抗人活化血小板单克隆抗体可变区基因序列

本发明涉及一种新的单克隆抗体，特别是涉及一种抗人活化血小板单克隆抗体(MAb)SZ-51及表达该抗体可变区的基因序列。

1975年由Kohler和Milstein创立的单克隆抗体技术是分子免疫学发展上的一个重要里程碑，用此技术生产的MAb在疾病的诊断、治疗等方面显示了广阔的应用前景。然而，鼠源性单抗对人体具有免疫原性，且抗体分子量较大，不易从肾脏中排泄，因而限制了其在人体内的广泛应用。1984年Morrison首次应用基因工程技术将MAb可变区基因与人恒定区基因连接，这种重组的嵌合体应用于人体大大减少了免疫原性。另外，通过基因工程技术还可制备抗体的最小功能片断，如FV、单链FV(SFV)，小片断FV应用于人体既可渗透到血栓组织深部，又可加快其从肾脏中排泄，减少了单抗在血液中的积聚从而亦减少了免疫原性。可见，单克隆抗体可变区基因的克隆已成为制备基因工程抗体的关健。

Taub等人(J Bio chem 1989；264：259-265)，专利号EP 368486报道了一种抗人活化血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIa复合物单抗PAC1的可变区基因序列，发现PAC1单抗重链可变区内CDR3中含有与纤维蛋白原相似的RYD序列，该CDR3(21肽)能竞争抑制圩维蛋白原与GPIIb/IIIa的结合，从而抑制血小板的聚集。故PAC1单抗中CDR321多肽可用来对富含活化血小板的血栓进行导向显像与导向溶栓。动物实验表明，人工合成的PAC1单抗CDR321多肽用放射性核素99mTc标记后，能快速进行血栓显像(KnightLc，etal：J Nucl Med 1994；35：282-288)。1992年，Tomiyama等，专利号WO9210520(J.Biochem 1992；267：18085-18092)亦克隆了抗血小板GPIIb/IIIa复合物单抗OP-G2的可变区基因，亦发现OP-G2单抗重链可变区CDR3中含有RYD序列，该多肽序列亦能抑制血小板的聚集，但与PAC1单抗不同的是，OP-G2单抗及其多肽序列除了与活化血小板结合外，还与静止血小板结合。

目前尚未见有报道关于抗活化血小板α颗粒膜蛋白(GMP)-140单抗可变区基因序列。我们通过基因克隆技术获得了抗GMP-140单抗SZ-51可变区基因序列，该序列有别于其它任何一种抗人活化血小板单抗。SZ-51单抗特有的可变区基因序列决定了该单抗与活化血小板GMP-140特异结合的特性，因而该单抗可变区基因序列可用来构建人源化单抗，进行重组表达。重组的人源化单抗可用于临床上对血栓性疾病患者进行导向血栓显像与导向溶栓治疗。

本发明提供了一种抗人活化血小板(GNP-140)单克隆抗体SZ-51的可变区基因序列，同时提供了含有该基因序列的原核细胞与真核细胞表达载体以及相应的工程细菌株与细胞株，表达的产物为SZ-51单抗可变区基因与人IgG恒区基因重组的人源化单抗，这种重组的单抗识别的抗原为活化血小板膜表面特有的颗粒膜蛋白(GMP-140)，因此与放射性核素99mTc标记后，能很好地进行血栓导向显像，与溶栓药物化学偶联后，能显著提高溶栓效率，故基因重组人源化的SZ-51单抗可用于临床，作为导向载体，对血栓性疾病进行导向血栓显像诊断与导向溶栓治疗。

本发明的技术方案如下：一、用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)(文献Sambrook T：Molecular cloning.Second edition，P14.20.)克隆SZ-51单抗可变区基因，进而对其进行DNA序列分析，获得SZ-51单抗重链与轻链可变区DNA序列，该序列为SZ-51单抗所特有，见图1。将SZ-51单抗可变区基因与人免疫球蛋白恒区基因连接，制备人-鼠嵌合抗体，即＂人源化＂单抗。该单抗应用于人体，既保留了SZ-51单抗与抗原GMP-140特异结合的特性，又可大大降低对人体的免疫原性。

具体过程如下：1.从SZ-51杂交瘤细胞中抽提RNA(超速离心法)。

2.以Oligo-(dT)亲和层析柱分离纯化mRNA。

3.应用逆转录酶合成第一条链cDNA。

4.设计并合成多套混合寡核苷酸引物。

5.以第一条链cDNA为模板，应用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增SZ-51单抗重链与轻链可变区cDNA。

6.将扩增的SZ-51单抗重链与轻链可变区cDNA(350bp)分别克隆至PUC18载体中。

7.以双脱氧核糖核酸终止法分别测定SZ-51单抗重链与轻链可变区cDNA核苷酸序列，再推算其氨基酸序列。

二、SZ-51嵌合Fab片段在大肠杆菌中的表达1.将SZ-51单抗重、轻链可变区cDNA片段分别与人免疫球蛋白K链恒区(CK)及r1重链恒区(CH1)CDNA连接，构建成表达载体PHEN1-51Fab，并导入大肠杆菌HB2151中，表达可溶性嵌合SZ-51Fab抗体片段。

2.应用放射免疫分析及免疫印迹分析(Western blot)技术分别测定表达上清液中表达的抗体蛋白与抗体活性。结果表明，表达的嵌合SZ-51抗体Fab片段能与GNP140显示特异结合反应。通过抗人活化血小板单克隆抗体SZ-51嵌合Fab片段在大肠杆菌中的表达，说明SZ51-Fab/HU能特异地与人活化血小板α颗粒膜蛋白GMP140结合，显示了SZ-51嵌合抗体用于人体内对血栓性疾病患者进行导向血栓显像与导向溶栓治疗的广阔应用前景。

本发明的优点在于：1.获得了SZ-51单抗特有的可变区基因序列，为人工合成SZ-51单抗可变区基因，奠定了基础。2.可用于制备基因重组＂人源化＂单抗，以减少鼠源性单抗对人体的免疫原性。3.为今后进一步用于临床对血栓性疾病患者进行导向血栓显像与导向溶栓治疗提供了必需的生物原材料。

附图说明

：图1  SZ-51可变区cDNA和氨基酸序列图2  显示总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，A为总RNAB为与r1重链恒区cDNA杂交后的放射自显影结果，C为与K轻链恒区cDNA杂交后的放射自显影结果图3显示使用2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。1、2为重链可变区；3、4为轻链可变区；M为标准DNA分子量图4  PCR扩增后2％琼脂糖凝胶电泳结果。1为标准DNA分子量；2为重链可变区；3为轻链可变区；4为嵌合Fab片段。

图5  PHEN1-SZ51Fab/HU表达质粒构建示意图图6  Western转移电泳1.为阳性对照2.为嵌合抗体图7  SZ-51重链表达质粒构建示意图图8  Slot-bolt筛选M13-51VH阳性重组子图9  酶切电泳检查表达质粒中插入片段的存在图10 SZ-51轻链表达质粒构建示意图图11 Slot-blot筛选M13-51VK阳性重组子图12 Western转移电泳检测表达上清中SZ-51嵌合抗体蛋白与活性a：SP2/0表达上清+125I-GAHb：GMP-140+表达上清+125I-GAHc：GMP-140+鼠SZ-51 IgG+125I GAMd：活化血小板+表达上清+125I-GAH实施例1：一、材料：1.SZ-51杂交瘤细胞系由经活化血小板免疫的小鼠脾细胞与NS-1小鼠骨髓瘤细胞融合制备而成。该单抗重链亚型经免疫扩散法鉴定为1型；轻链亚型经ELISA法鉴定为K型。

2.PCR引物合成：引物合成在上海细胞生物学研究所Appligene DNA合成仪上进行。

(1)Y1重链引物：5′VY 1-1：5′-AGGTCCAACTTCTCGAGTCTGG-3′5′vY 1-2：5′-AGGTCCAACTGCTCGAGTCTGG-3′3′CH1：   5′-AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT-3′(2)k轻链引物：5′Vk-1：  5′-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3′5′Vk-2：  5′-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3′3′Ck：    5′-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3′二、mRNA的制备新鲜培养的SZ-51杂交瘤细胞和NS-1骨髓瘤细胞(分别为5×108)，以CsCl超速离心法分离细胞总RNA，然后用酚/氯仿/异戊醇比例25/24/1抽提二次，RNA沉淀溶解在200μl DEPC-H2O中，分光光度法测定A268nm和A289nm吸光率，计算RNA含量和纯度。

取5ug总RNA按分子克隆方法进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和Nor-thern印迹转移。然后分别与32P标记的鼠免疫球蛋白r1和k链恒区cDNA(分别由日本大阪大学医学院T.Honjo博士和美国哈佛医学院P.Leder博士惠赠)进行杂交与放射自显影。三、RNA的分离与鉴定经CsCl超速离心法制备的RNA，A268/A288比值为2.28。总RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检查，可清楚见到28S和18S二条核糖体RNA，而无降解(图2A)。SZ-51杂交瘤细胞和NS-1骨髓瘤细胞总RNA经Northern印迹转移后，分别与鼠免疫球蛋白r1和k链恒区cDNA杂交，放射自显影结果见图2B和2C。由图可见，免疫球蛋白y1链和k链仅存在于SZ-51杂交瘤细胞中，而不存在于NS-1骨髓瘤细胞中。由于NS-1为用来融合制备SZ-51杂交瘤细胞的骨髓瘤细胞；NS-1细胞不分泌免疫球蛋白重链(r1)与轻链(k)，亦不含编码r1和k链的mRNA，从而说明制备的SZ-51细胞RNA中含有特异编码SZ-51单抗r1和k链的mRNA。四、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)在20μl反应体系中，含2μg总RNA，1μmol/L3′端CH1或3′端Ck引物，500μmol/L DNTPs，80U RNasin.70℃保温10分钟，冰浴5分钟，然后加入40UAMV逆转录酶，42℃反应1小时。

取10μl上述反应液进行PCR扩增。100μ1反应混合物中，含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各200μmol/L；1μmol/L5′端Vy1和3′端CH1引物或1μmol/L5′端Vk和3′端Ck引物；2.5U Taq DNA聚合酶。扩增条件为：先94℃变性4分钟，然后94℃1分钟，37℃2分钟，72℃3分钟，共30个循环。五、PCR产物的克隆PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离纯化SZ-51重链与轻链可变区基因片断。然后分别克隆至pUC18载体中，以Eco RI和Hind III双酶切筛选阳性重组子。取2μg阳性质粒DNA，采用双脱氧末端终止法，Sanger et al：PNAS 1977；74：5463以正向和反向引物同时进行DNA序列测定。六、DNA序列分析将SZ-51重链和轻链PCR扩增的cDNA片断(669bp)克隆至pUC18载体中，筛选阳性重组体进行全序列分析，测序结果见图1。我们共进行了二次PCR扩增，分别挑取了4个重链和4个轻链阳性重组体进行测序。结果4个重链的序列完全一致；轻链序列中仅有1个核苷酸改变，说明PCR扩增过程中碱基错配率很低(＜0.1％)。SZ-51重链序列包括可变区(VH)和恒定区(CH1)，轻链序列包括可变区(Vk)和恒定区(Ck)。SZ-51重链可变区包含117个氨基酸，轻链可变区包含107个氨基酸。七、抗人活化血小板单克隆抗体SZ-51嵌合Fab片段在大肠杆菌中的表达，过程如下：材料材料与试剂1.PCR引物设计与合成：引物合成在上海细胞生物学研究所Appligene合成仪上进行。

VH Back：   5′-CAACTGCAGGAGTCTGGACCTGAG-3′------Pst IVH For：    5′-GACGGTGACCGAGGTTCCCTGACC-3′-------Bst EIIVK Back：   5′-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3′------Sac IVK For：    5′-GATCTCGAGCTTGGTTCCTCC-3′------Xho IFAB For：   5′-CCACGATTCTGCGGCCGCTGACTCTCCGCGGTTGAA-3′--------Not  I以上引物由中科院上海细胞所基因室合成。

2.宿主菌株TG1：{K12，Δ(lac-pro)，supE，thi，hsdD5/F′traD36，proA+B+，laclα，lacZΔM15}为本室保存；HB2151：{K12，ara，Δ(lac-pro)，thi/F′proA+B+，laclαZΔM15}以及质粒pSW1-Fab，pHEN1均由英国剑桥MRC实验室Greg Winter博士惠赠。3.其它试剂：限制性内切酶为(Pst I，Bst EII，Sac I，Xho I，Not I)Boehringer Mannheim产品；T4 DNA连接酶(BioLabs公司产品)，PCR扩增试剂盒为P.E.Cetus公司产品；α-[32P]-dCTP以及随机引物标记试剂盒为Amersha/m公司产器；IPTG为promega公司产品；丙烯酰胺为Pharmacia公司产品；羊抗人IgG及HRP-羊抗人IgG为Immunotech产品。

3.抗人血小板单克隆抗体SZ-51重链与轻链可变区基因。二、方法：1.聚合酶链反应(PCR)参照Saiki等的方法，100μl反应体系中，含250μmol/L dNTPs；10mmol/L Tris-HCl，pH8.3；50mmol/LKCl；2.5mmol/L MgCl2；各25pmol两种引物；1ug DNA模板；2.5μ TaqDNA聚合酶。再覆盖100μl液体石腊油，置循环仪(P.E.Cetus公司)上进行PCR扩增。扩增条件为：先94℃变性4分钟，然后94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环，最后72℃保温5分钟。

2.PCR产物的克隆参照分子克隆方法，PCR扩增产物以等体积氯仿/异戊醇(24/1)抽提一遍，2.2倍体积乙醇沉淀后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离纯化SZ-51重链与轻链可变区基因片断。然后经klenow酶补平、限制性内切酶酶切后与相应的载体片段10∶1摩尔比混合，再加入单位T4DNA连接酶，反应总体积为20ul，15℃下反应过夜。取2-5ul连接反应液以CaCl2法转化感受态细菌TG1或HB2151。

应用随机引物法将α-[32P]-dCTP标记于SZ-51重链和轻链可变区基因片段上，并以此为探针，筛选阳性重组子。

3.PHEN1-51Fab/Hu表达载体的构建以VH Back、VH For，VK Back、Vk For二对引物分别扩增SZ51单抗VH与Vk基因(图4)，扩增条件：94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。SZ51VH(351bp)用Pst I和Bst EII双酶切，SZ51VK(320bp)用Sac I和Xho I双酶切，相继与同样酶切理的包含人免疫球蛋白恒区基因(CH1和CK)的pSW1-Fab/Hu连接，转化TG1。转化子经碱变性法快速抽提质粒DNA，并经杂交筛选获得阳性克隆pSW1-51Fab/Hu。

再以pSW1-51Fab/Hu为模板，以VH Back和FAB For为引物进行PCR扩增(图4C)，扩增条件为：94℃1分钟，55℃2分钟，72℃3分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。扩增产物(51Fab/Hu，1.47kb)及表达质粒pHEN1经Pst I和Not I双酶切后，进行连接并转化HB2151，同样以杂变法筛选阳性质粒，得到重组表达质粒pHEN1-51Fab/Hu(图5)。再以双脱氧末端终止法测定阳性克隆质粒DNA插入片断的序列，结果表明，SZ-51Fab/Hu已正确装入表达载体中，读框正确。

4.可溶性Fab片段在大肠杆菌中的表达将噬菌体质粒pHEN1-51Fab/Hu重组体转化的HB2151单个菌落接种至2ml 2×TY培养液(内含100ug/ml氨苄青霉素，1％葡萄糖)中，37℃震摇，待OD558＝0.5-1.0时，收集细菌，以50mmol/L NaCl洗涤一次，细菌沉淀悬浮于2ml2×TY(内含100ug/ml氨苄青霉素，1mmol/L IPTG)中，37℃震摇16-24小时。取上清液进行ELISA和WesternBlot直接测定表达抗体蛋白及抗体活性。

5.表达产物测定(1)ELISA法：用96孔酶标聚苯乙烯反应板包被羊抗人IgG 1μg/孔，0.05％Tweem 20-PBS洗涤3次后，2％BSA封闭过夜，尔后加入50ul待测上清液与50ul 2％BSA-PBS的混和液，37℃反应2小时后，加入HRP-羊抗人IgG，37℃温育2小时，充分洗涤后以邻苯二胺显色，3mol/L H2SO4中止反应，测定OD492nm吸光率。同时以标准人IgG(购自卫生部上海生物制品研究所)作标准曲线。从而测定Fab的表达量。

(2)免疫印迹分析(blot western)：GMP-140进行纯化，凝血酶活化的血小板以1％Triton X-100破碎后，过SZ-51与CNBr活化的SepharoseCL-6B偶联的亲和层析柱，结合的GMP-140以二乙胺(0.05mol/L，pH11.5)洗脱。按10ug纯化的GMP-140/孔进行7％SDS-PAGE电泳，尔后转移至硝酸纤维薄膜上，与表达上清液37℃温育2小时后，再加入125I标记的羊抗人IgG，最后进行放射自显影。羊抗人IgG碘标记采用Iodogen法。

噬菌体表达质粒pHEN1中装有噬菌体衣壳蛋白gene III结构，并引入琥珀突变(Amber)密码子UAG(图5)，本研究将pHEN1-51Fab/Hu导入非抑制性大肠菌株HB2151中，该菌株已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC：M95028。导入PHEN1-51Fab/Hu的HB2151菌株在IPTG诱导下，则表达出可溶性Fab片段，并分泌至培养上清中。经ELISA法测定SZ-51Fab/Hu表达量约为200μg/L；免疫转移电泳证实表达的SZ-51嵌合Fab片段能特异地与GMP-140结合(图6)。

实施例2：一～六同实施例1七：SZ-51嵌合抗体的构建及其在骨髓瘤细胞SP2/0中的表达：材料：1.引物设计与合成：VH Back与VH For同实施例1VK2 Back 5′-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3′-------Pvu IIVK2 For  5′-GTTAGATCTCCAGCTTGG-3′------Bgl II2.细胞株：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，由本室保存。(Immunotech公司提供)3.细菌菌株：JM110：rpsl(strx，thr，leu，thi-1，lacY，galk，galT，ara，tonA，tsx，dam，dcm，supE44，Δ(lac-proAB)，[F’traD36，proAB，lacIαZΔM15]，购自STRATAGENE公司。

4.培养基：(1)LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加水800ml溶解，用5N NaOH调PH至7.0，以H2O补足至1000ml，15磅灭菌20分钟。

(2)Opti-MEN与RPMI1640培养基：购自Gibco BRL公司。每袋培养基粉剂，加柚800ml充分溶解，加入2.4g NaHCO3及5gHEPES，缓慢通入CO2气体直至PH为7.2，用H2O补足1000ml，经0.45μ微孔滤膜过滤除菌。

(3)胎牛血清(FBS)为Gibco BRL产品；小牛血清(FCS)为杭州四季青生物制品研究所产品。

5.质粒：M13-VKPCR1，M13-VHPCR1，α-LyS17，α-ys30，均由英国剑桥MRC分子生物学实验室Greg Winter博士惠赠。

6.其它试剂：(1)周位素1′α-32P-dATP、α-32P-dCTP为Amersham公司产品，放射性比活度＞3000ci/mmol.

2′125I为中国同位素总公司产品。

(2)DNA与蛋白标准分子量1′DNA标准分子量III和VI为Boehringer公司产品；φ174DNAHaeIII为Pharmacia公司产品。

2′HMW、LMW蛋白标准分子量为Bio-Rad公司产品。

(3)工具酶与试剂盒限制性内切酶购自Boehringer、Promega、Appligene公司；T4 DNA连接酶、T4磷酸多核苷酸激酶购自Biolabs公司；PCR扩增试剂盒购自P.E.Cetus公司；随机引物探针标记试剂盒购自Amersham公司；T7 DNA序列分析试剂盒购自Pharmacia公司。

霉酚酸、黄嘌呤为Sigma公司产品；IPTG、X-gal为Promega公司产品；潮霉素B为Boehringer公司产品；Lipofectin Reagent为Gibco BRL公司产品；丙烯酰胺、尿素为Pharmacia公司产品；羊抗人(GAH)IgG、羊抗鼠(GAM)IgG、HRP抗K链单抗为Immunotech公司产品。方法：1.α-Lys30-51VH/Hu重链表达质粒的构建构建策略如图7所示。SZ-51重链可变区基因片段(51VH)以PstI、Bst EII双酶切，与经同样酶切处理的N13-VHPCR1噬菌体连接、转染。M13上清经Slot-blot与α-32P标记的SZ-51VH进行杂交，筛选阳性重组子(M13-5IVH)(图8)。阳性质粒，抽提RF DNA，以Hind III、BamHI酶切和电泳纯化820bp的插入片段，然后再与经同样酶切的α-Lys30表达质粒(该质粒克隆位点下游已插入人免疫球蛋白重链r，恒区基因)进行连接、转化。转化子以碱变性法小量抽提质粒DNA，经Hind III和Bam HI双酶切，琼脂糖凝胶电泳检查插入片段的存在(图9)。

2.α-Lys17-51VK/Hu轻链表达质粒的构建构建策略基本同重链(图10)。由于M13-VKPCR1噬菌体中含有Bc1 I克隆位点，该酶切位点在甲基化酶阳性(dam，dcm)的E.coli(TG1、JM109)中扩增时很易发生甲基化从而影响酶切，故我们选择了甲基化酶阴性(dam-，dcm-)的E.coli JM110扩增该质粒。以Pvu II，Bcl I酶切M13-VKPCR1，电泳纯化载体，然后与经Pvu II、Bg1 II酶切的51-VK片段连接，同样以Slot-blot筛选阳性重组子(图11)。最后，以粘末端(Hind III、Bam HI)将SZ-51VK插入α-Lys17表达质粒中。

3.SZ-51嵌合抗体在骨髓瘤细胞SP2/0中的表达(1)细胞培养：SP2/0骨髓瘤细胞培养于RPMI1640培养基中，内含20％FCS，100u/ml青、链霉素，2mM谷氨酰胺，2mM丙酮酸钠，置5％CO2、37℃下培养，每2-3天传代一次，使细胞处于对数生长期。

(2)Lipofectin Reagent转染SP2/0骨髓瘤细胞。

a.取2×108处于对数生长期SP2/0细胞，以无血清opti-MEM培养基洗涤1次，细胞悬浮于0.8ml无血清opti-MEM中。

b.在一无菌Eppendorf管中，加入2ug纯化质粒DNA(α-Lys17-51VK/Hu或α-Lys30-51VH/Hu)，100ul opti-MEM；另一Eppendorf管中，加入20ul Lipofectin(20ug)与100ul opti-MEM，然后将二管合并，轻轻混匀，室温放置15分钟。

c.将质粒DNA与Lipofectin的混合物加到SP2/0细胞中，共1ml，轻轻混匀，将细胞悬液接种至中φ3.5cm培养皿中，5％CO2，37℃培养5～24小时。

d.收集细胞，以opti-MEM洗涤1次，2500rpm离心10分钟，去除上清，细胞悬浮于2ml opti-MEM培养液(10％FBS)中，接种至φ3.5mm培养皿中，37℃培养48小时。

e.转染细胞用选择性培养基1∶5稀释，接种于6孔培养板(φ3cm)。

f.每周以选择性培养基换液1次，2-3周后，即可有细胞克隆出现。4周后，选择性培养基换成正常培养基。

(3)转染细胞的选择性培养：a.α-Lys17-51VK/Hu转染细胞在含400ug/ml潮霉素B的选择性培养基中培养；b.α-Lys17-51VK/Hu转染细胞在含1ug/ml霉酚酸、250ug/ml黄嘌呤、HAT选择性培养基中培养。100×霉酚酸、100×黄嘌呤均以0.1MNaOH配制，配制选择性培养基时，需同时加入等体积0.1N HCl，调pH至中性。

(4)单克隆化(有限稀释法)：持续分泌抗体的阳性细胞克隆扩至24孔板，取处于对数生长期细胞，在96孔板上进行单克隆化(0.5～1个细胞/孔)。

(5)构建好的表达质粒(α-Lya30-51VH/Hu、α-Lys17-51VK/Hu)采用碱变性法大量抽提，以CsCl超离心法纯化质粒DNA。然后，采用Lipofectin方法(Felgner PL et al：PNAS 1987；84：7413)将轻链和量链质粒先后导入SP2/0骨髓癌细胞中。先用轻链载体α-Lys17-51VK/Hu转染SP2/0细胞，在400ug/ml潮霉素B的选择性培养基中，经过二周的选择性培养，有二个细胞克隆生长。经ELISA检测，表达上清中含有人免疫球蛋白k轻链。通过单克隆化后，我们再以重链载体α-Lys30-51VH/Hu转染分泌轻链的细胞株。转染细胞在含有霉酚酸(1ug/ml)和黄嘌呤(250ug/ml)的HAT选择性培养基中生长，2周后有3个耐药细胞克隆出现。以GAHIgG及活化血小板包板，同时检测表达上清中抗体蛋白与坑体活性，阳性细胞克隆立即以有限稀释法进行单克隆化，结果获得一株能持续分泌SZ-51嵌合抗体的细胞株(E6)。

对E6细胞进行第二次单克隆化，选择6个表达水平较高的细胞克隆E6C7、E6C8、E687、E688、E6F4、E6G11。其中E6C7克隆在培养过程中发现抗体蛋白与活性均丧失，故丢弃。

4.重组表达产物的特性鉴定(1)表达上清中嵌合抗体的含量以标准人IgG作标准曲线，通过ELISA测定并计算表达上清中分泌抗体蛋白的含量。最高抗体含量可达5mg/L。

(2)重组嵌合抗体的分子量鉴定表达上清经5～15％SDS-PAGE电泳分离，并转移至硝酸纤维薄膜上，与125I-GAH孵育后进行放射自显影，结果见图12。重组SZ-51嵌合抗体的分子量为160KDa，与鼠SZ-51单抗的迁移位置大致相同。

(3)重组嵌合抗体识别抗原的鉴定表达上清中SZ-51嵌合抗体在Western blot上能特异地与分子量为140KDa的GMP-140纯品呈结合反应(图12)。由于活化血小板中含有人IgG以及所用二抗为GAHIgG，所以活化血小板带型中，除了GMP-140外，尚有IgG区带。

SP2/0骨髓瘤细胞具有易培养，分裂快等特点，而且还可接种小鼠腹腔大量生产富含抗体的腹水。本研究将真核细胞表达载体(α-Lys17-51Vk/Hu，α-Lys30-51VH/Hu)导入SP2/0骨髓瘤细胞株(SZ-51HuE6)，该细胞株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC：C95014其表达产物经ELISA测定细胞上清含量为5mg/L，免疫转移电泳分析证实能特异地与活化血小板GMP-140呈结合反应。从而显示了SZ-51嵌合抗体用于人体内对血栓性疾病患者进行导向血栓显像与导向溶栓治疗的广阔应用前景。