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基于免疫磁珠和MnO2 纳米粒子检测副溶血性弧菌 试剂盒

阅读：1020发布：2020-09-16

专利汇可以提供基于免疫磁珠和MnO2 纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了基于免疫磁珠和MnO2 纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，制备具有超顺磁性的磁珠，将该磁珠与副溶血性弧菌多克隆抗体偶联；合成MnO2纳米粒子，将该纳米粒子与副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体偶联；取待测液，将其与两种探针混合，使用磁力架分离磁珠‑菌体‑MnO2复合物，用柠檬酸盐缓冲液重悬该混合物，加入TMB显色，从而实现副溶血性弧菌快速特异性检测。该发明提出利用免疫磁珠和MnO2纳米粒子技术对副溶血性弧菌检测，利用ELISA方法的免疫学反应显色，缩短了检测时间，定量检测时变异系数小。最低检测浓度为10CFU/mL，加标回收率达到96.7%，灵敏度高，稳定性好。，下面是基于免疫磁珠和MnO2 纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.基于免疫磁珠和MnO2 纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，它包括：羧基化Fe3O4纳米粒子与抗副溶血性弧菌兔多抗偶联的免疫磁珠和MnO2纳米粒子与抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体IgY偶联的MnO2纳米探针。
2.快速检测食品副溶血性弧菌的方法，它包括：
1）纳米磁珠的制备：
添加1.08g FeCl3.6H2O到22mL乙二醇中，超声溶解10min，；再添加1.2g NaAc和0.2g柠檬酸钠超声10min，；最后，添加0.2g PEG6000于上述溶液中，超声混匀，将所得均质溶液转移至反应釜中，于199℃烘箱中反应18h；用永磁铁从反应溶液中分离中黑色的固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗3-5次，得到羧基化Fe3O4纳米粒子；
2）免疫磁珠的制备：
取0.5mg羧基化Fe3O4纳米粒子，用PBS洗2次，用1mL PBS重悬，加入10mg EDC和10mg NHS活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，PBS洗3次，1mL PBS重悬，加入50µg抗副溶血性弧菌兔多抗，室温反应2h，磁分离，去上清，PBS洗3次，加入1mL封闭液封闭1h，得到功能化免疫磁珠；
3）纳米MnO2粒子的制备：
添加25mg牛血清白蛋白于10mL PBS中，搅拌混匀，加入100µL MnSO4.H2O(0.1M)于混合液中，搅拌2min，再向其加入1M的NaOH 100µL ，搅拌6-7h后，用超纯水透析48h，15000rpm离心，得到MnO2纳米粒子；
4）MnO2纳米探针的制备：
取1mg MnO2纳米粒子，PBS重悬，加入1mg EDC和1.5mg NHS活化15min，加入50µg抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体IgY，反应2h，15000 rpm离心，得到功能化MnO2纳米探针；
5）副溶血性弧菌的检测：
取待测样品液100µL，MnO2纳米探针100µL，免疫磁珠0.5mg 重悬为800µL于室温反应
30min,磁分离，去上清，PBS洗3遍，加入1mL柠檬酸盐缓冲液和10µL TMB显色10min，于紫外分光光度计测吸收光谱。
3. 根据权利要求2所述的快速检测食品副溶血性弧菌的方法，其特征在于：所述的PBS缓冲液为8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O，0.24g KH2PO4溶于1L超纯水中，调节pH至7.4。
4. 根据权利要求2或3所述的快速检测食品副溶血性弧菌的方法，其特征在于：所述的封闭液为10mg 牛血清白蛋白（BSA）加入1mL PBS 缓冲液中，现用现配。
5. 根据权利要求4所述的快速检测食品副溶血性弧菌的方法，其特征在于：所述的柠檬酸盐缓冲液为0.73g Na2HPO4.2H2O、0.4665g柠檬酸溶于50mL超纯水中，调节pH至5。
6.根据权利要求5所述的快速检测食品副溶血性弧菌的方法，其特征在于：所述的步骤
1）Fe3O4纳米粒子尺寸为130-330nm。

说明书全文

基于免疫磁珠和MnO2 纳米粒子检测副溶血性弧菌 试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属微生物检测领域，具体涉及基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒。

背景技术

[0002] 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种革兰氏阴性非芽孢嗜盐菌，是常见的食源性致病菌之一。该菌主要来源于虾，鱼和贝类等海产品中，主要通过污染的海产品引起人类急性胃肠炎、伤口感染和败血症等。近几年来，随着食用海产品的人群在不断扩增，由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趋势，据报道，自1998年以来，副溶血性弧菌引起的食物中毒已超过沙门菌食物中毒，成为最严重的食源性病原菌。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌。

[0003] 当前，我国副溶血性弧菌的传统检测方法以微生物培养法为主，全程大概需要5-8天，操作繁琐，耗时长，已不能满足人们对食品安全检测快速简便的要求。随着技术的不断进步，推动着检测方法的不断发展，越来越多的方法应用于检测副溶血性弧菌，如PCR技术、酶联免疫吸附法（ELISA）、环介导等温扩增技术（LAMP）等。PCR技术可在短时间内放大检测目标，具有灵敏度高的特点，但是PCR操作过程要求高且易出现假阳性。ELISA法利用抗原-抗体的特异性结合检测，对设备要求低，但是耗时长，灵敏度相对而言较低。LAMP作为一个新兴的检测技术，具有费用低，灵敏度高，特异性高等特点，但是LAMP需要先选择性增菌培养，因此不利于样品的现场检测，而且有可能进入新的污染。所以，非常必要有开发一种快速，灵敏度高，特异性强的检测手段，来监控食源性致病菌，以保障人们的食品安全。

发明内容

[0004] 本发明目的是提供一种快速、灵敏、简便的副溶血性弧菌检测的基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒。

[0005] 基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，它包括：羧基化Fe3O4纳米粒子与抗副溶血性弧菌兔多抗偶联的免疫磁珠和MnO2纳米粒子与抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体IgY偶联的MnO2纳米探针。

[0006] 快速检测食品副溶血性弧菌的方法，它包括：1）纳米磁珠的制备：
添加1.08g FeCl3.6H2O到22mL乙二醇中，超声溶解10min，；再添加1.2g NaAc和0.2g柠檬酸钠超声10min，；最后，添加0.2g PEG6000于上述溶液中，超声混匀，将所得均质溶液转移至反应釜中，于199℃烘箱中反应18h；用永磁铁从反应溶液中分离中黑色的固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗3-5次，得到羧基化Fe3O4纳米粒子；
2）免疫磁珠的制备：
取0.5mg羧基化Fe3O4纳米粒子，用PBS洗2次，用1mL PBS重悬，加入10mg EDC和10mg NHS活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，PBS洗3次，1mL PBS重悬，加入50µg抗副溶血性弧菌兔多抗，室温反应2h，磁分离，去上清，PBS洗3次，加入1mL封闭液封闭1h，得到功能化免疫磁珠；
3）纳米MnO2粒子的制备：
添加25mg牛血清白蛋白于10mL PBS中，搅拌混匀，加入100µL MnSO4.H2O(0.1M)于混合液中，搅拌2min，再向其加入1M的NaOH 100µL ，搅拌6-7h后，用超纯水透析48h，15000rpm离心，得到MnO2纳米粒子；
4）MnO2纳米探针的制备：
取1mg MnO2纳米粒子，PBS重悬，加入1mg EDC和1.5mg NHS活化15min，加入50µg抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体IgY，反应2h，15000 rpm离心，得到功能化MnO2纳米探针；
5）副溶血性弧菌的检测：
取待测样品液100µL，MnO2纳米探针100µL，免疫磁珠0.5mg 重悬为800µL于室温反应
30min,磁分离，去上清，PBS洗3遍，加入1mL柠檬酸盐缓冲液和10µL TMB显色10min，于紫外分光光度计测吸收光谱；
所述的PBS缓冲液为8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O，0.24g KH2PO4溶于1L超纯水中，调节pH至7.4；
所述的封闭液为10mg 牛血清白蛋白（BSA）加入1mL PBS 缓冲液中，现用现配；
所述的柠檬酸盐缓冲液为0.73g Na2HPO4.2H2O、0.4665g柠檬酸溶于50mL超纯水中，调节pH至5；
所述的步骤1）Fe3O4纳米粒子尺寸为130-330nm。

[0007] 本发明提供了基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，制备具有超顺磁性的磁珠，将该磁珠与副溶血性弧菌多克隆抗体偶联；合成MnO2纳米粒子，将该纳米粒子与副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体偶联；取待测液，将其与两种探针混合，使用磁力架分离磁珠-菌体-MnO2复合物，用柠檬酸盐缓冲液重悬该混合物，加入TMB显色，从而实现副溶血性弧菌快速特异性检测。该发明提出利用免疫磁珠和MnO2纳米粒子技术对副溶血性弧菌检测，利用ELISA方法的免疫学反应显色，缩短了检测时间，定量检测时变异系数小。最低检测浓度为10CFU/mL，加标回收率达到96.7%，灵敏度高，稳定性好。附图说明

[0008] 图1 免疫磁珠和MnO2纳米探针对副溶血性弧菌的检测流程图。

具体实施方式

[0009] 实施例1 副溶血性弧菌兔克隆抗体IgG的制备9 -1
取浓度为1×10 CFU·mL 灭活菌液与等量的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂乳化完全，制备灭活疫苗。首次免疫取浓度为1×109 CFU·mL-1弗氏完全佐剂疫苗免疫健康新西兰大白兔（由吉林大学基础医学院实验动物中心提供），采用背部皮下多点注射法，每只免疫2 mL，在第二周、第三周采用同等剂量的弗氏不完全佐剂疫苗对兔进行第二次免疫、第三次免疫。10天后，用灭活菌液加强免疫两次。每次免疫前兔耳缘静脉取血，测定血清效价。达到分离标准，兔心脏采血，分离血清，得到抗副溶血性弧菌的抗血清。采用饱和硫酸铵盐析沉淀法对所述的抗血清中的多克隆抗体IgG进行纯化；采用间接ELISA法对纯化后抗体的效价和特异性进行测定，表1为免疫前后兔血清及抗体效价测定结果，结果显示，随着免疫次数的增加，血清抗体效价逐渐升高，最终获得的副溶血性弧菌兔多克隆抗体效价可以达到1:
1024000；表2为兔多克隆抗体IgG特异性结果，结果显示，制备的抗体特异性较好；采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的IgG抗体的浓度进行测定，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为
1mg/mL，-20℃保存备用。

[0010] 实施例2 副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY的制备取浓度为1×109 CFU·mL-1灭活菌液与等量的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂乳化完全，制备灭活疫苗，用来免疫蛋鸡。采用肌肉多点注射的方式将疫苗接种于鸡胸。首次免疫采用弗氏完全佐剂疫苗，每只鸡1mL，间隔两周后采用弗氏不完全佐剂疫苗进行第二次免疫，随后每隔两周进行一次强化免疫。收集免疫前后的鸡蛋，储存于4℃冰箱中备用。采用PEG 6000盐析法对鸡蛋中的卵黄抗体进行提取。采用间接ELISA法对纯化前后卵黄抗体的效价和特异性进行测定，表3为免疫前后鸡血清及抗体IgY效价测定结果，结果显示，随着免疫次数的增加，鸡血清中的抗体效价逐渐升高，最后一次免疫后，抗体效价高达1：64000，经提取纯化后，最终获得的副溶血性弧菌IgY抗体效价可以达到1:128000。表4为鸡卵黄抗体IgY特异性结果，结果显示制备的IgY抗体特异性较好；采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的IgY抗体的浓度进行测定，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为1mg/mL，-20℃保存备用。

[0011] 实施例3免疫磁珠的制备添加1.08g FeCl3.6H2O到22mL乙二醇中，超声溶解10min，形成红棕色溶液；再添加
1.2g NaAc和0.2g柠檬酸钠到该溶液中，超声10min，形成暗红色溶液；最后，添加0.2g PEG6000于上述溶液中，超声混匀，将所得均质溶液转移至反应釜中，于199℃烘箱中反应
18h。用永磁铁从反应溶液中分离中黑色的固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗3-5次，得到Fe3O4纳米粒子；取0.5mg羧基化Fe3O4纳米粒子，用PBS洗2次，用1mL PBS重悬，加入10mg EDC和10mg NHS活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，PBS洗3次，1mL PBS重悬，加入50µg抗副溶血性弧菌兔多克隆抗体，室温反应2h，磁分离，去上清，PBS洗3次，加入1mL封闭液封闭1h，得到功能化免疫磁珠。

[0012] 实施例4 MnO2纳米探针的制备添加25mg牛血清白蛋白（BSA）于10mL PBS中，搅拌混匀，加入100µL MnSO4.H2O(0.1M)于混合液中，搅拌2min，溶液变成乳白色，再向其加入100µL NaOH (1M)，溶液由乳白色渐变为棕黄色，搅拌6-7h后，用超纯水透析48h，15000rpm离心，得到MnO2纳米粒子；取1mg MnO2纳米粒子，PBS重悬，加入1mg EDC和1.5mg NHS活化15min，加入50µg抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体（IgY），反应2h，15000rpm离心，得到功能化MnO2纳米探针。

[0013] 实施例5 缓冲液的配置PBS缓冲液: 取8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O，0.24g KH2PO4溶于1L超纯水中，调节pH至7.4。

[0014] 实施例6菌液标准品的制备取-80℃保存菌种，进行菌株活化。将活化后的菌株在3%氯化钠胰蛋白胨琼脂平板上划线分纯，37 ℃培养18 24 h后，挑取单个菌落，接种3%氯化钠胰蛋白胨液体培养基，37 ℃振~
荡培养12 18 h。取1mL菌液10倍倍比稀释平板倾注法进行活菌计数。剩余的菌液用1 %甲醛~
在室温下灭活10 min ，将灭活的菌液 3000 rpm 离心 3 min，收集菌体，然后用PBS溶液充分混匀，制成菌悬液并，用PBS溶液调节菌悬液浓度为109 CFU·mL-1，存于4 ℃冰箱中备用。

[0015] 实施例7 基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌的方法检测流程图如图1。取待测样品液100µL，MnO2纳米探针100µL，免疫磁珠0.5mg重悬800µL于室温反应30min,磁分离，去上清，PBS洗3遍，加入1mL柠檬酸盐缓冲液和10µL TMB显色
10min，于紫外分光光度计测吸收光谱。参考所做的标准曲线图，确定样品中副溶血性弧菌的数量。定量检测该菌浓度的范围在10-105CFU/mL.本发明方法检测稳定，检测限可低至10 CFU/mL，检测时间短，检测效果好。对副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特菌（LM）、志贺菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7等菌进行检测，只有副溶血性弧菌的检测结果呈阳性，其余均为阴性，该方法特异性强，未见假阳性和假阴性结果，结果如表5。

[0016] 注：<+>表示副溶血性弧菌阳性，<->表示副溶血性弧菌阴性。

[0017] 实施例8试剂盒的制备由实施例3所描述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠、实施4例所描述的MnO2纳米探针、实施例5所描述的缓冲液、实施例6所描述的菌液标准品共同组成基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌的试剂盒。

[0018] 实施例9 模拟样品的检测制备蛤蜊浸出液：精确称取5g蛤蜊肉，加入5mL灭菌PBS，研磨均匀后，用滤纸过滤，用
0.22μm滤膜对滤出液进行抽滤；取不同浓度的副溶血性弧菌接种于该浸出液中，用本发明检测方法对其进行检测。取待测样品液100µL，MnO2纳米探针100µL，免疫磁珠0.5mg重悬800µL于室温反应30min,磁分离，去上清，PBS洗3遍，加入1mL柠檬酸盐缓冲液和10µL TMB显色
10min，于紫外分光光度计测吸收光谱。

[0019] 参考所做的标准曲线图，确定样品中副溶血性弧菌的数量。定量检测该菌浓度的范围在10-103CFU/mL.本发明方法检测稳定，加标回收率达到96.7%。

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