改良型人肿瘤坏死因子的基因及其生产工艺
专利汇可以提供改良型人肿瘤坏死因子的基因及其生产工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程生产多肽药物领域，用于 治疗 恶性 肿瘤 。本发明所述改良型TNF为删除TNF第三、四位的丝 氨 酸和第七、八位的苏氨酸、脯氨酸，将第五位的丝氨酸改为赖氨酸，由153个氨基酸组成的TNF变体蛋白。改良后的TNF基因在大肠杆菌中高效表达并分离纯 化成 单一组分纯品，比活为3-8×107u/mg，比天然TNF比活高3-5倍，毒性也相应降低，基因表达 水 平比天然TNF表达水平高一倍，由24％增加至50％左右，因此，分离纯化工艺简单，得率高，成本低，适宜大规模生产。，下面是改良型人肿瘤坏死因子的基因及其生产工艺专利的具体信息内容。
1.一种改良型人肿瘤坏死因子基因特征是：删除TNF第三、四位的 丝氨酸和第七、八位的苏氨酸、脯氨酸的密码子，将第五位的丝氨酸改 为赖氨酸密码子，经基因表达产生由153个氨基酸组成的TNF变体蛋白。
2.根据权利要求1所述的改良型TNF基因，其特征是改造过的TNF基 因经NcoI和BamHI双酶切插入表达载体PET-11d中转化至大肠杆菌BL-21， 经筛选得阳性克隆，将阳性克隆接种于2ml LB/Amp(100μg/ml)培养 液中，37℃振荡培养8小时，接种入200ml LB/Amp(50μg/ml)培养液中， 37℃振荡培养16小时。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征是将培养液过夜，收集菌 体，超声破菌，离心，收集上清液，再用硫酸铵沉淀，经透析，上 DEAE-纤维素(DE52)柱层析，收集洗脱峰，用SDS-PAGE检测，将含纯品 的部分合并。
4.根据权利要求1所述的改良型TNF基因，其特征是可用做治疗恶性 肿瘤的药物。
本发明属于基因工程生产多肽药物技术领域。
肿瘤坏死因子(TNF)主要是由巨噬细胞、单核细胞分泌的蛋白质， 具有多种生物功能，如：抗肿瘤、抗病毒、调节血管内皮应答性、刺激 血管新生、介导免疫反应和炎症反应、诱导其他细胞因子的产生等。最 受到人们关注的是杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无影响的特性。
TNF由Carswell等在1975年发现，从此，众多研究者进行TNF的研 究，他们观察到TNF对实验动物的肿瘤有戏剧性治疗效果，当从尾静脉 注射一微克TNF后，竟使肿瘤消退，因此引起轰动。进入80年代，首先 从培养的人白血病细胞HL-60培养液中提取并纯化了人TNF；1984年 Pennica和Shirai等人在大肠杆菌中成功地表达了重组的人TNF，并制成 纯品，1985年开始了第一例抗癌临床试验，十年来，美、日、欧洲都已 相继开展了临床研究，现已进入II期临床研究，在美国尚未获FDA的批 准，至今还未成为上市商品。经过了漫长的临床观察，积累了很多有益 的经验，首先他们摸索了给药途径和剂量，对于大多数病例都是全身给 药，即：静脉滴注、肌肉注射或皮下注射，少数病例为瘤体内直接注射。 全身用药治疗剂量为：10-200微克，局部用药剂量：10微克左右，结果 表明：瘤内直接注射有效率大大提高。某些医疗机构，如：日本高野医 院试验了90余例，约有50％病例有症状改善，生存期延长。但在日本另 外19个医疗单位对晚期癌症进行的试验中则很少有效，由此可见，全身 用药时治疗效果不稳定，报道的病例大多无效，而瘤内注射以及合并其 他抗癌药使用，使有效率稳定在50％以上，个别病例经治疗获痊愈。在 治疗中发现TNF毒性较强，用药后病人普遍出现发冷、发热、有些病例为 寒战高烧达40℃，伴有恶心，呕吐，少数病人有血压下降。
在国内，1987年开始，南京大学和复旦大学协作接受了国家“863” 任务—TNF的基因工程，至1990年完成了实验室试验，我们双方均独立 地完成了在大肠杆菌中的TNF表达，近年来，南京大学初步观察了少数 病例，和国外情况一致。
到目前为止，TNF的临床疗效远不及对动物的抑瘤效果，其主要原 因是：按公斤体重折算，使用的TNF剂量相差甚远，20克体重的小鼠用 1μg TNF，抑瘤效果很强，按此推算，对人体的有效剂量应为2-3mg， 但这种高剂量伴随的毒性病人无法耐受，因此，研制高活性、低毒性 的改良型TNF势在必行。为此，国内外研究者纷纷设计不同的TNF突变体， 至今突变体已逾百种，但真正达到此目的的仅少数几种。
本发明的目的在于：创造一种抗癌效果好，毒性低的药物；另外， 考虑到大规模生产时经济效益，我们构建了一种高效表达体系，发酵时 间短，培养基成分较普遍，分离纯化步骤少，最后得率高。
本发明的技术方案包括：1.改良型TNF基因构建
2.改良型TNF基因在大肠杆菌中高效表达
3.表达产物分离纯化
我们设计的改良型TNF，缺失了N-端四个氨基酸，即删除第三、 四位的丝氨酸和第七、八位的苏氨酸、脯氨酸，另外，将第五位的丝氨 酸改为碱性氨基酸-赖氨酸，最后产生的TNF变体为153个氨基酸组成的 蛋白，分子中由于多了一个赖氨酸，碱性较强。本发明按照上述设计思 想，合成了引物，以PCR法扩增了长度为160bp 基因片段，经酶切，再替换天然TNF基因的相应片段。将改造过的TNF基 因经NcoI和BamHI双酶切插入表达载体PET-11d中转化至大肠杆菌BL -21，经筛选获得阳性克隆，经过培养，SDS-PAGE检测，表明在分子量 17KD处新出现一条很粗条带为表达产物，扫描结果，表达的蛋白占菌体 总蛋白约50％。
将工程菌培养过夜，收集菌体，超声破菌，离心收集上清液，再用 硫酸铵沉淀，经透析，上DEAE-纤维素(DE52)柱层析，收集洗脱峰，用 SDS-PAGE检测，将含纯品的部分合并。
本发明优点是
创造了一种活性高、毒性低的新型抗癌药。其关键是改造天然 TNF的N-端结构。TNF的活性是通过其受体而发挥作用的，凡影响TNF和 受体结合的因素，都会影响活力。现在已经知道在TNF分子中，5，31- 35，84-87，117-119和143-148位氨基酸和活性密切相关，另外，TNF的 N-端对活力也有影响，缺失N-端几个氨基酸往往使活力增加，因为TNF 的N端游离于分子三级结构表面，对邻近的受体结合区有干扰作用。也 就是说N-端虽不直接和受体结合，但可调节和修饰生物学活性。
构建了高效基因表达体系，使表达蛋白占菌体总蛋白约50％。 这种表达产物为可溶性的活性形式，而不是包涵体。
摸索一条适用于大规模生产的简便生产工艺。发酵时间短(12 -16小时)，不需任何诱导，分离纯化步骤较少，最后得率高，每立升发 酵液可获纯品30-40mg。因此，经济效益巨大。
本发明所述改良型肿瘤坏死因子，可用做治疗恶性肿瘤的药物。
下面是本发明的实施例： (一)改良型TNF基因的构建，具体如下：
1.天然TNF基因克隆至M13中，抽提M13/TNFF重组DNA以此作为模板。
2.合成一对PCR引物： 5′-引物：总长度为44个核苷酸，其中15个核苷酸和天然TNF基因匹配，
另外，含有BamHI、HindIII和NcoI的酶切位点，还将Ser的密 码子改为Lys的密码子。
具体序列如下： 5′-ATT CCT CTT CGA AGG TAC CAA GCA TTT GCA AGA CTG TTT GGT CA-3 3′-引物：和天然TNF基因中编码44-51位氨基酸密码序列相同，含有kpnI
酶切位点。
具体序列为：5′—GCC ATG GTG TTC GAC CAA CAG TGC GTC-3′
3.PCR：以10ng M13/TNF重组DNA为模板，用上述一对引物扩增30 个周期(45℃-72-℃-92℃)，扩增产物经1％agarose电泳检查，主要为 160bp一个条带，与预期结果一致。从凝胶中回收此条带，用BamHI和 KpnI双酶切，再从凝胶中回收。
4.将M13/TNF(天然)重组双链DNA，经BamHI和KpnI双酶切，用1％ agarose电泳，回收大片段。
5.将以BamHI和KpnI切后的PCR片段和M13/TNF(天然)大的片段， 加T4DNA连接酶使这二个片段连接，再转化至TG1中，经杂交筛选(用5′- 引物为探针)，选出所需的克隆，再制备DNA，用NcoI和BamI切出改良后 的TNF基因。经DNA序列测定，证明N-端的序列和预计的序列一致。
(二)改良型TNF基因在大肠杆菌中的表达
将表达载体PET-11d用NcoI和BamI双酶切，加入改良的TNF基因(用 同两种酶切)，加连接酶转化至BL-21(DE3)用32P标记该基因作探针，选 出阳性克隆。
将阳性克隆接种于2ml LB/Amp(100μg/ml)培养液中，37℃振荡培 养8小时，接种入200ml LB/Amp(50μg/ml)培养液中，37℃振荡培养16 小时。
(三)产物的分离纯化
1.将培养液5,000rpm离心15分钟，4℃，收集菌体。
2.超声破菌：将收集的1克菌体悬于pH8.2 10mM磷酸缓冲液中， 超声10分钟(超声15秒，间歇15秒)。
3.12,000rpm，4℃离心15分钟，收集上清。 用SDS-PAGE检测上述细胞裂解液，在分子量17,000处有一条很粗条带， 经扫描含量约50％，由此可见，表达产物主要为可溶性而不是包涵体。
4.硫酸铵分部：在细胞裂解液中加固体硫酸铵至60％饱和度(0℃)， 放置过夜(0℃)，12,000rpm，4℃离心15分钟，保留沉淀部分，用pH 8.220mM磷酸缓冲液10ml溶解沉淀，并对此缓冲液透析24小时。离心 10,000rpm，4℃10分钟，丢弃沉淀，上清进一步作柱层析。
5.DEAE-纤维素(DE-52)柱层析
将处理后的DE-52装柱(Φ2.6×20cm)，用pH8.210mM磷酸缓冲液 平衡，透析后的样品上柱，并用此缓冲液充分洗涤，穿过峰丢弃。再 用pH8.220mM磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
经蛋白定量测定，洗脱峰总蛋白为8mg，即200ml发酵液获纯蛋 白10mg，若以每立升发酵液计算可得40mg，经SDS-PAGE检测，银染或 考马斯亮蓝染色主要为一条带，另在分子量三万左右有一细带，含量约 5％，经Western印迹分析，SDS-PAGE上显示的两个条带均呈阳性，说明 分子量三万的条带为TNF的二聚体。
用HPLC凝胶柱分析出现一个单峰。
活力测定：用L929方法，并测蛋白，计算比活。
纯品比活为3-8×107u/mg。
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