一种引物中部序列干扰PCR技术
阅读：0发布：2022-10-13
专利汇可以提供一种引物中部序列干扰PCR技术专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且“一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是采用引物中部序列的一段不互补或同序 碱 基、引物分子内外反义干扰而竞争性地破坏引物间聚合来选择性抑制引物二聚体(PD)扩增的改良PCR技术。所述引物中部序列干扰是指在常规设计原则优选的引物 基础 上，选用一对引物中部序列(ID)平行不互补或同序技术、或/和引物加入ID反义修饰寡核苷酸(Oligo)干扰技术、或/和引物分子内ID反义Oligo干扰技术及其组合，仅干扰引物ID而不影响靶特异性扩增，最大程度分散引物对末端少数碱基 配对 氢键与末端外的碱基氢键合 力 ，而选择性抑制PD，使PCR体系内没有PD累积。辅以矿物油封闭下的引物缓释 热启动 及UDG预处理消除了PCR体系外产物气雾胶污染，使核酸扩增可靠，实时 荧光 PCR定量准确。，下面是一种引物中部序列干扰PCR技术专利的具体信息内容。
1.一种引物中部序列干扰PCR技术，其共同特征是选取一对引物中间部分序列(IntermediateDomain,ID)进行各种技术干扰来破坏引物间聚合而选择性抑制非特异性扩增的改良PCR技术,所述PCR技术改良是指一对中间部分ID不互补或同序的引物选取及ID干扰选择性抑制其PCR体系内引物二聚体PD非特异性扩增反应和隔绝PCR系统外产物气雾胶交叉污染的创新改进,所述引物中部序列干扰包括采用ID不互补或同序的天然序列引物,与引物ID互补的反义修饰碱基寡核苷酸,分子内加上与引物ID互补的反义修饰碱基嵌合引物等各种技术途径,仅引物中部序列干扰不影响引物与靶基因特异性结合及特异性扩增效率,而选择性地抑制优化引物PCR引物二聚体PD非特异性扩增，改善PCR应用上的非特异性根本局限。
2.一种引物中部序列干扰PCR技术，所述的引物中部序列特征是首先遵守一般常规引物设计所有原则基础上，5’-3’方向平行比对备选模板上下游引物序列,选择一对中部偏
3’端位置即离3’末端4-5个碱基起倒数5-9个碱基base不互补或同序的引物,引物对3’端之间还尽量避免2个或2个以上反向互补碱基,引物3’最末端1～2base避免之间任何单个反向互补碱基，其末端以碱基C或A结尾，如此一系列中部不互补/同序的引物对适用于所有引物对的基因扩增PCR方法,中部不互补/同序引物干扰能不同程度地减少PCR体系内引物二聚体PD非特异性扩增反应,与单链结合蛋白SSB联用显著增强SSB抑制PCR非特异性作用。
3.根据权利要求2所述的一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是优选一对中部相同方向比对6-8base不互补或同序的引物能选择性地干扰引物间聚合非特异性扩增,其中部同向不互补或同序碱基不够时在不互补或同序左侧/5’侧人为突变一个碱基以增加一个不配对或同序碱基,或中间差一个时突变成不配对/同序，如不互补或同序左侧不好就再选择其右侧/3’侧临近碱基突变,中部不互补或同序区引入一个RNA碱基/2-F RNA修饰碱基来增加引物间负电荷斥力而轻度提升抑制PD非特异性；还要注意引物对3’末端倒数第二、三个碱基也不能是CG/GC序列(CG夹),甚至单一引物本身3’末端倒数第二、三个碱基CG/GC序列(CG夹)自身间会增加PD非特异性。
4.一种引物中部序列干扰PCR技术，所述的中部序列干扰技术特征是与引物中部序列互补的反义修饰碱基寡核苷酸As Oligo竞争性地结合引物并干扰引物之间的结合,采用
5-11base末端封闭的化学修饰的“反义”碱基序列既不能充作PCR模板也不能作为引物,这种仅保留结合功能的反义寡核苷酸竞争性地结合引物中部序列ID而干扰引物间聚合,引物中部序列AsOligo干扰不影响引物与靶基因特异性结合及特异性扩增效率,仅选择性地抑制优化引物PCR引物二聚体PD非特异性扩增，中部序列干扰As Oligo独立应用于常规引物设计原则初步优化的引物PCR能不同程度减少体系内引物二聚体PD非特异性扩增反应；中部序列干扰As Oligo固相化还适用于引物缓释热启动PCR。
5.根据权利要求4所述的一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是优选离引物3’末端3base起的中部序列反向互补6-10base As Oligo,所述的反义寡核苷酸成份反义修饰碱基包括2’-O-Methyl(OMe)RNA、2’-O-methoxy-ethyl(MOE)RNA、2’-Amino-RNA、
2’-Fluoro-RNA、2’-O,4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁核酸)、和PNA(肽核酸)、Morpholino、N3’->N5’Phosphoramidate,反义寡核苷酸采用1-8个修饰碱基与正常碱基间隔,其3’末端设修饰碱基终止延伸或3’端羟基封闭。
6.一种引物中部序列干扰PCR技术，所述的中部序列干扰技术特征包括引物分子内中部序列ID干扰技术,采用将ID反义碱基序列连接于引物5’端前面使引物分子内3’端含特异性靶结合序列和5’端含反义碱基序列的嵌合引物,其5’端反义碱基序列能反折与引物自身中部序列ID结合抑制。选取一对引物一端或两端引物ID区5-7base序列的反义链碱基以5’-3’方向加在靶模板引物5’端前面,化学合成一增加了5-7个反义碱基与自身ID序列能配对互补的嵌合引物,引物分子内干扰独立应用于常规设计原则初步优化的引物PCR能显著减少体系内引物二聚体PD非特异性扩增反应,适合没有中部不互补或同序引物如检测点突变引物。
7.根据权利要求6所述的一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是中部序列互补的
5’端反义序列反折分子内干扰联用荧光标记引物PCR及多重荧光引物PCR,一端分子内反折引物直接标记荧光发光基团和荧光淬灭基团,如引物3’末端倒数第三至ID某个中间碱基设为标记荧光发光基团如6-FAM-dT、Cy3-dT碱基,而其反义5’端标记荧光淬灭基团dabcyl、或采用5’dG淬灭序列,另一端引物为普通引物,反之引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光淬灭基团,而在其5’端标记各种波长荧光发光基团,扩增产物使淬灭基团远离荧光基团；多对标记不同波长荧光发光基团的分子内反折引物在多波长荧光PCR仪上可以进行单反应管同时多重检测实时荧光定量PCR。
8.一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是PCR反应液之上加入矿物油或称石腊油物理隔绝封闭,并使用dUTP代替dTTP底物,同时PCR体系加入尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG，消化微量泄漏气雾胶污染；联合采用PCR一成份缓释热启动,将一成份如首选引物溶于20%w/v葡聚糖Dextran，含引物20%Dextran高比重粘液预先加入PCR管底,再依次加PCR各成份,不要混匀Vortex!以免破坏缓释分层,短瞬离心使所有反应液均沉降于管底,经PCR变性使管底的重引物热释放进入反应液启动扩增,而矿物油封闭层面上残留液因缺少完全的PCR成份仅产生无效扩增的微量气雾胶；联合技术挫施隔绝PCR体系外产物气雾胶交叉污染。
9.根据权利要求8所述的一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是矿物油封闭下UDG与dU底物联用的简易控制PCR体系外气雾胶污染方法,适用于一般非反复/重复检验的科研检测情况；在矿物油封闭和UDG-dU联用的基础上,整合采用PCR一成份缓释策略：
PCR一成份如引物溶于20%葡聚糖Dextran、PCR一成份如引物可逆结合于固相配体,热变性释放进入反应液启动扩增,杜绝了泄漏气雾胶污染,适用于权利要求1-7各种临床诊断PCR使假阳性率达到酶免疫诊断的低于3‰水平。
10.一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是一对中部序列结合固相化As Oligo的引物缓释PCR,纳米微球交联As Oligo吸附不同引物对预先加入硅片经覆胶、曝光、显影、光刻、清洗后的阵列纳升-微升级圆井反应腔内，固相缓释引物分隔于圆井内热启动才释放,不同圆井不同靶引物,微球交联As Oligo干扰引物间聚合而抑制PD，配制不含引物PCR反应液并加入样本DNA,使之均匀分布芯片PCR腔,再加矿物油于芯片表面密闭圆井以防止缓释后的引物串扰,最后硅芯片盖上带胶面的透明塑料薄片,整张硅芯片进行多重阵列实时荧光PCR。
11.一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是引物中部序列同向6-8base不互补或同序选择设计及反义寡核苷酸和5’端反义序列反折分子内干扰设计软件策略应用于计算机软件程序编写，提高引物选择设计准确性和设计效率,进一步完善引物中部序列干扰PCR技术。
12.根据权利要求1,2,4,6所述的一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是权利要求
2引物中间序列ID不互补或同序技术、权利要求4引物加入反义修饰寡核苷酸Oligo干扰技术、和权利要求6引物分子内反义Oligo干扰技术,三种技术既可以有效单独使用,又可以组合联用可以进一步增强抑制PD非特异性扩增效果。
13.根据权利要求1-12所述的一种引物中部序列干扰PCR技术，其特征是所述的引物中部序列干扰PCR技术应用作为基因扩增检测试剂盒,试剂盒成份包括：样本核酸提取试剂，底物dNTPs，聚合酶Taq及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，引物及引物设计指导程序软件。
一种引物中部序列干扰PCR技术
技术领域：
[0002] 核酸扩增的思想起源于1971年，发现遗传密码的Khorana曾提出了核酸体外扩增设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”(Kleppe,1971,J.Molec.Biol.,56:341),然而由于当时不具备寡核苷酸合成、耐热聚合酶、热循环仪的条件限制了其发展。直到1983年,美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感:于试管中模拟天然的DNA体内指数式复制过程。其基本原理:提供一种合适的条件---模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间,就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利（US Patent 4,683,202）。 [0003] 核酸扩增PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：拟扩增的模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：升温至72℃左右，DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原则，按5’-3’方向合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链,不断重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。一般PCR进行30个循环就能将待扩目的基因呈指数扩增放大数百万倍以上,超过30个循环引物二聚体非特异性扩增就极剧增加。反应最终的DNA扩增量可用Yn＝(1＋X) 计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应有时效率达不到理论值。反应初期PCR产物逐渐增加，进入一定循环后靶序列DNA片段的增加呈指数形式即对数期，随着扩增产物的累积及PCR成份的消耗，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，达到“停滞效应”平台期。
[0004] 随着1985-1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中Taq耐热DNA聚合酶的提取应用以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。PCR技术已成为生命科学领域最重要的核心基础技术,Kary Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。
[0005] 在以后的二十年里，多达数十种PCR新改进，新方法不断涌现,被发明，包括反转录PCR(RT-PCR),原位PCR,连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，标记PCR(Labeled primers，LP-PCR)，反向PCR(reverse PCR,扩增两引物外侧未知序列)，不对称PCR(asymmetric PCR)， 降落PCR(touchdown PCR)，重组PCR (recombinant PCR)，巢式PCR(nest PCR)，多重PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(Stranddisplacement amplification,SDA)，依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)，转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification system,TAS)，Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA扩增,滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA),环介导的等温扩增(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)等,尤其是各种实时荧光PCR(Real-time PCR)技术的发展实现了从定性测定到精确定量的飞跃，如荧光染料SYBR GreenⅠ实时荧光PCR和各种荧光探针Taqman（Hydrolysisprobe）,FRET Hybridition probes,andMolecular Beacons PCR，详见综述(Maisa L.Wong and Juan F.Medrano,BioTechniques39:75-85，July 2005)。核酸扩增技术不仅极大提升了基因克隆技术也提高了核酸检测灵敏度、效率，PCR应用已拓展到生物学的众多领域。PCR技术已不是单一技术方法,而是包括一系列理论、方法学及应用的新学科。详细综述于PCR书籍（黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年），PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究，及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，已成为二十一世纪生物学最核心的基础技术。
近年来，在PCR基础上为提高检测效率而发展出了许多增加热循环速度的快速微流体缩微PCR(lab-on-chip)和多重靶检测的高通量纳升PCR芯片(PCR-on-chip),详见论文SURVEY and SUMMARY，Da Xing(2007)Nucleic AcidsRes.,Vol.35,No.13,p4223-4237，截至目前全世界PCR专利或相关的设计更是多达三至四位数以上。
近年来，在PCR基础上为提高检测效率而发展出了许多增加热循环速度的快速微流体缩微PCR(lab-on-chip)和多重靶检测的高通量纳升PCR芯片(PCR-on-chip),详见论文SURVEY and SUMMARY，Da Xing(2007)Nucleic AcidsRes.,Vol.35,No.13,p4223-4237，截至目前全世界PCR专利或相关的设计更是多达三至四位数以上。
[0006] 继上所述,常规终末检测PCR只能定性分析,同样浓度靶分子扩增终末产物量变化很大，灵敏度仍不够,低于数千拷贝数标本测不了否则引物二聚体非特异性扩增导致假阳性结果,以及扩增产物汽雾胶再污染所致假阳性等难题，常规PCR加产物凝胶电泳检测方法难以适用临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量（产物标记荧光强度）与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数为Ct值（Cycle threshold）,其与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数（Ct）。扩增产物增加的信号既可通过产物DNA结合荧光染料显示,如基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR（US Patent6,569,627）；又可采用带淬灭基团的荧光探针；和荧光标记引物来检测。被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活,如1995年美国PE公司研制出了Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量PCR技术(Livak KJ,et al.,1995,Genome Res:4:357-362)，于1997年申请了水解探针(商品名:TaqMan)PCR发明专利（US Patent6,485,903），以及Epoch公司在水解荧光探针基础上增加结合效率的MGB探针(US Patent7,205,105)。被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构改变而激活,分子信标Molecularbeacon(Tyagi S,et al,1996,Nat Biotechnol 14:303-308)正是这样一种茎环结构的杂交探针,于1999年申请了Molecular beacon发明专利（US Patent 05925517）。其它双杂交(FRET)探针,蝎形(Scorpion)探针,Sunrise-Primer,荧光引物Lux Pimers等使用范围局限于一定的应用,不明显优于水解探针TaqMan方法。荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR法灵敏度可达数个拷贝,定量精确,但引物二聚体扩增结合荧光的假阳性限制了其临床应用；而水解探针TaqMan实时 荧光PCR增加了一道特异探针杂交，非特异性引物二聚体扩增不产生荧光，广泛用于临床检验,但也存在灵敏度低染料法一个数量级,定量线性关系不精确。
[0007] 不同于常规PCR检测终末反应-平台期扩增产物，一般PCR只扩增25至30个循环产物量就够用了;而实时荧光PCR需要检测低至10拷贝靶分子的近Ct40循环数，TaqMan等标记探针PCR至少需要扩增40个循环,基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR为了发挥更高灵敏度通常需要扩增45个循环。因此实时荧光PCR技术存在着更严重的引物二聚体(Primer-Dimer,PD)非特异性扩增问题，极过量的仅四种碱基排列组合的一对引物存在25%以上的同源性，也具有25%的互补性，引物对3’末端少量互补杂交后在聚合酶作用下延伸形成引物二聚体PD，在随后热循环中以二聚体为模板被游离引物大量非特异性扩增、并结合染料。在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR实验中，绝大多数优化设计的一对引物产生二聚体的本底循环阈值(Ct值)一般在30个循环附近,有些引物对本底Ct值甚至不到25个循环,位于靶分子定量检测范围Ct值15-37循环或“黄金检测窗口”之内，严重干扰低浓度(拷贝数)靶分子的定量和弱阳性误读。其实常被忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见引物二聚体发射荧光,但会竞争PCR系统成份,降低扩增效率而导致灵敏度降低,弱阳性可能漏检,定量也不准确；低浓度(拷贝数)靶分子竞争不过二聚体模板,及线性关系及重复性不佳。目前专门研究引物二聚体PD和解决PD非特异性扩增的报导很少,多数还是通过设计没有连续反向互补的优化引物并辅以热启动PCR来抑制扩增前低温时的少数碱基杂交延伸,一般PCR各成份均是一次加入并同时进入循环,所谓热启动是一种控制PCR反应的必须组份直到热变性后才起作用来启动PCR,减少扩增前低温时非特异性反应的2+
方法。采用蜡包Mg 离子热释放、聚合酶Taq修饰抑制包括端N缺失的KlenTaq(Milko B.,et al,2003,Nucleic Acids Res.Vol.31,No21:6139-6147),抗Taq酶抗体(Kellogg DE,et al,1994,Biotechniques 16:1134-1137)和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar(Lin Y，et al,1997,J.Mol Biol271:100-111),和四氧化戊烷热激活引物(Lebedev AV，et al,2008,Nucleic Acids Res.Vol.36,No20:e131)等热启动方法,但低温杂交延伸效率低,且未加某一必须组份PCR在热变性后才手动加入的绝对热启动PCR本底Ct值也仅推后1-3个循环数,多在Ct33个循环左右，低于40°C度Taq酶活性很低,低温延伸不是PD形成关键原因。与本发明相近的解决PD非特异性的途径有采用完全同序Tag引物对法Hands(Homo-Tag assisted non-dimer system,Brownie J.,et al,1997,Nucleic Acids Res.Vol.25,No16:p3235-3241)；嵌合DNA-RNA引物法(Peleg O.,et al,AppliedEnviro Micro-Bio.,2009,Vol.75,No19:6393-6398；和PCT:WO 2009/004630)；完全同序引物通过引物二聚体单链两端自身结合竞争游离引物,和多处RNA碱基嵌合引物通过含多个RNA碱基二聚体不能有效成为Taq聚合酶模板,它们不仅显著抑制PD非特异性,但也都没有选择性地干扰靶特异性扩增效率。引物对末端少数碱基配对互补使其互为模板和互为引物的PD扩增机理与引物-靶基因扩增原理没有本质上差别,只有程度上轻一些,作用基本是平行的!抑制了整个引物也就没有选择性地抑制了靶特异性扩增。
方法。采用蜡包Mg 离子热释放、聚合酶Taq修饰抑制包括端N缺失的KlenTaq(Milko B.,et al,2003,Nucleic Acids Res.Vol.31,No21:6139-6147),抗Taq酶抗体(Kellogg DE,et al,1994,Biotechniques 16:1134-1137)和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar(Lin Y，et al,1997,J.Mol Biol271:100-111),和四氧化戊烷热激活引物(Lebedev AV，et al,2008,Nucleic Acids Res.Vol.36,No20:e131)等热启动方法,但低温杂交延伸效率低,且未加某一必须组份PCR在热变性后才手动加入的绝对热启动PCR本底Ct值也仅推后1-3个循环数,多在Ct33个循环左右，低于40°C度Taq酶活性很低,低温延伸不是PD形成关键原因。与本发明相近的解决PD非特异性的途径有采用完全同序Tag引物对法Hands(Homo-Tag assisted non-dimer system,Brownie J.,et al,1997,Nucleic Acids Res.Vol.25,No16:p3235-3241)；嵌合DNA-RNA引物法(Peleg O.,et al,AppliedEnviro Micro-Bio.,2009,Vol.75,No19:6393-6398；和PCT:WO 2009/004630)；完全同序引物通过引物二聚体单链两端自身结合竞争游离引物,和多处RNA碱基嵌合引物通过含多个RNA碱基二聚体不能有效成为Taq聚合酶模板,它们不仅显著抑制PD非特异性,但也都没有选择性地干扰靶特异性扩增效率。引物对末端少数碱基配对互补使其互为模板和互为引物的PD扩增机理与引物-靶基因扩增原理没有本质上差别,只有程度上轻一些,作用基本是平行的!抑制了整个引物也就没有选择性地抑制了靶特异性扩增。
[0008] 实时荧光PCR“闭管分析”多数情况下并不完全密闭，也存在扩增产物汽雾胶再污染的难题，除螺旋盖毛细管外，大多数0.2ml PCR试管或96孔板，在热循环95℃变性时，5 6
高温高压下就会有一些气雾胶溢(挤)出管盖，一个气雾胶颗粒就含有10-10 分子拷贝,气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的引物二聚体扩增或引物探针聚合体的扩增,且每一个检测反应管/孔都会产生引物二聚体非特异性指数扩增。随着重复同 一PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从0循环开始而是从上次PCR结束循环数开始，污染物越来越多。扩增产物气雾胶再污染一般采用dUTP代替dTTP产物再结合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG,US Patent
6,090,553)选择性降解污染产物,UDG/UNG随后PCR热变性失活，但加入量少UDG不能有效降解过多气雾胶分子,量多又因热变性不完全失活而降解含dU的PCR产物，在实际工作中单独使用对极其过量的引物二聚体含dUTP扩增产物降解作用有限,并不能消除或推后SYBR Green I实时荧光PCR本底引物Ct值。
高温高压下就会有一些气雾胶溢(挤)出管盖，一个气雾胶颗粒就含有10-10 分子拷贝,气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的引物二聚体扩增或引物探针聚合体的扩增,且每一个检测反应管/孔都会产生引物二聚体非特异性指数扩增。随着重复同 一PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从0循环开始而是从上次PCR结束循环数开始，污染物越来越多。扩增产物气雾胶再污染一般采用dUTP代替dTTP产物再结合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG,US Patent
6,090,553)选择性降解污染产物,UDG/UNG随后PCR热变性失活，但加入量少UDG不能有效降解过多气雾胶分子,量多又因热变性不完全失活而降解含dU的PCR产物，在实际工作中单独使用对极其过量的引物二聚体含dUTP扩增产物降解作用有限,并不能消除或推后SYBR Green I实时荧光PCR本底引物Ct值。
[0009] 为了克服引物二聚体PD造成的PCR假阳性结果使SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR等核酸扩增技术不利于临床检测分析的局限，以及现有抑制PD技术同时没有选择性地影响靶特异性扩增效率的不足。本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”在常规引物设计原则优选的一对引物基础上,选用引物中间/中部序列(ID)不互补或同序技术、或/和引物加入ID反义修饰寡核苷酸Oligo干扰技术、或/和引物分子内ID反义Oligo干扰技术及其组合，本技术仅干扰引物中部序列而不影响靶特异性扩增效率,能最大程度地破坏引物对末端少数碱基配对所需的借力/合力，进而选择性抑制PD。进行实时荧光PCR扩增，既不干扰靶分子特异性扩增，其本底又在PCR反应45个循环内基本为一直线，没有非特异性扩增值干扰。再辅助以矿物油封闭下的一端引物缓释热启动及UDG预处理使核酸应用检测在PCR反应内没有引物二聚体累积，PCR多重封闭没有气雾胶产生或仅没有扩增的气雾胶，万一可能的微量泄露也可进一步被UDG有效酶解，多重保证不产生假阳性非特异性反应，使核酸扩增检测绝对可靠。发明内容：
[0010] 为了解决PCR非特异性主要原因引物间聚合扩增,着手引物间非特异性聚合与引物特异性结合两者差异来选择性地控制非特异性聚合，本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”选取仅争对引物中部序列的一段不互补或同序碱基、引物分子内外反义修饰序列干扰,就可以选择性地破坏引物二聚体非特异性聚合,而不影响整条引物全长与靶模板间特异性结合。
[0011] 所述的“一种引物中部序列干扰PCR技术”，其共同特征是采用引物对中部序列干扰而竞争性地破坏引物间聚合来选择性抑制PCR非特异性扩增的改良PCR技术方法,所述PCR技术方法改良是指决定PCR特异性和非特异性关键成份引物的选取及竞争性地干扰其非特异性结合的创新改进,在常规优化设计引物基础上选择一对中间部分ID不互补或同序的进一步优化引物,具有中部不互补或同序技术特征的引物对能不同程度地减少PCR非特异性引物二聚体扩增；所述中部序列干扰是采用与引物中部序列ID互补的反义修饰碱基寡核苷酸竞争性地结合,仅引物中部序列干扰不影响引物与靶基因特异性结合及特异性扩增效率,而选择性地抑制优化引物PCR引物二聚体PD非特异性扩增，改善PCR应用上的非特异性根本局限。
[0012] “一种引物中部序列干扰PCR技术”，所述的引物中部序列特征是首先遵守一般引物设计所有原则基础上，5’-3’方向平行比对备选模板上下游引物序列,选择一对中部偏3’端位置即离3’末端4-5个碱基起倒数5-9个碱基base不互补或同序的引物,引物对3’端之间还尽量避免2个或2个以上反向互补碱基,引物3’最末端1～2base避免之间任何单个反向互补碱基，其末端以碱基C或A结尾，如此一系列中部不互补/同序的引物对适用于所有引物对的基因扩增PCR方法,中部不互补/同序引物干扰能不同程度地减少PCR体系内引物二聚体(PD)非特异性扩增反应,与单链结合蛋白(SSB)联用显著增强SSB抑制PCR非特异性作用。所述的特征是优选一对中部同向6-8base不互补或同序的引物能选择性地干扰引物间聚合非特异性扩 增,其中部同向不互补或同序碱基不够时在不互补或同序左侧/5’侧人为突变一个碱基以增加一个不配对或同序碱基,或中间差一个时突变成不配对/同序，如不互补或同序左侧不好就再选择其右侧/3’侧临近碱基突变,中部不互补或同序区引入一个RNA碱基/2-F RNA修饰碱基来增加引物间负电荷斥力而轻度提升抑制PD非特异性；还要注意引物对3’末端倒数第二、三个碱基也不能是CG/GC序列(CG夹),甚至单一引物本身3’末端倒数第二、三个碱基CG序列(CG夹)自身间会增加PD非特异性。 [0013] “一种引物中部序列干扰PCR技术”，所述的中部序列干扰技术特征是与引物中部序列互补的反义修饰碱基寡核苷酸(As Oligo)竞争性地结合引物并干扰引物之间的结合,采用5-11base末端封闭的化学修饰的“反义”碱基序列既不能充作PCR模板也不能作为引物,这种仅保留结合功能的反义寡核苷酸能竞争性地结合引物中部序列(ID)干扰引物间聚合,引物中部序列As Oligo干扰不影响引物与靶基因特异性结合及特异性扩增效率,而选择性地抑制优化引物PCR引物二聚体PD非特异性扩增，中部序列干扰As Oligo独立应用于常规引物设计原则初步优化的引物PCR能不同程度减少体系内PD非特异性扩增反应,中部序列干扰AsOligo固相化还适用于引物缓释热启动PCR。所述的特征是优选离引物3’末端3base起的中部序列反向互补6-10base As Oligo,所述的反义寡核苷酸成份反义修饰碱基包括2’-O-Methyl(OMe)RNA、2’-O-methoxy-ethyl(MOE)RNA、2’-Amino-RNA、
2’-Fluoro-RNA、2’-O,4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁核酸)、和PNA(肽核酸)、Morpholino、N3’->N5’Phosphoramidate,反义寡核苷酸采用1-8个修饰碱基与正常碱基间隔,其3’末端设修饰碱基终止延伸或3’端羟基封闭。
2’-Fluoro-RNA、2’-O,4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁核酸)、和PNA(肽核酸)、Morpholino、N3’->N5’Phosphoramidate,反义寡核苷酸采用1-8个修饰碱基与正常碱基间隔,其3’末端设修饰碱基终止延伸或3’端羟基封闭。
[0014] “一种引物中部序列干扰PCR技术”，所述的中部序列干扰技术特征还包括引物分子内中部序列干扰技术,采用将ID反义碱基序列连接于引物5’端前面使引物分子内3’端含特异性靶结合序列和5’端含反义碱基序列的嵌合引物,其5’端反义碱基序列能反折与引物自身中部序列ID结合抑制。选取一对引物一端或两端引物ID区5-7base序列的反义链碱基以5’-3’方向加在靶模板引物5’端前面,化学合成一增加了5-7个反义碱基与自身ID序列能配对互补的嵌合引物,引物分子内干扰独立应用于常规设计原则初步优化的引物PCR能显著减少体系内引物二聚体PD非特异性扩增反应,适合没有中部不互补或同序引物如测点突变引物。所述的中部序列互补的5’端反义序列反折分子内干扰联用荧光标记引物PCR及多重荧光引物PCR,一端分子内反折引物直接标记荧光发光基团和荧光淬灭基团,如引物3’末端倒数第三至ID某个中间碱基设为标记荧光发光基团如6-FAM-dT、Cy3-dT碱基,而其反义5’端标记荧光淬灭基团dabcyl、或采用5’dG淬灭序列,另一端引物为普通引物,反之引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光淬灭基团,而在其5’端标记各种波长荧光发光基团,扩增产物使淬灭基团远离荧光基团；多对标记不同波长荧光发光基团的分子内反折引物在多波长荧光PCR仪上可以进行单反应管同时多重检测实时荧光定量PCR。
[0015] “一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是PCR反应液之上加入矿物油或称石腊油物理隔绝封闭,并使用dUTP代替dTTP底物,同时PCR体系加入尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG),消化微量泄漏气雾胶污染；联合采用PCR一成份缓释热启动,将一成份如首选引物溶于20%(w/v)葡聚糖(Dextran),含UGI引物20%Dextran高比重粘液预先加入PCR管底,再依次加PCR各成份,不要混匀Vortex!以免破坏缓释分层,短瞬离心使所有反应液均沉降于管底,经PCR变性使管底的重引物热释放进入反应液启动扩增,而矿物油封闭层面上残留液因缺少完全的 PCR成份仅产生无效扩增的微量气雾胶；联合技术挫施隔绝PCR体系外产物气雾胶交叉污染。所述的矿物油封闭下UDG与dU底物联用的简易控制PCR体系外气雾胶污染方法,适用于一般非反复/重复检验的科研检测情况；在矿物油封闭和UDG-dU联用的基础上,整合采用PCR一成份缓释策略：PCR一成份如引物溶于20%Dextran、PCR一成份如引物可逆结合于固相配体,热变性释放进入反应液启动扩增,杜绝了泄漏气雾胶污染,适用于引物中部序列干扰策略的各种临床诊断PCR假阳性率达到酶免疫诊断的低于3‰水平。
[0016] “一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是一对中部序列结合固相化As Oligo的引物缓释PCR,纳米微球交联As Oligo吸附不同引物对预先加入硅片经覆胶、曝光、显影、光刻、清洗后的阵列纳升-微升级圆井反应腔内，固相缓释引物分隔于圆井内热启动才释放,不同圆井不同靶引物,微球交联As Oligo干扰引物间聚合而抑制PD，配制不含引物PCR反应液并加入样本DNA,使之均匀分布芯片PCR腔,再加矿物油于芯片表面密闭圆井以防止缓释后的引物串扰,最后硅芯片盖上带胶面的透明塑料薄片,整张硅芯片进行多重阵列实时荧光PCR。
[0017] “一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是引物中部序列同向6-8base不互补或同序选择设计及反义寡核苷酸和5’端反义序列反折分子内干扰设计软件策略应用于计算机软件程序编写，提高引物选择设计准确性和设计效率,进一步完善引物中部序列干扰PCR技术。
[0018] 所述的“一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是本发明技术方案中间序列ID不互补或同序技术、技术方案引物加入反义修饰寡核苷酸Oligo干扰技术、和技术方案引物分子内反义Oligo干扰技术,三种技术既可以有效单独使用,又可以组合联用可以进一步增强抑制PD非特异性扩增效果。
[0019] 所述的“一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是所述的引物中部序列干扰PCR技术应用作为基因扩增检测试剂盒,成份包括：样本核酸提取试剂，底物dNTPs，聚合酶Taq及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，引物及引物设计指导程序软件。
[0020] 本发明为改良PCR技术就从PCR关键成份引物开始,引物靶特异性虽然取决于引物全部碱基序列,但越是离引物3’末端近的碱基越是重要,尤其是最末几个碱基，例如在常规Taq聚合酶PCR条件下,一对引物中一条3’末端最末1-2个碱基突变与靶DNA模板不同就能几乎抑制90%-999‰以上靶特异性扩增(附图1a),该特性常被用于SNP检测单核苷酸变异的ARMS技术;而在引物中部或5’端引入1-2个突变碱基常常不易/不抑制靶特异性扩增,突变碱基离引物3’末端越远对PCR影响越小;在引物5’端甚至可以耐受连续多个突变碱基序列而不影响PCR扩增效率,分子克隆常在引物5’端引入酶切位点序列。但特异性最重要的3’末端也不能独立作用,依次需要引物中部和5’端序列辅助。同理引物非特异性尤其是引物二聚体(PimerDimer,PD)非特异性扩增也是离引物3’末端越近的碱基越是重要,一对引物3’末端连续多个碱基互补就可以互为DNA模板和互为扩增引物、PCR杂交延伸、导致PD非特异性扩增,该特性常被用于长链DNA人工合成；设计/选择一对引物最根本原则就是避免引物对3’末端连续3个/3个以上碱基互补,然而DNA仅由四种碱基组成,引物3’最末端与其它引物1-2个碱基互补难以排除、避免,一对引物3’末端
1-2个碱基互补在PCR热循环条件下结合力太小,还须借助引物3’末端外的无规则多碱基配对的氢键合力才能杂交、引物二聚体(PD)非特异性扩增;而引物5’端连续多个碱基配对因距离扩增重要的3’末端太远、对非特异性扩增帮助非常小;因此一对引物3’末端1-2个互补碱基结合力借助引物离3’末端较近的中部/中间序列多碱基配对的氢键合力为主,借助较远的引物5’端多碱基配对的氢键合力为辅。因此一对引物5’端 对特异性、非特异性扩增均起辅助作用;一对引物3’末端对特异性扩增起最主要作用,而一对引物设计时重点排除了3’末端PD非特异性主要因素，引物离3’末端临近的中部多碱基互补序列对非特异性就成为最重要的决定性力量。所以定义引物中部序列(Intermediate Domian,ID)为离3’最末端4-5个碱基距离远的中部/中间6-8个碱基的一段引物序列,“ID”决定着引物非特异性，本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”选择特异的引物中部序列天然干扰或引物分子内/外人工干扰技术手段来最大程度地抑制引物二聚体(PD)非特异性扩增而基本不影响PCR特异性效率。
1-2个碱基互补在PCR热循环条件下结合力太小,还须借助引物3’末端外的无规则多碱基配对的氢键合力才能杂交、引物二聚体(PD)非特异性扩增;而引物5’端连续多个碱基配对因距离扩增重要的3’末端太远、对非特异性扩增帮助非常小;因此一对引物3’末端1-2个互补碱基结合力借助引物离3’末端较近的中部/中间序列多碱基配对的氢键合力为主,借助较远的引物5’端多碱基配对的氢键合力为辅。因此一对引物5’端 对特异性、非特异性扩增均起辅助作用;一对引物3’末端对特异性扩增起最主要作用,而一对引物设计时重点排除了3’末端PD非特异性主要因素，引物离3’末端临近的中部多碱基互补序列对非特异性就成为最重要的决定性力量。所以定义引物中部序列(Intermediate Domian,ID)为离3’最末端4-5个碱基距离远的中部/中间6-8个碱基的一段引物序列,“ID”决定着引物非特异性，本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”选择特异的引物中部序列天然干扰或引物分子内/外人工干扰技术手段来最大程度地抑制引物二聚体(PD)非特异性扩增而基本不影响PCR特异性效率。
[0021] 本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”说明书内容依次从荧光染料SYBR Green I实时荧光定量PCR技术和PCR非特异性的复杂性、主要原因、可能机理、和控制措施来阐述;采用SYBR Green I实时荧光定量PCR特别是不加DNA模板的本底SYBR Green I实时荧光PCR来验证引物非特异性程度,和内容书写以SYBR Green I实时荧光定量PCR技术来描述,主要考虑是SYBR Green I实时荧光PCR不仅操作简便、灵敏、精准,更易直观地反应引物非特异性扩增情况,且书写直接明了,并不代表本发明仅限于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术,本发明可应用于含有/具有引物的各种PCR技术,包括各种DNA/RNA的扩增技术、各种热循环/恒温解链PCR技术、各种荧光染料/荧光探针PCR技术、各种定量/变异检测PCR技术、各种多重/阵列PCR技术、等等。同时为了对说明书内容理解的准确性,将本发明说明书系列技术特征一并作出准确定义,关键词“引物”为一段靶特异性(保守)序列18-25个核苷酸碱基长度的DNA寡核苷酸单链,包括上游引物(Forward,F)采用模板上游5’端一段序列有意义链、下游引物(Reward,R)采用模板下游3’端序列反意义链,有时亦称5’端/3’端,一边/或一端引物；关键词“引物中部/中间序列(Intermediate Domian,ID)”为离3’最末端4-5个碱基距离远的中部/中间6-8个碱基的一段引物序列,“ID”决定着引物非特异性；关键词“模板”是指PCR扩增目的基因片段,有时亦将非特异性扩增DNA片段或短寡核苷酸片段如另一引物称为扩增模板；“碱基反向互补”是指模板5’-3’方向时引物以3’-5’方向与模板碱基G︰C或A︰T配对结合,类似天然DNA双链5’-3’反方向杂交；“平行互补”是相对于“反向互补”而言一种“同向互补”状态,模板5’-3’方向时引物也以5’-3’方向与模板碱基G︰C或A︰T配对结合,或部份碱基配对形成无规氢键；“同源/同序”都指两来源或两段基因片段高度相似,同源指来基因片段自于同一种属来源,同序就指一段连续碱基排列顺序完全相同；“序列不互补”指两来源或两段基因片段之间一段连续碱基排列顺序完全不同,且嘌呤配对嘌呤、嘧啶配对嘧啶,相互间无法形成互补氢键；“优化引物”是指在常规设计引物初步优化基础上选取一对中间部份连续不互补/或同序的进一步优化引物；“引物二聚体(Primer-Dimer,PD)”是过量引物3’末端以另一过量引物序列为模板，一对引物通过引物3’末端数个碱基/或PCR部份延伸数个碱基之间形成连续反向互补碱基氢键结合而互为模板和互为引物,在PCR聚合酶催化作用下3’末端延伸而形成二条引物聚合体双链,并以其为模板,被随后游离过量引物指数扩增产生引物二聚体(PD)非特异性；“空白PCR及本底Ct值”是指除不加目的基因外所有扩增成份完全不缺的SYBR Green I实时荧光PCR来验证体系非特异性情况及作为阴性本底对照,其扩增曲线进入对数期时的循环数为本底Ct值,没有扩增的本底直线称为无Ct值；“反义寡核苷酸”指由化学修饰碱基组成的“反义”寡核苷酸序列既不能充作扩增模板也不能作为扩增引物,这种仅保留结合功能“死的”反义寡核苷酸能竞争性地结合DNA如引物而选择性地竞争抑制DNA功能如引物非特异性扩增。
[0022] PCR以指数形式扩增靶基因,也就是说每经过一次PCR热循环,靶分子就扩增一倍的含 量。荧光染料SYBR Green I实时荧光定量PCR在普通PCR基础上引入DNA荧光染料SYBRGreen I并实时监测记录PCR反应的荧光值,SYBR Green I是一种能结合于DNA双螺旋小沟中的荧光染料,其单独游离时本底荧光值很低,结合DNA双链后荧光读值增加数百倍以上,可以同步实时反应PCR扩增的DNA含量。当PCR扩增产物DNA达到某一固定产量(对数增长初期拐点)即基线荧光值标准差10倍的荧光阈值时，如果扩增前初始模板靶分子数量越多,扩增产物DNA达到一固定阈值时所需要的PCR热循环数(threshold cycle,Ct)就越少；相反初始模板越少,产物DNA达到这一固定阈值时所需要的循环数(Ct值)就越多,理论上PCR扩增效率100%时,每多一个循环数(Ct值),初始模板数(Copy拷贝数)就少一倍,或每增加3.3个循环数(Ct值),相应初始模板数(Copy数)就少10倍,成反对数关系。利用已知初始模板Copy拷贝数的标准品可作出标准曲线,一般SYBR Green I实时荧光PCR的Ct值分别为16,19.3,22.6,26,29.5,33,和37循环时,每PCR反7 6 5 4 3 2 1
应Copy数分别约为10,10,10,10,10,10,和10Copy拷贝左右范围,实际上SYBR Green I实时荧光PCR扩增效率非常接近100%。因此,只要获得待测样品的Ct值,即可从标准品的标准曲线上查得并计算出该样品的初始模板Copy拷贝数。
应Copy数分别约为10,10,10,10,10,10,和10Copy拷贝左右范围,实际上SYBR Green I实时荧光PCR扩增效率非常接近100%。因此,只要获得待测样品的Ct值,即可从标准品的标准曲线上查得并计算出该样品的初始模板Copy拷贝数。
[0023] 由于指数式扩增的PCR技术极其灵敏,在选择性扩增特异靶分子同时,PCR系统亦带来极其严重的靶分子外非特异性扩增的困扰。不加DNA模板的空白SYBR Green I实时荧光PCR,其本底荧光值理论上必须永远是一条基线,不应该出现对数增长的荧光Ct值。然而本发明检验了数百对经设计优化的引物扩增实验,不加模板的空白SYBR Green I荧光PCR,大多数引物对本底荧光Ct值均为30循环左右。对于非荧光定量的普通PCR而言,扩增30个循环的产物已经足够用了,刚好避开了大多数非特异性扩增。但是,一般SYBR Green I实时荧光PCR定量检测范围需要到40个循环,最好再增加几个循环以检验有无非特异性扩增的假阳性反应,而大多数引物对本底荧光Ct值30循环非特异性扩增类似等于阳性模板数千至一万拷贝/次反应,不仅位于实时荧光定量PCR“黄金”检测范围,非特异性假阳性反应极其严重。TaqMan探针实时荧光定量PCR由于增加了一道特异探针杂交检测,探针一般不与引物二聚体PD链杂交,其非特异性本底荧光Ct值低至37-39循环左右,减低了假阳性反应至接近可承受范围,但同时失去了一些精密性,灵敏度也低一个数量级。
[0024] PCR非特异性扩增情况异常复杂,常常是解决一种污染,其它不明原因非特异性依然存在干扰,使得PCR发明了二十多年且已授权三千多PCR专利期间,生物界无数努力仍未找到PCR污染的关键和解决PCR非特异性根本有效方法。仔细分析其污染基本来源一是PCR系统外的阳性模板交叉污染,和主要的同样PCR产物气雾胶再污染;二是PCR系统内的过量引物与其3’末端互补的任何DNA链杂交、扩增,主要是一条引物以另一条引物序列为模板的相互非特异性扩增。一.首先考虑非特异性扩增可能来源于PCR系统外的阳性模板交叉污染,包括实验室阳性样本DNA和同样PCR产物气雾胶的交叉污染。阳性样本DNA含量低而分子较大,在严格的临床实验室条件下相比较气雾胶污染很有限，而实时荧光PCR“闭管分析”多数情况下并不完全密闭，大多忽视了扩增产物汽雾胶再污染的问题，除螺旋盖毛细管外，大多数0.2ml PCR试管或96孔板，在热循环95℃变性时，反复的高温5
高压下就会有一些气雾胶溢(挤)出管盖，一个气雾胶颗粒就含有5×10 个分子拷贝,气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的小分子引物二聚体扩增或引物-探针聚合体的扩增，且每一个检测反应管/孔都会产生引物二聚体非特异性指数扩增。随着重复同一PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从0循环开始而是从上次PCR结束循 环数开始，污染物滚雪球样地越积越多。
二.PCR系统内过量引物3’末端与靶无关DNA模版的非特异性杂交、扩增，引物设计除考虑靶基因外，样本中所有核酸DNA可能交叉杂交的大段连续碱基序列均必须排除在引物选项之外，这样即使存在个别区少量连续碱基杂交也仅导致线性增加长单链产物，非特异性扩增不聚焦；不容易产生一对引物恰好都非特异性杂交于一段无关DNA的指数式扩增。还因无关DNA模板种类分散和浓度极低，过量的引物与低浓度随机无关序列DNA要进行比较多的循环才有可能产生足量的非特异性扩增；系统内过量引物3’末端主要还是以另一条过量的引物序列为模板，一对引物通过引物3’末端数个碱基连续反向互补的核苷酸序列间互补结合而互为模板和互为引物,在PCR聚合酶催化作用下3’末端延伸而形成一对引物3’端对3’端的二条引物聚合体双链,并以其为模板,被随后高浓度过量引物指数扩增产生典型的引物二聚体(Primer-Dimer,PD)非特异性扩增。但是一条过量引物3’末端与另一条引物3’端外的序列反向互补或与任何配对的一段DNA互补在PCR反应中部份延伸,延长了的引物对在随后热循环也会进一步加重引物二聚体PD非特异性扩增。由此可见引物二聚体(Pimer Dimer,PD)非特异性扩增是PCR非特异性污染源最根本和最主要的矛盾,解决了引物二聚体(PD)问题也就基本解决了PCR污染源。
高压下就会有一些气雾胶溢(挤)出管盖，一个气雾胶颗粒就含有5×10 个分子拷贝,气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的小分子引物二聚体扩增或引物-探针聚合体的扩增，且每一个检测反应管/孔都会产生引物二聚体非特异性指数扩增。随着重复同一PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从0循环开始而是从上次PCR结束循 环数开始，污染物滚雪球样地越积越多。
二.PCR系统内过量引物3’末端与靶无关DNA模版的非特异性杂交、扩增，引物设计除考虑靶基因外，样本中所有核酸DNA可能交叉杂交的大段连续碱基序列均必须排除在引物选项之外，这样即使存在个别区少量连续碱基杂交也仅导致线性增加长单链产物，非特异性扩增不聚焦；不容易产生一对引物恰好都非特异性杂交于一段无关DNA的指数式扩增。还因无关DNA模板种类分散和浓度极低，过量的引物与低浓度随机无关序列DNA要进行比较多的循环才有可能产生足量的非特异性扩增；系统内过量引物3’末端主要还是以另一条过量的引物序列为模板，一对引物通过引物3’末端数个碱基连续反向互补的核苷酸序列间互补结合而互为模板和互为引物,在PCR聚合酶催化作用下3’末端延伸而形成一对引物3’端对3’端的二条引物聚合体双链,并以其为模板,被随后高浓度过量引物指数扩增产生典型的引物二聚体(Primer-Dimer,PD)非特异性扩增。但是一条过量引物3’末端与另一条引物3’端外的序列反向互补或与任何配对的一段DNA互补在PCR反应中部份延伸,延长了的引物对在随后热循环也会进一步加重引物二聚体PD非特异性扩增。由此可见引物二聚体(Pimer Dimer,PD)非特异性扩增是PCR非特异性污染源最根本和最主要的矛盾,解决了引物二聚体(PD)问题也就基本解决了PCR污染源。
[0025] 一对扩增引物往往使用5μM/L或5pM/μl浓度(反应终浓度0.1μM/L或0.1pM/17 11 12
μl),折算成分子数为5×6.02×10 /L或5×6.02×10 /μl,其3×10 数目远远过量于模板浓度,甚至高出最后终末扩增产物分子数目多倍以上。一对引物每条浓度必须
3-5μM/L或3-5pM/μl才能有效的特异性扩增靶模版，仅四种碱基排列组合的一对引物存在25%以上的天然同源性，也具有25%的互补性，如此极过量的一对引物3’末端彼此间有互补即相互杂交延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体PD形成一般是借助其3’末端多个互补碱基反向配对,互为模版、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连续反向互补碱基可通过常规引物设计方法规避。但碱基仅四种组成排列,引物3’末端与非特异性模板有1-2个互补序列不可避免，同时DNA单链有一定柔性弯曲度,一对引物3’末端少数碱基互补就可借助其互补区外的多个断续配对碱基的合力结合、延伸一些序列,延伸了的引物对之间易多个碱基互补杂交、延伸产生二聚体,在随后热循环中以二聚体为模板被游离引物大量非特异性地扩增、并结合染料，在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR本底对照实验中，引物二聚体非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长期(附图4),非特异性扩增开始严重起来,对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大多PCR可以结束了，如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对于大多数30个热循环以内的PCR影响不太大。绝大多数一对引物产生二聚体的本底循环阈值(Ct值)一般在30-31个循环附近,实时荧光PCR第30-38个热循环仍位于10000-10拷贝靶分子检测范围或黄金检测窗口期，因此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确定性。引物形成二聚体理论上是低于引物间杂交Tm值温度时耐热聚合酶部分催化作用,但是经优化设计引物的绝对热启动PCR本底Ct值也仅推后1-3个循环数,多在Ct33个循环左右,绝对热启动是指缺少有效成份PCR在热变性后才加入启动；在引物长度及Tm值恒定情况下,提高PCR退火温度急剧减低扩增效率包括PD扩增，降低退火温度缓慢减低特异扩增效率和增加PD扩增,但退火低于40℃时也急剧减低扩增效率包括PD扩增。因此PCR热启动仅能破坏一对引物3’末端个别1-2个碱基低温杂交,引物二聚体大部分成因还应该是源于热循环引物退火温度54℃时末端少数互补碱基再借助3’末端外的引物间多个不连续配对互补碱基的合力结合、而稳定退火延伸产生二聚体;
也可能存在 引物退火温度时,加速其3’末端分子热运动碰撞、瞬间结合Taq酶催化每次延伸一两个无规碱基。理论上不找到PD形成原因还是难以从根本上解决PD问题。 [0026] 核酸扩增系统的引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液buffer和Mg2+离子成份均是长期实验优化结果,允许变化的范围非常窄,简单的浓度改变对引物二聚体非特异性扩增和靶特异性扩增的效果基本均是平行的作用,以及本发明试验了数百种化学/分子试剂添加PCR近千次影响实验,如有影响基本也都是平行的作用效果,抑制非特异性同时也降低了特异性，如使用降低一半浓度的常规引物能显著降低二聚体的形成量，但也同时平行急剧降低特异性靶模板扩增数量，使正常PCR不能进行。改变聚合酶及相应的缓冲液buffer
2+ +
和Mg 、K 离子效果基本也是同样结果。但对于扩增100-200bp短模板常规实时荧光PCR尤其TaqMan探针法而言,使用降低一半常规浓度dNTP底物可提高部分扩增效率。核酸扩增技术常常采用多种PCR增强试剂,如甜菜碱(Betaine),二甲基亚砜(DMSO),甲/乙酰胺和二甲基甲酰胺(DMF)等增加扩增效率、平行推前约1-2个Ct值,更主要还是有效增进模板二级结构解链而增加扩增效率,但也都平行增加引物二聚体本底Ct值。寻找解决PCR引物二聚体非特异性扩增关键性措施还得从PCR核心成份引物的作用机理去找,以及从引物的靶特异配对与碱基互补非特异性杂交的差异化规律去探索。
μl),折算成分子数为5×6.02×10 /L或5×6.02×10 /μl,其3×10 数目远远过量于模板浓度,甚至高出最后终末扩增产物分子数目多倍以上。一对引物每条浓度必须
3-5μM/L或3-5pM/μl才能有效的特异性扩增靶模版，仅四种碱基排列组合的一对引物存在25%以上的天然同源性，也具有25%的互补性，如此极过量的一对引物3’末端彼此间有互补即相互杂交延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体PD形成一般是借助其3’末端多个互补碱基反向配对,互为模版、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连续反向互补碱基可通过常规引物设计方法规避。但碱基仅四种组成排列,引物3’末端与非特异性模板有1-2个互补序列不可避免，同时DNA单链有一定柔性弯曲度,一对引物3’末端少数碱基互补就可借助其互补区外的多个断续配对碱基的合力结合、延伸一些序列,延伸了的引物对之间易多个碱基互补杂交、延伸产生二聚体,在随后热循环中以二聚体为模板被游离引物大量非特异性地扩增、并结合染料，在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR本底对照实验中，引物二聚体非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长期(附图4),非特异性扩增开始严重起来,对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大多PCR可以结束了，如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对于大多数30个热循环以内的PCR影响不太大。绝大多数一对引物产生二聚体的本底循环阈值(Ct值)一般在30-31个循环附近,实时荧光PCR第30-38个热循环仍位于10000-10拷贝靶分子检测范围或黄金检测窗口期，因此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确定性。引物形成二聚体理论上是低于引物间杂交Tm值温度时耐热聚合酶部分催化作用,但是经优化设计引物的绝对热启动PCR本底Ct值也仅推后1-3个循环数,多在Ct33个循环左右,绝对热启动是指缺少有效成份PCR在热变性后才加入启动；在引物长度及Tm值恒定情况下,提高PCR退火温度急剧减低扩增效率包括PD扩增，降低退火温度缓慢减低特异扩增效率和增加PD扩增,但退火低于40℃时也急剧减低扩增效率包括PD扩增。因此PCR热启动仅能破坏一对引物3’末端个别1-2个碱基低温杂交,引物二聚体大部分成因还应该是源于热循环引物退火温度54℃时末端少数互补碱基再借助3’末端外的引物间多个不连续配对互补碱基的合力结合、而稳定退火延伸产生二聚体;
也可能存在 引物退火温度时,加速其3’末端分子热运动碰撞、瞬间结合Taq酶催化每次延伸一两个无规碱基。理论上不找到PD形成原因还是难以从根本上解决PD问题。 [0026] 核酸扩增系统的引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液buffer和Mg2+离子成份均是长期实验优化结果,允许变化的范围非常窄,简单的浓度改变对引物二聚体非特异性扩增和靶特异性扩增的效果基本均是平行的作用,以及本发明试验了数百种化学/分子试剂添加PCR近千次影响实验,如有影响基本也都是平行的作用效果,抑制非特异性同时也降低了特异性，如使用降低一半浓度的常规引物能显著降低二聚体的形成量，但也同时平行急剧降低特异性靶模板扩增数量，使正常PCR不能进行。改变聚合酶及相应的缓冲液buffer
2+ +
和Mg 、K 离子效果基本也是同样结果。但对于扩增100-200bp短模板常规实时荧光PCR尤其TaqMan探针法而言,使用降低一半常规浓度dNTP底物可提高部分扩增效率。核酸扩增技术常常采用多种PCR增强试剂,如甜菜碱(Betaine),二甲基亚砜(DMSO),甲/乙酰胺和二甲基甲酰胺(DMF)等增加扩增效率、平行推前约1-2个Ct值,更主要还是有效增进模板二级结构解链而增加扩增效率,但也都平行增加引物二聚体本底Ct值。寻找解决PCR引物二聚体非特异性扩增关键性措施还得从PCR核心成份引物的作用机理去找,以及从引物的靶特异配对与碱基互补非特异性杂交的差异化规律去探索。
[0027] 为了探寻PCR引物二聚体非特异性扩增可能的机理,进行各种不加DNA模板的本底SYBRGreen I实时荧光PCR来验证所有引物非特异性作用情况,找出共同规律。一段20-30base碱基左右长的天然基因序列与任何一段20-30base左右的天然序列组成引物对,在不加模板的本底SYBR Green I实时荧光PCR系统中各种非特异性扩增Ct值分布从6-7个循环至40-45个循环的广泛范围,甚至比阳性DNA定量模板检测范围更宽泛,只有经目前引物设计原则优化的引物非特异性扩增本底Ct值才在30个循环左右。例如一对引物A和B,其中一边引物A3’最末端3-5base与另一边引物B中间部份偏3’端连续反向互补,而同时引物B的3’最末端3-5base也与A的中间偏3’端连续反向互补,扩增曲线几乎从PCR一开始不久就立即爬升进入对数扩增期,PD非特异性扩增最严重,本底Ct值仅几个循环数；如一对引物彼此3’最末端互有4-6base连续反向互补,PD非特异性扩增也非常严重,本底Ct值达6-15个循环数；令人惊奇的是一对引物AB,仅一引物A3’最末端
4-6base与另一引物B中间序列连续反向互补,反之B3’最末端与A中间没有连续互补,其PD非特异性扩增Ct值为30-无Ct循环数(附图1d)；如果一对引物AB,仅A3’最末端与B5’端序列7base以上连续反向互补的本底Ct值为35-无Ct循环数(附图1e),这种靠近5’端的连续反向互补会借助连续互补区外其它反向互补合力使引物形成稳定的部份双链,PCR反应荧光值基线常常增高；因此引物二聚体PD扩增似乎必须引物对3’末端相互都要有配对互补,仅一边引物3’末端连续反向互补不是PD扩增的主要原因。如果一段
4-6base连续反向互补均位于一对引物中间部位,其本底Ct值为32-35个循环数(附图
1b),连续反向互补不促进反而轻度抑制PD非特异性扩增；如果一段6-12base连续反向互补均位于一对引物5’端部位,其本底Ct值为30个左右循环数(附图1c),PCR基线也不增高,完全不影响PD非特异性扩增,由此初步可以排除一对引物无论5’端还是中部反向连续互补明显不是导致引物二聚体非特异性的原因。当然这些典型的大段碱基连续反向互补序列不会成为引物设计选项,只是为探寻引物二聚体可能机理提供线索,如序列大段连续反向互补不可能造成PD而少数碱基反向互补就更加不能。根据目前引物设计原则和引物设计软件 选择的大多数没有3个或3个以上连续碱基互补的优选引物对一般PD非特异性扩增Ct值仍为30个循环数,位于阳性DNA定量模板检测范围内,严重干扰低浓度靶分子定量测定,和造成弱假阳性反应。还有一对近似100%相同序列引物即等于单一引物加双倍量空白SYBR Green I实时荧光PCR,绝大多数单一引物加双倍量的本底荧光值在100次热循环内都是一条基线,没有出现对数增长的荧光Ct值，同序必须5’-3’平行比对且同序必须大于70%才明显抑制PD非特异性扩增；即使同向同序引物仍会存在反向互补,而一对完全同序但5’3’方向相反的引物,其本底Ct值又为30个左右循环数,等同于任意配对引物；这些就为我们提出了问题思路！
4-6base与另一引物B中间序列连续反向互补,反之B3’最末端与A中间没有连续互补,其PD非特异性扩增Ct值为30-无Ct循环数(附图1d)；如果一对引物AB,仅A3’最末端与B5’端序列7base以上连续反向互补的本底Ct值为35-无Ct循环数(附图1e),这种靠近5’端的连续反向互补会借助连续互补区外其它反向互补合力使引物形成稳定的部份双链,PCR反应荧光值基线常常增高；因此引物二聚体PD扩增似乎必须引物对3’末端相互都要有配对互补,仅一边引物3’末端连续反向互补不是PD扩增的主要原因。如果一段
4-6base连续反向互补均位于一对引物中间部位,其本底Ct值为32-35个循环数(附图
1b),连续反向互补不促进反而轻度抑制PD非特异性扩增；如果一段6-12base连续反向互补均位于一对引物5’端部位,其本底Ct值为30个左右循环数(附图1c),PCR基线也不增高,完全不影响PD非特异性扩增,由此初步可以排除一对引物无论5’端还是中部反向连续互补明显不是导致引物二聚体非特异性的原因。当然这些典型的大段碱基连续反向互补序列不会成为引物设计选项,只是为探寻引物二聚体可能机理提供线索,如序列大段连续反向互补不可能造成PD而少数碱基反向互补就更加不能。根据目前引物设计原则和引物设计软件 选择的大多数没有3个或3个以上连续碱基互补的优选引物对一般PD非特异性扩增Ct值仍为30个循环数,位于阳性DNA定量模板检测范围内,严重干扰低浓度靶分子定量测定,和造成弱假阳性反应。还有一对近似100%相同序列引物即等于单一引物加双倍量空白SYBR Green I实时荧光PCR,绝大多数单一引物加双倍量的本底荧光值在100次热循环内都是一条基线,没有出现对数增长的荧光Ct值，同序必须5’-3’平行比对且同序必须大于70%才明显抑制PD非特异性扩增；即使同向同序引物仍会存在反向互补,而一对完全同序但5’3’方向相反的引物,其本底Ct值又为30个左右循环数,等同于任意配对引物；这些就为我们提出了问题思路！
[0028] 在Taq等非校正功能聚合酶催化下,核酸合成须从正确配对的引物3’端开始延伸,引物3’端外的碱基配对是用来帮助引物在相对应的引物Tm值温度下稳定退火反应。所以，首先有必要将引物分成为3’端4-5base主要(Prime)PD区,中部偏3’端6-8base的同序(Identical)ID区,和5’端5-14base辅助(Assistant)AD区共三个功能区,离引物3’端距离越远的配对碱基功能区对核酸合成重要程度逐步降低，且其对靶特异性扩增和PD非特异性扩增作用是同等平行的。一对引物在正常PCR热启动、热循环条件下,需要它们3’端连续多个碱基反向互补才能在PCR引物Tm退火温度下有效配对、稳定结合,进一步PD非特异性扩增。目前的引物设计原则和设计软件基本排除了引物对间连续多个碱基反向互补的可能,尤其设计特别聚焦于引物3’端尽最大可能优化3’末端，但不可能优化整个引物的所有全长序列。引物3’末端启始PD非特异性扩增仍需要残留的末端1-2个base碱基正确配对,但力度已大大减小,不能成为引物PD非特异性扩增的独立/主要力量,须借助邻近的引物中部序列(ID)配对合力帮助，引物中部序列(ID)对PD非特异性扩增就转变成为主要支配因素。所以3’端优化的引物中部序列(ID)对引物-靶特异性配对和引物间非特异性杂交的竞争过程中就悄悄出现了差异化,引物3’末端仍对靶特异性作用最重要,而对3’末端残留1-2个base非特异配对碱基的优化引物对PD非特异性扩增作用减弱,情况就根本起了变化,引物中部序列(ID)成为了优化引物对PD非特异性扩增的决定性主要力量，降低引物中部序列(ID)的碱基结合力/或干扰引物中部序列(ID)的碱基结合对靶特异性影响小而对PD非特异性作用大,在不明显影响靶特异性扩增的同时极大地抑制PD非特异性扩增。
[0029] 当然解决PD非特异性扩增问题最好还是尽可能回到PD形成机理上来,但PD形成机理异常复杂,可能系多种作用机制并存。根椐多种引物二聚体PD产物测序分析,多数PD是一对引物3’末端间插入1-5个base,部份是缺失1-3个base,很少是插入一段长序列和未见缺失一段序列，缺失或插入碱基只是部份为连续引物序列,无规律。常规设计引物时排除了3个/3个base以上连续反向互补,一对仅四种碱基排列的引物间1-2个base互补就不可避免,而引物3’末端少数1-2个base互补在PCR退火条件下必须借力才能稳定配对结合。聚合酶催化DNA合成方向是引物与模板单链反向结合,引物3’末端沿5’-3’方向延伸合成新链,引物二聚体PD非特异性扩增亦遵循同样DNA合成原理/原则。
由此推论出PD非特异性扩增的几种可能机理:(1)首先一对引物中一引物3’最末端从另一引物3’端外的序列中找出尽可能多的几个反向精确G-C和A-T配对序列(示意见附图
2c,d),于PCR退火温度不稳定配对,需再借助临近3’端的多处非G-C和A-T配对的“不规则”碱基配对或错配氢键形成合力而稳定结合,Taq聚合酶催化延伸,一对引物3’末端均延伸少数几个碱基,在随后热循环中,增加了3’末端间能配对碱基数量/可能，延伸了的引物对互为模板和互为引物进行PD非特异性指数扩增；如果一对引物 中仅一引物延伸较长一段序列,延伸了的产物与模板结合力增强,在随后PCR循环中重新重复结合,部分延伸以线性扩增,阻碍其延伸了的3’末端与另一引物3’末端配对互补及PD非特异性指数扩增。(2)一对引物,一边/一端F引物3’最末端1-2个base与另一边/端R引物近
3’端序列反向精确配对,反之同样情况,两3’末端精确配对间距离间隔小于3个碱基时容易形成合力(见附图2b),类似于引物对3’末端连续多个碱基反向互补的PD非特异性指数扩增。(3)一对引物F和R,一边F3’最末端2个base与另一边R中间序列偏3’端反向精确配对,R的残余3’端序列太短而不足以提供“不规则”碱基配对互补合力,或者(2)式两3’末端精确配对间距离过大又不易形成合力(见附图2c)，偶尔延伸的F3’末端太长,与模板强力结合也竞争性地抑制了引物3’末端间配对互补及PD非特异性指数扩增。
(4)一对引物F和R,一边F3’最末端2个base与另一边R近5’端序列反向精确配对,R的3’端其余部份还可以找到与F3’末端以外的很多“不规则”反向配对形成合力；配合部分延伸3’末端的F与模板强力结合同样竞争性地排斥了引物3’末端间配对互补及PD非特异性指数扩增(见附图2d)。(5)一对引物F和R,一条F3’最末端2个base与另一条R最末端2个base反向配对互补,其3’末端外的“悬空”单链部份如要形成反向互补双链就失去了结合着力点,只能两引物链近3’末端处均扭曲转向,相邻碱基间转向使3’端外的引物链反折后5’-3’平行配对的合力这种可能的模式。核酸DNA合成有方向性,但碱基氢键结合是没有选择方向性的,如PNA肽核酸,以中性酰胺键为骨架的一种DNA类似物,以(2-氨乙基)甘氨酸结构单元为骨架,碱基部份通过亚甲基羰基连接于主骨架上,碱基与骨架间隔3个键,相邻碱基间隔6个键,其结构上与天然核酸具有相似性,使PNA对核酸分子具有独特的序列识别结合功能，PNA两种方向均能与核酸杂交,和PNA能抵抗各种酶的作用等特性。同时,PNA中性酰胺键骨架不带负电荷,与核酸杂交时亲和力每碱基Tm值要高1-2℃,也就是DNA每个磷酸基团抵消碱基结合力1-2℃,扣除一磷酸负电荷作用每对G︰C净Tm值有5-6℃和A︰T净Tm值有3-4℃,推算一对氢键结合力略大于一对磷酸基团斥力,两脱氧核酸链如存在一段连续碱基氢键甚至错配单个氢键就能克服其磷酸斥力而结合。一对引物或一对部分延伸了的引物3’最末端1-2个base相互反向互补配对后,两引物链近3’末端处均扭曲转向,序列中间的碱基每个可转30°-36°度,DNA单链最末端碱基自由度更大,使3’端外的引物链经数对碱基扭曲反折后沿5’-3’平行配对,众多的Watson G-C和A-T配对+Wobble G︰T和C︰A配对+其它G︰G/C︰T/T︰T/A︰
A/G︰A等错配氢键的合力促使引物3’最末端1-2个base反向互补碱基稳定退火(见附图2a)。一对近似100%相同序列引物即等于单一引物加双倍量空白SYBR Green I实时荧光PCR,绝大多数单一引物加双倍量的本底荧光值在100次PCR热循环内都是一条基线,没有出现对数增长的荧光Ct值,引物对5’-3’平行因同序碱基互斥而失去了众多配对的合力,和等量的一段10base以上与ID平行配对的反义寡核苷酸能有效抑制PD,两者均明显支持这一PD非特异性扩增机理。聚合酶Taq和荧光染料SYBR Green I也进一步提高少数碱基配对结合力/或杂交Tm值，总之不管是何种PD机理,引物中部序列ID干扰都能够分散、破坏各种可能PD机理的近3’末端的碱基配对合力。
由此推论出PD非特异性扩增的几种可能机理:(1)首先一对引物中一引物3’最末端从另一引物3’端外的序列中找出尽可能多的几个反向精确G-C和A-T配对序列(示意见附图
2c,d),于PCR退火温度不稳定配对,需再借助临近3’端的多处非G-C和A-T配对的“不规则”碱基配对或错配氢键形成合力而稳定结合,Taq聚合酶催化延伸,一对引物3’末端均延伸少数几个碱基,在随后热循环中,增加了3’末端间能配对碱基数量/可能，延伸了的引物对互为模板和互为引物进行PD非特异性指数扩增；如果一对引物 中仅一引物延伸较长一段序列,延伸了的产物与模板结合力增强,在随后PCR循环中重新重复结合,部分延伸以线性扩增,阻碍其延伸了的3’末端与另一引物3’末端配对互补及PD非特异性指数扩增。(2)一对引物,一边/一端F引物3’最末端1-2个base与另一边/端R引物近
3’端序列反向精确配对,反之同样情况,两3’末端精确配对间距离间隔小于3个碱基时容易形成合力(见附图2b),类似于引物对3’末端连续多个碱基反向互补的PD非特异性指数扩增。(3)一对引物F和R,一边F3’最末端2个base与另一边R中间序列偏3’端反向精确配对,R的残余3’端序列太短而不足以提供“不规则”碱基配对互补合力,或者(2)式两3’末端精确配对间距离过大又不易形成合力(见附图2c)，偶尔延伸的F3’末端太长,与模板强力结合也竞争性地抑制了引物3’末端间配对互补及PD非特异性指数扩增。
(4)一对引物F和R,一边F3’最末端2个base与另一边R近5’端序列反向精确配对,R的3’端其余部份还可以找到与F3’末端以外的很多“不规则”反向配对形成合力；配合部分延伸3’末端的F与模板强力结合同样竞争性地排斥了引物3’末端间配对互补及PD非特异性指数扩增(见附图2d)。(5)一对引物F和R,一条F3’最末端2个base与另一条R最末端2个base反向配对互补,其3’末端外的“悬空”单链部份如要形成反向互补双链就失去了结合着力点,只能两引物链近3’末端处均扭曲转向,相邻碱基间转向使3’端外的引物链反折后5’-3’平行配对的合力这种可能的模式。核酸DNA合成有方向性,但碱基氢键结合是没有选择方向性的,如PNA肽核酸,以中性酰胺键为骨架的一种DNA类似物,以(2-氨乙基)甘氨酸结构单元为骨架,碱基部份通过亚甲基羰基连接于主骨架上,碱基与骨架间隔3个键,相邻碱基间隔6个键,其结构上与天然核酸具有相似性,使PNA对核酸分子具有独特的序列识别结合功能，PNA两种方向均能与核酸杂交,和PNA能抵抗各种酶的作用等特性。同时,PNA中性酰胺键骨架不带负电荷,与核酸杂交时亲和力每碱基Tm值要高1-2℃,也就是DNA每个磷酸基团抵消碱基结合力1-2℃,扣除一磷酸负电荷作用每对G︰C净Tm值有5-6℃和A︰T净Tm值有3-4℃,推算一对氢键结合力略大于一对磷酸基团斥力,两脱氧核酸链如存在一段连续碱基氢键甚至错配单个氢键就能克服其磷酸斥力而结合。一对引物或一对部分延伸了的引物3’最末端1-2个base相互反向互补配对后,两引物链近3’末端处均扭曲转向,序列中间的碱基每个可转30°-36°度,DNA单链最末端碱基自由度更大,使3’端外的引物链经数对碱基扭曲反折后沿5’-3’平行配对,众多的Watson G-C和A-T配对+Wobble G︰T和C︰A配对+其它G︰G/C︰T/T︰T/A︰
A/G︰A等错配氢键的合力促使引物3’最末端1-2个base反向互补碱基稳定退火(见附图2a)。一对近似100%相同序列引物即等于单一引物加双倍量空白SYBR Green I实时荧光PCR,绝大多数单一引物加双倍量的本底荧光值在100次PCR热循环内都是一条基线,没有出现对数增长的荧光Ct值,引物对5’-3’平行因同序碱基互斥而失去了众多配对的合力,和等量的一段10base以上与ID平行配对的反义寡核苷酸能有效抑制PD,两者均明显支持这一PD非特异性扩增机理。聚合酶Taq和荧光染料SYBR Green I也进一步提高少数碱基配对结合力/或杂交Tm值，总之不管是何种PD机理,引物中部序列ID干扰都能够分散、破坏各种可能PD机理的近3’末端的碱基配对合力。
[0030] 引物3’最末端碱基还特别具有一些不同于核酸DNA链序列中间碱基的性能，处于核酸序列中间每个碱基两侧/两边均受相邻碱基和磷酸骨架链的空间限制,而引物3’最末端碱基仅一侧/边受相邻碱基和磷酸链的空间限制,造成引物对3’末端更易扭曲和更加容易碱基错误配对。核酸DNA双链一般呈右手双螺旋构型,其中磷酸戊糖骨架链位于双螺旋外侧,其负电荷使 双链相斥,与戊糖相连碱基位于双螺旋内侧而靠碱基环外酮基和氨基等基团间形成氢键使双链结合,及螺旋链纵轴方向碱基堆集力维持螺旋结构。受DNA螺旋内部空间限制,嘌呤碱基G、A分别与嘧啶碱基C、T形成氢键G︰C/A︰T,液态生理状态下为B型右手双螺旋,嘌呤与嘧啶严格按Watson配对G=C和A=T,以保证DNA复制准确和维持遗传稳定，相邻碱基沿轴旋转36°度,每10个碱基链旋转一圈。然而自然生命界亦存在除Watson G︰C和A︰T配对外的Wobble G︰T和A︰C配对+其它G︰G/C︰T/T︰T/A︰A/G︰A等错配,碱基突出双螺旋构型,一定条件下仍使DNA双链克服磷酸负电荷而结合,具有正常DNA双螺旋相近的稳定性。如此一来,一对引物3’最末端第一个碱基半游离而不受螺旋空间限制,非生理条件下极易形成“错配”氢键，除C/C配对氢键较不稳定外,由于仅一侧受相邻碱基及磷酸链的空间限制和仅一边存在碱基共轭环堆集力，几乎引物对任意3’末端第一个碱基容易相互间错配形成氢键；当然生命由此进化出了带有3’外切酶校正功能的聚合酶。进一步同理,一对引物A和B,一条A3’最末端第一个任何碱基能与B3’末端倒数第二个碱基配对形成氢键，反之B任意末端能与A3’端第二个碱基配对形成氢键,所以任意引物对容易形成3’末端两个碱基反向配对互补；如果一对引物AB,AB3’末端第二个碱基相互间G︰C/A︰T正常序列中的碱基配对,一条A3’最末端第一个任何碱基能与B3’末端倒数第三个碱基配对形成氢键，反之B任意末端能与A3’端第三个碱基配对形成氢键,引物对容易形成3’末端三对碱基反向配对互补；如果一对引物AB,AB3’末端第二、三个碱基相互间反向配对,一条A3’最末端第一个任何碱基能与B3’末端倒数第四个碱基配对形成氢键，反之B任意末端能与A3’端第四个碱基配对形成氢键,引物对容易形成3’末端四对碱基反向配对互补。所以,一对引物末端1-2碱基互补会放大成3-4碱基互补，引物对3’末端第二、三个碱基对的互补能借助3’最末端第一个碱基任意配对氢键增强结合,导致一些错配碱基延伸。一对引物中一引物3’末端倒数第二、三个碱基也绝对不能与另一引物3’端7base内有任何反向互补。
[0031] 由此看来,目前普通PCR引物设计原则亦存在一些认知局限和应用不足，目前引物设计原则是：(1)一般选取靶特异性(保守)序列18-25个核苷酸碱基长度,上下游引物长度差别不能大于3base碱基,两者Tm值相差不能大于5°C,上下游引物跨度以100-600bp为宜；(2)G+C含量应在40%-60%,4种碱基分布/配要均匀,避免出现4个以上碱基同一重复、序列反向重复(发夹结构)、和序列简单重复的二级结构；(3)一对引物间不能有3base或3base碱基以上的连续反向互补,特别是引物间3’末端的反向互补；(4)引物的3’末端碱基,尤其是最末和倒数第2个碱基应正确与靶配对,尽可能使每个引物的
3’最末碱基为G/C,但不能为NNGC或NNCG末端(所谓GC/CG夹),亦不能为特异性差的T结尾。在现有引物设计原则基础之上,还存在一定的认知差别或需要增补一些新的3’端细则：(1)一对引物离3’端5个碱基以外的中部和5’端序列间可以允许有连续碱基反向互补,甚至一条引物3’最末碱基与另一条引物3’端7个碱基以外的中部和5’端序列间连续碱基反向互补亦不会增加PD非特异性；(2)一对引物3’末端第二个碱基相互间不能G︰C/A︰T配对互补,亦最好避免G︰T/A︰C配对互补；(3)一对引物3’末端第二、三个碱基也不能是CG/GC序列(CG同序夹),甚至单一引物本身3’末端第二、三个碱基CG序列(CG同序夹)自身间会增加PD非特异性；(4)一对引物中一引物3’末端倒数第二、三个碱基也不能与另一引物3’端7base内有任何反向互补,特别是CG/GC互补；(5)每个引物的3’最末碱基最好选择C/A,既不要选氢键强“错配”的G结尾亦不要选特异性差/氢键弱的T 结尾,更不要采用重复双GG/TT结尾。如此细化设计的引物能减少普通终末PCR非特异性,但完全消除实时荧光定量PC非特异性还需要本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”。引物中部序列干扰PCR的技术路线选择及非特异性控制措施:
3’最末碱基为G/C,但不能为NNGC或NNCG末端(所谓GC/CG夹),亦不能为特异性差的T结尾。在现有引物设计原则基础之上,还存在一定的认知差别或需要增补一些新的3’端细则：(1)一对引物离3’端5个碱基以外的中部和5’端序列间可以允许有连续碱基反向互补,甚至一条引物3’最末碱基与另一条引物3’端7个碱基以外的中部和5’端序列间连续碱基反向互补亦不会增加PD非特异性；(2)一对引物3’末端第二个碱基相互间不能G︰C/A︰T配对互补,亦最好避免G︰T/A︰C配对互补；(3)一对引物3’末端第二、三个碱基也不能是CG/GC序列(CG同序夹),甚至单一引物本身3’末端第二、三个碱基CG序列(CG同序夹)自身间会增加PD非特异性；(4)一对引物中一引物3’末端倒数第二、三个碱基也不能与另一引物3’端7base内有任何反向互补,特别是CG/GC互补；(5)每个引物的3’最末碱基最好选择C/A,既不要选氢键强“错配”的G结尾亦不要选特异性差/氢键弱的T 结尾,更不要采用重复双GG/TT结尾。如此细化设计的引物能减少普通终末PCR非特异性,但完全消除实时荧光定量PC非特异性还需要本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”。引物中部序列干扰PCR的技术路线选择及非特异性控制措施:
[0032] 引物中部序列ID干扰PCR主要是根据引物ID对PCR特异性扩增仅起稳定退火温度的辅助作用；而对没有连续3base/以上碱基互补的优化引物而言,引物ID是PD非特异性扩增的决定性力量；利用这种差异化，选择尽量少/或没有互补ID的天然序列引物对使其减少相互间结合；或PCR中加入与ID竞争性结合的反义（死）核酸短链抑制引物间相互结合；在不明显影响靶特异性扩增情况下，最大可能干扰/降低引物ID对PD非特异性扩增的主要作用。(一)特异的引物中部序列天然干扰非特异性，首选一对引物间5’-3’平行比对碱基配对最少的序列或将连续6-8bp平行不互补的序列均放置于引物中部序列(Intermediate Domian,ID)区,连续配对最少/不互补是指引物间平行比对时嘌呤配对嘌呤与嘧啶配对嘧啶，引物对ID区平行连续碱基不互补提供不了引物3’末端少数互补所需的借力,也分散了引物对3’末端少数反向配对与5’端区配对氢键的合力,利用天然序列的连续碱基平行不配对、不互补并置于引物ID区来竞争性地干扰引物二聚体PD非特异性扩增,而完全不影响引物的特异性杂交、扩增；ID区连续6-8bp平行不互补的一对引物于不加模板的空白SYBR Green I实时荧光PCR的本底Ct值达40个循环以后,较一般优化引物本底Ct值能推后10个以上循环。如何选择平行连续碱基不互补的ID序列,通常将备选靶模板基因一边/端引物序列(常选下游反意义链)与另一边/端序列(上游有意义链)间5’-3’平行比对(Alignment)、寻找碱基配对最少的序列；并依次往后错一个碱基再重新反复平行比对、直到找出/选取连续6-8bp平行比对没有G︰C/A︰T正常碱基配对的序列、甚至没有G︰T/A︰C配对的最佳序列，并置于近3’端ID区的相应模板序列作为上下游引物，同时整体引物设计符合一般引物设计原则和3’末端细则。作为平行不配对的典型特例，一对引物ID区平行比对连续6-8base同序，即嘌呤碱基自身配嘌呤自身、嘧碇碱基自身配嘧碇自身而引物ID相互间不配对、不互补，引物ID平行6-8base连续同序可以明显地干扰PD非特异性扩增，一对ID间平行连续6base同序的引物空白SYBR Green I实时荧光PCR的本底Ct值达40个循环,较一般优化引物本底Ct值能推后10个循环，一对ID间平行连续8base同序的引物空白PCR的本底Ct值甚至能推后15个循环。如何寻找平行连续碱基同序的ID序列,通常将备选靶模板基因反意义链序列与其有意义链序列之间进行5’-3’平行比对(Alignment)、寻找6-8个碱基完全连续相同的序列。一对100%完全同序引物即等于单一引物加双倍量空白SYBR Green I实时荧光PCR,绝大多数单一引物加双倍量的本底荧光值在100次热循环内都是一条基线,没有出现对数增长的荧光Ct值,这也就提出了一对近似引物如何的思路一对部分6-8bp同序引物只有同序位于ID区才明显推后空白PCR的本底Ct值，实时荧光PCR的40个循环内没有PD非特异性扩增,PCR就可以结束了。引物中部序列连续不配对或同序PCR技术可应用于任何有引物的PCR包括各种荧光染料PCR、各种探针PCR并改善其扩增检测性能。
[0033] 天然序列干扰的还有一些特例及变通情况，如一对引物ID间平行连续8base以上不配对或同序的情况自然界很少,有也会因为高度同序的一对引物PCR产物单链分子内的两端高度互补自身结合而强力竞争游离引物结合,开始出现抑制/影响靶特异性扩增效率而不能采用；如一对引物ID间平行连续不配对或同序碱基少于6base以下或6base不够力时,如没有明显的抑制PD非特异性扩增效果,在ID平行连续不配对或同序左侧/5’侧最近碱基根据Wobble G︰T 和A︰C配对原则人为突变一个碱基以增加一个不配对或同序碱基,或备选的较长ID平行连续不配对区中间仅一个配对时人为突变成不配对/同序，人为碱基突变增加ID平行连续不配对或同序长度使其达到专门抑制PD非特异性扩增而不影响靶特异性扩增效率；如ID平行连续不配对或同序左侧/5’侧不好就再选择ID平行连续不配对或同序的右侧/3’侧临近碱基突变。人为化学修饰引物ID平行连续不配对或同序的碱基可以来增加引物ID间相互排斥能力,如一对引物中每一条引物ID序列引入一个RNA碱基/2-F RNA修饰碱基及一个5F-dU、5Br-dU、8-OH-dG、8-OH-dA等来增加引物ID间负电荷斥力而可以轻度提升抑制PD非特异性扩增/稍微推后本底Ct值,每一条引物含两个RNA碱基/2-F RNA修饰碱基就又明显影响靶特异性扩增效率。本发明引物ID不互补/同序的干扰技术与单链结合蛋白(Single-Strand BindingProtein,SSB)联用相互协同强化抑制PD非特异性扩增。引物中部序列连续不配对或同序PCR技术还适用于如应用抗原Ag/抗体Ab共价交联的Tag标签DNA(短Oligo)定量荧光PCR进行Ag-Ab免疫反应间接定量的免疫PCR,改善免疫荧光定量PCR特异性能；如采用饱和性荧光染料LC Green和高精度PCR仪(LightCycler480)的实时荧光PCR再进行高分辩熔解曲线(high-resolution melt,HRM)分析,与标准品对比实现特异“基因指纹”鉴定,同时减低LC Green的非特异性；如适用于一系列的不依赖于热循环解链的等温(/恒温)基因扩增技术并改善其引物PD非特异性能。核酸等温扩增术的特点是扩增反应的全过程（除初始的杂交步骤外）均在单一温度，无需专门的扩增仪器下进行，而不像PCR反应那样，需要经历几十个温度变化的循环过程。等温扩增技术的这一特点，使得它们对所需仪器的要求大大简化，检测时间显著缩短，因而适合于现场快检或床边检测。比较代表性的有：链置换扩增、滚环扩增、环介导或连环恒温扩增、解旋酶依赖扩增、和核酸序列依赖扩增，转录介导扩增等。
[0034] （二）引物分子外加反义核酸干扰非特异性，因化学修饰的“反义”碱基序列既不能充作扩增模板也不能作为扩增引物,这种仅保留结合功能“死的”反义寡核苷酸能竞争性地结合引物ID且长过引物ID间杂交区而选择性地竞争抑制PD非特异性扩增;特定争对引物ID的反义寡核苷酸不影响3’末端特异性杂交且明显短于引物-靶特异性杂交长度而不影响热循环条件下特异性靶扩增Ct值。采用各种3’端羟基封闭的反义寡核苷酸,包括第一代的MethylphosphateOligonucleotides(甲基磷酸骨架寡核苷酸),Phosphorothioate Oligonucleotides(硫代磷酸骨架寡核苷酸),这种第一代反义寡核苷酸能抵抗核酸酶水解而应用于gene silence/knockout(基因沉默或敲去)研究和作为抗癌药物,但对某些保真度不高的核酸聚合酶如Taq没有抑制,起不到较好的“反义”作用。新一代的反义寡核苷酸仅保留碱基结合功能而失去了作为扩增模板或引物等核酸基本性能,包括2’-O-Methyl(OMe)RNA、2’-O-methoxy-ethyl(MOE)RNA、2’-Amino-RNA、2’-Fluoro-RNA、
2’-O,4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁 核 酸 )、和 PNA(肽 核 酸 )、Morpholino、N3’->N5’Phosphoramidate等。不同于代谢研究和药物使用13-25nt(nucleotides)长反义寡核苷酸,本发明采用6-10nt/base末端羟基封闭的反义寡核苷酸,其序列与引物ID区序列反向互补配对,反向互补配对抑制引物非特异性扩增效果优于平行方向互补配对,平行方向互补配对需采用9-14nt/base。依据反义寡核苷酸长短不同,引物中加等量/或
5μM浓度引物含3μM-6μM反义寡核苷酸(/4μM浓度引物含2μM-5μM)不等,较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度得到最佳引物非特异性抑制效果。由于反义碱基序列合成价格较贵,反义寡核苷酸一般无须采用全长反义碱基序列而可以采用正常碱基与反义碱基间隔的策略,且3’端最末一定设置为强反义碱基以终止延伸，但采用正常碱基与 反义碱基间隔的反义寡核苷酸是一把双刃剑,既抑制引物非特异性扩增又可部分成为引物非特异性模板,其在引物(5μM浓度)中的量不能在7μM-30μM之间或低于
3μM,否则引物二聚体非特异性扩增本底Ct值明显前移或抑制不了。RNA类反义碱基序列不能有效作为扩增模板但仍可为引物,其末端羟基必须封闭但可仅限于3’末端,可采用乙酰化、磷酸基团、氨基、烷基、醛基、羧基、生物素、地高辛、胆固醇、及各种淬灭基团等选一种经济高效交联来封闭末端羟基的延伸;也可采用反义寡核苷酸3’末端最后一个碱基为最强修饰反义碱基，或双脱氧碱基及3’Inverted dT来封闭末端的延伸。反义寡核苷酸抑制一边/一端引物就能有效抑制非特异性扩增,一对引物均设制反义寡核苷酸可进一步降低非特异性本底但PCR体系也带来更多的复杂性、和不确定的交叉非特异性。引物分子外加ID反义核酸干扰技术可应用于任何优化引物的PCR包括各种荧光染料PCR、各种探针PCR并增强其扩增检测特异性能。
2’-O,4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁 核 酸 )、和 PNA(肽 核 酸 )、Morpholino、N3’->N5’Phosphoramidate等。不同于代谢研究和药物使用13-25nt(nucleotides)长反义寡核苷酸,本发明采用6-10nt/base末端羟基封闭的反义寡核苷酸,其序列与引物ID区序列反向互补配对,反向互补配对抑制引物非特异性扩增效果优于平行方向互补配对,平行方向互补配对需采用9-14nt/base。依据反义寡核苷酸长短不同,引物中加等量/或
5μM浓度引物含3μM-6μM反义寡核苷酸(/4μM浓度引物含2μM-5μM)不等,较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度得到最佳引物非特异性抑制效果。由于反义碱基序列合成价格较贵,反义寡核苷酸一般无须采用全长反义碱基序列而可以采用正常碱基与反义碱基间隔的策略,且3’端最末一定设置为强反义碱基以终止延伸，但采用正常碱基与 反义碱基间隔的反义寡核苷酸是一把双刃剑,既抑制引物非特异性扩增又可部分成为引物非特异性模板,其在引物(5μM浓度)中的量不能在7μM-30μM之间或低于
3μM,否则引物二聚体非特异性扩增本底Ct值明显前移或抑制不了。RNA类反义碱基序列不能有效作为扩增模板但仍可为引物,其末端羟基必须封闭但可仅限于3’末端,可采用乙酰化、磷酸基团、氨基、烷基、醛基、羧基、生物素、地高辛、胆固醇、及各种淬灭基团等选一种经济高效交联来封闭末端羟基的延伸;也可采用反义寡核苷酸3’末端最后一个碱基为最强修饰反义碱基，或双脱氧碱基及3’Inverted dT来封闭末端的延伸。反义寡核苷酸抑制一边/一端引物就能有效抑制非特异性扩增,一对引物均设制反义寡核苷酸可进一步降低非特异性本底但PCR体系也带来更多的复杂性、和不确定的交叉非特异性。引物分子外加ID反义核酸干扰技术可应用于任何优化引物的PCR包括各种荧光染料PCR、各种探针PCR并增强其扩增检测特异性能。
[0035] 修饰的反义寡核苷酸亦还有一些变通及特例，如首先常规合成正常普通碱基的寡核苷酸,在其碱基未脱保护情况下作广泛的烷基化、酰基化、卤代、及氧化等化学修饰,其末端羟基可简单卤氢酸反应卤代封闭,最后脱碱基保护基生成保留碱基特异性结合的抑制非特异性扩增反义寡核苷酸。其次设计与引物ID区序列互补配对的短6-10nt/base全反义碱基寡核苷酸,再连续合成串联的重复序列反义寡核苷酸二聚体或化学交联成重复序列反义二聚体。如反义寡核苷酸长度超过14base或超引物长度70%开始明显抑制/影响靶特异性扩增效率；置于引物3’端的反义寡核苷酸虽然有效热启动PCR,但也常部分影响靶特异性扩增效率。因此权衡各种利弊,引物的修饰反义寡核苷酸一般从引物3’末端到数第四第五碱基起始并采用6-10nt/base末端封闭的反义寡核苷酸,以反向互补为最佳,一对引物设置一条修饰反义寡核苷酸结合一边引物抑制效果已足够应用,一对ID同序引物置一条修饰反义寡核苷酸会抑制两边引物结合。通过反义寡核苷酸固相化而热变性释放引物也可以有效热启动PCR,还可适用于进行多点阵列PCR,即微纳阵列多重检测，阵列每一点仍为分隔的单重实时荧光定量PCR,即PCR芯片。单点PCR反应腔是由独立的光刻纳升-微升级的圆井组成，首先是在4英寸硅片上涂覆光刻胶，然后用设计数十-数千点阵的掩膜版做光刻，曝光和显影完成后，用ICP-RIE（InductivelyCoupled Plasma Reactive Ion Etching）深硅刻蚀设备刻蚀硅片，最后用氧等离子体设备去除光刻胶并清洗后完成。反应腔壁修饰上PEG（聚乙二醇），PEG可以在PCR腔壁上通过硅氧键共聚焦形式形成一层高度亲水的聚合物层，可有效防止腔壁对PCR聚合酶以及核酸的吸附，从而达到不影响PCR反应的目的。具备微纳阵列圆井的硅芯片每点圆井依次装载纳米微球固相化的不同引物对,封装就算完成了,固相缓释引物用来保证反应腔内预置的引物只有在PCR反应时才释放出来。使用时拆除芯片封装,配制PCR反应液并加入样本DNA,使之均匀分布芯片PCR腔,再加矿物油于芯片表面密闭,最后硅芯片盖上带胶面的透明塑料薄片,以保证反应腔的密闭性和防止反应腔之间引物的串扰，整张硅片进行实时荧光PCR。
[0036] (三)分子内引物5’端反折干扰非特异性技术，将ID“反义”碱基序列连接于靶模板引物5’端前面使引物分子内既含特异性靶结合序列又含ID“反义”碱基序列并反折与引物自身ID序列结合抑制。一对引物一端或两端引物ID区5-7base序列的“反义”链碱基以5’-3’方向加在靶模板引物5’端前面,化学合成一增加了5-7个“反义”碱基与自身ID序列能配对互补的嵌合引物,嵌合引物结构5’端最前面为能与自身ID序列反向配对互补的5-7base“反义”碱基紧接着连续联接靶特异性的常规引物18-25base碱基。嵌合引物5’端“反义”碱基不仅能反折与引物自身ID序列结合干扰、抑制；更可能的情况是同样两嵌合引物分子间相互5’端ID杂交结合,一引 物分子5’端与另一引物分子ID杂交结合,同时一引物分子ID也与另一引物分子5’端杂交结合；两段杂交合力更强(见附图3c)。这种5’端反折分子内干扰技术方案一大优点是嵌合引物“反义”序列可以采用普通碱基而无需修饰碱基,但嵌合接头处碱基和“反义”序列中与3’最末端配对的碱基设置为修饰碱基有助于“反义”序列在PCR反应中不扩增和避免任何的长引物非特异性扩增。分子内引物5’端反折干扰ID技术可应用于各种引物的PCR包括荧光染料PCR、探针PCR并改善其扩增检测特异性。
[0037] 分子内引物5’端反折干扰的一些特例及应用情况，本技术方案在找不到较好的优选序列引物如点突变检测限制选择引物时,一端或两端引物分子内5’端反折干扰非特异性技术就成为主要选项。两端引物均采用这种5’端反折结合ID的茎环结构引物分子内干扰技术与荧光探针如TaqMan法PCR联用可减少引物-探针间聚合,进一增强荧光探针法实时PCR特异性。还可以将一边/一端分子内反折引物直接标记荧光发光基团和荧光淬灭基团,如引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光发光基团6-FAM-dT(中间dT)等,而在其5’端标记荧光淬灭基团dabcyl/TAMRA、或采用5’dG淬灭碱基/淬灭序列,同时另一边引物采用非5’端分子内反折的普通引物/或嵌合接头处碱基设置为修饰碱基的5’端分子内反折引物；反之引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光淬灭基团dabcyl(如中间dT),而在其5’端标记各种波长荧光发光基团FAM/JOE等,扩增产物使淬灭基团远离荧光基团。多对标记不同波长荧光发光基团的分子内反折引物在多波长多通道PCR仪上可以进行单反应管同时多重检测实时荧光定量PCR。三种干扰技术联合使用策略:引物中间序列ID不互补或同序技术、引物加入反义修饰寡核苷酸Oligo干扰、和引物分子内反义Oligo干扰三种技术既可以有效单独使用,又可以组合联用以进一步增强抑制PD非特异性扩增效果。
[0038] (1)引物ID不互补/同序技术与加入反义Oligo干扰技术联合使用:这两种不同引物ID干扰途径机理的联合使用进一步显著地增强抑制引物二聚体(PD)非特异性扩增,为了引物3’末端不明显影响靶特异性扩增的同时于PCR反应内最大程度地避免PD非特异性扩增,采用一对中间序列ID不互补或同序引物技术的同时,一般联用一边引物加入反义Oligo干扰效果已足够应用,一边加入长过引物ID序列的反义Oligo主要结合抑制一边引物,但对同序ID的另一边引物也部份结合抑制，两边引物均加入反义Oligo干扰没有必要。本联合干扰技术即可以与荧光染料、荧光探针PCR再联用，亦可以与产物淬灭的PCR再联用,与现有的PCR产物产生荧光的技术路线相反,荧光标记引物通过产物荧光淬灭,一对ID不配对或同序引物中一边引物5’端可采用5甲基异胞嘧啶(iso-dC)标记荧光发光基团,同时另一边引物ID加入反义Oligo加强干扰，淬灭PCR产物通过含dabcyl标记的异鸟嘌呤(iso-dG)底物特异配对渗入PCR而产生扩增产物荧光淬灭的实时荧光定量PCR及多重实时荧光PCR。
[0039] (2)引物ID不互补/同序技术与引物内反义Oligo干扰技术联合使用:引物分子内干扰非特异性技术与一对中间6-8base同序引物干扰非特异性技术联合使用时,引物5’端“反义”Oligo采用自身ID与5’端区交界处5-7个base反义序列,ID区最多采用3个base,以免一边引物5’端“反义”Oligo与另一边引物ID同序配对结合,以免增加系统的非特异复杂性。一对中间6-8base不配对/同序引物降低其中部序列(ID)的碱基结合力/或干扰引物中部序列(ID)的碱基结合基础上,再联用一边或两边引物5’端“反义”Oligo来增强ID干扰和引物自身结合,在3’末端不明显影响靶特异性扩增的同时于PCR反应内极大程度地抑制引物二聚体(PD)非特异性扩增。本联合干扰技术即可以与荧光染料、荧光探针联用PCR,亦可与荧光基团标记引物并自身 抑制淬灭的PCR再联用,如引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光发光基团6-FAM-dT(中间dT)等,而在其5’端标记荧光淬灭基团dabcyl/TAMRA、或采用5’dG淬灭碱基/淬灭序列；反之引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光淬灭基团dabcyl(如中间dT),而在其5’端标记各种波长荧光发光基团FAM/JOE等,扩增产物使淬灭基团远离荧光基团；多对标记不同波长荧光发光基团的引物在多波长多通道PCR仪上可以进行单反应管同时多重检测实时荧光定量PCR。还可以与产物淬灭的PCR再联用，分子内反折引物5’端可采用5甲基异胞嘧啶(iso-dC)标记荧光发光基团,淬灭PCR产物通过含dabcyl标记的异鸟嘌呤(iso-dG)底物只渗入到iso-dC位置而产生荧光淬灭,和产物淬灭的多重实时荧光PCR技术。
[0040] (3)引物加入反义Oligo干扰技术与引物内反义Oligo干扰技术联合使用:如果仅一边/一端引物采用分子内反义Oligo干扰技术,另一边/一端引物就可采用加入反义Oligo的干扰技术,一对引物每边采用不同的反义Oligo干扰技术手段,可以在不明显影响靶特异性扩增的同时起到干扰协同增强的作用效果。本联合干扰技术即可以与荧光染料、荧光探针联用PCR,亦可与荧光基团标记引物并自身抑制淬灭的PCR再联用,如引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光淬灭基团dabcyl(如中间dT),而在其反折5’端标记各种波长荧光发光基团,扩增产物使dabcyl远离荧光基团；或反标记操作。还可以与产物淬灭的PCR再联用，分子内反折引物5’端可采用5甲基异胞嘧啶(iso-dC)标记荧光发光基团,含dabcyl标记的异鸟嘌呤(iso-dG)底物渗入到iso-dC位置而产物荧光淬灭,多对标记不同波长荧光发光基团的引物在多波长多通道PCR仪上可以单反应管同时多重检测实时荧光定量PCR。
[0041] (4)三种干扰技术同时联合使用:首先从待测模板序列选择ID序列6-8个base不互补/同序的引物对，再于一边/一端引物联用分子内反义Oligo干扰技术,另一边/一端引物就联用加入反义Oligo的干扰技术。此处引物5’端“反义”Oligo也采用自身ID与5’端区交界处5-7个base反义序列,ID区最多采用3个base,以免一边引物5’端“反义”Oligo与另一边引物ID同序配对结合,以免增加系统的非特异复杂性。本联合干扰技术即可以与荧光染料、荧光探针PCR再联用,亦可与荧光标记引物并自身淬灭的PCR再联用,如引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光淬灭基团dabcyl(如中间dT),而在其反折5’端标记各种波长荧光发光基团,扩增产物使dabcyl远离荧光基团；或反标记操作。还可以与产物淬灭的PCR再联用，分子内反折引物5’端可采用5甲基异胞嘧啶(iso-dC)标记荧光发光基团,含dabcyl标记的异鸟嘌呤(iso-dG)底物渗入到iso-dC位置而产物荧光淬灭,多对标记不同波长荧光发光基团的引物在多波长多通道PCR仪上可以单反应管同时多重检测实时荧光定量PCR。也适用于一系列的不依赖于热循环解链的等温(/恒温)基因扩增技术并改善其引物PD非特异性能。包括代表性的技术：链置换扩增、滚环扩增、环介导或连环恒温扩增、解旋酶依赖扩增、和核酸序列依赖扩增，转录介导扩增等，适合于现场快检或床边检测。
[0042] 其他非特异性控制措施:引物中部序列竞争干扰引物间聚合的PCR系统排除了最严重的体系内引物二聚体(PD)非特异性扩增之外,还存在严重的PCR体系外的引物二聚体(PD)产物和模板产物等气雾胶交叉污染的二次/重复扩增；以及阳性标本DNA交叉污染；和未纯化标本中残留DNA的非特异性扩增。也就是说在未控制PCR体系外的非特异性之前,任何抑制引物二聚体(PD)非特异性的措施或试验完全被体系外的非特异性污染所掩盖,任何努力都是徒劳的；反之PCR体系内PD非特异性扩增未很好解决前,又影响了PCR体系外非特异性的试验控制；这也是目前生物界没能彻底解决PCR非特异性的原因所在和PCR引物二聚体复杂 性之处。
[0043] 避免PCR产物气雾胶泄漏最简单可靠的途径是在PCR反应管内PCR反应液之上加入矿物油(又称石腊油)物理隔绝,等体积或几倍PCR反应体积的矿物油完全不影响透射的荧光值。但所加矿物油层面上仍残留极少量PCR反应液,即使在依次加入PCR反应液、加入矿物油封闭再离心操作后,矿物油层面上微量残留反应液仍能热循环扩增并仍有气雾胶泄漏,再努力优化的PCR此条件下本底Ct值仍顽固为30左右循环数，且仅使用矿物油封闭操作的荧光PCR仪反应管盖周围仍存有大量绿色荧光染料泄漏污渍就是明证。在采用矿物油封闭情况下,使用dUTP代替dTTP底物,同时PCR体系加入尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG),有效的Uracil-DNAGlycosylase(UDG)催化尿嘧啶从含尿嘧啶的DNA上释放,能从含dU的6碱基以上气雾胶产物水解dU,使微量污染气雾胶DNA不被二次/重复扩增,但是如引物没有进行本发明优化或中间ID干扰,不能完全热变性灭活的UDG作用于PD产物和特异靶扩增没有根本区别。采用矿物油封闭和UDG与dU底物联用的实时荧光PCR假阳性率低于探针法实时荧光PCR,适用于一般非反复/重复检验的科研检测情况。彻底杜绝临床诊断时的PCR产物气雾胶交叉污染或要求达到酶免疫诊断低于3‰假阳性率水平,在矿物油封闭和UDG-dU联用的基础上,必须整合采用PCR一成份缓释策略,通常将PCR一成份(常首选一引物)+UGI溶于20%(w/v)葡聚糖(Dextran),成比例含PCR一成份(如一引物)的20%Dextran高比重粘液预先加入PCR管底,再依次加PCR各成份、矿物油于PCR管壁,最后每管换一吸头取待测模板DNA加入PCR管液体中,不要混匀Vortex!以免破坏缓释分层,短瞬离心使所有反应液均沉降于管底。经PCR变性95°C2-4分钟后,管底的重引物热释放进入反应液启动扩增,而矿物油封闭层面上残留的微液因缺少完全的PCR成份仅产生无有效扩增的微量气雾胶,彻底杜绝了此类交叉污染。
[0044] 至于样本中未纯化的残留非靶DNA的非特异性扩增也还是必须通过临近引物3’末端的引物ID区干扰来使引物3’末端与非靶DNA少量配对氢键找不到借力或分散了非特异性合力。以及解决阳性标本DNA交叉污染就只能采取良好的PCR实验操作和使用独立/分区的PCR实验室,良好的临床基因检验科室必须建立单方向物流、人流的独立PCR反应试剂配制间、样本制备及加样间、和远离的PCR扩增反应间三个独立实验室,加样间须负压或于生物安全柜内加样；再简陋的PCR科研实验室也必须建立单向气流、物流和人流的分隔成试剂、加样、扩增三个间隔区,加样区配置负压生物安全柜；正确的标准操作规程使标本阳性DNA交叉污染的影响非常有限。
[0045] SYBR Green I实时荧光PCR验证PD及控制实验:
[0046] 实时荧光PCR是实时监测PCR整个反应荧光曲线并实时显示的过程,以相对荧光强度值为纵坐标,以扩增循环数为横坐标，由于即使同一PCR反应终末平台期荧光值变化非常大,而同一PCR对数增长初期荧光值重复性最好。因此以PCR反应前3-15个循环的反应基线平均荧光值10倍标准差定为阈值(threshhold)，一般位于PCR对数增长初期，当PCR扩增荧光曲线到达阈值的循环数则定义为循环阈值(Cycle threshold,Ct),Ct值循环数与样本中原始靶分子拷贝数成反对数关系。SYBR Green I实时荧光PCR如没有PD干扰定量最精确,其本身又是引物非特异性研究最锋利的技术工具，本发明采用不加待测模板的空白本底的SYBR Green I实时荧光PCR来检验引物非特异性扩增及本底Ct值。 [0047] 1.SYBR Green I实时荧光PCR技术操作:
[0048] 本发明所用材料SYBR Green I购自Invitrogen公司,LC Green购自Idaho Technology公司,底物dNTP包括dUTP、Taq购自生工生物工程(上海)股份有限公司,引物、探针及反义寡核苷酸合成购自上海生工公司,反义PNA合成购自PD Biotech派德生物有限公司,化学试剂主要购自Sigma公司,酶Taq、UDG、SSB、rTth酶均自产。实时荧光PCR仪器采用西安天隆有限公司TL988,ABI PRISM 7300,Stratagene Mx3000p,Bio-Rad CFX96型等。
[0049] 标准的常规终末PCR反应体积一般为50μl-100μl,作为筛克隆方法时甚至可10μl反应；探针TaqMan法实时荧光PCR由于阳性反应荧光值不高且与高荧光基线过于接近,至少需要40μl-50μl以上反应体积以增强荧光反差；染料法SYBR Green I实时荧光PCR可以进行从纳升级-微升级的任何反应体系,一般PCR芯片单点反应纳升体系、单反应管以25μl-50μl反应体积为主,本反应以25μl标准反应体系实时荧光PCR为例,依次按以下比例吸取PCR反应成份加于PCR反应管:
[0050]
[0051] 配制PCR反应液15μl于PCR反应管,剩余10μl为标准品、和试验影响PCR试剂,或另加10μl超纯水dH2O作为仅引物的空白PCR试验,小心沿反应管壁依次加入PCR反应成份,每管换一加样吸头;最后,每PCR管沿上部管壁小心加30μl矿物油,短瞬离心。进行一组10次PCR反应时,常预先配制10次PCR反应液15μl×10﹦150μl预混液,每PCR管再加预混反应液15μl试验。
[0052] 完成配制的PCR反应管上实时荧光PCR仪,具有激发光波长480nm和检测波长520nm任一款式实时荧光PCR仪均适合使用。设置反应条件,预反应95°C2-4分钟,然后热循环45次:变性94°C 20-30秒,退火54°C30秒,延伸72°C20-30秒并于72°C
读取荧光值，扩增45次热循环结束后再做50°C-90°C熔解曲线分析。加矿物油封闭的实时荧光PCR如同时设置高于变性95°几度的热盖条件,须在热盖未达到预设温度前就启动PCR使封闭矿物油面上残留反应液尽快气化挤出,否则残留反应液于热盖高温气化后冷凝于退火时矿物油表面继续有效扩增。
读取荧光值，扩增45次热循环结束后再做50°C-90°C熔解曲线分析。加矿物油封闭的实时荧光PCR如同时设置高于变性95°几度的热盖条件,须在热盖未达到预设温度前就启动PCR使封闭矿物油面上残留反应液尽快气化挤出,否则残留反应液于热盖高温气化后冷凝于退火时矿物油表面继续有效扩增。
[0053] 如采用以下验证试验4.肠道病毒EV的5’端非编码区一对未优化引物EVF10/EVR10,以5’端非编码区基因克隆质粒pUTRev为模板依次10倍稀释作荧光PCR标准曲线,8 7 6 5 4 3 2 1
结果见附图4,pUTRev拷贝数:4×10,4×10,4×10,4×10,4×10,4×10,4×10,4×10
0
,4×10,0,Ct值(循环数):13,16,19.5,23,26,29,30,30.5,30.5,31,未加pUTRev模板的空白本底对照与低于数千拷贝数的低浓度稀释模板扩增曲线全挤在一起,全都Ct值为30个左右循环数。
结果见附图4,pUTRev拷贝数:4×10,4×10,4×10,4×10,4×10,4×10,4×10,4×10
0
,4×10,0,Ct值(循环数):13,16,19.5,23,26,29,30,30.5,30.5,31,未加pUTRev模板的空白本底对照与低于数千拷贝数的低浓度稀释模板扩增曲线全挤在一起,全都Ct值为30个左右循环数。
[0054] 2.验证一引物3’末端是以另一引物中部/5’端为模板、还是以另一引物3’末端作为模板:
[0055] 在PCR引物延伸往往从正确配对及杂交结合的3’末端开始,引物3’最末端2-3个碱基不匹配就完全不能延伸等许多实验结果基础上，一端引物以另一端引物为模板从何处结合延伸以配对结合几率上来比较,一引物3’末端与另一引物中部为模板结合的概率大,两端小，为了验证哪种情况是引物二聚体PD非特异性主要途径故选择三组引物对,第一对一端引物3’末端与另一端引物3’末端连续4-6base反向互补、第二对一引物3’末端与另一引物中部连续4-6base反向互补、第三对一引物3’末端与另一引物5’端连续4-6base反向互补。采用连续数个碱基反向互补代替优化引物的少数1-2个碱基反向互补是为了放大作用效果,如果连续几个碱基互补不成为PD主要原因那就少数1-2个碱基互补更不会是PD主要原因。结果第一对组本底Ct值6-12循环数范围内扩增曲线就爬升、第二对组本底Ct值30循环-无Ct(直线)范围内、第三对组本底Ct值35循环-无Ct(直线)范围内，一引物3’末端与另一引物中部/5’端区的连续反向互补没有PD非特异性促进作用,结论一端引物3’末端以另一端引物3’末端为模板才是PD非特异性主要原因。引物对3’末端区对特异性非特异性均最重要,尤其3’最末端2base正确配对才能延伸, [0056] 三组引物试验重复性比较一致,在此仅以乙型肝炎病毒HBV、艾滋病毒HIV、乳头瘤病毒HPV等基因的引物HBVFn/HBVRn、HIVF2/HIVR2等6对引物作为代表而显示其结果如下:
[0057] HBVF1(nt321):5’-cac ctc caa tca ctc acc-3’
[0058] HBVR1(nt 125):3’-gag tgg gta tag cag tta ga-5’
[0059] HIVF2(nt7520):5’-c ctc caa tcg aag gag aaa-3’(HIV-1:JX236678.1) [0060] HIVR2(nt7756):3’-ctc ttt ttt ctc gtc aac ct-5’
[0061] HBVF3(nt281):5’-ggg gga gca ccc acg tgt c-3’
[0062] HBVR3(nt129):3’-gt ggg tat agc agt tag aag-5’
[0063] HBVF4(nt276):5’-ttc tag ggg gag cac cca-3’
[0064] HBVR4(nt123):3’-gac gga gtg ggt ata gca gt-5’
[0065] HCVF5(nt42):5’-ccc tgt gag gaa cta ctg tc-3’(HCV:JX14307.1) [0066] SYNCRIP5(nt5942)3’-gag tga ctt ttg aca gac gtc-5’(NCBI Seq:NM00125771.1)
[0067] HBVR6(nt1340):5’-gag ttg tcg gtt ccg atg ag-3’
[0068] HPVF6(nt685):3’-aac agc agt cct cac ttg ca-5’(HPV:HM537001.1) [0069] 试验管1-7为仅含引物的空白PCR试验,引物均常规浓度5μM按验证实验1.操作配制,引物对1-2为第一对组,引物对3-4为第二对组,引物对5-6为第三对组,引物对7为普通引物对照，然后管1-7再同时进行45个热循环:94°C 30秒、54°C退火30秒、72°C延伸30秒PCR,延伸72°C时读取荧光值,
[0070] 试验管号: 1,2,3, 4, 5, 6, 7,
[0071] Ct值(循环数):6,12,31,无(直线),35,无(直线),29.5,
[0072] 结果管1-2(第一组)一端引物3’末端与另一端引物3’末端连续6base反向互补本底Ct值6-12循环数、管3-4(第二组)一引物3’末端与另一引物中部连续6base反向互补本底Ct值31循环数-无Ct(直线)、管5-6(第三组)一引物3’末端与另一引物5’端连续6base反向互补本底Ct值35循环数-无Ct(直线)，PCR一端引物3’末端与另一端引物5’端和中部ID序列连续6base反向互补不促进本底Ct值,因此一端引物3’末端以另一端引物5’端和中部ID序列为模板的少数互补更加不是PD非特异性的主要原因；
PCR一端引物3’末端与另一端引物3’末端连续6base反向互补明显促进本底Ct值,所以一端引物3’末端以另一端引物3’末端为模板的反向互补是PD非特异性主要途径,但3’末端少数反向互补是否能够独立促进一对引物 PD非特异性
PCR一端引物3’末端与另一端引物3’末端连续6base反向互补明显促进本底Ct值,所以一端引物3’末端以另一端引物3’末端为模板的反向互补是PD非特异性主要途径,但3’末端少数反向互补是否能够独立促进一对引物 PD非特异性
[0073] 3.验证一对引物3’末端少数碱基互补扩增是高温碰撞瞬间延伸、还是借助3’末端外的合力稳定退火延伸:
[0074] 所谓“高温碰撞瞬间延伸”是指一对引物3’末端间少数1-2个碱基互补在PCR热循环条件下,热循环高温加速分子热运动,少数1-2个互补碱基间高温瞬间碰撞结合而延伸1-2个碱基再变性分离的一种设想的可能情况，为了验证一对引物3’末端间少数1-2个碱基互补是独立依靠瞬间碰撞延伸造成PD非特异性还是借助3’末端外的合力使3’末端少数互补碱基稳定退火延伸产生PD非特异性因此设计一对6-8bp短Oligo作为引物对3’末端互补模板,模板Oligo左半反意义链与一端引物3’最末端3-4base反向互补,右半有意义链与另一端引物3’最末端3-4base反向互补,但短Oligo模板仅与引物对3’末端杂交缺少了引物3’末端外的无规碱基配对氢键合力的辅助。结果模板短Oligo在94°C变性低温4°-8°C退火和室温延伸5个循环后再42°C退火PCR,短Oligo明显促进一对引物本底Ct值提前；而在Oligo缓释热启动和42°C退火PCR热循环条件下完全不促进一对引物PD非特异性就说明3-4base反向互补碱基氢键力在PCR热循环条件下不足以独立结合延伸,结论是引物对3’末端配对结合必须借助3’末端外的合力辅助才能使3’末端少数互补碱基稳定退火延伸产生PD非特异性。
[0075] 以乙型肝炎病毒HBV核心抗原基因的一对引物HBVcF/HBVcR作为代表性试验, [0076] HBVcF:5’-atg ccc cta tct tat caa c-3’
[0077] OligoBVc3: caa cg tcg
[0078] gtt gc agc
[0079] HBVcR:3’-cag cgt ctt cta gag tta g–5’
[0080] 试验管1-7均含常规浓度HBVcF/HBVcR,管1-2-3短Oligo水稀释低温退火延伸,管4-5-6短Oligo于20%Dextran预加于管底缓释热启动，然后管1-7再同时进行45个94°C 30秒、42°C退火30秒、70°C延伸30秒PCR,
[0081] 试验管号: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
[0082] 加Oligo:2μl 100μM,10μM,1μM,100μM,10μM,1μM,0(2μl Dextran), [0083] Ct值(循环数):15,19.5,22.5,39,45,41,35.5,
[0084] 结果(附图6.)管1-2-3短Oligo低温退火延伸5个循环后再42°C退火PCR本底Ct值15-22，而管4-5-6短Oligo缓释热启动直接42°C退火PCR本底Ct值39-45,实时荧光PCR热循环条件下4个碱基结合Oligo完全不促进一对引物PD非特异性,证明引物对3’末端少数碱基配对PCR条件下没有3’末端外的合力辅助就不能稳定退火延伸产生PD非特异性。
[0085] 4.中间ID不互补/同序的一对引物选择性抑制PD非特异性及推后空白PCR本底Ct值:
[0086] 一对引物3’末端少数碱基反向配对互补后如何借力3’末端外配对氢键唯一可能的方式是一对引物3’末端少数碱基均扭曲转向并反向配对互补,转向后的一对引物5’端和中部序列均以5’→3’平行配对并形成一些无规氢键而结合。由于这种体外非生理条件下的平行配对无规氢键结合力不强,需要近全长的引物序列无规氢键且PCR退火较长时间或较多循环数才能延伸足够长或扩增足够多片段后进入PD指数扩增，中间ID不互补/同序的一对引物由于破坏/分散了引物3’末端少数配对氢键力与3’末端外无规氢键的合力而选择性抑制PD非特异性。设置同向100%同序、反向100%同序、同向70%同序、和同向50%同序的引物对；中间4-6base 平行互补引物对，中间6-8base平行不互补引物对，中间
6-8base平行同序的引物对，5’端6-8base平行同序的引物对，3’端6-8base平行同序的引物对，进行仅引物对的空白实时荧光PCR试验。结果同向70％同序或以上的引物对完全抑制PD非特异性，小于70％同序如50％同序及反向100％同序均不抑制PD非特异性；奇怪的是中间4-6base平行互补的引物对大多推后空白PCR本底Ct值数个循环数而仅个别稍微提前本底Ct值几个循环数？，和中间6-8base平行不互补/同序的引物对推后空白PCR本底Ct值10个循环数以上。结论一对同向100％同序引物PCR产物(包括PD产物)单链两端100％互补而产生平底锅柄样自身分子内结合竞争引物结合，不仅有效抑制PD非特异性、也完全干扰靶特异性扩增；而反向100％同序引物PD产物单链两端100％逆互补产生PD单链两端e型双环自身紧密结合也竞争引物，PD单链两端自身结合不抑制PD非特异性、不是PD非特异性主要因素，仅为次要原因；一对中间6-8base平行不互补/同序的引物由于嘌呤配对嘌呤、嘧啶配对嘧啶无法配对氢键而破坏/分散了引物对3’末端少数1-2个互补碱基与5’端区无规碱基平行配对氢键合力，使引物对3’末端少数1-2个互补碱基在PCR热循环条件下无法独立稳定结合延伸而抑制PD非特异性及推后空白PCR本底Ct值；理应ID区4-6base平行互补促进PD非特异性及提前空白PCR本底Ct值，相反大多推后空白PCR本底Ct值，可能系多个连续平行碱基完全互补结合力太大而强力改变了引物对3’末端少数1-2个互补的无规氢键与借力共形成的构型。或者还存在其它引物二聚体PD形成机制途径？
6-8base平行同序的引物对，5’端6-8base平行同序的引物对，3’端6-8base平行同序的引物对，进行仅引物对的空白实时荧光PCR试验。结果同向70％同序或以上的引物对完全抑制PD非特异性，小于70％同序如50％同序及反向100％同序均不抑制PD非特异性；奇怪的是中间4-6base平行互补的引物对大多推后空白PCR本底Ct值数个循环数而仅个别稍微提前本底Ct值几个循环数？，和中间6-8base平行不互补/同序的引物对推后空白PCR本底Ct值10个循环数以上。结论一对同向100％同序引物PCR产物(包括PD产物)单链两端100％互补而产生平底锅柄样自身分子内结合竞争引物结合，不仅有效抑制PD非特异性、也完全干扰靶特异性扩增；而反向100％同序引物PD产物单链两端100％逆互补产生PD单链两端e型双环自身紧密结合也竞争引物，PD单链两端自身结合不抑制PD非特异性、不是PD非特异性主要因素，仅为次要原因；一对中间6-8base平行不互补/同序的引物由于嘌呤配对嘌呤、嘧啶配对嘧啶无法配对氢键而破坏/分散了引物对3’末端少数1-2个互补碱基与5’端区无规碱基平行配对氢键合力，使引物对3’末端少数1-2个互补碱基在PCR热循环条件下无法独立稳定结合延伸而抑制PD非特异性及推后空白PCR本底Ct值；理应ID区4-6base平行互补促进PD非特异性及提前空白PCR本底Ct值，相反大多推后空白PCR本底Ct值，可能系多个连续平行碱基完全互补结合力太大而强力改变了引物对3’末端少数1-2个互补的无规氢键与借力共形成的构型。或者还存在其它引物二聚体PD形成机制途径？
[0087] 以乙型肝炎病毒HBV、肠道病毒EV等基因的数对引物HbVFn/HbVRn作为代表性试验，
[0088] 试验管1-10均含5μM常规浓度HbVFn/HbVRn，EVFn/EVRn引物，为仅含引物的空白PCR试验，管1-2-3分别为R1/R1100％、R1/R270％、R1/R350％同向同序引物对，管4为R1／R4反向100％同序，管5为Id区6base平行互补，管6为ID8base平行不互补，管7-8为位于ID同向同序，管9-10分别为位于5’端、3’端7base同向同序。管1-10均预反应95℃2-4分钟，然后热循环45次：变性94℃ 20-30秒，退火54℃30秒，延伸72℃20-30秒并于72℃读取荧光值，
[0089] HbVxR1(nt1819)：5’-c atg gtg ctg gtg aac ac-3’
[0090] HbTn70R2：5’- gtg ctg gtg ac-3’(黑体斜写碱基代表人为变异) [0091] HbBi50R3：5’-c atg g aac ac-3’(黑体斜写碱基代表人为变异) [0092] HbDaoR4： (黑体斜写序列代表倒置同序)
[0093] HbVF5(nt317)：5’-g tcc cca ac t cac-3’(下划线斜写碱基代表同向互补)
[0094] HbVR5(nt354)：5’-gag gac aa g gtg ag-3’
[0095] HbVsF6(nt596)：5’-gca cct gta t cat c-3’
[0096] HbVsR6(nt765)：5’-ggc ccc caa cat c-3’(黑体斜写序列人为变异同向不互补)
[0097] HBVcF：5’-atg ccc cta tct tat caa c-3’
[0098] HaBVcR：5’-gat tga gat ctt tg cga c-3’(黑体a为原c人为突变优化，下划线序列同序)
[0099] EVF8(nt434)：5’-gag cta gtt agt agt cct c-3’
[0100] EVR8(nt556)：5’-acc caa agt agt cgg ttc-3’(下划线碱基为同向同序) [0101] EVF9(nt443)：5’-agt agt cct ccg gcc cct g-3’
[0102] EVR9(nt550)：5’-agt agt cgg ttc cgc tgc ag-3’(下划线碱基为同向同序) [0103] EVF10(nt431)：5’-act gag cta gtt agt agt c-3’
[0104] EVR10(nt562)：5’-acg gac acc caa agt agt c-3’(下划线碱基为同向同序) [0105] 试验管号： 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， [0106] Ct值(循环数)：无(直线)，44，31，30.5，24，43，37.5，40，26，29.5， [0107] 结果(附图7.)管6，7，8号一对中间6-8base平行不互补/同序的引物由于嘌呤配对嘌呤、嘧啶配对嘧啶无法配对氢键而破坏/分散了引物对3’末端少数1-2个互补碱基与5’端区无规碱基平行配对氢键合力，使引物对3’末端少数1-2个互补碱基在PCR热循环条件下无法独立稳定结合延伸而抑制PD非特异性及推后空白PCR本底Ct值10个循环以上。
[0108] 5.与引物ID互补的等量反义Oligo抑制PD非特异性及推后空白PCR本底Ct值： [0109] 等量的结合70％以上引物序列的反义寡核苷酸Antisense Oligo(＞14base)显著抑制PD非特异性，但也同样没有选择地抑制靶特异性扩增；一对引物3’末端少数碱基反向配对互补在PCR热循环条件下无法独立稳定结合，借助3’末端少数碱基均扭曲转向后的一对引物5’端和中部序列以5’→3’平行配对而形成一些无规氢键的结合力量，这一假设模型提出了如果仅抑制引物ID序列反义Oligo，可能不影响靶特异性扩增情况下选择性地抑制PD非特异性。为了验证和测试引物ID序列是否引物二聚体PD非特异性主要决定因素及引物ID序列的反义Oligo能否独立有效抑制PD非特异性？设置9base、12base同样5’→3’方向ID平行互补的反义Oligo，8base反向ID互补反义Oligo，8base反向5’端互补反义Oligo，8base反向3’端互补反义Oligo与对照组仅引物的空白实时荧光PCR试验。
结果等分子数量的(5μM浓度引物加3μM-6μM反义Oligo)反义寡核苷酸完全抑制优化引物PD非特异性，除5’端互补反义Oligo无作用外，和短的9base 5’→3’方向ID平行互补的反义Oligo作用弱而仅推后本底Ct值3-4个循环，其余本底Ct值为无(扩增曲线均为直线)，引物ID序列的反义Oligo能独立有效抑制PD非特异性，且独立使用和ID不互补/同序引物联用均完全不影响靶标准曲线特异性扩增效率(见实施例标准曲线)。结论：与引物ID互补的等量反义Oligo完全不影响靶特异性扩增情况下，显著抑制PD非特异性及无限推后空白PCR本底Ct值，较长的12base同样5’→3’方向ID平行互补的反义Oligo也有效抑制PD非特异性证明了引物对之间是可以同样5’→3’方向平行配对无规互补而结合的。
结果等分子数量的(5μM浓度引物加3μM-6μM反义Oligo)反义寡核苷酸完全抑制优化引物PD非特异性，除5’端互补反义Oligo无作用外，和短的9base 5’→3’方向ID平行互补的反义Oligo作用弱而仅推后本底Ct值3-4个循环，其余本底Ct值为无(扩增曲线均为直线)，引物ID序列的反义Oligo能独立有效抑制PD非特异性，且独立使用和ID不互补/同序引物联用均完全不影响靶标准曲线特异性扩增效率(见实施例标准曲线)。结论：与引物ID互补的等量反义Oligo完全不影响靶特异性扩增情况下，显著抑制PD非特异性及无限推后空白PCR本底Ct值，较长的12base同样5’→3’方向ID平行互补的反义Oligo也有效抑制PD非特异性证明了引物对之间是可以同样5’→3’方向平行配对无规互补而结合的。
[0110] 以乙型肝炎病毒HBV基因的一对HBVcF/HaBVcR引物作为代表性试验，加入各种反义Oligo，
[0111] 试验管1-6均含5μM常规浓度一对HBVcF/HaBVcR引物的空白PCR试验，同时管1加9hase同样5’→3’方向ID平行互补的反义Oligo、管2加12base同样5’→3’方向ID平行互补的反义Oligo、管3加8hase反向ID互补反义Oligo、管4加8hase反向5’端互补反义Oligo、管5加8hase反向3’端互补反义Oligo、管6不加反义Oligo的仅含引物对照组。管1-6均预反应95℃2-4分钟，然后热循环45次：变性94℃ 20-30秒，退火54℃30秒，延伸72℃20-30秒并于72℃读取荧光值，
[0112] 各反义寡核苷酸As Oligo序列如下：
[0114] 第5个碱基为2’-O-Methyl(OMe)RNA)
[0115] As Oligo2：5’- i2OMe i2OMe -3’(第 7，12个 碱 基 为2’-O-Methyl(OMe)RNA)
[0116] As Oligo3：5’- i2OMe /i2OMe -3’( 第 4，8 个 碱 基 为2’-O-Methyl(OMe)RNA)
[0117] As Oligo4：5’- i2OMe i2OMe -3’( 第 4，8 个 碱 基 为2’-O-Methyl(OMe)RNA)
[0118] As Oligo5:5’- i2O Me i2O Me -3’( 第 4,8 个 碱 基 为2’-O-Methyl(OMe)RNA)
[0119] 试验管号: 1, 2, 3, 4, 5, 6,
[0120] Ct值(循环数):36,无(直线),无,31,无,32,
[0121] 结果(附图8.)管3中加入与引物ID反向互补的等量反义Oligo能够独立抑制引物特别是优化引物PD非特异性以及对优化ID同序引物无限推后空白PCR本底Ct值；管2加入5’→3’方向与引物中部平行配对互补的较长12base反义Oligo也有效抑制PD非特异性,此实验证明了Oligo/引物对之间是可以同样5’→3’方向平行配对互补而形成无规氢键结合的。
[0122] 6.中间ID不互补/同序的优化引物与单链结合蛋白SSB协同抑制PD非特异性: [0123] 单链结合蛋白(Single-Strand Binding Protein,SSB)具有一定的抑制PCR非特异性作用,且不影响靶特异性扩增效率。可能正是SSB不抑制靶特异性扩增的缘故,对没有优化的本底Ct值在30循环前(＜30Ct值)的引物,SSB抑制PD非特异性作用很有限，或许因为没有优化的引物PD非特异性扩增机理类同于靶特异性扩增,只是程度不同而已。试验普通非优化引物、反义Oligo+普通引物、优化的ID同序引物、反义Oligo+ID同序引物等的空白实时荧光PCR；和添加4倍引物分子数的SSB后的普通非优化引物、As Oligo+普通引物、ID同序引物、反义As Oligo+ID同序引物等的空白实时荧光PCR。对比结果,As Oligo对优化引物抑制PD非特异性作用强，而SSB抑制PD非特异性作用差异更大,越是优化好的/本底Ct值越靠后的引物SSB抑制PD非特异性作用越强,两者相互正向协同放大增强抑制PD非特异性；SSB并不进一步增强反义Oligo抑制PD非特异性作用,可能处于同一作用途径。结论SSB作用类似于反义Oligo依靠竞争性结合抑制,对靶特异性结合与PD非特异性结合缺少差异选择性,只有引物设计将这一差异化强化后SSB才具有明显协同增强抑制PD非特异性作用。
[0124] 以乙型肝炎病毒HBV表面抗原的一对未优化引物HBVsF/HBVsR和核心抗原基因人为突变优化的HBVcF/HaBVcR作为代表性试验,
[0125] HBVsF:5’-gca cct gta ttc cca tcc cat c-3’
[0126] HBVsR:5’-ggc ccc caa tac cac atc atc-3’
[0127] HBVcF:5’-atg ccc cta tct tat caa c-3’
[0128] HaBVcR:5’-gat tga gat ctt tg cga c-3’(粗写a为原c人为突变优化,下划线序列同序)
[0129] 试验管1-8含5μM常规浓度各对引物的空白PCR试验，管1普通未优化引物HBVsF/HBVsR,管2普通引物+ID反义As Oligo,管3优化的HBVcF/HaBVcR引物,管4优化引物+ID反义AsOligo3,管5-8分别为管1-4引物及反义As Oligo+4倍引物分子数的SSB，然后管1-7预反应95°C2-4分钟,然后热循环45次:变性94°C 20-30秒,退火54°C30秒,延伸72°C20-30秒并于72°C读取荧光值,
[0130] 试验管号: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
[0131] Ct值(循环数):26,31,38,无(直线),28,35,无(直线),无(直线),
[0132] 结果(附图9.)对于未优化的常规设计引物,空白PCR中加入SSB,或/和加入As Oligo仅轻度抑制PD非特异性扩增；而对精心优化的中间ID不互补/同序的引物对,空白PCR中加入SSB,或/和As Oligo极显著抑制PD非特异性,优化设计与SSB/As Oligo两者相互协同放大其抑制PD非特异性作用,无限推后本底Ct值,于实时荧光PCR检测范围内或45个热循环反应内荧光曲线始终为一条直线,没有非特异性扩增。
[0133] 总之,优化设计的中间ID不互补/同序的引物对是选择性控制引物二聚体PD非特异性扩增的主要内在因素，辅助以分子内外As Oligo竞争抑制ID/和SSB结合等外部条件,完全抑制了引物二聚体PD非特异性扩增，不影响靶特异性扩增前提下,实实在在地改善了PCR非特异性扩增的根本局限。矿物油密闭联合dU底物+UDG酶消化微漏的PCR产物气雾胶再污染,进一步联用引物缓释热启动就彻底杜绝了PCR体系外再污染,保证了PCR临检数个拷贝的灵敏度同时也达到了最高标准的精确性、准确性和重复性要求。 [0134] 本发明应用举例:
[0135] (1).基因表达mRNA水平定量检测(RT-QPCR):
[0136] 随着人类基因组测序工作完成,生命科学正步入后基因组功能基因研究和功能蛋白组时代,需要大量的mRNA逆转录成cDNA进行定量功能研究,基因组不同表达定量展示,一些与临床疾病相关联的指示基因被发现越来越多,这些都需要大量的mRNA逆转录cDNA定量荧光PCR工作。样本RNA常规异硫氰酸胍一步法或Trizol方法制备,没有特殊要求。反转录(RT)即可常规分逆转录、扩增两步反应，亦可与PCR一步反应。快速检测选择一步RT-PCR单管反应，单管加入两种不同的酶，即用于RT的反转录酶(如AMV或M-MLV突变体、SuperScript II/SuperScript反转录酶等)，用于实时PCR的热稳定DNA聚合酶(如Taq、Taq Plus等)。热稳定DNA聚合酶活性在反转录过程中被其抗体所抑制,进入PCR过程的高温变性使反转录酶失活,同时也使抑制热稳定DNA聚合酶的抗体失活,使扩增反应顺利进行。还有一种策略是使用既具有反转录酶活性,又具有DNA聚合酶活性的Tth耐热聚合酶。
[0137] (2).微量蛋白抗原定量通过抗体交联Oligo定量检测:
[0138] 传统的抗原抗体酶免检测定量ELISA方法特别是化学发光ELISA方法非常准确、已十分成熟并大量应用,但灵敏度仍显不够,一般仅能达纳克级。更微量的抗原抗体分子定量检测有赖于新型免疫PCR技术途径,靠指数式扩增检测的飞克级灵敏度添补这一分子定量检测空白，本发明应用于免疫PCR,抗原或抗体交联链亲和素,通过生物素标记24-30base长的寡核苷酸DNA监测免疫反应,对应的寡核苷酸DNA量实时荧光PCR定量测定,标准曲线校正。抗原或抗体亦可以采用双功能交联剂直接共价偶联。
[0139] (3)传染病源基因筛查/定量检测:
[0140] 传染病源实时荧光PCR是最早开始使用实时荧光PCR领域,以传染病检测和血液筛查等实时荧光PCR带动或开创了分子诊断行业,传统的传染病酶免检测可以并逐渐都有相应的传染病源实时荧光PCR定量检测,没有酶免检测窗口期的漏检,提供更精细的更高的灵敏度。本发明应用实施例提供一些代表性实践样板。进一步的甚至传染病易感人群易感基因的筛查。
[0141] (4)遗传病源基因筛查检测:
[0142] 一些典型遗传性疾病源于先天基因缺限如α地中海贫血、蒙古痴呆症、杜氏肌营养不良、甚至遗传性糖尿病等,随着技术进步,会有更多疾病可能涉及遗传基因原因,实时荧光PCR特别本发明没有引物二聚体非特异性干扰的实时荧光PCR可作为一种快速、简便和有效的分析遗传病方法。
[0143] (5)代谢病及肿瘤基因SNP检测及早期预警:
[0144] 随着现代生活水平的优越,代谢性疾病及肿瘤越来越成健康主要问题,不良生活习惯也还 要通过一定的内因-内在基因起作用,越来越多的证据显示基因的单核苷酸多态性SNP与代谢性疾病关联,肿瘤往往由众多突变积累、与众多SNP基因关联,而几乎都不是单一基因决定的,随着后基因组时代人类SNP数据库的完善,检测SNP的相关实时荧光PCR在医学诊断和个性化治疗方面有着巨大广阔的应用前景。
[0145] (6)基因指纹鉴定及医疗基因配型检测:
[0146] 对于一些具有身份识别的标志性基因如短串联重复序列/微卫星DNA、Y染色体基因、线粒体基因、HLA相关基因的PCR扩增及限制性片段长度多态性分析、或扩增片段长度多态性分析已成为法医学个体识别及亲权鉴定,和医疗组织配型的主要可靠方法。采用本发明优化引物进行饱和染料LC Green实时荧光PCR与高精度PCR仪(LightCycler480)扩增再进行高分辩熔解曲线(HRM)分析方法必将成为新一代基因指纹鉴定及医疗基因配型检测最锋利的工具。
[0147] (7)耐药细菌及病毒基因筛查/定量检测:
[0148] 抗生素等药品的滥用及不正确用药造成了当今耐药菌泛滥,新药研发速度远感不上细菌抗药性的发展,特别是已出现了一些个超级耐药菌，照此下去,人类很快面临乏药可用,无药可用医的局面。快速极高灵敏度的实时荧光PCR技术将成为战胜抗药性迅速发展的超级细菌有力武器。
[0149] (8)食品污染肠道致病细菌和肠道致病病毒基因安检:
[0150] 时下食品安全问题愈来愈成为全民广泛关注的一个焦点,除了化学品污染外,生物有害污染也是一大健康杀手即所谓“病从口入”,本发明应用于致病金葡菌、沙门氏菌、志贺杆菌和致病大肠杆菌四重肠道菌实时荧光PCR试剂盒,肠道病毒EV、轮状病毒、纽瓦克病毒和甲肝病毒四重肠道病毒实时荧光PCR试剂盒,不仅可应用于临床检验科快速诊断,还可以用于食品生产、食品安全检测。
[0151] (9)转基因农产品及加工食品筛查/定量检测:
[0152] 转基因技术大幅度提高了农作物的产量、品质和效益,但其生物安全问题也日益受到各国政府以及公众的关注,农产品及加工食品转基因成份监测已提升为食品监管的重要手段及科学发展转基因产业的根本保障,一般以各种转基因共同的启动子基因作为待测模板,进行实时荧光PCR快速检测。
[0153] (10)农牧业病虫害筛查/定量检测:现代农牧业也进入了一科学化大发展时代,廉价先进的实时荧光PCR技术在农牧业也有着极广阔的应用之地。
[0154] (11)育种优良基因SNP筛查/检测:优良基因筛选育种无论从时间、效率、效果、成本那一个方面均要远远优于传统一代一代碰运气的低效育种方法手段,廉价高效的实时荧光PCR技术将成为基因筛选育种方法的得力助手和重要技术工具。
[0156] (13)发酵工业细菌基因定量检测:发酵工业工程菌的监控和有害菌污染品质监测也离不开廉价实用的实时荧光PCR技术及本发明的改良。
[0157] (14)其它,如研发领域任何微量基因扩增、定量测定。
[0158] 本发明优点:
[0159] (1)本发明“一种引物中部序列干扰PCR技术”抓住了引物特异性与非特异性扩增差异化,通过引物中部序列干扰控制了PCR最关键的引物二聚体PD非特异性扩增,使低浓度基因定量准确，适用于绝大多数调控/功能基因低拷贝数的准确定量测定和基因微量差别的准确定量/检测,真正发挥出了PCR极高灵敏度特性。
[0160] (2)引物中部序列干扰控制了PCR热循环反应体系内的非特异性扩增；而引物缓释热启动配合矿物油封闭加dU底物和UDG酶消化微漏的PCR产物气雾胶就杜绝了PCR体系外再污染；可靠的简单综合挫施适合于临床分子诊断,临床诊断绝不能有引物非特异性假阳性结果,巧妙的引物中部序列干扰挫施控制了PCR最关键的PD问题也就解决了临检最高标准的精确性、准确性和重复性要求问题,特别适用于传染性疾病的实时荧光PCR定量检测及准确诊断。
[0161] (3)没有PD干扰的中部不互补/同序引物促进高分辩熔解曲线(HRM)分析，由于饱和性荧光染料LC Green结合DNA效率极高,HRM能反应单碱基变异的微细变化,但也带来更严重的PD干扰,没有优化引物进行高分辩熔解曲线(HRM)分析几乎不可能,中部不互补/同序引物极大提高了HRM(对比标准品)鉴别特异“基因指纹”分辩率。 [0162] (4)没有互相干扰的引物适合多重(/元)PCR扩增技术,多重过量引物更难以逾越的引物非特异性扩增障碍只有优化引物及引物中部序列干扰技术才能克服,特别适用于肠道或呼吸道病源多重荧光PCR检测。
[0163] (5)适合等温快速扩增技术,等温扩增一般反应温度较低更易产生引物二聚体非特异性扩增,中部不互补/同序优化引物特别有助于提高快速基因诊断准确性。 [0164] (6)适合微纳PCR芯片技术,微纳PCR芯片缩微装置更加不容易控制引物非特异性扩增,仅优化引物设计及引物中部序列干扰就能解决微纳PCR芯片非特异性问题。 附图说明:
[0165] 图1.为排除引物二聚体PD形成原因示意图,长线条代表DNA寡核苷酸链及标出5’3’方向,符号▲∧代表互补碱基,●×代表非配对不互补碱基，(a)首先排除一对连续碱基互补但3’最末端两碱基不互补引物不会有效扩增；进而推广到(b)(c)一对中间/5’端有连续碱基互补引物,但3’末端均不配对就不会扩增；甚至(d)(e)一引物3’末端与另一引物中间/5’端完全连续互补也不促进引物二聚体PD形成。
[0166] 图2.为引物二聚体PD扩增可能机理示意图,长线条代表DNA寡核苷酸链及标出5’3’方向,符号▲∧代表配对碱基,×○代表不互补碱基和弯线条代表不互补序列，由于一引物3’末端与另一引物中间/5’端少数碱基配对互补需要借助临近无规配对氢键才能稳定结合，(c)一引物3’末端与另一引物中间3’末端借助剩余反向配对序列短而无规氢键少,不易PD；(d)一引物3’末端与另一引物5’端少数碱基反向互补借助其余反向配对序列长而无规氢键多,但合力强使双链反复重结合且延伸距离短,也不易PD；(b)一引物3’末端与另一引物临近3’端少数碱基反向互补且间隔最末端1-2个碱基,间隔远类似(c)(d)；间隔近类似(a)一对引物3’末端相互间少数碱基反向互补,只能借助3’末端均反折后5’3’平行配对氢键合力。
[0167] 图3.中部序列干扰设计的引物公式,(a)一对中部ID6-8base不互补/同序的引物公式,Fn代表上游引物序列碱基,Rn代表下游引物序列碱基,T代表中部ID不互补或同序的碱基；(b)反义寡核 苷酸As Oiligo公式,On代表与引物ID及中部能配对互补的7-10base反义碱基序列；(c)添加5’Oiligo反折分子内干扰ID的引物公式,长线条代表引物链及标出5’3’方向,短杆代表引物链内配对互补碱基,与ID互补的5’端是额外添加5-7base反义As Oiligo碱基,与ID同序引物策略联用时5’As Oiligo移为ID-5’区结合部互补序列。
[0168] 图4.为未优化普通引物的实时荧光PCR标准曲线,以肠道病毒阳性对照质粒8
pUTRev4×10 拷贝依次作10倍稀释,其Ct值:13,16,19.5,23,26,29,30,30.5,30.5,31,
3
从4×10 拷贝开始全挤在Ct值30个循环左右,PCR系统内外非特异性全在Ct值30循环处。图5.为PD成因实验,扩增曲线图数字号1-7为试验管号，管1-2是一引物3’末端以另一引物也是3’端为模板,能大量PD扩增,Ct值6-12；管3,4/5,6是一引物3’末端以另一引物中部/5’端区为模板,Ct值＞30不提前,不是PD形成主要原因。
pUTRev4×10 拷贝依次作10倍稀释,其Ct值:13,16,19.5,23,26,29,30,30.5,30.5,31,
3
从4×10 拷贝开始全挤在Ct值30个循环左右,PCR系统内外非特异性全在Ct值30循环处。图5.为PD成因实验,扩增曲线图数字号1-7为试验管号，管1-2是一引物3’末端以另一引物也是3’端为模板,能大量PD扩增,Ct值6-12；管3,4/5,6是一引物3’末端以另一引物中部/5’端区为模板,Ct值＞30不提前,不是PD形成主要原因。
[0169] 图6.为PD成因实验,与引物3’末端互补的低Tm值短双链Oligo作为引物扩增模板,管1-3是不同浓度Oligo能有效低温退火再扩增,Ct值15-22；而短双链Oligo与引物3’末端弱结合缺乏3’端外借力,管4-6是稍高＞40°C退火PCR不扩增,Ct值＞35；证明一对引物3’末端少数碱基反向互补弱结合PCR条件下需要借助3’端外合力才能稳定退火PD扩增。
[0170] 图7.为ID不互补/同序引物抑制PD实验,管1-3是随同序程度减低而Ct值提前,管4反向同序失去了同序抑制PD作用,管6/7,8部份不互补/同序序列放在引物ID关键位置也能达到高度同序引物抑制PD作用。ID不互补/同序引物对可能是主要通过破坏/分散3’末端少数互补弱结合与3’端外氢键合力抑制PD。
[0171] 图8.为ID区As Oligo抑制PD实验,管1-2平行互补的长As Oligo抑制PD证明Oligo-引物间5’3’方向可以平行配对结合,所以引物对之间也可以5’3’平行配对结合；管3引物ID区AsOligo也像管5引物3’端区As Oligo能独立有效地抑制PD；管4引物5’端区As Oligo类同管6对照组不能抑制PD。
[0172] 图9.为SSB协同ID同序引物抑制实验,管1普通引物对比管3ID同序优化引物,加入As Oligo的管2对比管4,As Oligo抑制PD优化引物作用非常明显；对比再加入SSB的管5-管8,SSB协同ID同序优化引物抑制PD作用更加明显。
[0173] 图10.为肠道病毒SYBR Green I实时荧光PCR作标准品pEV(0.1μg/ml)10倍稀6
释标准曲线,结果Ct值依次为16,20,24,28,32,36,40,直线；对应的拷贝数为其3×10,
5 4 3 2 1 0
3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,0拷贝/每反应,5组稀释标准Ct值完全重
合。
释标准曲线,结果Ct值依次为16,20,24,28,32,36,40,直线；对应的拷贝数为其3×10,
5 4 3 2 1 0
3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,0拷贝/每反应,5组稀释标准Ct值完全重
合。
[0174] 图11.乙型肝炎病毒（HBV）标准定量曲线:HBV核心抗原质粒对照pUCHBcore10
0.1μg/ml约3×10 /ml拷贝,作10倍稀释模板的SYBR Green I法标准定量曲线,最左
10
边第一条扩增曲线为0.1μg/ml模板约3×10 拷贝,随之作10倍稀释,最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照,结果Ct值依次为12.5,16,19.5,22,25.5,29,32.5,36,38，本底对照Ct值在45循环内基本为一直线,在PCR反应内几乎没有扩增Ct值。标准定量曲线梯度分布均间隔3.3个Ct值,尤其低拷贝梯度拉得开,扩增效率100%。多次重复性非常好。
0.1μg/ml约3×10 /ml拷贝,作10倍稀释模板的SYBR Green I法标准定量曲线,最左
10
边第一条扩增曲线为0.1μg/ml模板约3×10 拷贝,随之作10倍稀释,最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照,结果Ct值依次为12.5,16,19.5,22,25.5,29,32.5,36,38，本底对照Ct值在45循环内基本为一直线,在PCR反应内几乎没有扩增Ct值。标准定量曲线梯度分布均间隔3.3个Ct值,尤其低拷贝梯度拉得开,扩增效率100%。多次重复性非常好。
[0175] 图12.为乙肝HBV改良TaqMan法实时荧光PCR标准品pHBcore(1μg/ml)10倍稀释标准曲线，结果Ct值依次为15.5,19,23,26.5,31,35,37，本底对照Ct值为39。对应的9 8 7 6 5 4 3
拷贝数为其3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,3×10/ml,和本底0拷贝/ml,
灵敏度刚好较染料法低一个数量级。
具体实施例：
拷贝数为其3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,3×10,3×10/ml,和本底0拷贝/ml,
灵敏度刚好较染料法低一个数量级。
具体实施例：
[0177] 实施例一：人肠道病毒致病株实时荧光PCR检测：
[0178] 近年手足口病开始在我国幼儿中大规模流行，且病死率高。其病原肠道病毒(EnteroVirus，EV)的核酸实时荧光PCR检测成为监控其传染流行的重要技术手段，EV为RNA病毒，最初分为60种以上不同的血清型、包括肠道病毒68-71型。基于其核酸序列分类，人EV义分为A、B、C、D和PolioVirus五类，其中主要致病株CoxsackieA16(CA16)、EnteroVirus 71型(EV71)被归为人肠道病毒A型。肠道病毒EV基因变异大，仅5’UTR保守，有三段所有株共同同源保守区(下划线处)，发表的EV通用引物均选择此保守区因也会扩增非致病株而误检，只能作为总EV鉴定检测；有些EV71型鉴别引物选变异大的VP1区义会造成一定漏检。
[0179] 本实施例根椐一般常规引物设计原则及以上叙述的本发明3’细则来选取EV共同保守区EV71(SHzH98株)5’UTR同源保守区作为备选待扩增区：
[0180] 421cgaaaaatct cggcccct gaatgcggct aatccCaact
[0181] 481gcggagcaca cgccctcaag ccagcgggta gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcg[0182] 541 tcc gtgtttcctt ttatctttat attggctgct tatggtgacaatt
[0183] 将其反意义链序列与备选的有意义链平行比对Alignment，经反复比对各型肠道病毒基因，尽可能地找出连续不互补/同序的6-8个碱基序列，发现在nt434-448：为致病株CA16和EV71共有(同源)的特异序列可作为致病株检测上
游引物，第二段所有株共同保守区nt538-557： 反意义链有同序而作
为逆转录和下游引物。第一段所有株保守区nt 458-481：cct gaatgcggctaatccCaactg可作为荧光水解探针序列，其nt476位出现C大多为EV71株；T为CA16株，但变异太靠近3’末端PCR不易辩别亚型，探针3’末端加茎结构a ttc agg序列作为改良探针仍可检测总致病株。本实施例采用SYBR Green I实时荧光RT-QPCR作为肠道病毒总致病株检测盒，而LC Green实时荧光PCR及高分辩熔解曲线(HRM)分析作为EV71和CAl6亚型鉴别。
游引物，第二段所有株共同保守区nt538-557： 反意义链有同序而作
为逆转录和下游引物。第一段所有株保守区nt 458-481：cct gaatgcggctaatccCaactg可作为荧光水解探针序列，其nt476位出现C大多为EV71株；T为CA16株，但变异太靠近3’末端PCR不易辩别亚型，探针3’末端加茎结构a ttc agg序列作为改良探针仍可检测总致病株。本实施例采用SYBR Green I实时荧光RT-QPCR作为肠道病毒总致病株检测盒，而LC Green实时荧光PCR及高分辩熔解曲线(HRM)分析作为EV71和CAl6亚型鉴别。
[0184] 所以，选取EV致病株PCR引物如下：
[0185] EV3F：5’-gag cta gtt agt agt cct c-3’
[0186] EV3R：5’-c acc caa agt agt cgg ttc-3’(下划线处为同序碱基) [0187] (1)样本RNA提取：首选疱疹液、咽拭子，或血液、脑脊液，发病3天可选肛拭子或粪便浸出液(或细胞培养物)0.1ml，粪便浸出液须自然沉淀10分钟，取上清0.1ml(或0.1g固体标本)加RNA裂解液1ml(0.5ml的4M GTC液+0.5ml水饱和酚)或商业试剂Trizol变性裂解，强烈漩涡振荡，再加100μl氯仿振荡，最高速离心10分钟，取上清加3×结合缓冲液(6M碘化纳NaI)移至商业磁微球试剂或硅胶纯化柱(详细操作按商业公司说明书进行)，用洗涤缓冲液(含70％EtOH的2M NaI液)洗柱两次，加50μl DEPC处理的dH2O洗脱、离心收集纯化的RNA。或裂解上清加等量异丙醇和l/10体积的2M醋酸钠(PH4.0)置-20℃2小时再离心沉淀，75％冷乙醇洗涤一次，加50μl DEPC处理的dH2O溶解。
[0188] (GTC液：65℃溶解的4M异硫氰酸胍+0.1mM DTT和0.5％Sarkosyl.)
[0189] (2)RT实时荧光PCR：
[0190] 逆转录-实时荧光PCR两步合并单管反应：
[0191]
[0192] 反应液表面小心沿管壁再加30ul矿物油密闭!
[0193] 实际操作时,首先配制不加模板的50次×15μl=1.5ml反应混合液,既每个成份加50倍单个反应体积,混匀,平行分装96×15μl于96孔板或0.2ml的PCR反应管,每孔或每管再分别加10μl标本DNA/RNA或模拟标准品。每个检测平行5份×25μl计平均Ct值。标准曲线及质控：将EV部分5’-UTR序列插入pUC19酶切载体、克隆生成pUC-EV3L6 8
模拟阳性的质粒定量对照,质粒长2.8kb,分子量MW=1.8×10,计算1ng=3.3×10copy分子。质粒pUC-EV3L小提(Miniprep)制备DNA,测光密度OD260/OD280,按1个OD260值=50μg/ml DNA计算含量,并用TE液稀释成1μg/ml作为定量对照标准品。
模拟阳性的质粒定量对照,质粒长2.8kb,分子量MW=1.8×10,计算1ng=3.3×10copy分子。质粒pUC-EV3L小提(Miniprep)制备DNA,测光密度OD260/OD280,按1个OD260值=50μg/ml DNA计算含量,并用TE液稀释成1μg/ml作为定量对照标准品。
[0194] 模拟标准pUC-EV3L(1μg/ml)×10-2,×10-3,×10-4,×10-5,×10-6,×10-7,×10-8稀释。
[0195] 上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988、TL988-Ⅱ型和MJ Inc.DNA Engine TMOption 2),或具有激发光波长480nm和检测波长520nm任一款式实时荧光PCR仪。首先
1-5个循环逆转录RNA变性74℃4分钟，50℃20分钟；再PCR变性94℃2分钟，然后45个热循环，95℃20秒，54℃40秒，72℃30秒。于72℃读取荧光值。可设置50℃-90℃熔解曲线分析,或LC Green实时荧光PCR使用高分辩熔解曲线(HRM)分析。
1-5个循环逆转录RNA变性74℃4分钟，50℃20分钟；再PCR变性94℃2分钟，然后45个热循环，95℃20秒，54℃40秒，72℃30秒。于72℃读取荧光值。可设置50℃-90℃熔解曲线分析,或LC Green实时荧光PCR使用高分辩熔解曲线(HRM)分析。
[0196] (3)实验结果(见附图10)分析:
[0197]
[0198] (质粒pUC-EV3L标准品DNA,MW:1.8×106)
[0199] 结果:实时监测原始数据曲线图10为质控模拟阳性的实时荧光PCR扩增荧光曲线,批内5组重复定量标准扩增荧光曲线高度一致,扩增对数初期曲线完全重合，批间重复性一致甚至不同批次样本检测可参考比对同一个定量标准曲线而分析结果一样。待测样本模板初始拷贝量的负对数与扩增Ct值之间线性标准曲线大多由实时荧光PCR仪程序自动生成,样本拷贝数也可自动转换成浓度。实时荧光PCR程序分析实验结果图、熔解曲线分析图及LC Green实时荧光PCR实验图由于已有较多的附图等篇幅所限而未在此展示。结果判定:Ct值≤37为阳性,Ct 值≥39为阴性,Ct37-Ct38为灰区如熔解Tm值＞80℃为阳性,Tm值≤76℃为阴性,否则重测。目前模拟标准、培养EV检测准确可靠,但临床HEV样本检测结果差异较大，且样本数量尚不足以作结论。
[0200] 实施例二：人乙型肝炎病毒SYBR Green I实时荧光PCR:
[0201] 乙型病毒性肝炎（简称乙肝）由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起的一种世界性的传染性疾病。在我国人群中乙肝感染率非常高，极大的危害了人们的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增（PCR）荧光定量法等。酶免疫法应用较广，但是实时荧光PCR分析法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒基因含量,对感染者病毒复制水平的判断,病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。本实施例HBV实时荧光PCR又分A.乙肝HBV载量测定和B.乙肝HBV耐药株YIDD和YVDD检测。
[0202] A.乙型肝炎病毒（HBV）载量测定:
[0203] 乙型肝炎病毒（HBV）为部分双链DNA病毒，主要有三段种型特异保守区，分别位于表面抗原HBsAg区,X区和核心Core区,大部分HBV实时荧光PCR研究集中选择核心Core区和表面抗原HBsAg区。HBV核心Core区有正负双链DNA,表面抗原HBsAg区仅含负链DNA单链,且大量二级结构亦集中于此区域,影响PCR扩增效率。比较大多数发表的核心Core区PCR引物序列,仍存在一些明显的引物间形成二聚体碱基互补序列,甚至不符合一般引物设计通用原则,试用于PCR,其实际引物二聚体大都在Ct值30循环处。
[0204] HBVcore实时荧光PCR引物设计:
[0205] 根椐一般常规引物设计原则及以上叙述的本发明3’细则来选取HBV共同保守区作为备选引物序列,并将其反意义链序列与备选的有意义链序列平行比对Alignment,尽可能多地找出连续不互补/同序的5-8个碱基序列,从中选优以尽量减少引物二聚体来综合考虑、设计，备选了数对同序引物因其它如过多连续GC影响PD、二级结构不能扩增HBV病毒等原因不能入选而放弃。最后本发明精选乙型肝炎病毒（HBV）核心Core区基因作为待测模板，以乙型肝炎病毒（HBV）核心Core区（CDR:2306-2444）一段序列作为HBV同序引物的核酸扩增靶特异序列,展示两端各20碱基Core区（nt:2306-2444）序列如下: [0206] AB540584Core区（nt:2306-2444）
[0207] CAAATGCCCC TATCTTATCAAC––––––GTCGCAGAAGA TCTCAATCTC
[0208] 优选HBVc引物序列如下:
[0209] HBVcF:5’-at gcc cct a tca ac-3’
[0210] HBVcR:5’-g att gag c tgc gac-3’
[0211] (HaBVcR:5’-g att gag tgc gac-3’)
[0212] 由于上、下游引物HBVcF/HBVcR之间仅有atc tt五个碱基同向/平行同序,互斥作用力度不够,其本底Ct值仅推后5个循环为35循环数左右；因此在同序碱基右侧或3’侧再人为变化增加一个同序碱基,根据碱基错配强度顺序及不影响特异扩增效率原则将下游引物第13个c突变为a碱基成为下游引物HaBVcR,引物HBVcF/HaBVcR本底Ct值推后后至38-39循环数左右,非特异性PD扩增Ct值刚好落在特异扩增检测范围外最低值边缘。
[0213] 为了进一步控制HBV实时荧光PCR非特异性,降低或彻底消除本底扩增，本实施例联用引物ID反义As Oligo干扰技术，选择上游引物HBVcF的ID反义干扰寡核苷酸HBcFi,其序列为:5’-a taa/i2O Me g/ata/i2O Me g/-3’,其中第5,9个碱基g为2’-O-Methyl(OMe)RNA；选择下游引物HBVcR设计争对ID与5’区间反义干扰寡核苷酸HBcRi:5’-aga aga tct c-3’,其中第5位g为2’-O-Methyl RNA反义碱基,3’末端标记磷酸基团封闭(合成定购于上海生工生物工程有限公司)；一般仅选一端引物反义As Oligo干扰足够。首先用dH2O配制100μM引物和反义As Oligo储存液Stock,再用20%Dextran(w/v)稀释Stock成1.25μM引物HBVcF和1μM反义寡核苷酸HBcFi作为4×缓释引物;或HBVcR稀释成5μM加入等量/4μM的HBcRi反义干扰寡核苷酸。加入等量As Oligo引物本底Ct值推迟至45个循环数以后。
[0214] 以临床检验的已知HBV阳性标本血清作为阳性对照血清,选择一些强阳性血清用购买的标准单位含量DNA标定后再用灭活阴性血清作10倍稀释作为标准浓度梯度血清,阳性血清、浓度梯度血清和阴性血清均参与标本DNA处理。同时扩增全长Core区(1900-2450)片段且两侧带酶切位点序列550bp片段,将该片段酶切并克隆至pUC19载体作为乙肝模拟定量对照DNA(pHBVc),并且TaqI甲基化酶甲基化后以pUC19(1ng/ml)液从0.01μg/ml点开始作10倍稀释7次生成10倍模拟梯度定量标准品,并加入保护液-200C冻存,模拟定量标准DNA直接取5μl上样。
[0215] 采用热启动聚合酶KlenTaq、Taq(Stoffel fragment)/或Taq(5U/μl)中加入微量0.5-0.7mg/100ml Poly-Phosphoric Acid(Sigma04101,多聚磷酸),其所带负电菏常温时结合抑制Taq酶而热启动释放Taq酶活性,与反义寡核苷酸结合缓释引物联用双重热启动,进一步保证了靶特异扩增可靠性。底物dNTP中用dUTP代替dTTP并配合UDG酶预处理,一般于Taq(5U/μl)中加10%量的重组酶rUDG(1.5mg/ml)。
[0216] (1)标本DNA处理：
[0217] 采用一步煮沸法，取50μl-100μl血清加等量的2×煮沸缓冲液(用前充分混匀微珠,剪大口吸头吸取)，轻混,置沸水浴10分钟,经4℃短暂冷确后高速离心10分钟，取上清加样5μl。上样DNA含量等于稀一倍。
[0218] 弱阳性标本采用先PEG沉淀HBV后煮沸法,取血清500μl加500μl 20%(w/v)PEG盐液，Vortex混匀，高速离心10分钟沉淀病毒，弃上清970μl，沉淀留30μl加30μl dH2O再加等体积60μl的2×煮沸缓冲液，余同上煮沸法,上清加样5μl。但PEG沉淀回收率平均为60%,定量检测计算上样DNA含量等于浓5倍。或采用商业硅胶纯化柱或磁微球试剂盒提取。
[0219] (2×煮沸缓冲液:采用弱碱和去蛋白沉蛋白等试剂)
[0220] (2)SYBR Green I荧光PCR反应：
[0221] 使用25μl反应体系,由于SYBR Green I对单链和低于0.1μg/ml(1010拷贝数)DNA结合率极低,荧光本底很低,但对进入对数期扩增的高浓度DNA结合率增加数千倍,荧光信号强列使SYBR Green I PCR系统灵敏敏度高于探针法PCR 一个数量级,(反应体系25μl荧光信号已大大过剩,还可以减低至纳升级,更加适合高通量的微纳PCR芯片反应)。
[0222]
[0223]
[0224] 首先每个PCR管先加2μl的缓释引物HBVcF(1.25μM)于管底!后加反应混合液18μl于相应PCR管的近管底的管壁处;再每反应管再沿上部管壁小心加30μl石蜡油/矿物油,不要混匀,以防破坏缓释!管底缓释引物可以被随后热变性95℃释放热启动。梯度标准5μl和样本5μl最后加样且必须每管换一个吸头,取样5μl吸头插入矿物油层下面小心注入,PCR管盖好后不要混匀!短瞬离心使矿物油面上残留液沉下去,以防残留液扩增汽雾胶泄漏。也可以变通增加一倍反应体积总50μl，缓释引物、反应混合液、石蜡油均增加一倍体积,可上样10μl样本检测。染料SYBR Green I也可预加入缓释引物中,其颜色能辅助微量加样时可视而更准确,还能防止SYBR Green I通过汽雾胶泄漏污染实验室而危害健康。临床检验试剂盒还可配制预混5×反应混合液、10×反应混合液以进一步减少操作者工作量。
[0225] 每个检测可平行2-3份×25μl-50μl计平均Ct值,分析统计结果。
[0226] 上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型仪器和激发光波长:480nm,检测光波长:520nm的任一款实时荧光PCR仪),按使用说明书操作。首先预反应50℃2分钟-95℃4分钟，然后45个循环:94℃20-30秒，54℃30秒，72℃20-30秒。于72℃读取荧光值,并设置50℃-90℃熔解曲线分析。有矿物油封闭,实时荧光PCR仪仍需要设置热盖以防止矿物油面上微量残留液热循环时蒸发至PCR管盖形成冷凝水挡住荧光光路而影响荧光值,但设置热盖不需要热盖达到预设温度时就可启动PCR,先启PCR热变性95℃4分钟使矿物油面上残留液在热循环前尽量蒸发挤出管外。
[0227] 也可不加SYBR Green I的反应液进行常规终末PCR35次热循环反应,扩增条件相同,矿物油代替热盖,产物用1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测(电泳时荧光染料影响电泳迁移率)。
[0228] (3)实验结果分析:
[0229] 模拟阳性基因质粒pHBcore(MW2.1×106)定量标准品作10倍稀释梯度,其系列浓度与拷贝数的换算及SYBR Green I实时荧光PCR产生的Ct值线性关系见下表: [0230]
[0231] 质粒pHBcore标准品DNA,MW:2.1×106
[0232] SYBR Green I实时荧光PCR实时结果见附图11,作10倍稀释模板的标准定量曲线,表左边第一条扩增曲线为0.01μg/ml模板约109拷贝/ml,随之10倍稀释,最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照,本底对照Ct值在45PCR循环内几乎没有扩增Ct值。 [0233] 血清样本加等量煮沸缓冲液后上样5μl,较标准品5μl稀释了一倍。根据标准曲线Ct值所得样本拷贝数或国际单位须乘两倍,按下表样本换算。Ct值≤37为阳性,Ct>38为阴性,融解曲线分析,阳性Tm值87℃,Tm<78℃为阴性。(经标准品测算本发明技术方案6个拷贝数约等于1个国际单位)。
[0234]
[0235]
[0236] HBV DNA MW:1.57×106~2.09×106（HBV颗粒大小不一）
[0237] 购买中检所乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量标准品(批号0711)阳性参考品及定量参考品L1-L5标准检测结果与标准值基本一致,阴性参考品全为基线反应。北京佑安医院、河南省直第三人民医院、河南省武警总医院等三家医院临床试验500多例检测,其中阳性标本450多例，采用上海克隆生物高技术有限公司生产的“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒”,国药准字号:S20040029,有效期至20130607,作为对比试剂；对检测结果不一致的样本采用第三方罗氏分子诊断公司“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒”,国食药监械(进)字2008第3403079号,有效期48个月,进行复测。结果总结:对HBV大三阳阳性和HBV大三阳阴性的血清样本进行检测，乙型肝炎病毒HBV核酸检测灵敏度95.45%,高于对比92.04%；检测特异度99.28%对比98.53%；检测假阴性率4.55%对比7.96%；检测假阳性率0.72%对比1.47%；标定试剂检测结果与HBV大三阳ELISA检测结果的总符合率为95.58%，根据本发明研发的“乙型肝炎病毒HBV核酸荧光定量PCR检测盒”检测结果与HBV大三阳ELISA检测结果的总符合率97.59%,高于对比试剂总符合率为95.58%。 [0238] B.乙型肝炎病毒（HBV）耐药变异株检测:
[0239] 乙肝的治疗采用α-干扰素和核苷酸类抗病毒药拉米夫定（Lamivudine）,然而拉米夫定治疗中受药物选择而容易产生耐药变异株。据临床统计,血清e抗原阳性病人经一年拉米夫定治疗，会有14-32%耐药，长期治疗，第二、三、四年的耐药率增加至38%、49%和66%（KarayianmisP.,Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003,51:p761-785）。耐药株基因变异主要在HBV多聚酶活性区PoL/RT片段（349-692aa，即rt1-rt344）,常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸YMDD变异，即由YMDD变异为YIDD（rtM204I）或YVDD（rtM204V）,YVDD常伴有rtL180M变异（Lai CL.,et.al.,Clin.Infect.Dis,2003,36:p687-696）。而且血清HBV RNA的YMDD变异更早于HBV DNA变异检测（Hatakeyama.,et.al.,Hepatology;2007,45-5:p1179-86）。因此，检测HBV YMDD基因变异尤其RNA的YMDD变异对调整治疗方案，合理用药、及时用阿德福韦（adefovir）代替拉米夫定的耐药无效治疗具有重要的指导意义。
[0240] 选择乙型肝炎病毒（HBV）包含PoL/RT片段基因作为待测模板，以乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶活性区或S区（CDR:596-764）一段序列作为HBV耐药变异株的核酸扩增靶特异序列,展示两端各约20碱基PoL/S区（nt:596-764）YMDD、Y DD、Y DD序列分别如下: [0241] GCA CCT GTA TTC CCA TCC CAT C------TAT ATG GAT GAT GTG GTA TTG GGG GCC [0242] GCA CCT GTA TTC CCA TCC CAT C------TAT A GAT GAT GTG GTA TTG GGG GCC [0243] GCA CCT GTA TTC CCA TCC CAT C------TAT G GAT GAT GTG GTATTG GGG GCC [0244] (粗黑体碱基代表点突变)
[0245] 单核苷酸突变检测亦采用ARMS(Newton,C.R.et al,1989,Nucleic Acids Res,17:2503)技术引物设计,单点突变碱基置于一端引物3’最末端使突变序列选择性扩增,然而单碱基突变不足以抑制野生未突变序列扩增，因此常在引物3’末端倒数第二/第三位置人为增加一个突变,采用轻度错配嘌呤变嘌呤、嘧啶变嘧啶使突变序列扩增轻微影响情况下野生尽量不扩增。为了控制单核苷酸突变PCR引物二聚体PD非特异性扩增干扰,联用5’端分子内反折干扰引 物(见附图3c)，且在引物3’末端倒数第三至ID的碱基标记荧光发光基团中间6-FAM-dT/中间Cy3-dT,而在其5’端标记荧光淬灭基团dabcyl、或采用5’dG淬灭序列,另一边采用非5’端分子内反折的普通引物,实现双荧光标记引物双重单核苷酸突变实时荧光PCR。
[0246] 所以,选取HBV YMDD耐药突变株PCR引物如下:
[0247] YMDDF:5’-cct gta ttc cca tcc cat c-3’
[0248] 5YIDR:5’dabcyl-t gtg gta-ccc caa wac cac a/6-FAM-dT/c at a-3’ [0249] 5YVDR:5’dabcyl-t gat gtg-c caa wac cac atc a/Cy3-dT/c ac-3’ [0250] (下划线处为5’端分子内反折干扰As Oligo序列,粗黑体 代表人为轻度错配突变)
[0251] 样本DNA处理同上HBV载量测定,样本总RNA提取同上实施例一；荧光标记引物实时荧光PCR操作包括配制没有染料的反应混合液,引物及荧光引物、底物dNTP、缓冲液Buffer、聚合酶Taq加量及加样均同上HBV载量测定。上2-4个荧光通道实时荧光PCR仪,激发光波长:490nm,检测光波长:520nm检测YIDD、激发光波长:640nm,检测光波长:670nm检测YVDD,按使用说明书操作。常规染料法实时荧光PCR反应条件,预反应50℃2分钟-95℃4分钟，然后45个循环:94℃20-30秒，54℃30秒，72℃20-30秒,于72℃读取荧光值,并设置50℃-90℃熔解曲线分析。结果YIDD、YVDD突变序列选择性扩增相比HBV总载量仅推后一个Ct值不到,扩增效率几乎没有降低；突变序列引物对野生未突变模板仅有数千分之一扩增(未展示)。
[0252] 实施例三：HBV改良TaqMan探针法实时荧光PCR:
[0253] 探针法实时荧光PCR主要以TaqMan探针为代表,也包括增加结合力的MGB探针和锁核酸LNA碱基探针。扩增产物增加的信号通过带淬灭基团的荧光探针来检测。一般TaqMan探针5’端标记FAM、VIC、NED等荧光基团,3’末端标记TAMRA、DABCYL&BHQ等淬灭基团,被淬灭荧光的TaqMan探针通过Taq酶的5’外切酶水解而游离荧光基团产生荧光。TaqMan探针设计尊循以下一般原则:1)探针的Tm值比引物的Tm值要高10°C以上;2)探针5’端不能是G碱基，被酶切降解的G仍具有淬灭报告荧光作用;3)探针中的G不能多于C;4)避免单一核苷酸成串,尤其是G;5)富含AT的序列要增加长度,以达到符合要求的Tm值,但探针必须<40nt,否则淬灭效率低,反应本底高;6)探针退火时,其5’端应尽可能接近引物,同时又不重叠,离引物的3’端至少一个碱基远;7)检测单碱基变异(SNP)时,突变点尽量置于探针中间或靠近5’端,探针尽可能短;8)探针做mRNA表达分析时,探针序列应包括外含子/-/外含子边界;9)探针的3’端必须淬灭剂封闭以防止PCR扩增时延伸。
[0254] 本发明采用改良TaqMan探针的实时荧光PCR反应,其探针3’末端再人为增加6-8个与5’端互补的碱基,以使3’淬灭基团靠近5’荧光基团。整合TaqMan与Molecular beacon技术优点,其改良探针选取靶基因(临近下游一端引物)的一段代表性序列(nt:2374-2405),靶特异性序列(/互补序列)5’端标记报告荧光染料FAM,利用Taq酶
5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放荧光基团;探针3’端靶序列外添加几个与5’端互补碱基再标记淬灭基团BHQ--1,探针两末端类似Molecular beacon分子内末端互补形成锅柄样结构,不仅降低了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体,也抑制降低了本底荧光2-4倍,,兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点。
5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放荧光基团;探针3’端靶序列外添加几个与5’端互补碱基再标记淬灭基团BHQ--1,探针两末端类似Molecular beacon分子内末端互补形成锅柄样结构,不仅降低了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体,也抑制降低了本底荧光2-4倍,,兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点。
[0255] 本实例同样精选乙型肝炎病毒（HBV）核心Core区（CDR:2306-2444）一段序列作为HBV同序引物置换的核酸扩增靶特异序列,展示两端各20碱基Core区（nt:2306-2444）序列如下:
[0256] AB540584Core区（nt:2306-2444）
[0257] CAAATGCCCCTATCTTATCA AC––––––GTCGCAGAAGA TCTCAATCTC
[0258] 根椐同样一般引物选取原则以尽量减少引物二聚体来综合考虑、设计HBVcore探针法荧光PCR引物:
[0259] HBVc引物序列如下:
[0260] THBVFc:5’-ca aat gcc cct a tca ac-3’
[0261] THBVRc:5’-gag att gag c tgc gac-3’
[0262] 其中F代表上游引物序列,R代表下游直接靶特异引物,粗体代表同序碱基。 [0263] 设计争对THBVFc引物反义干扰寡核苷酸PNA,其序列为:5’-g ttg a-3’(合成定购于PDBiocem Co.,Ltd),THBVFc(5μM)加入千分之一体积的100nM反义PNA使引物中含100pM浓度。THBVRc用18%Dextran(w/v)和0.1M NaCl液稀释成2.5μM缓释引物。 [0264] 探针序列如下: ,采用其反意链并加3’末端茎结构碱基,
[0265] TqHBc:5’-FAM cgt ctg cga ggc gag gga gtt ctt ctt cta gg cac acg BHQ-1-3’ [0266] (1)临床血标本DNA提取：
[0267] 离心柱方法:取血清100μl.，加100μl的样本煮沸缓冲液,轻混,置沸水或金属浴中煮沸10分钟,高速离心10分钟,上清加3倍的6M碘化纳NaI液移至商业DNA纯化柱(核酸硅吸附膜柱)，加洗涤缓冲液(含70%EtOH的2M NaI液)离心洗涤两次，加50μl dH2O离心洗脱收集纯化的样本。(煮沸上清可直接PCR)。
[0268] 微磁珠方法:采用盐酸胍/异硫氰酸胍裂解,核酸在高浓度4M胍盐条件下结合至聚苯乙烯微磁球硅烷化表面羟基(Melzak et al,1996),用小于pH6.0的缓冲液洗涤,大于pH8.5缓冲液洗脱。微磁球法已经越来越多地取代酚-氯仿抽提液体方法和硅吸附膜离心柱方法。
[0269] 取血清100μl于1.5ml试管中，加等体积的胍盐裂解液5分钟,加0.8ml稀释中和液后再加25μl顺磁纳米硅化微球结合,将试管置于磁分离试管架吸附固定磁微球,弃液后,加0.8ml洗液洗涤一次,最后磁微球加50μl洗脱液收集DNA。
[0270] (2)TaqMan实时荧光PCR反应：
[0271] 由于TaqMan探针PCR每个模板每次循环最多释放一个荧光基团,其反应荧光强度远低于SYBR Green I荧光染料法(每3-4bp DNA能结合一个SYBR Green I分子),所以TaqMan法必须采用较大体积的50μl反应体系,以使PCR仪器能接受到足够强度的荧光信号。当然也成比例增加了PCR反应基线荧光本底,TaqMan探针3’末端增加几个与5’端互补的碱基,以使3’淬灭基团靠近5’荧光基团降低本底荧光2-4倍而不影响特异扩增。 [0272] 首先每个PCR反应管加2μl缓释引物R(2.5μM),缓释引物热启动和防产物气雾胶污染。再按以下配方取1.5ml的EP管配制不含待测模板和引物F的反应混合液, [0273]
[0274]☆
[0275] ( 探针荧光会逐渐衰减,旧标记探针可相应多加一些。)
[0276] 所配的×25次反应混合液共0.95ml分装于预加缓释引物的PCR反应管/或12管排管,每管38μl分装25管。其中一管加10μl纯化水dH2O作为PCR系统阴性对照，表面再小心、缓慢地沿管壁加上50μl矿物油封闭,短瞬离心,切记不要混匀!以防破坏缓释。
[0277] 含2μl缓释引物R和38μl反应液的PCR管加10μl待检DNA，表面再小心、缓慢地加上50μl矿物油封闭。为了检测结果的可靠性,每次检测必须设立实验阳性阴性对照和1-6个定量校准品(根据是否定量需要),实验对照参与提取DNA过程，模拟阳性定量校准品是0.1μg/ml作10倍梯度稀释,如90μl dH2O加10μl标准品,混匀后吸出10μl加入下一个10×倍稀释点90μl dH2O,余以此类推。
[0278] 每个检测可平行2-3份×50μl计平均Ct值,分析统计结果。
[0279] 标准曲线:-1 -2 -3 -4 -5 -6
[0280] 模 拟 标 准0.1μg/ml,0.1μg/ml×10 ,×10 ,×10 ,×10 ,×10 ,×10 稀6 11
释点。以pUC-HBcore(3.36kb,分子量MW=2.1×10,计1μg=2.8×10 copy分子)计
9 8 7 6
算,相应标准品梯度分子拷贝数为:5.6×10/ml,5.6×10/ml,5.6×10/ml,5.6×10/
5 4
ml,5.6×10/ml和5.6×10/ml。
释点。以pUC-HBcore(3.36kb,分子量MW=2.1×10,计1μg=2.8×10 copy分子)计
9 8 7 6
算,相应标准品梯度分子拷贝数为:5.6×10/ml,5.6×10/ml,5.6×10/ml,5.6×10/
5 4
ml,5.6×10/ml和5.6×10/ml。
[0281] 反应管上实时荧光PCR仪(调整仪器激发光波长FAM:480nm,检测光波长FAM:520nm)。按使用说明书设置运行程序,首先进行一个预反应50℃2分-94℃2分钟；然后PCR扩增40个热循环：94℃30秒，58℃60秒；于58℃读取荧光值。矿物油封闭表面残留反应液蒸发至管盖会挡住光路,仍需设置热盖但不用等热盖升温就开始PCR。 [0282] (3)实验结果分析:
9
9
[0283] HBV核心抗原质粒对照pUC-HBcore 0.01μg/ml约10/ml拷贝,作10倍稀释模9
板的标准定量曲线,最左边第一条扩增曲线为0.01μg/ml模板约10 拷贝,随之作10倍稀释,最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照,结果本底对照Ct值在40循环内基本为一直线,在PCR反应内几乎没有扩增Ct值(见附图12)。阴性参考品全为基线反应。多次重复性非常好。
板的标准定量曲线,最左边第一条扩增曲线为0.01μg/ml模板约10 拷贝,随之作10倍稀释,最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照,结果本底对照Ct值在40循环内基本为一直线,在PCR反应内几乎没有扩增Ct值(见附图12)。阴性参考品全为基线反应。多次重复性非常好。
[0284] 购买中检所乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量标准品(批号0711)阳性参考品及定量参考品L1-L5标准检测结果基本一致,阴性参考品全为基线反应。临床试验500例阳性标本99%与上海克隆生物高技术有限公司检测结果符合,各种阴性血清检测未出现假阳性反应。多次重复性非常好。
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