一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法
阅读：1038发布：2020-07-08
专利汇可以提供一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种猪源性抗 猪瘟 病毒的单链 抗体 及其制备方法，该单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区由连接肽连接；所述重链可变区的 氨 基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。本 发明 的单链抗体能够与 猪瘟病毒 特异性结合，直接由重组 疫苗 进行体内表达，可快速、高效诱导中和抗体的产生，不依赖于 机体 免疫系统，用于阻断猪瘟病毒的感染。，下面是一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区由连接肽连接；所述重链可变区的氨基酸列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。
2.根据权利要求1所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的基因。
4.如权利要求1所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的表达载体，其由猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因与原核表达载体pET28或pET30重组构建得到。
5.根据权利要求4所述单链抗体的表达载体，其特征在于，所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因与原核表达载体通过双酶切位点连接，所述双酶切位点为NcoI和NotI，NcoI的序列为CCATGG，NotI的序列为GCGGCCGC。
6.一种筛选猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因的方法，包括如下步骤：
1)以猪瘟活疫苗作为传代细胞源，对猪进行注射免疫；
2)从免疫猪的外周血中分离淋巴细胞，利用带FITC标记的猪瘟病毒E2蛋白，以流式细胞术对分离出的淋巴细胞进行分选，选出能够结合FITC标记及猪瘟病毒E2蛋白的B细胞；
3)将分选出的B细胞稀释，接种后进行培养，连续培养3-5天，收集淋巴细胞上清液；
4)以猪瘟病毒作为包被抗原，用Elisa方法对收集的淋巴细胞上清液进行筛选，筛选出亲和力好的阳性抗体；
5)将筛选出的阳性抗体，进行PCR扩增，获得猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因。
7.根据权利要求6所述筛选猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因的方法，其特征在于，所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述筛选猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因的方法，其特征在于，步骤5)中的PCR扩增过程为：从阳性抗体中提取RNA，采用RT-PCR法扩增出淋巴细胞抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因；再利用SOE-PCR法将连接肽与重链可变区基因和轻链可变区基因相连，构建猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体，其中，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。
9.一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的制备方法，包括如下步骤：
a)构建重组表达单链抗体
将猪源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pET28或pET30中，
获得猪源性抗猪瘟单链抗体基因的重组表达载体；
b)转化、诱导表达ScFv
将构建的重组表达载体转化至感受态细胞DH5α中，挑取单克隆菌落验证其阳性率，菌落验证正确的克隆进行测序分析；然后将验证正确的克隆，转化到表达感受态细胞中；
挑取菌落，进行培养，OD600值为0.4-0.5时，添加IPTG，继续培养，收集菌液；
c)表达产物的纯化
将原核表达产物的可溶性蛋白进行纯化，得纯化的目的蛋白。
一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 猪瘟疫苗免疫常因不能诱导产生有效的中和抗体而导致免疫失败。在疫苗的研究中，通过筛选单克隆中和抗体，用重组表达载体来构建表达猪瘟中和抗体蛋白的重组菌毒株，进而研发出抗体疫苗。
[0003] 自20世纪70年代以来，小鼠杂交瘤细胞技术以及噬菌体展示技术已经成为筛选和制备单克隆抗体的通用技术手段，目前在国内外已上市的抗体药物绝大部分也是运用这两种技术获得的。
[0004] 这两种技术方法具有很多优点，比如筛选获得的单克隆抗体特异性强、亲和力高，然而也有很多不足，包括筛选花费时间较长、不能获得天然抗体的重链和轻链配对信息、后期需要人源化改造以及亲和力成熟等问题。
[0006] 然而，所报道的单细胞扩增法在第一步操作复杂，如实验步骤繁多，单个B细胞需要单个培养，很容易交叉培养，对结果造成影响；同时试剂和仪器价格昂贵，这些都是亟待改进的问题。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法，该单链抗体能够与猪瘟病毒特异性结合，直接由重组疫苗进行体内表达，可快速、高效诱导中和抗体的产生，不依赖于机体免疫系统，用于阻断猪瘟病毒的感染。
[0008] 为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区由连接肽连接；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID No.2所示；所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。
[0010] 进一步，所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体具有如SEQID No.3所示的氨基酸序列。
[0011] 一种编码所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的基因。
[0012] 一种所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的表达载体，其由猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因与原核表达载体pET28或pET30重组构建得到。
[0013] 优选地，所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因与原核表达载体通过双酶切位点连接。
[0014] 又，所述双酶切位点为NcoI和NotI，NcoI的序列为CCATGG，NotI的序列为GCGGCCGC。
[0015] 一种筛选所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的方法，具体步骤如下：
[0016] 1)以猪瘟活疫苗作为传代细胞源，对猪进行注射免疫；
[0017] 2)从免疫猪的外周血中分离淋巴细胞，利用带FITC标记的猪瘟病毒E2蛋白，以流式细胞术对分离出的淋巴细胞进行分选，选出能够结合FITC标记及猪瘟病毒E2蛋白的B细胞；
[0018] 3)将分选出的B细胞稀释，接种后进行培养，连续培养3-5天，收集淋巴细胞上清液；
[0019] 4)以猪瘟病毒作为包被抗原，用Elisa方法对收集的淋巴细胞上清液进行筛选，筛选出亲和力好的阳性抗体；
[0020] 5)将筛选出的阳性抗体，进行PCR扩增，获得猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因。
[0021] 优选地，所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0022] 又，步骤5)中的PCR扩增过程为：从阳性抗体中提取RNA，采用RT-PCR法扩增出淋巴细胞抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因；再利用SOE-PCR法将连接肽与重链可变区基因和轻链可变区基因相连，构建猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体，其中，所述连接肽的氨基酸为GGGGSGGGGSGGGGS。
[0023] 一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0024] a)构建重组表达单链抗体
[0025] 将猪源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pET28或pET30中，获得猪源性抗猪瘟单链抗体的重组表达载体；
[0026] b)转化、诱导表达ScFv
[0027] 将构建的重组表达载体转化至感受态细胞DH5α中，挑取单克隆菌落验证其阳性率，菌落验证正确的克隆进行测序分析；然后将验证正确的克隆，转化到表达感受态细胞中；
[0028] 挑取菌落，进行培养，OD600值为0.4-0.5时，添加IPTG，继续培养，收集菌液；
[0029] c)表达产物的纯化
[0030] 将原核表达产物的可溶性蛋白进行纯化，得纯化的目的蛋白。
[0031] 本发明中，采用B细胞抗体制备技术，筛选到能够与目标抗原相结合的细胞，经培养3-5天后，从上清液采用RT-PCR方法扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链(VL)可变区基因，利用SOE-PCR(重组延伸反应)法将连接肽(Linker)与VH基因和VL基因相连构建猪源性单链抗体(ScFv)基因，并将其克隆到pET载体中，测序后进行序列分析，证明该单链抗体属于猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0033] 本发明利用B细胞获得能够和病毒结合分泌IgG的淋巴细胞，相对于传统的噬菌体筛选方法，B细胞筛选更容易获得特异性和中和病毒能力高的目标抗体，其蛋白表达量高，表达蛋白来不及折叠为活性形式，即使表达产物中有包涵体，小鼠免疫实验也能顺利进行。
[0036] 图1为本发明实施例中的流式细胞筛选图谱。
[0037] 图2为本发明实施例中的VH-Linker-VL PCR电泳图；其中，M为2000bp DNA ladder marker，泳道1，VH-Linker；泳道2，VL-Linker；泳道3，ScFv(VH-Linker-VL)。
[0038] 图3为本发明实施例中的重组原核表达载体质粒图谱，其中，M，Marker 2000；泳道1.pET28a；2.ScFv(VH-Linker-VL)。
[0039] 图4为本发明实施例中的重组原核表达载体表达图谱，其中，M.Marker；泳道1.对照；2.ScFv 2-16；3.ScFv 1-17；4.ScFv 3-15。
[0040] 图5为本发明实施例中的抗猪瘟病毒单链抗体的纯化电泳图；M.Marker；1.ScFv 2-16；2.ScFv 1-17；3.ScFv 3-15。
具体实施方式
[0041] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0042] 猪瘟活疫苗，广东永顺生物制药股份有限公司；
[0044] 本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得。实施例中各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明，可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。
[0045] 实施例一种猪源性抗猪瘟病毒单链抗体的获得方法
[0046] 1.采用猪瘟活疫苗作为传代细胞源，注射免疫2头30日龄仔猪，1头份，间隔两周进行二次免疫；对免疫后的仔猪参照奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》法检测血清抗体效价；具体如下：
[0049] (3)采集的猪血清1：100稀释，100μl/孔；
[0050] (4)HRP标记羊抗猪IgG1：250稀释，100μl/孔；
[0051] (5)显色液A：B＝1：1 50μl/孔；
[0052] (6)终止液2M H2SO4 50μl/孔；
[0053] 结果：二次免疫后猪血清OD值：0.987。
[0054] 2.用FITC标记E2蛋白
[0055] (1)将E2蛋白(浓度1mg/ml)对交联反应液透析三次，4℃，至pH＝9.0。
[0056] (2)将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml；每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
[0057] (3)按P：F(蛋白质：FITC)＝1mg：150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8hr。
[0058] (4)加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2hr。
[0059] (5)将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
[0060] (6)交联物的鉴定：蛋白浓度(mg/ml)＝[A280-0.31×A495]/1.4。
[0061] 注：A280和A495为蛋白的吸光值。
[0062] F/P比例：3.1×A495/[A280-0.31×A495]，该值应介于2.5-6.5之间。
[0063] (7)FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％NaN、3.1％BSA，4℃暗处保存。
[0064] 3.分离猪淋巴细胞
[0065] (1)取免疫猪的新鲜抗凝全血，EDTA抗凝剂均可，用等体积PBS稀释。
[0066] (2)在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。分离液、抗凝未经稀释全血、PBS体积为1：1：1。
[0069] (5)用PBS或RPMI1640稀释到一定体积，颠倒混均，室温，水平转子250g，离心10min弃上清；重复洗涤1-2次。
[0070] (6)用PBS或合适的培养基将细胞重悬备用。
[0071] 4.分选B细胞
[0072] 采集抗凝血分离出的淋巴细胞，采用流式细胞术进行IgG+B淋巴细胞的分选，获得抗猪IgG-FITC和标记FITC-E2的IgG+B淋巴细胞，阳性率＞30％，参见图1。
[0073] 将分选的淋巴细胞稀释后在96孔板进行培养，1个淋巴细胞/孔，接种至5-20％的血清浓度中，同时添加0.35μg/ml PMW，连续培养5天，采集上清液。
[0074] 5.ELISA方法鉴定阳性克隆
[0075] (1)用碳酸氢盐包被液稀释CSFV(1：100)包被96孔板。
[0076] (2)8％脱脂牛奶封闭。
[0077] (3)采集的淋巴细胞上清液，100μl/孔。
[0078] (4)HRP标记羊抗猪IgG(1：250稀释)，100μl/孔。
[0079] (5)显色液A：B＝1：1，50μl/孔。
[0080] (6)终止液2M H2SO4，50μl/孔。
[0081] 结果筛选到阳性率最高的4株淋巴细胞，分别命名为：OD2-19、OD2-16、OD1-17和OD3-15，其分泌抗体水平分别为：OD2-19：0.839；OD2-16：0.9；OD1-17：0.875；OD3-15：0.903。
[0082] 6.扩增猪源ScFv编码基因
[0083] 1)从筛选出的阳性淋巴细胞中，用Trizol法利用TRIZOL Reagen提取RNA，根据反转录试剂盒的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。
[0084] 2)设计引物
[0085] 根据GenBank已公布的猪抗体编码基因重链可变区序列(AF064688.1；AF064687.1；AF064690.1；AF064689.1)和轻链可变区序列(GQ867595.1；KF561242.1；
GQ867594.1)设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
GQ867594.1)设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0086] 表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
[0087]
[0088]
[0089] 注：下划线代表NcoI或Not I酶切位点，方框代表连接肽序列。
[0090] Linker采用(GGGGS)3，其对应的编码核苷酸序列为：GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGCGGCGGGTCT。
[0091] 3)VH和VL基因的扩增
[0092] 以cDNA模版，Vk Forward和Vk backward为引物扩增Vk-Linker基因；以cDNA为模版，两对引物VH Forward 1和VH backward、VH Forward2和VH backward扩增VH-Linker基因。
[0093] PCR反应体系如下所示：
[0094] 扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火1min(VH-Linker 66℃退火1min)，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物(120V,20min)，紫外凝胶成像系统观察结果，参见图2。
[0095] 7.获得ScFv基因
[0096] 分别以VH-Linker和Vk-Linker基因为模板，VH backward和Vk forward为引物，扩增带有连接肽Linker的重链可变区基因和轻链可变区基因，条件同上，参见图2，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的基因ScFv基因。
[0097] 8.构建重组表达单链抗体
[0098] 根据常规分子克隆方法参照萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》，目的基因和pET28a载体分别经NcoI和NotI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳并用凝胶回收试剂盒回收酶切产物。
[0099] 将酶切后的目的基因插入同样酶切的pET28a载体中，构建重组表达质粒，参见图3，并将其转化感受态细胞DH5α中，涂含有卡那霉素的LB平板。
[0100] 挑取单克隆菌落验证其阳性率，菌落验证正确的克隆进行测序分析。然后将验证正确的克隆，转化到表达感受态细胞BL21中。
[0101] 9.诱导表达ScFv
[0102] 挑取单个基因工程菌菌落，接种于5ml相应抗性的LB培养液，37℃200rpm/min振荡培养过夜。取1μl过夜培养菌液接种到1mlLB培养液中，37℃200rpm/min扩大培养，测OD600值为0.4-0.5时，将培养液添加IPTG至1mM终浓度，培养5h，收集菌液，参见图4。
[0103] 10.重组质粒pET28a-ScFv原核表达产物可溶性分析
[0104] 重组质粒pET28a-ScFv按照上述条件优化诱导表达，收集沉淀，菌体沉淀悬浮于适量PBS，超声破碎，程序如下：超声3s，间歇5s，超声90次。菌体经超声波裂解后于4℃，13000rpm/30min，分别收集上清与沉淀，SDS-PAGE电泳分析，观察重组质粒pET28a-ScFv原核表达产物的可溶性状态。
[0105] SDS-PAGE灰度分析鉴定蛋白4/5为包涵体，1/5为可溶性状态。
[0106] 11.表达产物的纯化
[0107] 经上述鉴定重组质粒pET28a-ScFv原核表达产物可溶性蛋白，进行目的基因的纯化，流程如下：
[0108] (1)离心收集经诱导表达的大肠杆菌工程菌，菌体用1/5-1/10体积的Ni-Native-0缓冲液充分悬浮。
[0109] (2)超声破碎细菌，释放重组蛋白。超声功率控制在250W，工作4s，停歇8-10s。
[0110] (3)细菌破碎液在4℃、12000g离心20min，收集上清液，调整pH值到8.0。
[0111] (4)充分悬浮Ni-NTA-琼脂糖凝胶，打开层析柱，使乙醇流出。
[0112] (5)凝胶用5-10倍体积的Ni-Native-0缓冲液冲洗平衡，控制流速约1ml/min。
[0113] (6)将含有目标蛋白的上清液加入层析柱，控制流速0.5-1.0ml/min。
[0114] (7)吸附蛋白的凝胶用Ni-Native-20缓冲液充分流洗至无蛋白流出。
[0115] (8)凝胶用5-10倍体积Ni-Native-50缓冲液进行洗脱，流速为1ml/min，分管收集洗脱液。
[0116] (9)凝胶用5-10倍体积的Ni-Native-100缓冲液进行洗脱，流速为1ml/min，分管收集洗脱液。
[0117] (10)凝胶用5-10倍体积的Ni-Native-250缓冲液进行洗脱，流速为1ml/min，分管收集洗脱液。
[0118] (11)凝胶用5-10倍体积的Ni-Native-500缓冲液进行洗脱，流速为1ml/min，分管收集洗脱液。
[0119] (12)凝胶用10倍体积的Ni-Native-0缓冲液进行洗脱，最后浸泡于30％乙醇。
[0120] (13)各管洗脱液分别进行SDS-PAGE电泳，将含有高纯度目的蛋白的各管混合，经脱盐、浓缩后即得纯化的目的蛋白，参见图5。
[0121] 12.重组质粒pET28a-ScFv克隆阳性菌纯化蛋白的浓度测定
[0122] 采用碧云天生物技术研究所的BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定重组质粒pET28a-ScFv克隆阳性菌纯化蛋白的浓度，具体方法如下：
[0123] 1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。
[0124] 2)完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/ml。
[0125] 3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL分别加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μL。
[0126] 4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μL。
[0127] 5)各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30min。
[0128] 6)测定A562和A540-595nm之间的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
[0129] 蛋白浓度结果如下：ScFv 2-19：0.53；ScFv 2-16：0.623；ScFv 1-17：0.575；ScFv 3-15：0.603。
[0130] 13.制备高免血清
[0131] 将6周龄的雄性小白鼠随机分为四组，每组4只，分别饲养于不同鼠笼中；免前断尾采血，制备血清作阴性对照；
[0132] 取150μg纯化蛋白，加入150μg佐剂，使用注射器乳化30min；每只小鼠颈、背部皮下多点注射乳化好的蛋白抗原，每只小鼠注射100μl；10d、25d分别加强免疫1次。首免、二免10d分别断尾采血、收集血清。Elisa鉴定血清抗体水平。
[0133] 二免后10d检测抗体水平：ScFv 2-19：0.497；OD2-16：0.685；ScFv 1-17：0.593；ScFv 3-15：0.633阴性：0.084。
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