一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA试剂盒专利检索-猪瘟病毒生物学专利检索查询-专利查询网

一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA 试剂盒

阅读：1032发布：2020-06-05

专利汇可以提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA 试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA 试剂盒及其用途，属于生物技术领域。试剂盒采用原核表达的重组P54蛋白作为包被抗原，依据间接ELISA原理检测猪血清中非洲猪瘟病毒的抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗原为原核表达的重组P54蛋白，其具有良好的抗原性。本发明提供的酶联免疫试剂盒包括P54蛋白包被的96孔板、阳性对照、阴性对照、辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体、浓缩洗涤液、血清稀释液、TMB底物、终止液。本发明试剂盒可用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便。，下面是一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA 试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA 试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，借助该酶标记抗体，建立间接ELISA法检测非洲猪瘟病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照。
3.根据权利要求2所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，
所述ELISA板条：每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P54蛋白，规格为8孔×12条；
所述血清稀释液和浓缩洗涤液：血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；
所述底物显色液：即用型TMB显色液，50mL；
所述终止液：2mol/L的H2SO4溶液，50mL；
所述酶标单克隆抗体：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；
阳性对照；
阴性对照。
4.权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺，其特征在于：
采用辛酸-硫酸铵法纯化猪血清IgG，制备纯化的猪IgG，并用此纯化IgG免疫家兔，制备兔抗猪IgG多克隆抗体；采用过碘酸钠法对上述多克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记。
5.权利要求1所述的间接ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒抗体中的应用。

说明书全文

一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA 试剂盒

技术领域

[0001] 本发明为检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测试剂盒，属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种动物检疫中检测抗体的ELISA试剂盒及其用途。

背景技术

[0002] 非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、
水肿及脏器出血。(William，Hess Adv.African swine fever：a reassessment[J].Vet Sci
Comp Med，1981，25：39～69)世界动物组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾
病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2)：117～119)。

[0003] 本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛
仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007
年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。

[0004] 非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之
外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特
性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病
毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知
的代表种。

[0005] 非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb～190kb，中央
有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加
或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafacl，Yancz，Javier M，et
al.Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus[J].
Virology，1995，208：249～279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分
泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个
ORF，可以编码150～200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多
肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998，28(11)：42～43)。

[0006] 非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性，其中P54蛋白为具有较好抗原性的蛋白之一。

[0007] ASFV P54蛋白是由E183L基因编码的，约25kD的多肽，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网膜处。P54蛋白可以在体外培养，并能感染细胞。而且在感染细胞后
在内质网膜处短暂表达。P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前
体时起着十分重要的作用(Rodriguez JM，Garcia EscuderoAfrican Swine Fever Virus
Structural Protein p54 Is Essential for the Recruitment of Envelope Precursors
toAssembly Sites.Journal of Virology，2004，78(8)：4299～4313)。另外ASFV P54蛋
白与8kD的轻链细胞质动力蛋白DLC8存在特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加
工过程中起重要作用。感染病毒后复制早期，病毒可激活细胞凋亡蛋白酶而诱发细胞脱
噬作用(AlonsoC，J Miskin African Swine Fever Virus Protein p54Interacts with
the Microtubular Motor Complex through Direct Binding to Light-Chain Dynein.
Journal ofVirology 2001，75：9819～9827)。为了分析结构蛋白P54在细胞脱噬中所起的
作用，2004年Hernaez B和Diaz-Gil G将其在非洲绿猴肾细胞内短暂表达，实验表明可激
活细胞凋亡蛋白酶，诱发细胞脱噬作用(Hernaez B，Diaz Gil G The African swine fever
virus dynein-binding protein p54 induces infected cellapoptosis.FEBS Letters
2004，569(123)：224～228)。但P54的突变体缺失13aa而失去激活细胞凋亡蛋白酶的功
能(Alejo A，GAndrés，ML Salas.African Swine Fever Virus Proteinase Is Essential
for Core Maturation andInfectivity Journal of Virology，2003，77：5571～557)。

发明内容

[0008] 本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，可用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛查。

[0009] 本发明还提供了一种P54基因载体构建、蛋白的表达及纯化的工艺。

[0010] 本发明还提供了一种兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺及辣根过氧化物酶标记方法。

[0011] 本发明的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒。

[0012] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆
抗体。

[0013] 还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照。

[0014] 上述用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒包括：

[0015] 所述ELISA板条：每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P54蛋白，规格为8孔×12
条；

[0016] 所述血清稀释液和浓缩洗涤液：血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；

[0017] 所述底物显色液：即用型TMB显色液，50mL；

[0018] 所述终止液：2mol/L的H2SO4溶液，50mL；

[0019] 所述酶标多克隆抗体：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；

[0020] 阳性对照；

[0021] 阴性对照。

[0022] 所述的间接ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

[0023]

[0024]

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

[0026] 本发明的技术方案如下：

[0027] 一、抗原制备

[0028] 1.非洲猪瘟P54蛋白的表达

[0029] 根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV)P54基因序列，设计合成了1对引物，采用PCR方法从ASFV DNA中扩增出P54基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒
pET-P54，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。

[0030] 设计的引物为：

[0031] P54-1-5’-GCGGATCCCATTATTATCATCGTT-3’

[0032] P54-2-5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’

[0033] 下划线部分为引入的酶切位点，P54-1为ASFV P54基因上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHIP54-2为ASFV P54基因下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI。

[0034] 2.非洲猪瘟P54蛋白的纯化。

[0035] 诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声1s，间隔1s，共10min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用
镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备
较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，标准品浓度及其对应的OD值见表1。纯
化后P54蛋白的OD值为1.583，与标准品比较后，其浓度为900μg/ml。

[0036] 表1BCA法测定标准品蛋白含量

[0037]样品 A(μg/ml) B(μg/ml) C(μg/ml) D(μg/ml) E(μg/ml) F(μg/ml) G(μg/ml) H(μg/ml) 0(μg/ml)名称
浓度 2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0
OD值 2.6894 2.2378 1.6493 1.3278 1.0414 0.6454 0.4062 0.1893 0.1251[0038] 二、辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG的制备

[0039] 1.纯化猪IgG的制备

[0040] 取经检验合格的肥育猪作为采血用猪，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉与动脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。

[0041] 取1份预处理过的血清加2份0.06mol/L pH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调pH至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加
完，4℃静置2小时，取出12000r/min离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入
1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调pH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％
饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS
中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，
分装，冻存备用。

[0042] 2.兔抗猪IgG多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

[0043] 上述制备的纯化猪IgG作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗猪IgG多克隆抗体。

[0044] 纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：

[0045] 称取5mg HR溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；向其中再加入20μl
0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.01M碳
酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg(10mg/ml)，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配
的4mg/ml NaBH4，混匀，4℃放置2小时；所得产物对0.15M pH7.4PBS中4℃透析过夜。

[0046] 透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。3000r/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS
中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH 7.4的PBS缓冲液透析，取出铵离子，10000r/
min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。

[0047] 三、标准ASFV阳性血清及标准ASFV阴性血清的制备

[0048] 在ELISA检测过程中，不同的操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，操作误差会导致检测样品OD值的误差。本发明研制了标准ASFV抗体阳性对照血清和标准
ASFV抗体阴性对照血清，用于检测条件的优化和检测结果的判定。

[0049] 1.标准阳性血清的制备

[0050] 取健康成年家兔，体重2-3kg，剪去两后脚掌的部分兔毛，用碘酒消毒皮肤。第一次免疫，用注射器吸取弗式完全佐剂(FCA)乳化的抗原(纯化后重组P30)(以下称FCA-P30)
液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。间隔10-14天后，进行第二次免疫，与两侧腘窝及鼠蹊
部肿大的淋巴结内注入弗式不完全佐剂(FIA-P30)，每个淋巴结0.1ml，其余注入淋巴结附
近的皮下共1ml。间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5-1.0ml，分离血清，采用ELISA方法检
测血清效价，抗体效价可达到1∶100以上。

[0051] 采用心脏采血法采血，将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中。将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱3小时。待血液凝固血块收缩后，用滴管吸取血清，3000r/
min离心15min，取上清，加入终浓度为0.01％的硫柳汞防腐，分装后，-20℃保存。

[0052] 2.标准阴性血清的制备

[0053] 取经检验合格的肥育猪作为采血用猪，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉与动脉采血，分离血清，加入万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml
分装于无菌管中，-20℃保存。

[0054] 四、试剂盒的建立

[0055] 1.本发明试剂盒的检测原理

[0056] 采用间接法，将重组的非洲猪瘟病毒结构蛋白P54包被于微孔板中，然后用1％BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的非洲猪瘟
病毒抗体能与酶标板中包被的P54抗原反应，加入酶标兔抗猪IgG多克隆抗体后，酶标抗体
与上一步反应结束的P54抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显
色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm 波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止
显色反应后颜色的深浅)与待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的含量成正比。

[0057] 2.本发明试剂盒的组成

[0058] a)酶标板的最佳制备方法

[0059] 用pH9.60.05M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组P54蛋白稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的P54含量为0.2ug。4℃包被过夜，次
日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥
后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。

[0060] b)工作试剂的配置

[0061] 洗涤液(pH 7.4，0.15M PBS)：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。

[0062] 血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml

[0063] 底物缓冲液(pH 5.0磷酸柠檬酸)：0.2M Na2HPO425.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml

[0064] TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％H2O2 32ul终止液(2MH2SO4)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml

[0065] c)检测非洲猪瘟的间接ELISA试剂盒的组建

[0066] 组建检测非洲猪瘟的酶联免疫试剂盒，包含以下组分：

[0067] P54重组蛋白包被的96孔酶标板

[0068] 辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体

[0069] 标准阳性对照

[0070] 标准阴性对照

[0071] 浓缩洗涤液

[0072] 血清稀释液

[0073] TMB底物

[0074] 终止液

[0075] 产品说明书

[0076] 五、样品中非洲猪瘟病毒抗体的检测

[0077] 1.用上述制备的试剂盒进行检测

[0078] 1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。

[0079] 2)每孔加入稀释后酶标兔抗猪IgG多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。

[0080] 3)每孔加入TMB底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。

[0081] 4)每孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。

[0082] 2.检测结果分析

[0083] 1)测中阳性对照血清(PC)的OD值与阴性对照血清(NC)的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。

[0084] PC-NC≥0.4

[0085] 阳性Cut Off＝NC+0.05

[0086] 其中NC＝阴性对照血清OD值

标题	发布/更新时间	阅读量
一种猪瘟病毒检测方法	2020-05-11	74
一种猪瘟病毒E2次单位疫苗及其制备	2020-05-14	519
猪瘟病毒配体表位多肽SE242及其应用	2020-05-15	473
一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸	2020-05-16	854
猪瘟病毒疫苗及其生产方法	2020-05-18	864
一种猪瘟病毒抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备	2020-05-12	774
抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用	2020-05-13	233
非洲猪瘟病毒焦磷酸测序方法	2020-05-13	154
抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用	2020-05-17	777
猪瘟病毒抗体检测卡	2020-05-12	179

一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA试剂盒

一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA试剂盒

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：

一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA 试剂盒

一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA 试剂盒