剂盒下盖正确的位置，盖好上盖置于自动压盒机上进行压盖。把压合好的试剂盒逐一进行检查，查看NC膜表面有无污物，切割边缘有无缺口，合格后，装入铝箔袋内，封口，包装，即形成了猪蓝耳病毒抗体快速检测试剂条。见图1和图2，其中，1为卡体，2为检测窗孔，3为加样孔，4为透气孔，5为质控线C1，6为猪瘟病毒重组蛋白的判断线T，7为指示体内抗体是否具有保护作用的指示线C2，8为样品垫，9为滤血膜，10为硝酸纤维素膜（C1，T，C2），11为吸水垫，12为免疫胶体金金标垫（12），13为反应支持物。
[0041] （5）猪瘟病毒抗体检测试剂条特异性及敏感性实验通用性及特异性实验：
根据猪瘟病毒的致病机理及病理表现，本产品与全国不同地区病毒株及下述病源感染的猪血清进行交叉反应性检测。结果表明，本产品与表中全国不同地区病毒株感染的血清都有交叉反应，而与所列其他病原血清无交叉反应，说明本产品相对于表1中所列病原血清是通用、特异的。
根据猪瘟病毒的致病机理及病理表现，本产品与全国不同地区病毒株及下述病源感染的猪血清进行交叉反应性检测。结果表明，本产品与表中全国不同地区病毒株感染的血清都有交叉反应，而与所列其他病原血清无交叉反应，说明本产品相对于表1中所列病原血清是通用、特异的。
[0042] 表1 猪瘟病毒抗体检测试剂条对不同病原血清的交叉反应性灵敏度实验：
本产品的灵敏度实验采用阳性猪血清。首先用全病毒ELISA对阳性猪血清的效价进行滴定，然后用生理盐水进行稀释。我们共对12份阳性猪血清进行了实验，结果表明，本品检测血清灵敏度为1:3000（ELISA 效价）。结果如表2所示：
表2：猪蓝耳病毒抗体检测试剂条对不同血清稀释度的检测
实施例4 检测方法（参见图2）
在加样孔内滴入100ul滴待检测的血清或血液样品，平放于桌面上，于室温下静置5到
20分钟内判定结果。
本产品的灵敏度实验采用阳性猪血清。首先用全病毒ELISA对阳性猪血清的效价进行滴定，然后用生理盐水进行稀释。我们共对12份阳性猪血清进行了实验，结果表明，本品检测血清灵敏度为1:3000（ELISA 效价）。结果如表2所示：
表2：猪蓝耳病毒抗体检测试剂条对不同血清稀释度的检测
实施例4 检测方法（参见图2）
在加样孔内滴入100ul滴待检测的血清或血液样品，平放于桌面上，于室温下静置5到
20分钟内判定结果。
[0043] 如果被检测猪未接种过猪蓝耳病疫苗，当在检测条带（6）无明显色带出现时，说明被检测样品中没有猪蓝耳病抗体，应该适时接种猪蓝耳病疫苗，如果被检测猪已接种过猪蓝耳病疫苗，当在检测条带（6）颜色小于指示线（7）时说明被检测猪中猪蓝耳病毒抗体水平较低，猪蓝耳病抗体未达到抵御猪蓝耳病毒攻击的最低保护滴度，也应该适时接种猪蓝耳病疫苗，若出现质控线（5）不显色的情况时，说明检测卡质量不合格，应更换检测卡再次检测。
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