一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用
阅读：1030发布：2020-06-20
专利汇可以提供一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种线粒体靶向的纳米药物递送系统，包括连接有TPP的聚乙二醇和连接有 化疗药物 的缩硫 酮 linker，且两者通过 氨 基和羧基缩合反应彼此连接。还包括DSPE?PEG和 光敏剂 ；化疗药物在内侧形成疏 水 的核，聚乙二醇在中间形成亲水的壳层，TPP在外侧形成靶向线粒体的冠，光敏剂是疏水结构分布在核内和/或核的周围。TPP可选择性 定位 于线粒体。该系统是ROS响应的，激 光激发 光敏剂释放ROS，ROS切割缩硫酮linker释放出化疗药物，同时ROS可进行 光动 力 治疗 ，从而实现线粒体靶向的光动力治疗和化疗的协同治疗作用。本发明还公开了该纳米药物递送系统的制备方法和应用。，下面是一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种线粒体靶向的纳米药物递送系统，其特征在于，包括嵌段聚合物；所述嵌段聚合物包括连接有TPP的聚乙二醇和连接有化疗药物的缩硫酮linker，所述连接有TPP的聚乙二醇和所述连接有化疗药物的缩硫酮linker通过氨基和羧基缩合反应连接。
2.如权利要求1所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统，其特征在于，还包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和光敏剂；化疗药物在内侧形成疏水的核，聚乙二醇在中间形成亲水的壳层，TPP在外侧形成靶向线粒体的冠，所述光敏剂是疏水结构分布在所述核内和/或所述核的周围。
3.如权利要求1所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统，其特征在于，所述线粒体靶向的纳米药物递送系统的表面的TPP的量足够多以使得所述线粒体靶向的纳米药物递送系统的表面带正电荷且电位≥40mV。
4.如权利要求1所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统，其特征在于，所述缩硫酮linker的结构式是：
其中，所述缩硫酮linker通过其羧基与化疗药物连接；所述缩硫酮linker是ROS敏感的，可被ROS切断，从而释放出化疗药物。
5.如权利要求1所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统，其特征在于，所述光敏剂包括酞菁锌和间-四苯基卟吩中的一种或者两种，其对应的结构式是：
其中，左边是酞菁锌，右边是间-四苯基卟吩。
6.如权利要求2所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统，其特征在于，所述线粒体靶向的纳米药物递送系统的水合粒径为80-150nm。
7.如权利要求2所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统，其特征在于，所述化疗药物是CPT，所述光敏剂是ZnPc，所述嵌段聚合物是TL-CPT-PEG1K-TPP，TL-CPT-PEG1K-TPP和DSPE-PEG质量比为8:1，CPT在所述线粒体靶向的纳米药物递送系统中的负载量w/w为14.91％±
1％，CPT占TL-CPT-PEG1K-TPP分子总量的17.52％±1％，ZnPc的所述线粒体靶向的纳米药物递送系统中的负载量w/w为4.27％±0.5％。
8.如权利要求1或2任一种所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、缩硫酮linker的合成；
步骤二、缩硫酮linker与化疗药物连接；
步骤三、连接有化疗药物的缩硫酮linker与聚乙二醇一端的氨基连接，得到复合物一；
步骤四、三苯基膦的修饰：5-溴戊酸和三苯基膦加入乙腈中加热回流，冷冻过滤，乙酸乙酯洗涤，干燥后得经过修饰的三苯基膦，即TPP；
步骤五、TPP与所述复合物一的聚乙二醇另一端的氨基连接，得到嵌段聚合物；
步骤六、装配完整的线粒体靶向的纳米药物递送系统：将所述嵌段聚合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和光敏剂混合装配出完整的所述线粒体靶向的纳米药物递送系统。
9.如权利要求8所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于，所述步骤六具体为：装配完整的线粒体靶向的纳米药物递送系统：将溶于DMSO的所述嵌段聚合物、溶于氯仿的DSPE-PEG和溶于DMSO的光敏剂混合，缓慢滴加到去离子水中，边滴加边超声，超声功率为120-140W，滴加完后继续超声2-5min，得到胶束溶液；将所述胶束溶液离心去沉淀物，上清液加入超滤管中超滤去除有机成分；加去离子水稀释后过0.45μm无菌滤膜得无菌胶束溶液，即所述线粒体靶向的纳米药物递送系统。
10.如权利要求1-7任一项所述的线粒体靶向的纳米药物递送系统作为制备抗肿瘤药物制剂的应用。
一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用。
背景技术
[0002] 线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为"power house"，其直径在0.5到1.0微米左右。线粒体在细胞的凋亡中也占据重要作用。线粒体功能紊乱与肿瘤的发生和发展有重要关系。光动力治疗是通过光敏剂将光能转换成化学能——活性氧自由基(缩写为ROS)。单线态氧(1O2)作为一种ROS，在光动力治疗中最常用到，但它在生物体内停留时间很短(<0.1ms)，并且扩散半径很小(<20nm)。因此，在光动力治疗中，光敏剂必须与治疗位点足够贴近。线粒体是有氧呼吸的主要场所。因此，线粒体靶向的负载光敏剂的纳米体系能扰乱ROS的代谢，诱导细胞的凋亡，实现光动力治疗效率的最大化。
[0003] 肿瘤细胞的线粒体功能和正常组织细胞的功能有所不同。肿瘤细胞的线粒体膜电位与正常组织细胞的线粒体膜电位相比，线粒体膜电位更负。这就有利于阳离子的药物或纳米颗粒进入肿瘤细胞。之前有人研究表明，在37℃条件下，正常细胞和肿瘤细胞的60mV电位差可导致肿瘤细胞的吞入量是正常细胞的大约10倍。三苯基膦带正电荷，能选择性积累在膜电位为负的线粒体内。细胞膜也带负电，三苯基膦很容易穿透，进入细胞浆的三苯基膦有80％以上积累于线粒体。三苯基膦的这种特性被探索用于引导成像和药物进入线粒体，靶向于线粒体对某些作用于线粒体的药物来说，可减小毒副作用，提高疗效，降低多药耐药性。
[0004] 化疗是肿瘤确诊之后常用的治疗方法，但化疗常伴随很多副作用，为了获得最好的治疗效果而避免副作用，许多纳米材料用来负载缓释化疗药物。这些药物通常能靶向于肿瘤且药物释放是可控制的。比如pH敏感型、还原敏感型、温度敏感型、酶敏感型和光敏感型等等，但ROS应答的药物释放很少有人研究。光控产生的ROS刺激具有能够精确控制释放的时间和空间的优点。
[0005] 肿瘤细胞的ROS压力比正常细胞要高，一部分原因可能来源于癌基因的刺激增加了代谢活性和线粒体的功能紊乱。在相同的ROS压力下，正常细胞比肿瘤细胞能处理更多的ROS。因此，适当提高细胞中ROS的水平能达到选择性杀伤肿瘤细胞的作用。光动力治疗能产生ROS杀伤细胞，光敏剂ZnPc有较高的ROS产率，常被用于光动力治疗。
发明内容
[0006] 为了获得一种更好的药物递送系统，发明人以线粒体为靶向，结合ROS刺激产生光动力治疗和常规化疗，研发出一种线粒体靶向的纳米药物递送系统。该线粒体靶向的纳米药物递送系统是一种线粒体靶向ROS(Reactive oxygen species)响应的纳米药物递送系统。
[0007] 本发明公开了一种线粒体靶向的纳米药物递送系统，包括嵌段聚合物；所述嵌段聚合物包括连接有TPP的聚乙二醇和连接有化疗药物的缩硫酮linker，所述连接有TPP的聚乙二醇和所述连接有化疗药物的缩硫酮linker通过氨基和羧基缩合反应连接。TPP是PPh3Br-(CH2)4-COOH的缩写。TPP与聚乙二醇的连接是通过TPP上的羧基与聚乙二醇上的一个氨基缩合反应连接的。
[0008] 进一步地，还包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)和光敏剂；化疗药物在内侧形成疏水的核，聚乙二醇在中间形成亲水的壳层，TPP在外侧形成靶向线粒体的冠，所述光敏剂是疏水结构分布在所述核内和/或所述核的周围。
[0009] 进一步地，所述线粒体靶向的纳米药物递送系统的表面的TPP的量足够多以使得所述线粒体靶向的纳米药物递送系统的表面带正电荷且电位≥40mV。
[0010] 进一步地，所述缩硫酮linker(TL)的结构式是：
[0011]
[0012] 其中，所述缩硫酮linker通过其羧基与化疗药物连接；所述缩硫酮linker是ROS敏感的，可被ROS切断，从而释放出化疗药物。
[0013] 进一步地，所述光敏剂在633-660nm激光激发下释放出ROS，用于肿瘤的光动力治疗。
[0014] 进一步地，所述光敏剂包括酞菁锌(Zinc phthalocyanine，ZnPc)和间-四苯基卟吩中的一种或者两种，其对应的结构式是：
[0015]
[0016] 其中，左边是酞菁锌，右边是间-四苯基卟吩。
[0017] 进一步地，所述化疗药物包括喜树碱(CPT)、阿霉素(DOX)、伊立替康、紫杉醇中的一种或者多种。
[0018] 进一步地，所述线粒体靶向的纳米药物递送系统的水合粒径为80-150nm。
[0019] 在本发明的一个较佳实施方式中，所述化疗药物是CPT，所述光敏剂是ZnPc，所述嵌段聚合物是TL-CPT-PEG1K-TPP，TL-CPT-PEG1K-TPP和DSPE-PEG质量比为8:1，CPT在所述线粒体靶向的纳米药物递送系统中的负载量w/w为14.91％±1％，CPT占TL-CPT-PEG1K-TPP分子总量的17.52％±1％，ZnPc的所述线粒体靶向的纳米药物递送系统中的负载量w/w为4.27％±0.5％。
[0020] 本发明还公开了上述线粒体靶向的纳米药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
[0021] 步骤一、缩硫酮linker的合成；
[0022] 步骤二、缩硫酮linker与化疗药物连接；
[0023] 步骤三、连接有化疗药物的缩硫酮linker与聚乙二醇一端的氨基连接，得到复合物一；
[0024] 步骤四、三苯基膦的修饰：5-溴戊酸和三苯基膦加入乙腈中加热回流，冷冻过滤，乙酸乙酯洗涤，干燥后得经过修饰的三苯基膦，即TPP；
[0025] 步骤五、TPP与所述复合物一的聚乙二醇另一端的氨基连接，得到嵌段聚合物；
[0026] 步骤六、装配完整的线粒体靶向的纳米药物递送系统：将所述嵌段聚合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和光敏剂混合装配出完整的所述线粒体靶向的纳米药物递送系统。
[0027] 进一步地，所述步骤一具体是：缩硫酮linker的合成：无水的3-巯基丙酸和无水的丙酮在干燥的HCl气体饱和的情况下室温反应2-6h，反应产物结晶过滤，洗涤，真空冷冻干燥得产物缩硫酮linker(TL)。
[0028] 所述步骤二具体是：缩硫酮linker与化疗药物连接：缩硫酮linker在无水的二甲基甲酰胺中，在先加入三乙胺、2,4,6-三氯苯甲酰氯、二甲氨基吡啶的情况下，搅拌5-20min；将抗肿瘤化疗药物加入，室温搅拌反应20-30h，粗产物过硅胶柱得连接有缩硫酮linker的抗肿瘤化疗药物纯品；如加入的化疗药为喜树碱(CPT)，本步反应产物为TL-CPT。
[0029] 所述步骤三具体是：连接有化疗药物的缩硫酮linker与聚乙二醇一端的氨基连接，得到复合物一：溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)的连接有化疗药物的缩硫酮linker、三乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、1-羟基苯并三唑室温搅拌10min后加入到两端为氨基分子量约为1000的聚乙二醇(即NH2-PEG1K-NH2)中，室温搅拌反应24h；24h后，反应液缓慢滴加到适量的去离子水中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌4h使其形成胶束；4h后，将其装入透析袋(MWCO＝3.5kDa)透析48h，透析完后进行冷冻干燥得复合物一。如修饰的药物为CPT，本步反应所得到的复合物一为TL-CPT-PEG1K-NH2。
[0030] 所述步骤四具体是：三苯基膦(PPh3)的修饰：5-溴戊酸和三苯基膦加入乙腈中加热回流24h,冷冻过滤得析出的粗产物，乙酸乙酯洗涤3遍干燥后得白色粉末产物PPh3Br-(CH2)4-COOH(缩写为TPP)。
[0031] 所述步骤五具体是：TPP与所述复合物一的聚乙二醇另一端的氨基连接，得到嵌段聚合物：TPP、三乙胺、EDC.HCl和1-羟基苯并三唑室温搅拌10min后加入到所述步骤三得到的复合物一中反应24h；24h后，此反应液缓慢滴加到适量的去离子水中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌4h以形成胶束；4h后，将此液体装入透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，透析48h，透析后冷冻干燥得到所述嵌段聚合物。如修饰的药物为CPT，本步反应产物为TL-CPT-PEG1K-TPP。
[0032] 所述步骤六具体为：装配完整的线粒体靶向的纳米药物递送系统：将溶于二甲基亚砜(DMSO)的所述嵌段聚合物、溶于氯仿的DSPE-PEG和溶于DMSO的光敏剂混合，缓慢滴加到去离子水中，边滴加边超声，超声功率为120-140W，滴加完后继续超声2-5min，得到胶束溶液；将所述胶束溶液离心去沉淀物，上清液加入超滤管中超滤去除有机成分；加去离子水稀释后过0.45μm无菌滤膜得无菌胶束溶液，即所述线粒体靶向的纳米药物递送系统。
[0033] 进一步地，步骤一中丙酮的加入量为过量，3-巯基丙酸和丙酮加入摩尔比为1:2，通入的氯化氢气体必须为干燥的气体。
[0034] 进一步地，步骤二中缩硫酮linker的加入量为过量，优选地，缩硫酮linker和抗肿瘤化疗药物加入摩尔比为2:1。
[0035] 进一步地，步骤三中连接有缩硫酮linker的化疗药和NH2-PEG1K-NH2的加入摩尔量比为1:1。
[0036] 进一步地，步骤四中5-溴戊酸的加入量略过量，5-溴戊酸和三苯基膦的加入摩尔比约为1.06:1。
[0037] 进一步的，步骤五中TPP的加入量为过量，TPP加入的摩尔量为复合物一的5倍以上。
[0038] 本发明还公开了上述线粒体靶向的纳米药物递送系统作为制备抗肿瘤药物制剂的应用。此线粒体靶向的纳米药物递送系统是线粒体靶向的光动力治疗与化疗相结合的纳米体系，可通过光动力治疗和化疗联合治疗根除肿瘤。
[0039] 基本原理：三苯基膦能选择性积累于线粒体，缩硫酮linker(TL)是ROS响应的，ROS能切割TL释放化疗药物。在这个体系中，三苯基膦使颗粒选择性定位于细胞的线粒体，尤其是肿瘤细胞的线粒体；633nm激光激发光敏剂如ZnPc释放ROS，ROS切割TL释放出化疗药物。从而实现了光动力治疗和化疗的协同治疗作用。
[0040] 其有益效果：
[0041] (1)此纳米药物递送系统是线粒体靶向的，而线粒体是细胞有氧呼吸的场所，有利于产生ROS用于光动力治疗，线粒体在细胞的凋亡中也占据重要作用,线粒体功能紊乱与肿瘤的发生和发展有重要关系。因此，靶向于肿瘤细胞的线粒体的光动力治疗能实现疗效的最大化。
[0042] (2)ROS可以切割缩硫酮linker释放抗肿瘤化疗药物。因此，使用ROS响应的纳米药物递送系统可以在时间和空间上对药物释放进行控制。
[0043] (3)光控产生ROS和ROS敏感的化学键的切割-释放抗肿瘤化疗药物，使得利用ROS响应的纳米药物递送系统可进行光动力治疗和化疗联合治疗，一次将肿瘤根除。
[0044] (4)此纳米制剂的生物相容性好。
[0046] 图1是本发明的较佳实施方式中的嵌段聚合物TL-CPT-PEG1K-TPP的合成路线图。
[0047] 图2是本发明的较佳实施方式中的线粒体靶向的纳米药物递送系统用于光动力治疗和化疗联合治疗的机理图。
[0048] 图3是本发明的较佳实施方式中的嵌段聚合物TL-CPT-PEG1K-TPP的1H NMR图。
[0049] 图4是本发明的较佳实施方式中的线粒体靶向的纳米药物递送系统的水合粒径分布图。
[0050] 图5是本发明的较佳实施方式中测试ROS敏感的缩硫酮linker的敏感性的1H NMR图。
[0051] 图6是发明的较佳实施方式中的线粒体靶向的纳米药物递送系统靶向检测的流式图。
[0052] 图7是发明的较佳实施方式中的线粒体靶向的纳米药物递送系统在体外用于光动力和化疗对肺癌细胞NCI-H460的联合治疗效果图。
[0053] 图8是发明的较佳实施方式中的线粒体靶向的纳米药物递送系统用于光动力和化疗对肺癌NCI-H460裸鼠移植瘤的联合治疗效果图。
具体实施方式
[0054] 下面结合附图和具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055] 实施例一
[0056] 1.合成ROS敏感的缩硫酮linker(TL)步骤如下：
[0057] 无水的3-巯基丙酸(5.2g，49.1mmol)和无水的丙酮(5.8g，98.2mmol)以干燥的HCl气体饱和，在室温反应4h。反应产物结晶过滤，以己烷和冷水洗涤，硫醇linker真空冷冻干燥得产物。
[0058] 2.合成TL-CPT实验步骤如下：
[0059] TL(252.1mg，1.0mmol)溶于无水的10mL DMF中，依次加入三乙胺(TEA，3.0mmol)、2,4,6-三氯苯甲酰氯(241.9mg，1.0mmol)，二甲氨基吡啶(DMAP，24.4mg，0.2mmol)，搅拌
10min。溶于10mL DMF的喜树碱(CPT，174.1mg，0.5mmol)后加入，室温搅拌反应24h。以水淬灭反应，以CH2Cl2萃取5次。粗产物过硅胶柱得纯品TL-CPT。
10min。溶于10mL DMF的喜树碱(CPT，174.1mg，0.5mmol)后加入，室温搅拌反应24h。以水淬灭反应，以CH2Cl2萃取5次。粗产物过硅胶柱得纯品TL-CPT。
[0060] 3.TL-CPT与聚乙二醇一端氨基的连接步骤如下：
[0061] TL-CPT(232.8mg，0.4mmol)溶于10mL无水的DMF，三乙胺(triethylamine，TEA，1.8mmol)、EDC.HCl(134.19mg，0.7mmol)和1-羟基苯并三唑(hydroxybenzotriazole，HOBT，
94.6mg，0.7mmol)溶于3mL的DMF并滴加到TL-CPT溶液中，边滴加边搅拌，室温搅拌反应
10min后，溶于2mL DMF的NH2-PEG1K-NH2(400mg，0.4mmol)加入到反应液中，室温搅拌反应
24h。24h后，反应液缓慢滴加到100mL去离子水中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌4h。4h后，将其装入透析袋(MWCO＝3.5kDa)透析48h。透析完后进行冷冻干燥得产物TL-CPT-PEG1K-NH2。
94.6mg，0.7mmol)溶于3mL的DMF并滴加到TL-CPT溶液中，边滴加边搅拌，室温搅拌反应
10min后，溶于2mL DMF的NH2-PEG1K-NH2(400mg，0.4mmol)加入到反应液中，室温搅拌反应
24h。24h后，反应液缓慢滴加到100mL去离子水中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌4h。4h后，将其装入透析袋(MWCO＝3.5kDa)透析48h。透析完后进行冷冻干燥得产物TL-CPT-PEG1K-NH2。
[0062] 4.三苯基膦的修饰步骤如下：
[0063] 5-溴戊酸(3.1g，17.1mmol)和三苯基膦(PPh3，4.24g，16.1mmol)加入40mL乙腈中加热回流24h。冷冻过滤得析出的粗产物，乙酸乙酯洗涤3遍干燥后得白色粉末产物PPh3Br-(CH2)4-COOH(缩写为TPP)。
[0064] 5.修饰后的三苯基膦(TPP)与聚乙二醇另一端氨基的连接步骤如下：
[0065] TPP(173.1mg,0.66mmol)溶于3mL无水的DMF中，溶于3mL无水DMF的三乙胺(triethylamine，TEA，2mmol)，EDC.HCl(153mg，0.8mmol)和1-羟基苯并三唑(hydroxybenzotriazole，HOBT，108mg，0.8mmol)加入含TPP的溶液中室温搅拌反应10min。10min后，含TL-CPT-PEG1K-NH2(200mg，0.133mmol)的4mL无水DMF加入上述溶液室温反应
24h。24h后，此反应液缓慢滴加到70mL去离子水中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌4h以形成胶束。4h后，将此液体装入透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，透析48h。透析后冷冻干燥得产物TL-CPT-PEG1K-TPP。产物TL-CPT-PEG1K-TPP的合成路线见图1，对该产物的结构检测见的见图3。
24h。24h后，此反应液缓慢滴加到70mL去离子水中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌4h以形成胶束。4h后，将此液体装入透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，透析48h。透析后冷冻干燥得产物TL-CPT-PEG1K-TPP。产物TL-CPT-PEG1K-TPP的合成路线见图1，对该产物的结构检测见的见图3。
[0066] 6.装配复合胶束ZnPc-CPT-TPPNPs的过程如下：
[0067] DSPE-PEG溶于氯仿的母液浓度为50mg/mL，ZnPc溶于DMSO母液的浓度为0.4mg/mL。纳米颗粒含有成分的比例不同但制作方法相同。以CPT-PEG1K-TPP:DSPE(8:1)为例，将溶于
0.1mL DMSO的8mg CPT-PEG1K-TPP，溶于氯仿的1mg DSPE-PEG和0.4mg溶于DMSO的ZnPc的溶液混合，缓慢滴加到10mL去离子水中，边滴加边超声，超声功率为130W，滴加完后继续超声
3min。超声后的胶束溶液离心(5000rpm/min，3min)去沉淀物，离心后上清液加入超滤管中超滤3-4次去除有机成分。加去离子水稀释后过0.45μm无菌滤膜得无菌胶束溶液，即线粒体靶向的纳米药物递送系统，这里具体为ZnPc-CPT-TPPNPs。
0.1mL DMSO的8mg CPT-PEG1K-TPP，溶于氯仿的1mg DSPE-PEG和0.4mg溶于DMSO的ZnPc的溶液混合，缓慢滴加到10mL去离子水中，边滴加边超声，超声功率为130W，滴加完后继续超声
3min。超声后的胶束溶液离心(5000rpm/min，3min)去沉淀物，离心后上清液加入超滤管中超滤3-4次去除有机成分。加去离子水稀释后过0.45μm无菌滤膜得无菌胶束溶液，即线粒体靶向的纳米药物递送系统，这里具体为ZnPc-CPT-TPPNPs。
[0068] 以实施例一得到的线粒体靶向的纳米药物递送系统为例来说明本发明的线粒体靶向的纳米药物递送系统用于光动力治疗和化疗联合治疗的机理(见图2)。装配好的线粒体靶向的纳米药物递送系统的构造是：化疗药物CPT在线粒体靶向的纳米药物递送系统的内侧形成疏水的核，聚乙二醇(PEG1K)在中间形成亲水的壳层，TPP在外侧形成靶向线粒体的冠，光敏剂ZnPc核内和核的周围。TPP使得线粒体靶向的纳米药物递送系统的表面带正电荷，有利于穿透细胞膜，和有利于以线粒体为靶标，带动线粒体靶向的纳米药物递送系统达到线粒体，尤其是肿瘤细胞的线粒体。633nm激光照射使得光敏剂ZnPc释放ROS，ROS切割TL释放出化疗药物CPT。从而实现了靶向的，光动力治疗和化疗的协同治疗作用。这里化疗药物还可以是其他抗肿瘤化疗药，比如阿霉素(DOX)、伊立替康、紫杉醇。光敏剂也不限于ZnPc，可以是间-四苯基卟吩。激光照射的波长也不限于633nm，可以是633-660nm。
[0069] 实施例一得到的线粒体靶向的纳米药物递送系统的水合粒径分布见图4，其水合粒径主要集中在100nm附近。
[0070] 缩硫酮linker对ROS的敏感性检测：从图5中可以看出，加ROS后，缩硫酮linker(TL)被切断，缩硫酮linker的双甲基峰(δ1.47,1.54ppm)消失，证明此TL具有ROS敏感性。
[0071] 线粒体靶向性检测：以线粒体膜电位荧光探针JC-1染细胞，具有正电荷的纳米颗粒进入线粒体后，使线粒体的负电位发生变化。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出红色荧光；线粒体如果由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。从图6中可以看出与健康对照、ZnPc、CPT和ZnPc-CPT-NH2NPs相比，ZnPc-CPT-TPPNPs对线粒体的靶向性非常好。
[0072] 疗效检测：
[0073] (1)线粒体靶向的纳米药物递送系统ZnPc-CPT-TPPNPs在激光激发下在体外对肺癌细胞NCI-H460的治疗效果显著好于没有激发光的情况，在激光照射下，ZnPc-CPT-TPPNPs对NCI-H460的治疗效果也好于非线粒体靶向的ZnPc-CPT-NH2NPs，见图7。
[0074] (2)在激光激发下，线粒体靶向的纳米药物递送系统ZnPc-CPT-TPPNPs对肺癌NCI-H460裸鼠移植瘤的治疗效果是几种治疗方案中最好的，见图8。
[0075] 实施例二
[0076] 1.ROS敏感的缩硫酮linker(TL)合成步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0077] 2.合成TL-DOX实验步骤如下：
[0078] TL(252.1mg，1.0mmol)溶于无水的10mL DMF中，依次加入三乙胺(TEA，303.6mg，3.0mmol)、2,4,6-三氯苯甲酰氯(241.9mg，1.0mmol)、二甲氨基吡啶(DMAP，24.4mg，
0.2mmol)，搅拌10min。溶于10mL DMF的阿霉素(DOX，271.76mg，0.5mmol)后加入，室温搅拌反应24h。以水淬灭反应，粗产物过硅胶柱得纯品。
0.2mmol)，搅拌10min。溶于10mL DMF的阿霉素(DOX，271.76mg，0.5mmol)后加入，室温搅拌反应24h。以水淬灭反应，粗产物过硅胶柱得纯品。
[0079] 3.TL-DOX与聚乙二醇一端氨基的连接步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0080] 4.三苯基膦的修饰步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0081] 5.修饰后的三苯基膦与聚乙二醇另一端氨基的连接步骤与实施例一相同，这里不再赘述。
[0082] 6.装配ZnPc-DOX-TPPNPs的过程与实施例一相同，这里不再赘述。
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