同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法专利检索-猪瘟病毒生物学专利检索查询-专利查询网

同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR 试剂盒及方法

阅读：1035发布：2020-09-15

专利汇可以提供同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR 试剂盒及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB 荧光定量PCR 试剂盒及方法。所述试剂盒包括PCR反应液A/B/C，PCR反应液包括分别具有猪细小病毒(PPV)、猪链球菌II型(SS-II)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(Hp-PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)引物对和Taqman探针。本发明提供的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法，能够快速、有效地同时检测猪12种病原，所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测病原进行快速诊断和有效检测。，下面是同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR 试剂盒及方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR 试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：
PCV-2-F：5’-TGACCTCTCTACTGCTGTGAGTACCT-3’；
PCV-2-R：5’-CAGCCCGCGGAAATTTCT-3’；
PCV-2-Taqman-MGB：5’-FAM-CGTTGCAGAGCAGC-MGB-3’；
PRV-F：5’-CGGCTTCGACGTCTGGTT-3’；
PRV-R：5’-CACGCCATAGTTGGGTCCAT-3’；
PRV-Taqman-MGB：5’-HEX-AGAAACCGGAAGTGACG-MGB-3’；
PPV-F：5’-ACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAA-3’；
PPV-R：5’-TGGTGATAACCTTTTCTTGTGTTAGC-3’；
PPV-Taqman-MGB：5’-ROX-CTACCACAGAAGGAGACC-MGB-3’；
SS-II-F：5’-TTACCAAATGGTGGTGTTTCAAAC-3’；
SS-II-R：5’-TGCCGTCAACAATATCATCAGAA-3’；
SS-II-Taqman-MGB：5’-CY5-AAGGAATTACGGTATCAAAA-MGB-3’；
CSFV-F：5’-TTTTTTGACGAAGTGCAGTTCTG-3’；
CSFV-R：5’-AGCCATCGATGCACACATATG-3’；
CSFV-Taqman-MGB：5’-FAM-AGGTGACCAAAAGGATA-MGB-3’；
FMDV-F：5’-CACGCACACACGGAAAGATG-3’；
FMDV-R：5’-ATGGTGTTCAACCAGCAGTTGT-3’；
FMDV-Taqman-MGB：5’-HEX-TCACTCTTCACAACGGTG-MGB-3’；
PRRSV-F：5’-CAAATAGGGTCGCGCTCACT-3’；
PRRSV-R：5’-AAACGGCATCTGGAGGTGAT-3’；
PRRSV-Taqman-MGB：5’-ROX-AGCCATAGAAACCTGGAAA-MGB-3’；
Hp-PRRSV-F：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’；
Hp-PRRSV-R：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’；
Hp-PRRSV-Taqman-MGB：5’-CY5-TGGGATGTCCCCTACTT-MGB-3’；
SIV-F：5’-AAGATGCAACAGCTGGCCTTA-3’；
SIV-R：5’-TCCATTCCAGTGCGAACAAG-3’；
SIV-Taqman-MGB：5’-FAM-TGAATGATGCCACGTACCA-MGB-3’；
TEGV-F：5’-GCTTCCCAGCGTAGTTGAGATT-3’；
TEGV-R：5’-TCTGGACCTGTTGTTGCCATT-3’；
TEGV-Taqman-MGB：5’-HEX-CCTAACACACCTCCTACTT-MGB-3’；
PEDV-F：5’-TGCAGGTGGTATGAACATCGA-3’；
PEDV-R：5’-TGCTTTCAACTTCTTGCCAACA-3’；
PEDV-Taqman-MGB：5’-ROX-TTTACCAAAATACGTAATGGTTG-MGB-3’；
PRTV-F：5’-CGTGCACTTACGACAGCTACAATTA-3’；
PRTV-R：5’-AGTACCATGTAGTAGCGCCATCAG-3’；
PRTV-Taqman-MGB：5’-CY5-CTGAGAGGTTCAGTTTC-3’。
2.根据权利要求1所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCV-2Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，
3’端标记MGB淬灭基团，PRV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PPV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；SS-II Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；CSFV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，FMDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；Hp-PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；SIV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，TEGV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PEDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PRTV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括2×One Step RT-PCR Buffer。
4.根据权利要求1所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合物(PrimeScript RT Enzyme Mix)、阳性对照、阴性对照，阳性对照A为PCV-2、PRV、SS-II、PPV混合质粒，阳性对照B为CSFV、FMDV、PRRSV、Hp-PRRSV混合质粒，阳性对照C为SIV、TEGV、PEDV、PRTV混合质粒。
5.根据权利要求1所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；
95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
6.一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：
PCV-2-F：5’-TGACCTCTCTACTGCTGTGAGTACCT-3’；
PCV-2-R：5’-CAGCCCGCGGAAATTTCT-3’；
PCV-2-Taqman-MGB：5’-FAM-CGTTGCAGAGCAGC-MGB-3’；
PRV-F：5’-CGGCTTCGACGTCTGGTT-3’；
PRV-R：5’-CACGCCATAGTTGGGTCCAT-3’；
PRV-Taqman-MGB：5’-HEX-AGAAACCGGAAGTGACG-MGB-3’；
PPV-F：5’-ACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAA-3’；
PPV-R：5’-TGGTGATAACCTTTTCTTGTGTTAGC-3’；
PPV-Taqman-MGB：5’-ROX-CTACCACAGAAGGAGACC-MGB-3’；
SS-II-F：5’-TTACCAAATGGTGGTGTTTCAAAC-3’；
SS-II-R：5’-TGCCGTCAACAATATCATCAGAA-3’；
SS-II-Taqman-MGB：5’-CY5-AAGGAATTACGGTATCAAAA-MGB-3’；
CSFV-F：5’-TTTTTTGACGAAGTGCAGTTCTG-3’；
CSFV-R：5’-AGCCATCGATGCACACATATG-3’；
CSFV-Taqman-MGB：5’-FAM-AGGTGACCAAAAGGATA-MGB-3’；
FMDV-F：5’-CACGCACACACGGAAAGATG-3’；
FMDV-R：5’-ATGGTGTTCAACCAGCAGTTGT-3’；
FMDV-Taqman-MGB：5’-HEX-TCACTCTTCACAACGGTG-MGB-3’；
PRRSV-F：5’-CAAATAGGGTCGCGCTCACT-3’；
PRRSV-R：5’-AAACGGCATCTGGAGGTGAT-3’；
PRRSV-Taqman-MGB：5’-ROX-AGCCATAGAAACCTGGAAA-MGB-3’；
Hp-PRRSV-F：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’；
Hp-PRRSV-R：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’；
Hp-PRRSV-Taqman-MGB：5’-CY5-TGGGATGTCCCCTACTT-MGB-3’；
SIV-F：5’-AAGATGCAACAGCTGGCCTTA-3’；
SIV-R：5’-TCCATTCCAGTGCGAACAAG-3’；
SIV-Taqman-MGB：5’-FAM-TGAATGATGCCACGTACCA-MGB-3’；
TEGV-F：5’-GCTTCCCAGCGTAGTTGAGATT-3’；
TEGV-R：5’-TCTGGACCTGTTGTTGCCATT-3’；
TEGV-Taqman-MGB：5’-HEX-CCTAACACACCTCCTACTT-MGB-3’；
PEDV-F：5’-TGCAGGTGGTATGAACATCGA-3’；
PEDV-R：5’-TGCTTTCAACTTCTTGCCAACA-3’；
PEDV-Taqman-MGB：5’-ROX-TTTACCAAAATACGTAATGGTTG-MGB-3’；
PRTV-F：5’-CGTGCACTTACGACAGCTACAATTA-3’；
PRTV-R：5’-AGTACCATGTAGTAGCGCCATCAG-3’；
PRTV-Taqman-MGB：5’-CY5-CTGAGAGGTTCAGTTTC-3’。
7.根据权利要求6所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR方法，其特征在于，所述PCV-2Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，PRV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PPV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；SS-II Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；CSFV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，FMDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；Hp-PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；SIV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，TEGV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PEDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团；PRTV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。
8.根据权利要求6所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧
光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系A为20μl，包括：
PCV-2-F0.4μl，PCV-2-R0.4μl，PCV-2-Taqman-MGB0.4μl，PRV-F0.2μl，PRV-R0.2μl，PRV-Taqman-MGB0.2μl，PPV-F0.4μl，PPV-R0.4μl，PPV-Taqman-MGB0.4μl，SS-II-F0.4μl，SS-II-R0.4μl，SS-II-Taqman-MGB0.4μl；检测样品核酸1μl；2×One Step RT-PCR Buffer，10μl；酶混合物1μl；余量为灭菌去离子水；所述荧光定量PCR反应体系B为20μl，包括：CSFV-F0.8μl，CSFV-R0.8μl，CSFV-Taqman-MGB0.8μl，FMDV-F0.2μl，FMDV-R0.2μl，FMDV-Taqman-MGB0.2μl，PRRSV-F0.3μl，PRRSV-R0.3μl，PRRSV-Taqman-MGB0.3μl，Hp-PRRSV-F0.4μl，Hp-PRRSV-R0.4μl，Hp-PRRSV-MGB0.4μl；
检测样品核酸1μl；2×One Step RT-PCR Buffer，10μl；酶混合物1μl；余量为灭菌去离子水；所述荧光定量PCR反应体系C为20μl，包括：SIV-F0.3μl，SIV-R0.3μl，SIV-Taqman-MGB0.3μl，TEGV-F0.6μl，TEGV-R0.6μl，TEGV-Taqman-MGB0.6μl，PEDV-F0.4μl，PEDV-R0.4μl，PEDV-Taqman-MGB0.4μl，PRTV-F0.4μl，PRTV-R0.4μl，PRTV-MGB0.4μl；检测样品核酸1μl；2×One Step RT-PCR Buffer，10μl；酶混合物
1μl；余量为灭菌去离子水。
9.根据权利要求6所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR方法，其特征在于，所述20μl的荧光定量PCR反应体系不包括：50×ROX Reference Dye I/II，可根据荧光定量PCR仪需要掺入。
10.根据权利要求6所述的同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；
95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

说明书全文

同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量

PCR 试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明涉细菌及病毒的分子生物学检测领域，特别是涉及一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 我国是农业畜牧业大国，猪类养殖以规模化集约化养殖为主，高密度的养殖方式也使得猪类的传染性疾病难以预防，且问题日益显著。而且多种病原同时感染，导致诊断及预防疾病发生也十分困难。

[0003] 猪类常见的传染性疾病病原有猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、猪链球菌II型(Streptococcus suis type 2，SS-II)、猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、猪圆环II型病毒(Porcine circovirus-2，PCV-2)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TEGV)、流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、轮状病毒(Porcine rotavirus，PRTV)、猪流感病毒(Swine Influenza virus，SIV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、猪口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、猪蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(High pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，Hp-PRRSV)等。目前对猪病原的检测所采用的方法主要还是传统常规的分离鉴定法、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离鉴定法，操作烦琐，耗时长，漏诊率高；ELISA方法相对简便，快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。而且很难做到同时检测，耗时较长。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在诊断上受到一些限制。基因芯片技术可以同时检测多种核酸序列，但对于畜牧养殖企业及动物疫病检测单位等检测量大的单位来说成本较高，不易推广使用。

[0004] 实时荧光定量PCR(Real-time PCR，qPCR)，该方法与传统方法不同，它的优点：一是单管封闭操作，有效解决了PCR污染问题；二是自动化程度高；三是特异性更强；四是PCR反应的实时监控。有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果；五是绝对定量，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行绝对定量测定。Taqman探针法，可进行多重基因检测，其扩增的原始图能直观反映真实的扩增效率。可满足同一反应管检测多种核酸序列的要求。

[0005] 目前对猪病病原的检测所采用的方法主要为PCR检测方法。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。例如，申请号为CN200910234026.1公开了一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒及其检测方法，它采用PCR检测和凝胶电泳的方法可检测经典株和变异株的猪繁殖与呼吸综合征病毒。常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，实验及操作时间长，使之在诊断上受到一些限制。然而，随着PCR技术的发展，目前荧光定量PCR技术已逐步取代常规PCR技术。荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比，具有自动化程度高的特点，免去了常规PCR电泳步骤，并且可以实时进行监控；特异性、敏感性更高；并可进行定量检测。目前荧光定量PCR技术已由最初单一的染料法，发展到特异性更高的探针法。例如，申请号为CN201110240542.2公开了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒，该方法采用Taqman探针，通过荧光定量PCR方法检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒。申请号为CN200810198009.2公开了一种轮状病毒实时荧光PCR检测试剂盒。申请号为CN201110203471.9公开了一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法。申请号为CN201110073381.2公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒。而基于Taqman探针，Taqman-MGB探针与传统相比有探针长度缩短，与模板的特异性杂交来鉴定，具有更高的准确性、特异性和敏感性。目前尚未见用Taqman-MGB探针采用荧光定量PCR方法同时检测12种猪常见病毒及细菌的专利及文献。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，能够对12种病原进行快速检测。

[0007] 具体的针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：

[0008] 一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法，其特征在于，包括3种PCR反应液(A反应液、B反应液、C反应液)，其特征在于，所述A反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

[0009] PCV-2-F：5’-TGACCTCTCTACTGCTGTGAGTACCT-3’；

[0010] PCV-2-R：5’-CAGCCCGCGGAAATTTCT-3’；

[0011] PCV-2-Taqman-MGB：5’-FAM-CGTTGCAGAGCAGC-MGB-3’；

[0012] PRV-F：5’-CGGCTTCGACGTCTGGTT-3’；

[0013] PRV-R：5’-CACGCCATAGTTGGGTCCAT-3’；

[0014] PRV-Taqman-MGB：5’-HEX-AGAAACCGGAAGTGACG-MGB-3’；

[0015] PPV-F：5’-ACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAA-3’；

[0016] PPV-R：5’-TGGTGATAACCTTTTCTTGTGTTAGC-3’；

[0017] PPV-Taqman-MGB：5’-ROX-CTACCACAGAAGGAGACC-MGB-3’；

[0018] SS-II-F：5’-TTACCAAATGGTGGTGTTTCAAAC-3’；

[0019] SS-II-R：5’-TGCCGTCAACAATATCATCAGAA-3’；

[0020] SS-II-Taqman-MGB：5’-CY5-AAGGAATTACGGTATCAAAA-MGB-3’；

[0021] 进一步地，所述PCV-2Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，PRV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。PPV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。SS-II Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。

[0022] 进一步地，所述A反应液还包括2×One Step RT-PCR Buffer。

[0023] 进一步地，所述试剂盒还包括酶混合物(PrimeScript RT Enzyme Mix)、阳性对照、阴性对照A，所述阳性对照A为PCV-2阳性质粒、PRV阳性质粒、PPV阳性质粒和SS-II阳性质粒混合液。

[0024] 所述B反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

[0025] CSFV-F：5’-TTTTTTGACGAAGTGCAGTTCTG-3’；

[0026] CSFV-R：5’-AGCCATCGATGCACACATATG-3’；

[0027] CSFV-Taqman-MGB：5’-FAM-AGGTGACCAAAAGGATA-MGB-3’；

[0028] FMDV-F：5’-CACGCACACACGGAAAGATG-3’；

[0029] FMDV-R：5’-ATGGTGTTCAACCAGCAGTTGT-3’；

[0030] FMDV-Taqman-MGB：5’-HEX-TCACTCTTCACAACGGTG-MGB-3’；

[0031] PRRSV-F：5’-CAAATAGGGTCGCGCTCACT-3’；

[0032] PRRSV-R：5’-AAACGGCATCTGGAGGTGAT-3’；

[0033] PRRSV-Taqman-MGB：5’-ROX-AGCCATAGAAACCTGGAAA-MGB-3’；

[0034] Hp-PRRSV-F：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’；

[0035] Hp-PRRSV-R：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’；

[0036] Hp-PRRSV-Taqman-MGB：5’-CY5-TGGGATGTCCCCTACTT-MGB-3’；

[0037] 进一步地，所述CSFV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，FMDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，
3’端标记MGB淬灭基团。PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，
3’端标记MGB淬灭基团。Hp-PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。

[0038] 进一步地，所述B反应液还包括2×One Step RT-PCR Buffer。

[0039] 进一步地，所述试剂盒还包括酶混合物(PrimeScript RT Enzyme Mix)、阳性对照B、阴性对照，所述阳性对照B为CSFV阳性质粒、FMDV阳性质粒、PRRSV阳性质粒和Hp-PRRSV阳性质粒混合液。

[0040] 所述C反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

[0041] SIV-F：5’-AAGATGCAACAGCTGGCCTTA-3’；

[0042] SIV-R：5’-TCCATTCCAGTGCGAACAAG-3’；

[0043] SIV-Taqman-MGB：5’-FAM-TGAATGATGCCACGTACCA-MGB-3’；

[0044] TEGV-F：5’-GCTTCCCAGCGTAGTTGAGATT-3’；

[0045] TEGV-R：5’-TCTGGACCTGTTGTTGCCATT-3’；

[0046] TEGV-Taqman-MGB：5’-HEX-CCTAACACACCTCCTACTT-MGB-3’；

[0047] PEDV-F：5’-TGCAGGTGGTATGAACATCGA-3’；

[0048] PEDV-R：5’-TGCTTTCAACTTCTTGCCAACA-3’；

[0049] PEDV-Taqman-MGB：5’-ROX-TTTACCAAAATACGTAATGGTTG-MGB-3’；

[0050] PRTV-F：5’-CGTGCACTTACGACAGCTACAATTA-3’；

[0051] PRTV-R：5’-AGTACCATGTAGTAGCGCCATCAG-3’；

[0052] PRTV-Taqman-MGB：5’-CY5-CTGAGAGGTTCAGTTTC-3’；

[0053] 进一步地，所述SIV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，TEGV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。PEDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。PRTV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。

[0054] 进一步地，所述C反应液还包括2×One Step RT-PCR Buffer。

[0055] 进一步地，所述试剂盒还包括酶混合物(PrimeScript RT Enzyme Mix)、阳性对照C、阴性对照，所述阳性对照C为SIV阳性质粒、TEGV阳性质粒、PEDV阳性质粒和PRTV阳性质粒混合液。

[0056] 进一步地，所述荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

[0057] 本发明的另一个目的是提供一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR方法，可同时快速检测12种猪常见病原，且准确性、特异性和敏感性高。采用如下技术方案：

[0058] 一种同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR方法，其特征在于，包括3种PCR反应液(A反应液、B反应液、C反应液)，其特征在于，所述A反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

[0059] PCV-2-F：5’-TGACCTCTCTACTGCTGTGAGTACCT-3’；

[0060] PCV-2-R：5’-CAGCCCGCGGAAATTTCT-3’；

[0061] PCV-2-Taqman-MGB：5’-FAM-CGTTGCAGAGCAGC-MGB-3’；

[0062] PRV-F：5’-CGGCTTCGACGTCTGGTT-3’；

[0063] PRV-R：5’-CACGCCATAGTTGGGTCCAT-3’；

[0064] PRV-Taqman-MGB：5’-HEX-AGAAACCGGAAGTGACG-MGB-3’；

[0065] PPV-F：5’-ACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAA-3’；

[0066] PPV-R：5’-TGGTGATAACCTTTTCTTGTGTTAGC-3’；

[0067] PPV-Taqman-MGB：5’-ROX-CTACCACAGAAGGAGACC-MGB-3’；

[0068] S S-II-F：5’-TTACCAAATGGTGGTGTTTCAAAC-3’；

[0069] SS-II-R：5’-TGCCGTCAACAATATCATCAGAA-3’；

[0070] SS-II-Taqman-MGB：5’-CY5-AAGGAATTACGGTATCAAAA-MGB-3’；

[0071] 进一步地，所述PCV-2Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，PRV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。PPV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。SS-II Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。

[0072] 进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：PCV-2上游引物0.4μl；PCV-2下游引物0.4μl；PCV-2Taqman探针0.4μl；PRV上游引物0.2μl；PRV下游引物
0.2μl；PRVTaqman探针0.2μl；PPV上游引物0.4μl；PPV下游引物0.4μl；PPV Taqman探针0.4μl；SS-II上游引物0.4μl；SS-II下游引物0.4μl；SS-II Taqman探针0.4μl；
检测样品核酸1μl；2×One Step RT-PCR Buffer，10μl；酶混合物1μl；余量为无核酸酶水。

[0073] 所述B反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

[0074] CSFV-F：5’-TTTTTTGACGAAGTGCAGTTCTG-3’；

[0075] CSFV-R：5’-AGCCATCGATGCACACATATG-3’；

[0076] CSFV-Taqman-MGB：5’-FAM-AGGTGACCAAAAGGATA-MGB-3’；

[0077] FMDV-F：5’-CACGCACACACGGAAAGATG-3’；

[0078] FMDV-R：5’-ATGGTGTTCAACCAGCAGTTGT-3’；

[0079] FMDV-Taqman-MGB：5’-HEX-TCACTCTTCACAACGGTG-MGB-3’；

[0080] PRRSV-F：5’-CAAATAGGGTCGCGCTCACT-3’；

[0081] PRRSV-R：5’-AAACGGCATCTGGAGGTGAT-3’；

[0082] PRRSV-Taqman-MGB：5’-ROX-AGCCATAGAAACCTGGAAA-MGB-3’；

[0083] Hp-PRRSV-F：5’-TAAACTGGAGGGTGAGCATTGG-3’；

[0084] Hp-PRRSV-R：5’-GCCCTTATGCTCGCAACAA-3’；

[0085] Hp-PRRSV-Taqman-MGB：5’-CY5-TGGGATGTCCCCTACTT-MGB-3’；

[0086] 进一步地，所述CSFV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，FMDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，
3’端标记MGB淬灭基团。PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，
3’端标记MGB淬灭基团。Hp-PRRSV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。

[0087] 进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：CSFV上游引物0.8μl；CSFV下游引物0.8μl；CSFV Taqman探针0.8μl；FMDV上游引物0.2μl；FMDV下游引物0.2μl；FMDV Taqman探针0.2μl；PRRSV上游引物0.3μl；PRRSV下游引物0.3μl；
PRRSV Taqman探针0.3μl；Hp-PRRSV上游引物0.4μl；Hp-PRRSV下游引物0.4μl；
Hp-PRRSVTaqman探针0.4μl；检测样品核酸1μl；2×One Step RT-PCR Buffer，10μl；酶混合物1μl；余量为无核酸酶水。

[0088] 所述C反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

[0089] SIV-F：5’-AAGATGCAACAGCTGGCCTTA-3’；

[0090] SIV-R：5’-TCCATTCCAGTGCGAACAAG-3’；

[0091] SIV-Taqman-MGB：5’-FAM-TGAATGATGCCACGTACCA-MGB-3’；

[0092] TEGV-F：5’-GCTTCCCAGCGTAGTTGAGATT-3’；

[0093] TEGV-R：5’-TCTGGACCTGTTGTTGCCATT-3’；

[0094] TEGV-Taqman-MGB：5’-HEX-CCTAACACACCTCCTACTT-MGB-3’；

[0095] PEDV-F：5’-TGCAGGTGGTATGAACATCGA-3’；

[0096] PEDV-R：5’-TGCTTTCAACTTCTTGCCAACA-3’；

[0097] PEDV-Taqman-MGB：5’-ROX-TTTACCAAAATACGTAATGGTTG-MGB-3’；

[0098] PRTV-F：5’-CGTGCACTTACGACAGCTACAATTA-3’；

[0099] PRTV-R：5’-AGTACCATGTAGTAGCGCCATCAG-3’；

[0100] PRTV-Taqman-MGB：5’-CY5-CTGAGAGGTTCAGTTTC-3’；

[0101] 进一步地，所述SIV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团，TEGV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。PEDV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。PRTV Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记MGB淬灭基团。

[0102] 进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：SIV上游引物0.3μl；SIV下游引物0.3μl；SIV Taqman探针0.3μl；TEGV上游引物0.6μl；TEGV下游引物0.6μl；TEGVTaqman探针0.6μl；PEDV上游引物0.4μl；PEDV下游引物0.4μl；PEDV Taqman探针
0.4μl；PRTV上游引物0.4μl；PRTV下游引物0.4μl；PRTV Taqman探针0.4μl；检测样品核酸1μl；2×One Step RT-PCR Buffer，10μl；酶混合物1μl；余量为无核酸酶水。

[0103] 进一步地，所述20μl的荧光定量PCR反应体系A/B/C不包括：50×ROX Reference Dye I/II，可根据荧光定量PCR仪需要掺入。

[0104] 进一步地，所述荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

[0105] 由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

[0106] (1)本发明根据12种病原不同保守性特异序列设计并合成特异性引物及Taqman-MGB探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测12种病原，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测病原的快速、有效检测。

[0107] (2)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探针荧光定量qRT-PCR检测法，使得利用Taqman-MGB探针法荧光定量PCR检测的灵敏度约是普通PCR的100倍。

[0108] (3)由于采用定量检测技术-Taqman-MGB荧光定量PCR(Real-time PCR)，该方法(Real-time PCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。

[0109] (4)由于探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。

[0110] (5)Taqman-MGB探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样)可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。附图说明

[0111] 上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

[0112] 图1 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对猪圆环II型病毒特异性检测。

[0113] 图2 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对猪伪狂犬病毒特异性检测。

[0114] 图3 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对猪链球菌II型细菌特异性检测。

[0115] 图4 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对猪细小病毒特异性检测。

[0116] 图5 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对猪瘟病毒特异性检测。

[0117] 图6 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对猪口蹄疫病毒特异性检测。

[0118] 图7 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对猪蓝耳病毒特异性检测。

[0119] 图8 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对高致病猪蓝耳病毒特异性检测。

[0120] 图9 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C对猪流感病毒特异性检测。

[0121] 图10 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C对传染性胃肠炎病毒特异性检测。

[0122] 图11 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C 对流行性腹泻病毒特异性检测。

[0123] 图12 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C对轮状病毒特异性检测。

[0124] 图13 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对梯度稀释猪圆环II型阳性对照敏感性检测。

[0125] 图14 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对梯度稀释猪伪狂犬阳性对照敏感性检测。

[0126] 图15 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对梯度稀释猪链球菌II型阳性对照敏感性检测。

[0127] 图16 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A对梯度稀释猪细小阳性对照敏感性检测。

[0128] 图17 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对梯度稀释猪瘟阳性对照敏感性检测。

[0129] 图18 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对梯度稀释猪口蹄疫阳性对照敏感性检测。

[0130] 图19 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对梯度稀释猪蓝耳阳性对照敏感性检测。

[0131] 图20 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B对梯度稀释高致病猪蓝耳阳性对照敏感性检测。图21 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C对梯度稀释猪流感阳性对照敏感性检测。

[0132] 图22 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C对梯度稀释传染性胃肠炎阳性对照敏感性检测。图23 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C对梯度稀释流行性腹泻阳性对照敏感性检测。

[0133] 图24 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C对梯度稀释轮状病毒阳性对照敏感性检测。

[0134] 图25 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液A与阳性对照A检测。

[0135] 图26 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液B与阳性对照B检测。

[0136] 图27 Taqman-MGB荧光定量PCR反应液C与阳性对照C检测。

具体实施方式

[0137] 除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

[0138] 实施例1 建立同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法

[0139] 1.设计引物和Taqman-MGB探针

[0140] 根据的12种病原特异性序列，通过DNAstar软件进行序列比对，找出各种病原基因序列的特异性保守序列。运用Primer Primer 5.0软件进行引物和探针的设计。得到多对特异性引物和探针，经过比对筛选，最终分别确定一组最佳引物和MGB探针。

[0141] 表1 12种病原引物探针序列表

[0142]

[0143]

[0144] 由于TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：(1)提高TM值--平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。(2)提高信噪比--由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近。所以荧光定量的实验结果更精确，分辨率更高。

[0145] 2.核酸提取

[0146] 2.1 病毒DNA及猪链球菌II型基因组DNA提取

[0147] 按血液组织细胞基因组提取试剂盒(天根生化科技公司，货号DP304)说明书操作，分别提取猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪链球菌II型(SS-II)的基因组DNA。放置于-20℃备用。

[0148] 2.2 病毒RNA提取

[0149] (1)提前取出需要提取的猪细小病毒(PPV)、传染性胃肠炎病毒(TEGV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(Hp-PRRSV)。

[0150] (2)在超净中取出2n个1.5的EP管。

[0151] (3)在通风橱中每管加入600μl RNA裂解液，和200μl三氯甲烷后，分别加入200μl毒株。颠倒5-10次，震荡混匀5-10s，4℃，12000，15min。

[0152] (4)取新1.5的EP管，每管加入400μl异丙醇(-20℃预冷)。

[0153] (5)吸取步骤3中的上清550μl，避免吸出中间层。颠倒混匀4℃，12000，15min，弃上清。

[0154] (6)加入600μl 75％乙醇。4℃，12000，10min，弃上清。

[0155] (7)吸水纸上去水凉干，15-30min。

[0156] (8)加入10μl RNAase free water，瞬离5s，-80℃保存。

[0157] 3.PCR扩增：

[0158] 使用Takara Taq试剂盒(宝生物工程大连有限公司，货号R001A)进行DNA模板PCR扩增，PCR体系如下：

[0159] 表2 PCR体系配置表

[0160]试剂使用量
10×buffer 2μl
dNTP 1.6ul
上游引物 0.4μl
下游引物 0.4μl
Takara Taq 0.5
无核酸酶水 12.6μl
DNA模板 2.5μl

[0161] 将加好样品的PCR管放置PCR仪中进行扩增，PCR反应条件如下：94℃2min，为第一步循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s为第二步30个循环；72℃4min，为第三步循环。

[0162] 使用一步法RT-PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司，货号RR055A)进行病毒RNA模板PCR扩增，PCR体系如下：

[0163] 表3 RT-PCR体系配置表

[0164]试剂使用量
2×1Step Buffer 10μl
PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl
上游引物 0.4μl
下游引物 0.4μl
无核酸酶水 5.7μl
RNA模板 2.5μl

[0165]

[0166] 将加好样品的PCR管放置PCR仪中进行扩增，PCR反应条件如下：50℃30min，为第一步循环；94℃2min，为第二步循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s为第三步30个循环；72℃4min，为第四步循环。

[0167] 4.PCR产物纯化

[0168] 使用PCR产物快速纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，货号EP101-01)进行目的产物回收。

[0169] 5.目的片段克隆载体构建

[0170] (1)采用pMD19-T载体克隆试剂盒(宝生物工程大连有限公司，货号6013)将纯化的目的片段分别进行克隆载体连接转化。

[0171] (2)使用PCR法鉴定阳性克隆菌株。

[0172] (3)抽提质粒：采用高纯度质粒小提试剂盒(宝生物工程大连有限公司，货号DP104)，将所得质粒测定质粒浓度，并计算每μl质粒拷贝数。

[0173] 6.荧光定量PCR扩增：

[0174] 使用One-Step PrimeScript RT-PCR Kit(宝生物工程大连有限公司，货号RR064A)进行荧光定量PCR反应液A体系：

[0175] 表4 荧光定量PCR反应液A体系配置表

[0176]试剂使用量
PCV-2-F 0.4μl
PCV-2-R 0.4μl
PCV-2-Taqman-MGB 0.4μl
PRV-F 0.2μl
PRV-R 0.2μl
PRV-Taqman-MGB 0.2μl
PPV-F 0.4μl
PPV-R 0.4μl
PPV-Taqman-MGB 0.4μl
SS-II-F 0.4μl
SS-II-R 0.4μl
SS-II-Taqman-MGB 0.4μl
2×One Step RT-PCR Buffer 10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 1μl
模板 1μl
灭菌去离子水 3.8μl

[0177]

[0178] 荧光定量PCR反应液B体系：

[0179] 表5 荧光定量PCR反应液B体系配置表

[0180]试剂使用量
CSFV-F 0.8μl
CSFV-R 0.8μl
C SFV-Taqman-MGB 0.8μl
FMDV-F 0.2μl
FMDV-R 0.2μl
FMDV-Taqman-MGB 0.2μl
PRRSV-F 0.3μl
PRRSV-R 0.3μl
PRRSV-Taqman-MGB 0.3μl
Hp-PRRSV-F 0.4μl
Hp-PRRSV-R 0.4μl
Hp-PRRSV-MGB 0.4μl
2×One Step RT-PCR Buffer 10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 1μl
模板 1μl
灭菌去离子水 2.9μl

[0181] 荧光定量PCR反应液C体系：

[0182] 表6 荧光定量PCR反应液C体系配置表

[0183]试剂使用量
SIV-F 0.3μl
SIV-R 0.3μl
SIV-Taqman-MGB 0.3μl
TEGV-F 0.6μl
TEGV-R 0.6μl
TEGV-Taqman-MGB 0.6μl
PEDV-F 0.4μl
PEDV-R 0.4μl
PEDV-Taqman-MGB 0.4μl
PRTV-F 0.4μl
PRTV-R 0.4μl
PRTV-MGB 0.4μl
2×One Step RT-PCR 10μl
Buffer
PrimeScript RT 1μl
Enzyme Mix
模板 1μl
灭菌去离子水 2.9μl

[0184]

[0185] 荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

[0186] 7.特异性验证

[0187] 将提取的按血液组织细胞基因组提取试剂盒(天根生化科技公司，货号DP304)说明书操作，分别提取猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪链球菌II型(SS-II)的基因组DNA，并按照提取2.2RNA提取步骤提取的猪细小病毒(PPV)、传染性胃肠炎病毒(TEGV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(Hp-PRRSV)RNA作为待检样品，构建的猪圆环II型病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液A进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图1所示，猪圆环II型病毒阳性对照在19.85Ct处有扩增，猪圆环II型病毒DNA在27.41Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的猪伪狂犬病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液A进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图2所示，猪伪狂犬病毒阳性对照在17.87Ct处有扩增，猪伪狂犬病毒DNA在26.61Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的猪链球菌II型阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液A进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图3所示，猪链球菌II型阳性对照在23.65Ct处有扩增，猪链球菌II型DNA在21.35Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的猪细小病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液A进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图13-16所示，猪细小病毒阳性对照在18.11Ct处有扩增，猪细小病毒RNA在30.33Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的猪瘟病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液B进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图17-20所示，猪瘟病毒阳性对照在20.95Ct处有扩增，猪瘟病毒RNA在26.91Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的猪口蹄疫病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液B进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图21-24所示，猪口蹄疫病毒阳性对照在22.26Ct处有扩增，猪口蹄疫病毒RNA在24.49Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。
将12种提取核酸作为待检样品，构建的猪蓝耳病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液B进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图25所示，猪蓝耳病毒阳性对照在22.47Ct处有扩增，猪蓝耳病毒RNA在32.74Ct处有扩增，高致病猪蓝耳病毒RNA在30.23Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的高致病猪蓝耳病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液B进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图26所示，高致病猪蓝耳病毒阳性对照在24.45Ct处有扩增，高致病猪蓝耳病毒RNA在31.12Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。
将12种提取核酸作为待检样品，构建的猪流感病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液C进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图27所示，猪流感病毒阳性对照在19.75Ct处有扩增，猪流感病毒RNA在31.27Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的传染性胃肠炎病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液C进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图10所示，传染性胃肠炎病毒阳性对照在18.92Ct处有扩增，传染性胃肠炎病毒RNA在24.32Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的流行性腹泻病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液C进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图11所示，流行性腹泻病毒阳性对照在18.72Ct处有扩增，流行性腹泻病毒RNA在30.23Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将12种提取核酸作为待检样品，构建的轮状病毒阳性重组质粒稀释品为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液C进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图12所示，轮状病毒阳性对照在19.31Ct处有扩增，轮状病毒RNA在24.15Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。

[0188] 8.敏感性验证

[0189] 将构建成功的猪圆环II型病毒、猪伪狂犬病毒、猪链球菌II型、猪细小病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒、高致病猪蓝耳病毒株的重组质粒，分别进行10倍梯度稀释。分别取猪圆环II型病毒、6 0
猪伪狂犬病毒、猪链球菌II型、猪细小病毒10-10 拷贝/μl浓度梯度阳性重组质粒作为模板，无菌水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液A进行Taqman探针法荧光定量qPCR反应，记录结果。结果如图4所示，可见在最佳反应条件下，猪圆环II型病毒、猪伪狂犬病
1
毒、猪链球菌II型、猪细小病毒阳性质粒最低检测限均为1×10 拷贝/μl，Ct值分别为
29.57、29.02、30.15、30.88。分别取猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒、高致病猪蓝耳病
6 0
毒10-10 拷贝/μl浓度梯度阳性重组质粒作为模板，无菌水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液B进行Taqman探针法荧光定量qPCR反应，记录结果。结果如图5所示，可见在最佳反应条件下，猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒、高致病猪蓝耳病毒质粒最低检测
1
限均为1×10 拷贝/μl，Ct值分别为30.27、30.33、29.97、31.42。分别取猪流感病毒、传
6 0
染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒10-10 拷贝/μl浓度梯度阳性重组质粒作为模板，无菌水作为阴性对照，使用荧光定量PCR反应液C进行Taqman探针法荧光定量qPCR反应，记录结果。结果如图5所示，可见在最佳反应条件下，猪流感病毒、传染性胃肠炎病
1
毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒质粒最低检测限均为1×10 拷贝/μl，Ct值分别为29.86、
31.29、30.22、29.36。反应循环数40可大大满足12种病原Taqman-MGB荧光定量PCR最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，指数区明显，斜率较大，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。

[0190] 实施例2：猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒制备及样品检测[0191] 一、试剂盒的制备：

[0192] 试剂1配制：

[0193] 表7 荧光定量PCR反应液A配置表(180μl)

[0194]试剂使用量
PCV-2-F 4μl
PCV-2-R 4μl
PCV-2-Taqman-MGB 4μl
PRV-F 2μl
PRV-R 2μl
PRV-Taqman-MGB 2μl
PPV-F 4μl
PPV-R 4μl
PPV-Taqman-MGB 4μl
SS-II-F 4μl
SS-II-R 4μl
SS-II-Taqman-MGB 4μl
2×One Step RT-PCR 100μl
Buffer
灭菌去离子水 38μl

[0195]

[0196] 表8 荧光定量PCR反应液B配置表(180μl)

[0197]试剂使用量
CSFV-F 8μl
CSFV-R 8μl
CSFV-Taqman-MGB 8μl
FMDV-F 2μl
FMDV-R 2μl
FMDV-Taqman-MGB 2μl
PRRSV-F 3μl
PRRSV-R 3μl
PRRSV-Taqman-MGB 3μl
Hp-PRRSV-F 4μl
Hp-PRRSV-R 4μl
Hp-PRRSV-MGB 4μl
2×One Step RT-PCR Buffer 100μl
灭菌去离子水 29μl

[0198] 表9 荧光定量PCR反应液C配置表(180μl)

[0199]试剂使用量
SIV-F 3μl
SIV-R 3μl
SIV-Taqman-MGB 3μl
TEGV-F 6μl
TEGV-R 6μl
TEGV-Taqman-MGB 6μl
PEDV-F 4μl

[0200]PEDV-R 4μl
PEDV-Taqman-MGB 4μl
PRTV-F 4μl
PRTV-R 4μl
PRTV-MGB 4μl
2×One Step RT-PCR Buffer 100μl
灭菌去离子水 29μl

[0201] 试剂2：酶混合物(PrimeScript RT Enzyme Mix) 30μl

[0202] 试剂3：50×ROX Reference Dye I/II 20μl；

[0203] 试剂4：

[0204] 阳性对照A(PCV-2、PRV、SS-II、PPV混合质粒) 50μl；

[0205] 阳性对照B(CSFV、FMDV、PRRSV、Hp-PRRSV混合质粒) 50μl；

[0206] 阳性对照C(SIV、TEGV、PEDV、PRTV混合质粒) 50μl；

[0207] 试剂5：阴性对照 50μl。

[0208] 二、试剂盒检测指标的分析

[0209] 1.试剂盒质量控制检测结果

[0210] 将终浓度均为2.5×104拷贝/μl的猪圆环II型病毒、猪伪狂犬病毒、猪链球菌II型、猪细小病毒混合质粒，使用荧光定量PCR反应液A进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图7所示，猪圆环II型阳性对照在17.57Ct处有扩增，猪伪狂犬阳性对照在16.25Ct处有扩增，猪链球菌II型阳性对照在17.54Ct处有扩增，猪细小病毒阳性对照在21.04Ct
3
处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。将终浓度均为2.5×10 拷贝/μl的猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒、高致病猪蓝耳病毒混合质粒，使用荧光定量PCR反应液B进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图8所示，猪瘟病毒阳性对照在19.75Ct处有扩增，猪口蹄疫阳性对照在22.69Ct处有扩增，猪蓝耳阳性对照在19.85Ct处有扩增，高致病猪蓝耳阳性对照在21.37Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品
3
无非特异性扩增。将终浓度均为2.5×10 拷贝/μl的猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒混合质粒，使用荧光定量PCR反应液C进行荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图9所示，猪流感阳性对照在22.47Ct处有扩增，传染性胃肠炎阳性对照在18.92Ct处有扩增，流行性腹泻阳性对照在19.31Ct处有扩增，轮状病毒阳性对照在
26.91Ct处有扩增，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。

[0211] 2.试剂盒稳定性分析

[0212] 批内重复检测：将已知3个阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将已知3个阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。各选取3个已知猪圆环II型病毒、猪伪狂犬病毒、猪链球菌II型、猪细小病毒阳性的样品，分别提取核酸，并使用荧光定量PCR反应液A进行批内重复检测和批间重复检测。各选取3个已知猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒、高致病猪蓝耳病毒阳性的样品，分别提取核酸，并使用荧光定量PCR反应液B进行批内重复检测和批间重复检测。各选取3个已知猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒阳性的样品，分别提取核酸，并使用荧光定量PCR反应液C进行批内重复检测和批间重复检测。

[0213] 每管荧光定量PCR反应体系为20μl：需18μl试剂1，1μl试剂2，试剂4(阳性对照)或试剂5(阴性对照)1μl。(试剂3ROX I/II根据荧光定量PCR仪需要选择是否添加)

[0214] 表10 荧光定量PCR反应液体系配置表

[0215]试剂使用量
荧光PCR反应液A/B/C 18μl
酶混合物 1μl
阳性对照/阴性对照/待检样品 1μl

[0216] 荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，并记录实验结果。从表12中的检测结果分析，可以看出检测猪圆环II型病毒检测Ct值批内变异系数在0.86％-1.10％之间，批间变异系数在1.11％-1.71％之间；猪伪狂犬病毒检测Ct值批内变异系数在0.88％-1.05％之间，批间变异系数在1.38％-1.96％之间；猪链球菌II型检测Ct值批内变异系数在0.88％-1.05％之间，批间变异系数在1.38％-1.96％之间；猪细小病毒检测Ct值批内变异系数在0.97％-1.11％之间，批间变异系数在1.68％-1.86％之间；猪瘟病毒检测Ct值批内变异系数在0.70％-0.91％之间，批间变异系数在1.29％-1.51％之间；猪口蹄疫病毒检测Ct值批内变异系数在0.65％-1.04％之间，批间变异系数在1.37％-1.56％之间；猪蓝耳病毒检测Ct值批内变异系数在0.87％-1.09％之间，批间变异系数在1.40％-1.61％之间；高致病猪蓝耳病毒检测Ct值批内变异系数在0.91％-1.08％之间，批间变异系数在1.13％-1.55％之间；猪流感病毒检测Ct值批内变异系数在0.89％-1.09％之间，批间变异系数在1.61％-1.84％之间；传染性胃肠炎病毒检测Ct值批内变异系数在0.86％-1.05％之间，批间变异系数在1.26％-1.88％之间；流行性腹泻病毒检测Ct值批内变异系数在0.87％-1.04％之间，批间变异系数在
1.58％-1.87％之间；轮状病毒检测Ct值批内变异系数在0.99％-1.08％之间，批间变异系数在1.49％-1.81％之间；说明本试剂盒稳定性良好。

[0217] 表11 试剂盒稳定性分析

[0218]

[0219]

[0220]

[0221] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

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