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具有凋亡靶向功能的纳米探针及制备和应用

阅读：1015发布：2020-05-30

专利汇可以提供具有凋亡靶向功能的纳米探针及制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种具有凋亡靶向功能的纳米探针及其制备和应用，包括由Fe@Fe3O4 纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG，DPA-Zn修饰的脂质体组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针，制得的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn用于肿瘤凋亡MRI 磁共振成像。与现有技术相比，本发明具有采用廉价的DPA-Zn替代膜联蛋白或相关多肽，利用简便的无催化Click反应将DPA-Zn接到纳米粒子表面，以无创伤的MRI手段检测肿瘤凋亡等优点。，下面是具有凋亡靶向功能的纳米探针及制备和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有凋亡靶向功能的纳米探针，其特征在于，包括由Fe@Fe3O4 纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG，DPA-Zn修饰的脂质体组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。
2.根据权利要求1所述的一种具有凋亡靶向功能的纳米探针，其特征在于，所述的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针的直径为12～13nm。
3.一种如权利要求1或2所述的具有凋亡靶向功能的纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将DSPE-PEG-DBCO和DSPE-PEG溶于有机溶剂中，加入Fe@Fe3O4纳米粒子溶液，混合均匀，除去有机溶剂，再加水，加入N3-DPA-Zn透析过滤，得到MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。
4.根据权利要求3所述的一种具有凋亡靶向功能的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的DSPE-PEG-DBCO、DSPE-PEG、Fe@Fe3O4纳米粒子和N3-DPA-Zn的质量之比为(1～3)：(6～10)：5：(1～3)。
5.根据权利要求3所述的一种具有凋亡靶向功能的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为氯仿，所述的Fe@Fe3O4纳米粒子溶液为浓度0.5～1.5mg/mL的Fe@Fe3O4纳米粒子氯仿溶液；所述的有机溶剂、DSPE-PEG-DBCO和水的添加量之比为2mL：(1～3)mg：(3～7)mL。
6.一种如根据权利要求1所述的一种具有凋亡靶向功能的纳米探针的应用，其特征在于，将MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针用于MRI 磁共振成像检测肿瘤凋亡。

说明书全文

具有凋亡靶向功能的纳米探针及制备和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种多功能纳米探针，尤其是涉及一种具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针及制备和应用。

背景技术

[0002] 细胞凋亡(apoptosis)是由一系列基因控制的细胞自主的有序性死亡，或者叫做细胞的程序化死亡。自从1970年细胞凋亡第一次被Kerr等阐述开始，它一直是生物研究最热门的领域。凋亡过程的启动与实施涉及到一系列复杂的生化反应，并且受多种分子调节，凋亡基因和蛋白的某些特征使其成为肿瘤治疗中具有吸引力的靶点。凋亡通路主要有两条：外源性通路和内源性通路，也分别称为死亡受体通路和线粒体通路。半胱天冬氨酸蛋白酶家族(Caspases)的级联反应是两条凋亡通路的中心环节，它最终导致DNA的裂解，程序性细胞死亡的完成。鉴于其重要性，机体内Caspases的活性有着严格的调控机制。随着对肿瘤病因及分子机制研究的不断深入，一些新的治疗策略正不断产生。

[0003] 目前来讲，肿瘤最有效的治疗方法有3种，即手术、化疗和放疗。就化疗而言，抗肿瘤药物对肿瘤细胞的作用大多数是诱导细胞凋亡、坏死，因此测定肿瘤细胞凋亡、坏死逐渐成为评价肿瘤疗效的一项指标。随着分子影像的发展，在活体层次研究细胞凋亡的发生发展过程备受研究人员关注。分子影像作为一种非创伤性显像，可以在活体内实时、连续进行细胞凋亡、坏死的过程的观察，因而细胞凋亡、坏死显像对评价肿瘤化疗、放疗疗效，预测肿瘤对化疗药物的反应有重要的意义。当然，传统的流式细胞测定、免疫组织化学、原位细胞凋亡检测分析等方法也是评估凋亡水平的主要手段。

[0004] 中国专利201310127172.0公开了一种金属配合物核酸荧光探针，结构为将DPA或DPA-Zn(II)基团与四苯乙烯相连。DPA-Zn(II)在溶液中可以与核酸等磷酸衍生物结合，抑制分子的非辐射跃迁，从而发荧光。该荧光探针可用于核酸的检测，无论是对双链DNA，还是单链DNA检测都有较高灵敏度。将此类探针应用于凝胶电泳或生物样品中核酸的检测和显色具有较好的应用前景。该专利应用了小分子金属配合物DPA-Zn，但应用领域仅为核酸的检测和显色，在其他领域无法使用。中国专利200980116187.9公开了用于靶向凋亡细胞的肽及其用途，涉及具有特定氨基酸序列且靶向凋亡细胞的肽，应用于于靶向肿瘤、心肌梗塞、中风及动脉硬化组织里发生的凋亡。该专利采用的多肽操作复杂且价格昂贵。

发明内容

[0005] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、价格低廉的具有凋亡靶向功能的纳米探针及制备和应用。

[0006] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种具有凋亡靶向功能的纳米探针，其特征在于，包括由Fe@Fe3O4 纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG，DPA-Zn修饰的脂质体组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。

[0007] 所述的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针的直径为12～13nm。

[0008] 一种具有凋亡靶向功能的纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将DSPE-PEG-DBCO和DSPE-PEG溶于有机溶剂中，加入Fe@Fe3O4纳米粒子溶液，混合均匀，除去有机溶剂，再加水，加入N3-DPA-Zn透析过滤，得到MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。

[0009] 混合均匀的工艺条件为：在室温下摇床过夜；

[0010] 除去溶剂的工艺为常温旋蒸；

[0011] 所述的DSPE-PEG-DBCO、DSPE-PEG、Fe@Fe3O4纳米粒子和N3-DPA-Zn的质量之比为(1～3)：(6～10)：5：(1～3)。

[0012] 所述的有机溶剂为氯仿，所述的Fe@Fe3O4纳米粒子溶液为浓度0.5～1.5mg/mL的Fe@Fe3O4纳米粒子氯仿溶液；所述的有机溶剂、DSPE-PEG-DBCO和水的添加量之比为2mL：(1～3)mg：(3～7)mL。

[0013] 上述纳米粒子的制备过程中采用的原料为市售原料，或采用现有文献公开的技术制备而成，例如其中的：DSPE-PEG-DBCO、DSPE-PEG均为市售产品，其中Fe@Fe3O4纳米粒子采用以公开的文献技术制备而成(参考文献(Lacroix LM,Huls NF,Ho D,Sun X,Cheng K,Sun S.Stable sigle-crystalline body centered cubic Fe nanoparticles.Nano Lett 2011；11:1641-5.))

[0014] N3-DPA-Zn为自制产品，其制备方法如下：将2-溴乙醇和NaN3按摩尔比1:2～3比加入水溶解，80℃搅拌反应，得叠氮乙醇。将4-甲基苯磺酰氯溶于二氯甲烷，逐滴加入叠氮乙醇，其中4-甲基苯磺酰氯与2-溴乙醇的摩尔比为1：1，得TosO～N3.将DPA和Tos～N3按质量比14:17溶解于无水MeCN，加热搅拌回流得DPA～N3。以甲醇为溶剂，加入Zn(NO3)2·6H2O,搅拌过滤得N3-DPA-Zn。

[0015] 一种具有凋亡靶向功能的纳米探针的应用，其特征在于，将MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针用于MRI磁共振成像检测肿瘤凋亡。

[0016] 本发明以磁性Fe@Fe3O4纳米粒子(MNPs)作为纳米探针的载体，其具有较高的饱和磁化强度，表面含有疏水性的油胺、油酸等。脂质体DSPE-PEG中DSPE端表现为疏水性，将脂质体与Fe@Fe3O4纳米粒子相混合，通过疏水范德华相互作用使得脂质体DSPE-PEG偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表面，再加入N3-DPA-Zn，通过无催化Click反应，即新型肿瘤凋亡靶向核磁共振成像纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn。DSPE-PEG本身具有很高的生物相容性，获得的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn不仅生物相性好，而且在体内血液循环时间长。制得的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn粒径大小均一、饱和磁化强度高、形貌具有核壳结构、生物相容性好且具有凋亡靶向功能，在水溶液、生理盐水和培养液中具有较好的分散性和稳定性。磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)是细胞质膜重要的磷脂成分之一，具有重要的生物学功能。在正常生理情况下，PS通常集中分布于细胞质膜内小叶。在细胞发生凋亡的条件2+
下，细胞内ATP将供能不足，胞浆Ca 浓度升高，引起PS发生外翻。该纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn能与凋亡细胞外翻的PS相结合，进而通过MRI分子影像手段评估PS外翻情况，反映经化疗诱导后肿瘤的凋亡程度，达到肿瘤的靶向分子影像诊断目的。由于MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针具有高的饱和磁化强度，可适用于凋亡肿瘤的MRI磁共振成像研究。

[0017] 与现有技术相比，本发明制备的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn粒径均一、饱和磁化强度高、形貌可控、生物相容性好且具有凋亡靶向，在水溶液、生理盐水和培养液中具有较好的分散性和稳定性，制备工艺简单，反应条件为温和，合成原料价廉易得，所制得的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn适用于凋亡肿瘤MRI磁共振成像研究。附图说明

[0018] 图1为本发明的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn的合成示意图；

[0019] 图2为本发明的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米粒子的TEM图；

[0020] 图3为本发明的Fe@Fe3O4纳米粒子的XRD图；

[0021] 图4为本发明的Fe@Fe3O4纳米粒子的磁滞回线图；

[0022] 图5为本发明的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn在4T1细胞中0.5T MRI的T2数值分析图；

[0023] 图6为为本发明的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn在4T1细胞种植的BALB/C裸鼠肿瘤位置7.0T下MRI T2数值图。

[0024] 图7为本发明的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn在4T1细胞种植的BALB/C裸鼠肿瘤位置7.0T下MRI T2显像图。

具体实施方式

[0025] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

[0026] 下述实施例中，脂质体DSPE-PEG-DPA-Zn的制备为将包裹在MNPs上的脂质体DSPE-PEG-DBCO与N3-DPA-Zn肽进行无催化Click反应，得到具有凋亡靶向效果的脂质体DSPE-PEG-DPA-Zn，所述MNPs接DPA-Zn反应具体可参考文献(Campbell-Verduyn,L.S.；Mirfeizi,L.；Schoonen,A.K.；Dierckx,R.A.；Elsinga,P.H.；Feringa,B.L.,Strain-Promoted Copper-Free“Click”Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin.Angewandte Chemie International Edition 2011,50,11117-11120.)。

[0027] 油溶性Fe@Fe3O4纳米粒子(MNPs)的制备：取盐酸十六胺0.1g、十八烯20mL、油胺0.2mL，加入到三口瓶中，升温至180℃，注入铁源Fe(CO)5 0.7mL，保持20～30min，加入油酸
0.3mL，冷却至室温，暴露在空气中，搅拌1h，用正己烷和异丙醇离心3～5次，分散在氯仿中。
可以参考文献(Lacroix LM,Huls NF,Ho D,Sun X,Cheng K,Sun S.Stable sigle-crystalline body centered cubic Fe nanoparticles.Nano Lett 2011；11:1641-5.)。

[0028] 由图2中的TEM电镜图中可以看出：本发明中制备的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米粒子具有明显的核壳结构，且分散性很好；由图3的XRD图谱可以看出：晶态单质铁晶面的衍射峰，四氧化三铁壳层结晶区域小，峰变宽，所以衍射峰没有看到；由图4可以看出：Fe@Fe3O4纳米粒子具有较高的磁性。

[0029] N3-DPA-Zn的制备：向100mL圆底烧瓶加入3.4g 2-溴乙醇和3.1g NaN3,加入水溶解，80℃搅拌反应，得叠氮乙醇。将4.0g 4-甲基苯磺酰氯溶于二氯甲烷，逐滴加入反应瓶，得TosO～N3.将210mg DPA和255mg Tos～N3溶解于无水MeCN，加热搅拌回流得TosO～N3。以甲醇为溶剂，加入Zn(NO3)2·6H2O,搅拌过滤得N3-DPA-Zn。

[0030] 实施例1

[0031] 一种具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针，包括由Fe@Fe3O4纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG和凋亡靶向探针DPA-Zn组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针的直径为12～13nm。

[0032] 上述具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针的制备方法，包括以下步骤：取2mg DSPE-PEG-DBCO和8mg DSPE-PEG溶于2mL氯仿中，加入5mg Fe@Fe3O4纳米粒子，室温下摇床过夜，常温旋蒸除去氯仿，再在80℃水浴旋蒸1min，再加入5mL水，加入N3-DPA-Zn 2mg，用8000～14000Da透析袋透析48h，使用0.22μm滤膜过滤，得到1mg/mL的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn溶液，4℃冰箱保存。

[0033] 实施例2

[0034] 一种具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针，包括由Fe@Fe3O4纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG，脂质体DSPE-PEG-DBCO和凋亡靶向探针DPA-Zn组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针的直径为12～13nm。

[0035] 上述具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针的制备方法，包括以下步骤：取1mg DSPE-PEG-DBCO和9mg DSPE-PEG溶于2mL氯仿中，加入5mg Fe@Fe3O4纳米粒子，室温下摇床过夜，常温旋蒸除去氯仿，再加入5mL水，加入N3-DPA-Zn 1mg，用8000～14000Da透析袋透析48h，使用0.22μm滤膜过滤，得到1mg/mL的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn溶液，4℃冰箱保存。

[0036] 实施例3

[0037] 一种具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针，包括由Fe@Fe3O4纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG，脂质体DSPE-PEG-DBCO和凋亡靶向探针DPA-Zn组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针的直径为12～13nm。

[0038] 上述具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针的制备方法，包括以下步骤：取3mg DSPE-PEG-DBCO和7mg DSPE-PEG溶于2mL氯仿中，加入5mg Fe@Fe3O4纳米粒子，室温下摇床过夜，常温旋蒸除去氯仿，再加入5mL水，加入N3-DPA-Zn3mg，用8000～14000Da透析袋透析48h，使用0.22μm滤膜过滤，得到1mg/mL的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn溶液，4℃冰箱保存。

[0039] 实施例4

[0040] 以DOX作为凋亡诱导剂，浓度5μg/mL，诱导4h。设置空白组，材料对照组，凋亡对照组，实验组和封闭组，封闭组采用1mg/mL DPA-Zn封闭0.5h。取实例1制备的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn，材料对照组、实验组和封闭组孵育浓度100μg/mL，孵育时间2h.从图5来看，实验组ΔT2/T2高于材料对照组和封闭组，证明MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn的凋亡靶向作用。

[0041] 实施例5

[0042] 4T1细胞种植BALB/C裸鼠，经尾静脉注射DOX(1mg/mL,200μL,1次/2天)进行凋亡诱导，分为二次DOX诱导组、一次DOX诱导组和正常肿瘤组。在注射纳米探针前，肿瘤处MRI成像并记下T2加权成像的信号值。取实施例1中制得的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn的纳米探针水溶液经超滤离心，分散于0.2mL生理盐水中，尾静脉注射至4T1细胞种植的BALB/C裸鼠中，观察3h、10h时间点肿瘤处T2加权成像，记下对应时间点肿瘤处加权成像的信号值。

[0043] 图6～7显示了本实施例中纳米分子影像探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn尾静脉注射在种植4T1的BALB/C裸鼠肿瘤处7.0T下MRI显像图，在三种不同模型下，注射3h后，我们可以发现二次DOX诱导组在肿瘤处相对T2加权成像的信号值明显增强，成像图与注射之前的成像图对比，肿瘤处信号明显变暗，一次DOX诱导组和正常肿瘤组在肿瘤处相对T2加权成像的信号值变化不大。在注射后10h后，一次DOX诱导组在肿瘤处相对T2加权成像的信号值增强显著，成像图与注射之前的成像图对比，肿瘤处信号明显变暗，正常肿瘤组变化不明显。结果表明纳米粒子MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn具有凋亡靶向效果，靶向效果与肿瘤细胞凋亡程度呈现正相关关系，尤其在二次DOX诱导组展现出了很好的体内靶向T2加权成像效果。

[0044] 实施例6

[0045] 一种具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针，包括由Fe@Fe3O4纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG，脂质体DSPE-PEG-DBCO和凋亡靶向探针DPA-Zn组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针的直径为12～13nm。

[0046] 上述具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针的制备方法，包括以下步骤：取3mg DSPE-PEG-DBCO和10mg DSPE-PEG溶于2mL氯仿中，加入5mg Fe@Fe3O4纳米粒子，室温下摇床过夜，常温旋蒸除去氯仿，再加3mL水，加入N3-DPA-Zn 3mg，用8000～14000Da透析袋透析48h，使用0.22μm滤膜过滤，得到1mg/mL的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn溶液，4℃冰箱保存。

[0047] 实施例7

[0048] 一种具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针，包括由Fe@Fe3O4纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG，脂质体DSPE-PEG-DBCO和凋亡靶向探针DPA-Zn组成的MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针。MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn纳米探针的直径为12～13nm。

[0049] 上述具有凋亡靶向功能用于肿瘤凋亡核磁共振成像纳米探针的制备方法，包括以下步骤：取3mg DSPE-PEG-DBCO和6mg DSPE-PEG溶于2mL氯仿中，加入5mg Fe@Fe3O4纳米粒子，室温下摇床过夜，常温旋蒸除去氯仿，再加入7mL水，加入N3-DPA-Zn3mg，用8000～14000Da透析袋透析48h，使用0.22μm滤膜过滤，得到1mg/mL的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-DPA-Zn溶液，4℃冰箱保存。

[0050] 上述的对实施例的描述旨在方便该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。对本领域熟悉的技术人员可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于以上实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

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