尽管多种抗癌药物应用于临床，但是肿瘤病人对抗癌药物的耐受严重制约了临床化疗 的疗效。肿瘤从一开始就对某些药物不敏感，是由于肿瘤细胞的内在特性或药物方面的因 素所致；肿瘤最初对化学治疗很敏感，而一但复发，则呈现出完全不同的表型，对以前用 过的药物和不同结构及不同作用机制的新药都产生抵抗力，又称做多药耐药性(MDR)。而 耐药的机制是多方面的，不同药物耐受的机制也有所不同。如药物摄取的减少；细胞内药 物分布的改变；药靶相互作用的改变；机体解毒作用的增加；细胞生长周期的失调；DNA 损伤修复的增加；细胞调亡的减少等多种机制参与机体对药物耐受的形成(Hio Chung Kang， Il-Jin Kim，et al.Identification of Genes with Differential Expression in Acquired Drug-Resistant Gastric Cancer Cells UsingHigh-Den-sity Oligonucleotide Microarrays.Clinical Cancer Research.2004，272(10)，272-284)
目前，体外药敏实验已经成为了一种的预测临床化疗效果的实验方法。它是直接用原 代细胞进行的体外实验，克服临床用药的盲目性和经验用药的缺点，在肿瘤临床诊断和治 疗监测方面具有一定的意义。
早在1950年，Black和Spear等人首先报道了体外实验预测肿瘤病人对化疗药的反应 性，它们利用琥珀酸脱氢酶能使底物显色的原理进行有活力细胞的显色检测，比较了氨基 喋呤的体外药敏实验与临床反应性的关系(MM BLACK and FD SPEER.Further observations on the effects of cancer chemotherapeutic agents on the in vitro dehydrogenase activity of cancer tissue.J Natl Cancer Inst，1954；14：1147-58.)，不过其预测 准确性不是很高。而后发展起来的几种常用的方法有：
(1)克隆分析法：这是评价化疗药物抑制琼脂中肿瘤干细胞的增殖能力的实验，它是根据原 代消化后的肿瘤细胞中的某些瘤细胞具有干细胞增殖特性的原理，所用的琼脂培养基能够 排除非转化细胞的增殖(DD Von Hoff，R Kronmal，SE Salmon，J Turner，JB Green，JS Bonorris，EL Moorhead，HE Hynes，RE Pugh，and RJ Belt.A Southwest Oncology Group study on the use of a human tumor cloning assay for predicting response in patients with ovarian cancer.Cancer，1991；67：20-7.)。实体的肿瘤先用剪刀剪成多细胞组织 块的悬液，再通过一定孔径大小的筛网或者用胶原酶消化，最后将消化后的液体通过一高 尺寸的针孔(high-gauge needles)获得了单细胞悬液。将细胞用药物孵育1小时，漂洗， 种于含琼脂的生长培养基14到28天后计数从琼脂培养基中生长出的经药物处理过的细胞 的克隆和对照未经药物处理过的细胞克隆数。但是该方法的主要缺点是耗时长，操作麻烦， 成功率低，一般只能使低于50％的实验样本获得实验结果，因此不大适合应用于临床实验 预测。而且一些消化后的很小的细胞团块也可能被误认为是增殖的克隆，从而干扰了分析 的结果。
(2)[3H]胸腺嘧啶掺入法：其原理是细胞增殖前必须复制DNA，而胸腺嘧啶是DNA的特异性 碱基。用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(TdR)掺入到新合成的DNA后，会均匀地分布于子 细胞中。此时只要测定3H的放射性脉冲数便可比较药物处理前和处理后细胞的增殖活性从 而计算出药物的抑制率。它作为一种分析的终点法，能够部分的消除消化后细胞团块引起 的影响，并且将分析的时间从原来的14天缩短到了1个星期，实验成功率增加到了85％(N Tanigawa，DH Kern，and Y Hikasa，et，al.Rapid assay for evaluating the chemosensitivity of human tumors in soft agar culture.Cancer Res.1982；42：2159 -2164.)。但是[3H]胸腺嘧啶系统需要较长的药物作用时间，而且对仪器设备的要求较高， 对周围的环境也能产生放射性的影响，因此该方法也不适合作为我们体外药物筛选的实验 方法。
(3)特异性染色细胞毒分析法(DiSC)：该法是Bosanquent A G等人于1996年发展起来 的一种分析技术，它是根据活细胞的结构完整性的原理进行药物敏感性分析(AG Bosanquet and PB Bell.Enhanced ex vivo drug sensitivity testing of chronic lymphocytic leukaemia using refined DiSC assay methodology.Leuk Res，1996；20：143-53.)。 在Disc分析中，细胞加一定浓度的药物孵育4天后，在含有2％快绿和1％苯胺黑的溶液中 加入一定数量的固定的鸭红细胞作为计数内标，通过细胞离心将细胞转移到显微镜的载玻 片上，干燥，甲醇固定，最后经Romanocosky染色，活细胞经过与内标的固定红细胞对比 得出肿瘤细胞的形态特征加以鉴别。Disc方法需要超过10％的肿瘤细胞，并且能够测量分 裂期和非分裂期细胞群的杀伤。但是该方法的缺点是细胞计数烦琐，有些淡染细胞不易区分 死活，染色时间要准确，稍长时则活细胞也染色，故敏感性较差。
(4)有报道也有人将消化后的原代细胞经过密度梯度离心法排除成纤维细胞，淋巴细胞等各 种非肿瘤细胞，将纯化后的肿瘤细胞用MTT直接法进行药敏实验，取得了不错的效果(H Yamaue，H Tanimura，T Tsunoda，M Tani，M Iwahashi，K Noguchi，M Tamai，T Hotta， and K Arii.Chemosensitivity testing with highly purified fresh human tumour cells with the MTT colorimetric assay.Eur J Cancer，Jan 1991；27：1258-63.)。但是这 种方法有两个最大的缺点：一是临床所能提供的标本量，往往难以满足实验要求，不能得 到足够数量的纯癌细胞。二是原代消化的肿瘤细胞，单个的肿瘤细胞与成团的细胞混在一 起，当成团的细胞所占比例较大时，往往不能取得较好的纯化效果。
尽管已建立了上述这些能用于药物敏感性的试验方法，但由于各自的缺点，很难实际 应用于临床。因而目前临床几乎不存在有效的评价方法，只能是试验性治疗，即临床用药 一段时间来决定是否有效，存在很大的盲目性。所以人们一直在探索能预测药物有效性(敏 感或抵抗)的技术方法。
肿瘤细胞对化疗药物的耐受是一个多基因表达改变的过程，涉及细胞代谢、细胞内信 号传导等多组基因。单一的基因改变无法全面理解耐受形成的机制。药物诱导细胞表型的 改变这些基因的改变相互协调，相互制约导致了耐药肿瘤细胞的耐药表型的出现。对于芯 片技术带给我们巨大的生物信息量，仍然需要进一步深入研究。包括这些基因的量变的生 物学以及功能的确定。然而，采用传统的方法如Northern、Southern blotting、Western blotting仅能分析个体很少一部分基因的改变。对于耐药细胞系和临床对化疗药物耐受病 例中的全部基因的改变知之甚少。基因芯片技术是近年迅速发展起来的高新生物技术之一， 具有能在同一张芯片上同步检测成千上万个基因的技术优势，有效地克服了传统分子生物 学方法的局限性、片面性和敏感性较低的缺点，能够尽量获得全面的耐药相关基因改变图 谱，为研究新的耐药相关基因提供参考，并且可以指导临床治疗，使化疗药物的使用更加 合理有效(Schena M，Shalon D，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.Science，1995，270(5235)：467-470)。 这种“分子指纹”将会使开展有个体针对性的临床化疗成为可能。

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯 片。
本发明的技术方案概述如下：
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，是在玻片或硅片或高分子材料上固定检测药物 敏感性的DNA探针，所述DNA探针为序列表从SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中由至少5个 核苷酸序列组成。
还可以是在所述SEQ ID No.1至SEQ ID No.59的核苷酸序列中每个核苷酸序列的碱基 数为任意的连续的20个碱基。
本发明旨研究筛选出能用于评价药物敏感性的基因，并确定其特异性系列片段，用于 制备基因芯片设计。本发明人前期进行的工作是：
①从临床获取肿瘤标本进行体外短暂培养，并确定其对药物的敏感性，而后从基因组水平， 用生物芯片进行筛选，获得与药物敏感相关的基因；
②体外肿瘤细胞系，用药物进行低量长期诱导建立肿瘤耐药细胞系，然后与亲本细胞系进 行基因表达谱分析，获取药物敏感性相关基因；
③在筛选出药物敏感性相关基因后。利用生物信息学方法及结合实验研究，最终设计、确 定了59个肿瘤药物敏感性相关的基因的各自特异性片段(55个碱基)作为本发明的基因 芯片的探针分子。
以这些基因片段作为检测药物敏感性基因表达变化的探针(可以由市售服务公司进行 化学或生物方法合成)，在获得这些探针后，制备了以玻片基质为载体的基因芯片，并进行 了初步的检测应用。本技术发明的主要优点是：
1.本发明从分子水平检测抗性或敏感的指标，因而具有更能全面、更特异、更准确的特点；
2.敏感性大大高于现有的一些方法；
3.检测时间上大大缩短；
4.规模生产之后，其实际成本低于现有方法。
附图说明
图1为制备的检测药物敏感性的基因芯片照片。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
序列表
SEQ ID No.1.5’ aatgtggagt cctgtggctc tctgcgtcct gaaaccattg tcctgtcagc cctct3’
SEQ ID No.2.5’ ccgaggaggt ggacctctcc aaggacattc agcactggga atccctgaaa cccga3’
SEQ ID No.3.5’ ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaa3’
SEQ ID No.4.5’ agtgatgaat tttaacttct ggaaatcaga cttttacaac tggatgtgtg actag3’
SEQ ID No.5.5’ gaggacgtga agctccttcc agacgatgaa aacacgccgg aaaagcgagc cgaga3’
SEQ ID No.6.5’ gggacctggc agcgagaaac attcttttat ctgagaacaa cgtggtgaag atttg3’
SEQ ID No.7.5’ cctggggacg agcggcggaa actcatccga tacgtcacag ccttcaatgg ggagc3’
SEQ ID No.8.5’ gcaggtagag gaggaagttg atgccatgct ggccgtcaag aagtaaagga aagaa3’
SEQ ID No.9.5’ accagagaac tgaccaacga tggggaactg atcctgacca tgacggcgga tgacg3’
SEQ ID No.10.5’ gataaccaga cctgctgccg agacaaccga cagggctggg cctgctgtcc ctacg3’
SEQ ID No.11.5’ accagtccaa cttcagctta tcaggtgccc agatagatga caacaatccc aggcg3’
SEQ ID No.12.5’ aaggtgatgg tgatgaagag ggagaaaatg aggaggagga ggaagatgca gaggc3’
SEQ ID No.13.5’ agttcccaac ctgtcccagt ttgtctgagg atcaagtatt ggcctgaaat agagt3’
SEQ ID No.14.5’ tgccttccct tttgagctat tgcacacgcc tgaaaagtgg gtgaggttca agtac3’
SEQ ID No.15.5’ cggctcaaca ccatcatgga ctacacaagg gtgatcgtct tggacaaagg agaaa3’
SEQ ID No.16.5’ acaatctgta tctttgacaa ttctgggtgc gagtgtgaga gtgtgagcag ggctt3’
SEQ ID No.17.5’ catcagtgaa atgacagata aactagggct tcagtctctt cgtaacagaa catgg3’
SEQ ID No.18.5’ attttcctta tctgcttcct agtcctgtat gcccttttcc taacactcac aacaa3’
SEQ ID No.19.5’ gaaaggataa ggatgctaaa ttccgtctga ttctaataga gagccggatt caccg3’
SEQ ID No.20.5’ ttgaatgatg agtgggagtt tgataggtaa agaaaaggag gaatggccgg gcaca3’
SEQ ID No.21.5’ tagttggaaa ctgcttttgt ggtggcactg cgacttgaca ggttaatgac tgctg3’
SEQ ID No.22.5’ actgatgtcc ctgtctccag gacggcctcc tctcctactt tgggacgccc acgtg3’
SEQ ID No.23.5’ ctatctgggc cacaagtgaa gtcaacatgc ctgccccaaa caaatatgca aaagg3’
SEQ ID No.24.5’ gtggaactct atgggaacaa tgcagcagcc gagagccgaa agggccagga acgct3’
SEQ ID No.25.5’ tcagcgaaag ttctcccggt ccgaccacct gaagacccac accaggactc ataca3’
SEQ ID No.26.5’ atgaaggaat ggcataccac accagacaga tgcgttcagc cgatgaaggg caaac3’
SEQ ID No.27.5’ atctgtacgg gcaaagaaac ctataaagta cctggaagag tcagatgaag atgat3’
SEQ ID No.28.5’ agctgaattt gattctccag ccaacctcat tgcagctaga ggcatcttct acggg3’
SEQ ID No.29.5’ cgtggtaagt gcccagtgcc cctttggtgg attcaagatg tctggaaatgg aaga3’
SEQ ID No.30.5’ ctgctgcaaa gaggagaaaa ccagccagcg tgaggtggtc ctgagctgcc ccaat3’
SEQ ID No.31.5’ agccaacgtc accatcttca gaccctcaac cttcttcatc atcgcccaga ccagc3
SEQ ID No.32.5’ gctgcctccc ctcctctgct tgccatccct ccctccacct ccctgcaata aaatg3’
SEQ ID No.33.5’ aggtcctccc gctgctgtca tggttggttc gctaaactgc atcgtcgctg tgtcc3’
SEQ ID No.34.5’ ccatcctcct ggtgtcagca agctgggttt gcagtgtctt ccaagcgacg gtgtt3’
SEQ ID No.35.5’ ggtctgttgg tcaatctcac aaccattgca tcttggctgt catggcttca gtact3’
SEQ ID No.36.5’ gatgtggttt acttcagccc agggcaaccc caacgaggaa gtggcgaggt tctat3’
SEQ ID No.37.5’ tggaagtgcg tcttttggat gcagaaaaca aagtcgtggc gaatgggact gggac3’
SEQ ID No.38.5’ aatcactggg acaactgtgg gaaggctggg aaggttaaga aacaacagag gtgga3’
SEQ ID No.39.5’ ttcctggcct cccctgagta cgtgaacctc cccatcaatg gcaacgggaa acagt3’
SEQ ID No.40.5’ gaaggtcaag tgtgtaccaa gcataggaga aaaggctctc atggactaga aatat3’
SEQ ID No.41.5’ aaacacgttg ctttactaca agacttctgg gagccttcag tatgctgctg ttcat3’
SEQ ID No.42.5’ ctgacattct ccacttcttg ttccccactg acagcctccc acccccatct ctccc3’
SEQ ID No.43.5’ tgagtggggc gggtggggcc ataaacggtt cctggtgact cctgagtctt gcctg3’
SEQ ID No.44.5’ agccttgctc ctggctgggg cctgttgaag atgcttgtat tttacttttc cattg3’
SEQ ID No.45.5’ aacagctaac ctctaatggg agttggcttc tgattctcat tcaggcttct cacgg3’
SEQ ID No.46.5’ caccacccac tctggcactg gcttcatcct ttacctatcc ccttccaccc tcctt3’
SEQ ID No.47.5’ gaggcagacg agctgatgaa gagagtgggt ttccagtatg agggcaccta caagt3’
SEQ ID No.48.5’ gctctatgct ggtgactgga cacatcgcct ctggttaaat ctctcctgct tggtg3’
SEQ ID No.49.5’ accacccact ctggcactgg cttcatcctt tacctatccc cttccaccct ccttt3’
SEQ ID No.50.5’ tttcaatggt cagtgtccag gctggaacaa agcgccagtg aactctgact gtatg3’
SEQ ID No.51.5’ gatgagaaat gatgaaaagg ttgcctgaaa aatgggagac agcctcttac ttg3’
SEQ ID No.52.5’ ggggttgtgg tcggggagct ggggtacagg tttggggagg gggaagagaa att3’
SEQ ID No.53.5’ ctgcaatggg ttaccacatt ctcatctgga gccaggagga agccaggaca cgg3’
SEQ ID No.54.5’ agccaagaaa gggaagggaa aggactagac gccaagcctg gatgccaagg agc3’
SEQ ID No.55.5’ aggtggactt cagtgagttc atcgtgttcg tggctgcaat cacgtctgcc tgt3’
SEQ ID No.56.5’ gctccctcgc tgtatgattt aggcttctat gtccaacaga gtggactctt ccc3’
SEQ ID No.57.5’ caccgccggt ttatatgatc ttcatacctt tccctggacc acaggcgttt ctc3’
SEQ ID No.58.5’ ctacttgcca gcagagtatc tgtcttattt taggatgcag tgtgaaactt acc3’
SEQ ID No.59.5’ tatgaagtcc ctgccactag ccagccatcc taattgatga aagttatctg ttc3’
实施例2
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.50 所示的核苷酸序列组成。
实施例3
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在硅片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.10、SEQ ID No.15、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.55所示的核苷酸序列组成。
实施例4
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在高分子材料上固定检测药物敏感性的DNA探 针，所述DNA探针为序列表SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No.29、SEQ ID No.41、 SEQ ID No.56所示的核苷酸序列组成。
实施例5
除实施例2、实施例3、实施例4所示的检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片以外，还 可以选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意5个核苷酸序列组成基因芯片，用于 检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例6
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.50、 SEQ ID No.58所示的核苷酸序列组成。
实施例7
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.2、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.35、 SEQ ID No.45所示的核苷酸序列组成。
实施例8
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.8、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.39、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57所示的核苷酸序列组成。
实施例9
除实施例6、实施例7、实施例8所示的检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片以外，还 可以选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意6个核苷酸序列组成基因芯片，用于 检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例10
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.21、SEQ ID No.25、 SEQ ID No.29、SEQ ID No.44所示的核苷酸序列组成。
实施例11
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.55所示的核苷酸序列组成。
实施例12
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.34、SEQ ID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.45、SEQ ID No.48、SEQ ID No.58所示的核苷酸序列组成。
实施例13
除实施例10、实施例11、实施例12所示的检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片以外， 还可以选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意6个核苷酸序列组成基因芯片，用 于检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例14
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.50、 SEQ ID No.52、SEQ ID No.53所示的核苷酸序列组成。
实施例15
除实施例14所示的检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片以外，还可以选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意7个核苷酸序列组成基因芯片，用于检测肿瘤化疗药物敏 感性。
实施例16
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意8个核苷酸序列组成基因芯片，用于 检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例17
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意9个核苷酸序列组成基因芯片，用于 检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例18
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意10个核苷酸序列组成基因芯片，用 于检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例19
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意20个核苷酸序列组成基因芯片，用 于检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例20
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意30个核苷酸序列组成基因芯片，用 于检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例21
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意40个核苷酸序列组成基因芯片，用 于检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例22
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59中任意50个核苷酸序列组成基因芯片，用 于检测肿瘤化疗药物敏感性。
实施例23
选用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.59个核苷酸序列组成基因芯片，用于检测肿瘤 化疗药物敏感性。
实施例24
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.1中从第10个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.2 中从第15个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.5中从第21个核苷酸始连接20 个核苷酸的序列、SEQ ID No.9中从第19个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.50 中从第30个核苷酸始连接20个核苷酸的序列所示的核苷酸序列组成。
实施例25
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.4中从第15个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.6 中从第15个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.15中从第21个核苷酸始连接 20个核苷酸的序列、SEQ ID No.9中从第5个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.50 中从第33个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.51中从第23个核苷酸始连接 20个核苷酸的序列所示的核苷酸序列组成。
实施例26
检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片，在玻片上固定检测药物敏感性的DNA探针，所 述DNA探针为序列表SEQ ID No.5中从第16个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.6 中从第19个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.16中从第21个核苷酸始连接 20个核苷酸的序列、SEQ ID No.19中从第8个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.32中从第21个核苷酸始连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.34中从第22个核苷酸始 连接20个核苷酸的序列、SEQ ID No.51中从第19个核苷酸始连接20个核苷酸的序列所 示的核苷酸序列组成。
实施例27  检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片的制备，在玻片上固定检测药物敏感性的 DNA探针，所述DNA探针为序列表从SEQ ID No.1至SEQ ID No.59所示的核苷酸序列组成。
(一)基因芯片的制备
玻片片基的清洁
1.将玻片(MICROMaX Glass Slides：UltraCleanTM I，PerkinElmer Inc.)在去离子水中 用软布擦洗数次。
2.将玻片置于NaOH-乙醇溶液中，60rpm摇洗4h。
NaOH-乙醇溶液配制方法：

混匀后，继续加入去离子水300mL，至溶液澄清。
3.将玻片置于1.5L去离子水中，60rpm摇洗4h。
4.将玻片置于1.5L去离子水中，60rpm摇洗过夜。
5.次日将玻片置于离心管中，2000rpm离心5min甩干水分，置于室温保存。
片基的包被
1.将500μL aPS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)加入500mL甲苯中(aPS终浓度为0.1％)， 混匀，42℃水浴预热10min。
2.将清洁的玻片置于预热后的aPS-甲苯溶液中，42℃温箱中静置30min。
3.将玻片置于500mL甲苯中，60rpm摇洗10min。
4.将玻片置于500mL甲苯中，60rpm摇洗15min。
5.取出玻片，迅速置于110℃烤箱中干烤20min。
6.将所得的氨基包被的玻片置于室温保存。
基因芯片的点样
上述59个基因探针由美国IDT公司合成
1.将合成好的探针于室温1500rpm离心10min。
2.用含有0.01％二甲苯蓝的3×SSC溶液将各孔探针溶解为300μmol/L的溶液。
3.室温1000rpm离心10min。
4.置于摇床上60rpm摇动溶解过夜。
5.次日从溶解好的探针中各取10μL，加入含有0.01％二甲苯蓝的3×SSC溶液140μL， 得到终浓度为20μmol/L的探针溶液。
6.取20μmol/L的探针溶液按顺序加入96孔板中，置于点样仪(SpotarrayTM 24， PerkinElmer Inc.)中，设置好程序和参数后进行点样。
7.点样完毕后，将玻片在点样仪中自然干燥12h。
8.将玻片在紫外交联仪中300mJ进行紫外交联。
9.将玻片在110℃烤箱中干烤5sec。
10.将点样后的玻片置于室温保存。
基因芯片的点样后处理
1.配制以下溶液：
(1)3×SSC(含0.2％SDS)共3组

(2)0.256％NaBH4溶液共1组

NaBH4    1.33g
(3)去离子水500mL共5组
2.将玻片置于3×SSC(含0.2％SDS)溶液中，60rpm摇洗1min，共2次。
3.将玻片置于去离子水中，60rpm摇洗1min，共2次。
4.将玻片置于0.256％NaBH4溶液中，60rpm摇动封闭1min(不要过长)。
5.将玻片置于去离子水中，60rpm摇洗1min。
6.将玻片置于3×SSC(含0.2％SDS)溶液中，60rpm摇洗1min。
7.将玻片置于去离子水中，60rpm摇洗1min，共2次。
8.将玻片置于离心管中，2000rpm离心5min。
9.将处理后的玻片置于-20℃避光保存。并扫描，确定其质量，数据见附图。
(二)组织大片段RNa的提取(mirVanaTM miRNa Isolation Kit，ambion Inc.)和鉴定
1.选取临床资料上显示对某药物敏感或耐药的病例手术切除的组织标本，离体后迅速置于 液氮中保存。
2.将冻存组织称重，而后置于研钵中，边加液氮边用力研磨，直至成极细的碎末状。
3.加裂解液(Lysis/Binding Buffer)约200μL/mg组织，继续研磨，使裂解液和组织充 分作用。
4.待匀浆物成浊液状时，移至1.5mL Ep管中，加入1/10体积的裂解佐剂(miRNa Homogenate additive)，涡旋，冰浴10min。
5.加入与起始裂解物等体积的酸性酚：氯仿(acid Phenol：Chloroform)，涡旋30-60sec。
6.室温16100×g离心15min，小心吸取上清，置于另一管中。
7.在上清中加入1/3体积的无水乙醇，涡旋混匀。
8.将裂解物-乙醇混合物通过滤器(Filter Cartridge)，10000×g离心15sec。(大片段 RNa被滤器吸附，小片段RNa在滤液中)
9.将滤器移至新管，加入500μL洗脱液2/3(Wash Solution 2/3)，10000×g离心10sec， 弃滤液。
10.重复步骤9一次。
11.10000×g离心1min，除净残留的液体。
12.将滤器移至新管，加100μL 95℃预热的DEPC处理的水，16100×g离心30sec，回收 大片段RNa。
13.重复步骤12一次，共收集大片段RNa 2管200μL。
14.将所得的RNa各取出2μL用于鉴定，其余置于-80℃保存。
15.将各组RNa取1μL用于OD260吸光度测定，1μL用于1％琼脂糖凝胶电泳，计算RNa的 浓度(OD260×4，μg/μL)并根据电泳图检查RNa的质量。
(小片段RNa的纯化过程略)
(三)样品的标记和cDNa分析(MICROMaXTM TSaTM Labeling and Detection Kit，PerkinElmer Inc.)
cDNa的合成和标记
1.在两个无RNa酶和DNa酶的管上标记好荧光素(FL)或生物素(Biotin)，制备以下的标 记反应混合物：   试剂   用量   溶于无RNa酶水中的5μg总RNa   “x”μL   (Y)反应混合浓缩液   0.5μL   荧光素或生物素核苷酸   0.5μL   无RNa酶的水   9-“x”μL   总体积   10μL
2.65℃孵育10分钟，使RNa的二级结构变性。
3.将反应物冷却至室温(25℃)5分钟，使引物与RNa模板退火。
4.将反应物加热至42℃维持2-3分钟，而后在每管中按顺序加入以下试剂，每加入一种试 剂时应用加样器吹打混匀。    试剂 用量(初始体积10μL)    (a)10×RT反应缓冲液，混匀 1.25μL    (E)aMV逆转录酶/RNa酶抑制剂混合    物 1.0μL    总体积 12.25μL
5.继续于42℃孵育60分钟。
6.将标记反应物冷却到4℃维持5分钟，加入以下试剂，每加入一种试剂时应用加样器吹打 混匀。     试剂 用量(初始体积12.25μL)     0.5M EDTa，pH8，混匀 1.25μL-终止反应     1.0N NaOH，混匀 1.25μL-开始水解     总体积 14.75μL
7.65℃孵育30分钟。(注意：不要超过30分钟)
8.冰上冷却5分钟，加入：     试剂 用量(初始体积14.75μL)     1M Tris-HCl，pH7.5，混匀 3.25μL-中和反应物     终体积 18μL
9.将各标记反应物移至离心管中，加入以下试剂：     试剂 用量(初始体积18μL)     5M乙酸铵，混匀 2.7μL     100％异丙醇 31μL     总体积 51.7μL
10.涡旋混匀，4℃孵育30分钟。
11.4℃10000g离心沉淀15分钟。
12.小心去除尽可能多的上清，将沉淀用100μL 70％乙醇洗2遍。(加入70％乙醇，涡旋混匀， 4℃离心10分钟，弃去上清。)
13.去除尽可能多的上清，在真空离心干燥机中干燥5分钟。
14.将各标记反应物沉淀溶于10μL杂交缓冲液(Q)中，在室温(25℃)放置10分钟，不时 摇动。
15.取1μL进行后续的cDNa分析，其余暂存于-20℃。
标记的cDNa分析
1.按以下方法准备荧光素标记的对照cDNa(aa)和生物素标记的对照cDNa(G)用无DNa酶和 RNa酶的水进行的系列稀释物：
a.)取各对照cDNa 1μL加入9μL TE缓冲液中(1∶10稀释)。
b.)继续进行倍比稀释(取5μL加入5μL TE缓冲液中)，制得以下浓度的溶液： 1∶10 1∶20 1∶40 1∶80
2.按以下方法准备荧光素标记的样品cDNa和生物素标记的样品cDNa用无DNa酶和RNa酶的 水进行的系列稀释物：
a.)取各样品cDNa 1μL加入4μL TE缓冲液中(对原样品浓度进行1∶5稀释)。
b.)从上步溶液中取1μL加入9μL TE缓冲液中(对上步溶液进行1∶10稀释)。
c.)继续进行倍比稀释(取5μL加入5μL TE缓冲液中)，制得以下浓度的溶液：
1∶5(按照原样品浓度计算)   1∶10(按照上步溶液浓度计算)
1∶20                      1∶40
3.操作GeneScreenTM 膜(F)时应始终戴手套。准备8cm×8cm大小的膜，用铅笔和干净的尺 在膜上划线，划分为4个2cm×8cm的区域，将4个区域标记好“实验”或“对照”荧光素 和“实验”或“对照”生物素。
4.在确保移液器吸头不碰触到膜的情况下，取各连续稀释的溶液1μL滴加在膜上，每排滴 加两个复点。置于空气中干燥。
5.将膜的边缘在约10mL 2×SSC中浸湿(不要将膜的点样部分浸没)，而后置于滤纸上。
6.在紫外交联仪中120mJ交联固定cDNa。
7.用镊子夹取整张膜置于可密封塑料袋中，加入2mLTN封闭缓冲液(TNB)，挤除气泡后进 行热熔密封。
8.在摇床上60rpm轻摇孵育30min。
9.将抗荧光素-HRP复合物(Z)和抗生物素-HRP复合物(J)各12μL加入2.1mL TNB中制得 结合缓冲液，并在配制后10分钟内使用。
10 剪开塑料袋，挤出TNB，应确保挤净剩余液体。将全部的结合缓冲液加入袋中，挤除气 泡后进行热熔密封。
11.在摇床上60rpm轻摇孵育30min。
12.准备一个干净的与膜大小匹配，能装入至少20mL TNT缓冲液的碟子。剪开塑料袋，用 镊子将膜夹出，迅速移至装有TNT缓冲液的碟中。
13.置于摇床上60rpm摇动洗脱5次，每次5分钟。
14.将0.5mL 4CN Plus稀释液(BB)和100μL 4CN Plus底物(CC)加入4.5mL双蒸水中， 制得4CN Plus工作试剂。4CN Plus工作试剂应在配制后5分钟内使用。
15.将膜置于另一个碟中，迅速将4CN Plus工作试剂用移液器滴加在膜上，确保能完全覆 盖膜的表面。在有盖容器中暗处孵育30分钟。
16.所有的cDNa点都应可见，点迹深度变化应与浓度变化相对应。
(四)标记的样本与基因芯片杂交
1.将杂交器和点样并处理后的芯片置于55℃温箱中预热。
2.将每对配对的cDNa样品各取4.5μL混合成终体积为9μL的溶液，90℃水浴2分钟，瞬时离 心。
3.立即将以上溶液滴加至玻片的微阵列区，加盖玻片。
4.在杂交器中加入200μL的2×SSC溶液以保持湿度。
5.置于55℃温箱中杂交过夜(12-16小时)。
(五)杂交后处理和检测(MICROMaXTM TSaTM Labeling and Detection Kit，PerkinElmer Inc.)
1.配制以下溶液：
(1)0.5×SSC，0.01％SDS溶液共2组

(2)0.06×SSC，0.01％SDS溶液共1组

(3)0.06×SSC溶液共2组

2.打开杂交器，迅速将芯片置于0.5×SSC，0.01％SDS溶液中，轻轻直立芯片，使盖玻片滑 落。
3.将玻片移入新的0.5×SSC，0.01％SDS溶液中，60rpm摇动5分钟。
4.将玻片移入0.06×SSC，0.01％SDS溶液中，60rpm摇动5分钟。
5.将玻片移入0.06×SSC溶液中，60rpm摇动5分钟。
6.将玻片沥去液体，用1.5mL TNB溶液孵育10分钟。
7.将玻片移入40mL TNT缓冲液中，60rpm摇动1分钟。
8.将玻片沥去液体，在200μL的抗-荧光素-辣根过氧化物酶结合物溶液中孵育10分钟。
抗-荧光素-辣根过氧化物酶结合物溶液：

9.将玻片移入40mL TNT缓冲液中，60rpm摇动1分钟，共3次。
10.将玻片沥去液体，在250μL的Cy3-酪胺溶液中孵育10分钟。
Cy3-酪胺溶液：

11.将玻片移入40mL TNT缓冲液中，60rpm摇动5分钟，共3次。
12.将玻片沥去液体，在200μL的HRP灭活溶液中孵育10分钟。
HRP灭活溶液：

13.将玻片移入40mL TNT缓冲液中，60rpm摇动1分钟，共3次。
14.将玻片沥去液体，在200μL的抗-生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物溶液中孵育10分 钟。
抗-生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物溶液：

15.将玻片移入40mL TNT缓冲液中，60rpm摇动1分钟，共3次。
16.将玻片沥去液体，在250μL的Cy5-酪胺溶液中孵育10分钟。
Cy5-酪胺溶液：

17.将玻片移入40mL TNT缓冲液中，60rpm摇动5分钟，共3次。
18.将玻片移入0.06×SSC溶液中，60rpm摇动1分钟。
19.将玻片置于离心管中，2000rpm(500×g)离心5分钟。
(六)数据的获取和分析
1.将玻片置于扫描仪(Scanarray Express，Packard BioScience)中进行扫描。本次实 验扫描的基本参数如下：敏感病例：用Cy3检测，激发光波长543nm，激发光强度90％， 增益(PMT)90％，扫描精度10μm。耐药病例：用Cy5检测，激发光波长633nm，激发光 强度80％，增益(PMT)80％，扫描精度10μm。
2.用软件中的网格进行像素和背景的位置确定，并输出数据。
3.分别对标准化后和未标准化的数据进行数据处理。取各点像素的中位数值-背景值进行 分析，以Cy5/Cy3比值≥2，并且Cy5≥1000的基因确定为上调基因，以Cy5/Cy3比值≤0.5， 并且Cy3≥1000的基因确定为下调基因。(结果见表1)。
表1 肺鳞状细胞癌耐药基因芯片检测结果  敏感病例：张xx(180353)，耐药病例：迟xx(179610)     表达变化 Index 基因   基因编号 化疗药 标化后 上调 166，167，168 钙结合蛋白2(Calbindin 2)   NM_001740 氟尿嘧啶 169，170，171 簇联蛋白(Clusterin)   NM_203339 氟尿嘧啶， 顺铂 下调 52，53，54 细胞色素亚单位II(Cytochrome oxidase subunit II)   AF181091(complete cds) 长春新碱 未标化 上调 22，23，24 突触结合蛋白(Synaptotagmin)   M55047(mRNA，complete cds) 阿霉素 94，95，96 骨髓蛋白聚糖基因(BMPG，bone marrow proteoglycan gene)   BC005929(mRNA，complete cds) 甲氨蝶呤 97，98，99 DHFR(dihydrofolate reductase)   BC000192(mRNA，complete cds) 甲氨蝶呤 100，101，102 还原叶酸载体(RFC，reduced folate carrier)   U19720(mRNA，complete cds) 甲氨蝶呤 124，125，126 野生型p53(wt-p53)   AH007667(mRNA，complete cds) 卡氮芥 130，131，132 信号转导和转录激活因子1(stat 1， Signal transducer and activator of transcription 1)   BC002704(mRNA，complete cds) 顺铂 136，137，138 Fibroblast muscle-type tropomyosin   M12126(mRNA，complete cds) 顺铂 139，140，141 6-磷酸葡萄糖脱氢酶变异体A(Glucose-6- phosphate dehydrogenase variant A)   M21248(complete cds) 顺铂 145，146，147 骨架原肌球蛋白-β(Skeletal β- tropomyosin)   X06825(mRNA) 顺铂 148，149，150 MDR1   AF016535(mRNA，complete cds) 紫杉醇 154，155，156 胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin- like growth factor binding protein 2)   NM_000597 氟尿嘧啶 166，167，168 钙结合蛋白2(Calbindin 2)   NM_001740 氟尿嘧啶 169，170，171 簇联蛋白(Clusterin)   NM_203339 氟尿嘧啶， 顺铂 172，173，174 抗药蛋白(Sorcin)   NM_003130 氟尿嘧啶 下调 52，53，54 细胞色素亚单位II(Cytochrome oxidase subunit II)   AF181091(complete cds) 长春新碱
序列表
<110>天津医科大学
<120>检测肿瘤化疗药物敏感性的基因芯片
<160>59
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