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表柔比星超顺 磁性 氧化 铁纳米粒及其制备方法

阅读：164发布：2020-05-16

专利汇可以提供表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒，由二氯化铁、三氯化铁、偏硅酸钠、碳二亚胺、EDC?HCl、氮羟基琥珀酰亚胺和表柔比星组成，以Fe3+、Fe2+、SiO32-为主要原料，通过化学共沉淀法制备SPION；并利用SPION表面存在羟基与硅烷偶联剂发生硅烷反应，引入活性基团伯羰基；再利用胺基与羰基之间的亲核反应，将EPI嫁接至纳米粒得到目标产物Epi-SPION。本发明所制得的EPI-SPION具有良好的导电性和导磁性，在外加磁场的作用下能定向到达肿瘤病变部位，而不损伤正常的组织细胞，对肿瘤具有靶向治疗的应用价值。，下面是表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒，其特征在于，由以下重量配比的原料制成：
二氯化铁：10mg
三氯化铁：27 mg
偏硅酸钠：28 mg
碳二亚胺：5 mg
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐：2 mg
氮羟基琥珀酰亚胺：2 mg
表柔比星：26 mg；
所述纳米粒通过以下步骤实现：
（1）分别称取二氯化铁、三氯化铁和偏硅酸钠，溶解在500ml纯化水中，用稀盐酸调节pH至1.5～2.0后转入聚四氟乙烯内衬高压反应釜中；
（2）在上述反应釜中逐滴加入质量分数为25%的氨水，至反应液pH值为9～10，在反应过程中持续通入氮气，控制温度为30℃，并维持机械搅拌，维持反应4-6小时，室温离心3分钟，8000rpm，分离沉淀物；
（3）取步骤（2）所得的沉淀物，依次用纯化水、体积比75%乙醇溶液分别洗涤三遍后分散在pH为5.0的硼酸缓冲液，而后在硼酸溶液中加入碳二亚胺进行烷化反应，即得超顺磁性氧化铁纳米粒溶液；
（4）在步骤（3）所得的超顺磁性氧化铁纳米粒溶液中，依次加入表柔比星、EDC•HCl、和NHS 进行酰胺化交联反应，反应时间48小时，反应温度25℃，8000rpm离心，分离沉淀物并用截留分子量3000道尔顿的渗透膜透析法纯化反应产物，最终得到棕红色混悬液，真空干燥后，得到表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒。

说明书全文

表柔比星超顺磁性 氧化 铁纳米粒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属制药领域，涉及一种表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒及其制备方法。

背景技术

[0002] 癌症是严重危害人类身体健康的头号杀手之一，据世界卫生组织统计，全球每年有1000万癌症患者，而死于癌症的人数约600万，占全球死亡人数的12%；在我国，每年新增癌症患者180万，死亡140万，平均每3分钟就有1.3人死于癌症，而且癌症的发病率呈急剧上升趋势。化疗是治疗癌症的重要方法之一，表柔比星是临床上常用的一种广谱抗肿瘤化疗药物，它是阿霉素的衍生物，其进入体内后能迅速透入肿瘤组织与肿瘤细胞DNA 结合、抑制核酸合成和有丝分裂，在S期和G2期有强大的细胞毒效应，被广泛用于乳腺癌、皮肤癌、卵巢癌、肺癌等的治疗。而在实际的治疗过程中，虽然表柔比星对肿瘤细胞有较强的杀伤力，但它为细胞周期非特异性抗肿瘤药，对正常细胞也有较大杀伤力，在获得治疗效果的同时，不可避免地产生了严重的毒副作用，因此寻找表柔比星稳定的载药方式，使药物只在肿瘤部位发生作用还有待进一步研究。

[0003] 超顺磁性氧化铁纳米粒（Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles，SPION）为近年来国内外靶向药物和医用纳米材料领域研究的最新研究成果，它是指具有磁响应性的纳米级粒子，其直径一般小于30 nm，它比细胞、病毒、蛋白质、基因等的大小更小或者接近，这样有利于它们之间发生相互作用，生物分子在其表面的覆盖也更容易达到。SPION能在外加磁场作用下定向运动，可以实现药物在肿瘤部位的定向富集，同时在交变磁场作用下，可以产生热效应，从而可以更好地控制药物的靶向释放，另外大量的动物实验和体外实验证明SPION具有良好的生物兼容性，基于上述特点，SPION已成为最具有开发前景的给药载体。

[0004] 综上，如果能将表柔比星嫁接到超顺磁性氧化铁纳米粒表面，就可以通过外磁场将表柔比星直接输送到肿瘤发生部位，实现表柔比星在肿瘤发生部位的定向富集，达到靶向治疗的目的。

发明内容

[0005] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒，由以下重量配比的原料组成：

[0006] 二氯化铁（FeCl2·4H2O）：8～15%

[0007] 三氯化铁（FeCl3·6H2O）：25～35%

[0008] 偏硅酸钠（Na2SiO3·9H2O）：25～35%

[0009] 碳二亚胺：2～7%

[0010] 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC•HCl）：1～5%[0011] 氮羟基琥珀酰亚胺（NHS）：1～5%

[0012] 表柔比星（Epirubicin, EPI）：20～30%。

[0013] 优选的，一种表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒，由以下重量配比的原料组成：

[0014] 二氯化铁（FeCl2·4H2O）：10%

[0015] 三氯化铁（FeCl3·6H2O）：27%

[0016] 偏硅酸钠（Na2SiO3·9H2O）：28%

[0017] 碳二亚胺：5%

[0018] 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC•HCl）：2%

[0019] 氮羟基琥珀酰亚胺（NHS）：2%

[0020] 表柔比星（Epirubicin, EPI）：26%。

[0021] 本发明的另一个目的是提供所述表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒的制备方法，通过以下步骤实现：

[0022] （1）按照上述重量配比分别称取二氯化铁（FeCl2•4H2O）、三氯化铁（FeCl3•6H2O）和偏硅酸钠（Na2SiO3•9H2O），溶解在500ml纯化水中，用10% 的盐酸调节pH至1.5～2.0后转入聚四氟乙烯内衬高压反应釜中；

[0023] （2）在上述反应釜中逐滴加入质量分数为25%的氨水，至反应液pH值为9～10，在反应过程中持续通入氮气，控制温度为25℃，并维持机械搅拌，维持反应4-6小时，室温离心3分钟，8000rpm，分离沉淀物；

[0024] （3）步骤（2）所得的沉淀物，依次用纯化水、75%乙醇（v/v）分别洗涤三遍后分散在pH为5.0的硼酸缓冲液，而后在硼酸缓冲液中加入5mg碳二亚胺进行烷化反应，得超顺磁性氧化铁纳米粒（SPION）溶液；

[0025] （4）在步骤（3）所得的超顺磁性氧化铁纳米粒（SPION）溶液中，依次加入表柔比星、EDC•HCl、NHS 进行酰胺化交联反应，反应时间48小时，反应温度25℃，离心，8000rpm，分离沉淀物并用截留分子量3000道尔顿的渗透膜透析法纯化反应产物，最终得到棕红色混悬液，真空干燥后，得到表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒(Epi-SPION)。

[0026] 本发明根据超顺磁性纳米粒在外加磁场的作用下定向富集的特性，实现表柔比星在肿瘤发生部位的定向富集的一种表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒及其制备方法。所制得的表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒（EPI-SPION）具有良好的导电性和导磁性，在外加磁场的作用下能定向到达肿瘤病变部位，而不损伤正常的组织细胞，对肿瘤具有靶向治疗的应用价值；同时，本法制备原料简单便宜、易于获取，制备方法简单，采用本法制得的表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒（EPI-SPION）结构稳定，适合于工业化生产应用。附图说明

[0027] 图1是本发明所制得的EPI-SPION在透射电镜下的形态及粒径大小。

[0028] 图2是本发明所制得的EPI-SPION在激光粒度分布仪中测定的粒径大小分布图。

[0029] 图3是本发明所制得的EPI-SPION和SPION的磁滞回线。

[0030] 图4是本发明所制得的EPI-SPION和SPION在200～800nm范围内进行紫外-可见吸收光谱扫描的图谱。

[0031] 图5是本发明所制得的EPI-SPION和SPION在在4000～400cm−1范围进行傅里叶变换红外光谱扫描的图谱。

[0032] 图6是本发明所制得的EPI-SPION和SPION在光学显微镜下观察对WM266黑色素瘤细胞形态的影响。

[0033] 图7是采用CCK8溶液检测相同药物浓度的EPI和EPI-SPION对WM266黑色素瘤细胞存活率的结果。

[0034] 具体实施方法

[0035] 下面结合实施例及附图对本发明所述的表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒及其制备方法进行详细说明。

[0036] 实施例一: 表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒及其制备方法

[0037] 表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒（EPI-SPION）由如下重量配比的原料制得：

[0038] 二氯化铁（FeCl2·4H2O）：10mg；

[0039] 三氯化铁（FeCl3·6H2O）：27mg；

[0040] 偏硅酸钠（Na2SiO3·9H2O）：28mg；

[0041] 碳二亚胺：5mg；

[0042] 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC•HCl）：2mg；

[0043] 氮羟基琥珀酰亚胺（NHS）：2mg；

[0044] 表柔比星（EPI）：26mg；

[0045] 上述EPI-SPION的制备方法依次包括下列步骤：

[0046] （1）按照上述重量配比分别称取10mg二氯化铁（FeCl2•4H2O）、27mg三氯化铁（FeCl3•6H2O）和28mg偏硅酸钠（Na2SiO3•9H2O）溶解在500ml纯化水中，用稀盐酸调节pH至1.5～2.0后转入聚四氟乙烯内衬高压反应釜中；

[0047] （2）在上述反应釜中逐滴加入质量分数为25%的氨水，至反应液pH值为9-10，在反应过程中持续通入氮气，控制温度为25℃，并维持机械搅拌，维持反应4-6小时，离心，8000rpm分离沉淀物；

[0048] （3）步骤（2）所得的沉淀物，依次用纯化水、75%乙醇分别洗涤三遍后分散在pH为5.0的硼酸缓冲液，而后在硼酸溶液中加入5mg碳二亚胺进行烷化反应（反应条件），即得超顺磁性氧化铁纳米粒（SPION）溶液；

[0049] （4）在步骤（3）所得的超顺磁性氧化铁纳米粒（SPION）溶液中，依次加入26mg 表柔比星、2mg EDC•HCl、2mg NHS 进行酰胺化交联反应，反应时间48小时，反应温度25℃，离心，8000rpm，分离沉淀物并用渗透膜截留分子量3000道尔顿的反应产物，最终得到棕红色Epi-SPION混悬液，真空干燥后，得到表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒(Epi-SPION)。

[0050] 实施例二：表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒的形态及粒径测定

[0051] 用透射电镜专用的200目铜网支撑膜蘸取适量实施例一中所制得的Epi-SPION混悬液，常温干燥后置JEM-1200EX型透射电镜下观察纳米粒的大小及形状，结果参见图1：Epi-SPION纳米粒的粒径为8～10nm，颗粒规则，呈近似圆球形，分散性较好，未见有明显团聚现象发生；另取适量（约0.5ml）纳米粒混悬液，超声分散处理后稀释至3～5倍，用Zetasizer Nano S90高灵敏纳米粒度分析仪测定纳米粒的粒径大小及Zeta电位，测定结果参见图2：EPI-SPION粒径主要分布在28.1nm，呈正态分布，多分散系数0.181，表明制备得到的Epi-SPION粒子大小均匀性良好。在pH为5.0的硼酸缓冲液中Zeta电位28.4mV，具有利于稳定的荷电性质。采用激光散射采用动态激光散射法测得是水合动力半径，由于SPION经表面修饰后具有较好的亲水性，所以测得的结果要比TEM实际测得的粒径大了2～
3倍。

[0052] 实施例三：表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒的磁力学性质测定

[0053] 取适量实施例一中所制得的Epi-SPION混悬液（约1ml），采用Lake Shore 7303型振动样品磁强计测试SPION磁性纳米粒的磁性，计算其饱和磁化强度，测定温度为300K，-1外磁场从−5000～5000 kA • m ，记录磁滞的变化情况，以外加磁场的强度H（单位：kA · -1 -1
m ）为横坐标，以质量磁化强度（单位：emu· g ）为纵坐标，绘制对应的磁滞回线，结果参见图3：Epi-SPION和SPION的磁滞回线均经过原点，且以原点成中心对称，证明了Epi-SPION和SPION的矫顽力几乎为零，具有较好的超顺磁性，未嫁接药物SPION与嫁接表柔比星Epi-SPION均具有较高的磁化强度，其饱和磁化强度分别为79.7和77.8emu/g，这个结果也表明SPION的超顺磁的大小主要取决于Fe2O3的晶核大小，表面嫁接药物对SPION的磁性性质几乎没有影响。

[0054] 实施例四：表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒的结构测定

[0055] 为了验证表柔比星是否有效地嫁接于SPION表面，将所得Epi-SPION混悬液及真空干燥后的磁流体粉末分别进行紫外-可见光谱和红外光谱测定，测定过程依次为：

[0056] （1）取用硼酸盐缓冲液分散的EPI-SPION、表柔比星及SPION适量，稀释成适当的浓度，在200～800nm范围内进行紫外-可见吸收光谱扫描并记录图谱，结果参见图4，SPION在200～800nm无明显吸收峰，表柔比星的吸收峰在488nm，嫁接药物后的Epi-SPION在521nm出现一个明显的吸收峰，嫁接后出现红移现象，这主要由于药物与SPION上的伯胺基共价键结合后其发光基团共轭性质发生改变有关。

[0057] （2）取真空干燥的EPI-SPION、表柔比星及SPION粉末适量，分散于溴化钾的小片−1中，在4000～400cm 范围进行傅里叶变换红外光谱扫描并记录图谱，结果参见图5，SPION-1
的红外光谱中在2924cm 附近出现的宽而强的吸收峰为羧基中O-H的伸缩振动吸收峰，表-1 -1
明了SPION表面羧基修饰的成功，2368cm 的吸收表明Si-H键的伸缩振动信号，605 cm出现了属于铁氧化物的品格振动吸收峰信号，这些SPION的特征吸收峰在复合颗粒中也-1
可明显观测到；在表柔比星的红外光谱中，1690 cm 左右信号代表共轭羰基的伸缩振动，-1 -1 -1 -1
1622cm 左右信号代表伯氨基的面内弯曲振动，1284cm 、1202cm 、978cm 信号代表了苯环的面内弯曲振动，这些为表柔比星的特征峰，在复合颗粒的红外谱中也可以明显观测到。综上Epi-SPION的红外光谱是SPION和Epi的红外谱的复合，可以判断表柔比星成功嫁接到在SPION纳米粒表面。

[0058] 实施例四：表柔比星超顺磁性氧化铁纳米粒对WM266黑色素瘤细胞的影响[0059] 1.仪器与试剂

[0060] 高糖DMEM培养基、FBS、NEAA购自Invitrogen公司；小牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（trypsin）均购自Sigma公司；二氧化碳细胞培养箱（3111型）、层流超净工作台（1851型）为Thermo Electron公司；荧光倒置显微镜（DMIL型）为Nikon公司；普通光学显微镜（PM-10AD）为Olympus公司；细胞培养瓶为Corning公司；高速离心机（TDL-5）为上海安亭科学仪器厂；细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK8）为上海生工工程技术服务有限公司提供。

[0061] WM266黑色素瘤细胞（来源这样写可以吗？其实是同学带回来的）为德国慕尼黑大学赠送。

[0062] 2.实验方法

[0063] 采用常规方法复苏WM266黑色素瘤细胞后，倒掉培养基，用PBS液冲洗细胞3次，加2 mL EDTA和胰蛋白酶混合液（0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA），消化至细胞分散，通常为5～15 min（为避免细胞团块形成，在消化时避免摇动培养瓶；细胞若难以分散可放在37 ℃孵箱消化）；加6～8 mL完全培养基，吸出细胞转移至离心管中，800～1000 rpm离心5 min；弃去上清液，用培养液混匀细胞，接种在新的培养瓶内。放置于5% CO2，37 ℃条件下培养，1～2天更换培养液或传代。

[0064] WM266细胞以每孔5 ×104个细胞密度接种于96孔板中。在37 ℃、5% CO2条件-6 -7 -8下培养24 h，弃去上清液，用PBS 洗涤2 遍，加入药物浓度分别为5×10 ，5×10 ，5×10 ，
9 -10
5×10-和5×10 mol/L的EPI溶液和EPI-SPION溶液，每组设3个复孔，培养24 h 后，（1）光学显微镜下观察EPI-SPION的药效；（2）每孔分别加入20 μLCCK8溶液，于37 ℃，
5% CO2培养箱中继续培养1 h。单细胞孔作为阴性对照组，培养基溶液孔作为空白对照，酶标仪450 nm 波长测定各孔吸光度，根据计算细胞存活率。

[0065] 3.实验结果

[0066] 参见图6、图7，WM266黑色素瘤细胞用5(10-6 mol/L EPI和EPI-SPION处理24 h后，光学显微镜观察其对细胞存活率的影响。从图6的结果可以看出，单加SPION对WM266细胞生长基本没有影响；加入EPI和EPI-SPION后，能显著抑制细胞生长并表现出细胞杀伤作用。结果提示当EPI药物接在SPION上时，并不影响其抑制肿瘤细胞生长药效的发挥。图7是CCK8检测比较相同药物浓度时EPI和EPI-SPION药效，结果显示EPI和EPI-SPION杀伤肿瘤细胞效果随着浓度增加而增强。

[0067] 综上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依照本发明申请专利范围的内容所做的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范畴。

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