一种具有原位产氢的纳米胶束及其制备方法与应用
阅读：1022发布：2020-07-02
专利汇可以提供一种具有原位产氢的纳米胶束及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种具有原位产氢的纳米胶束及其制备方法与应用。所述纳米胶束包括：氟化壳聚糖、[FeFe]氢化酶和 化疗药物 ，所述[FeFe]氢化酶和化疗药物包载于所述纳米胶束的 内核 中，所述氟化壳聚糖构成所述纳米胶束的 外壳 。本发明所述纳米胶束能够有效穿透膀胱粘膜层，到达膀胱癌病灶区域，在 近红外 激光的刺激下纳米胶束稳定产生氢气分子。该纳米胶束可应用于 肿瘤 细胞的光氢 治疗 中，其产生的氢气联合负载药物能有效杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。，下面是一种具有原位产氢的纳米胶束及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种具有原位产氢的纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束包括：氟化壳聚糖、[FeFe]氢化酶和化疗药物，所述[FeFe]氢化酶和化疗药物包载于所述纳米胶束的内核中，所述氟化壳聚糖构成所述纳米胶束的外壳。
2.根据权利要求1所述的具有原位产氢的纳米胶束，其特征在于，按质量百分比计，所述纳米胶束的载药量为10-20％。
3.根据权利要求1所述的具有原位产氢的纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束中，[FeFe]氢化酶与化疗药物的质量比为1:0.5-2:1。
4.根据权利要求1所述的具有原位产氢的纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束的粒径为20-500nm。
5.根据权利要求1所述的具有原位产氢的纳米胶束，其特征在于，所述氟化壳聚糖的含氟功能基团为七氟丁酸、全氟庚酸或19F癸酸。
6.根据权利要求1所述的具有原位产氢的纳米胶束，其特征在于，所述化疗药物选自吉西他滨、阿霉素、柔红霉素、阿柔比星、伊达比星、戊柔比星和紫杉醇中的一种或多种。
7.一种权利要求1-6任一项所述的具有原位产氢的纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将氟化壳聚糖、[FeFe]氢化酶和化疗药物共混后自组装制备得到所述纳米胶束。
8.根据权利要求7所述的具有原位产氢的纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述[FeFe]氢化酶的制备方法包括步骤：
(1)将双氯化合物(ClCH2S)2NC6H4CHO与化合物Fe2(SH)2(CO)6溶解在四氢呋喃溶液中，在三乙胺的存在下进行搅拌处理，得到中间产物A；
(2)在惰性气氛保护下，将中间产物A、苯甲醛和吡咯溶于二氯甲烷中，避光加入三氟乙酸，经搅拌处理后，加入四氯苯醌，加热回流后经Al2O3碱性柱分离，得到[FeFe]氢化酶。
9.根据权利要求8所述的具有原位产氢的纳米胶束的制备方法，其特征在于，将中间产物A、苯甲醛和吡咯按照1:3:4的摩尔比溶于二氯甲烷中。
10.一种权利要求1-6任一项所述的具有原位产氢的纳米胶束在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
一种具有原位产氢的纳米胶束及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 膀胱癌是一种常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，属全球第九大常见的肿 瘤。在我国，膀胱癌发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位，且近年来其 发病呈逐年上升和年轻化趋势。临床上75％以上的膀胱癌为非肌层浸润型膀 胱癌(NMIBC)，其中30％～80％的患者行经尿道膀胱肿瘤切除术后5年内会 出现复发，10％～20％的非浸润型膀胱癌患者会进展为转移能力强的肌层浸 润型膀胱癌。
[0003] 膀胱灌注化疗属于腔内化疗的一种。医生利用导尿管将化疗药物注入 膀胱内，保留一定时间后，患者自然排尽尿液即完成。然而肿瘤细胞耐药 性的产生给膀胱癌的治疗和预后带来了新的挑战。随着患者依赖药物剂量 的增加，导致患者灌注治疗后出现严重的副反应，甚至还会导致治疗失败。
[0004] 作为一个弱还原剂，氢气可以快速的扩散进入到每个组织和细胞中， 并且选择性的消除具有细胞毒性的活性氧自由基(Reactive Oxide Species, ROS)，包括羟基自由基和过氧亚硝基，因此在生物医学领域逐渐受到越来 越多的重视。氢分子具有作为潜在抗氧化剂的优点，没有副作用：它既不 会干扰代谢氧化还原反应，也不会影响ROS，后者在细胞信号传导中发挥作 用，并且在其自身穿透生物膜的物理能力方面具有良好的分布特征，可以 通过屏障扩散到细胞成分中。此外，在大气压下，H2可以在水中溶解至0.8mM (1.6ppm，wt/vol)，而已有研究表明当溶液中氢气的溶解度到0.8mM (1.6ppm，wt/vol)，即可具有明显的生理调节功能。然而由于氢分子极 易挥发，不易稳定保存，因此限制了其在肿瘤治疗中的应用。
[0005] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
[0006] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有原位产氢 的纳米胶束及其制备方法与应用，旨在解决现有氢分子极易挥发，不易稳 定保存，限制了其在肿瘤治疗中的应用的问题。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 一种具有原位产氢的纳米胶束，其中，所述纳米胶束包括：氟化壳聚 糖、[FeFe]氢化酶和化疗药物，所述[FeFe]氢化酶和化疗药物包载于所述 纳米胶束的内核中，所述氟化壳聚糖构成所述纳米胶束的外壳。
[0009] 进一步地，按质量百分比计，所述纳米胶束的载药量为10-20％。
[0010] 进一步地，所述纳米胶束中，[FeFe]氢化酶与化疗药物的质量比为1:1。
[0011] 进一步地，所述纳米胶束的粒径为100nm。
[0012] 进一步地，所述氟化壳聚糖的含氟功能基团为七氟丁酸、全氟庚酸或 19F癸酸。
[0013] 进一步地，所述化疗药物选自吉西他滨、阿霉素、柔红霉素、阿柔比 星、伊达比星、戊柔比星和紫杉醇中的一种或多种。
[0014] 一种本发明所述的具有原位产氢的纳米胶束的制备方法，其中，包括 步骤：
[0015] 将氟化壳聚糖、[FeFe]氢化酶和化疗药物共混后自组装制备得到所述 纳米胶束。
[0016] 进一步地，所述[FeFe]氢化酶的制备方法包括步骤：
[0017] (1)将双氯化合物(ClCH2S)2NC6H4CHO与化合物Fe2(SH)2(CO)6溶解在四 氢呋喃溶液中，在三乙胺的存在下进行搅拌处理，得到中间产物A；
[0019] 进一步地，将中间产物A、苯甲醛和吡咯按照1:3:4的摩尔比溶于二氯 甲烷中。
[0020] 一种本发明所述的具有原位产氢的纳米胶束在制备治疗膀胱癌药物中 的应用。
[0021] 有益效果：本发明所述纳米胶束由以具有细胞膜穿透特性的氟化壳聚 糖聚合物、具有近红外光敏感特性的[FeFe]氢化酶和具有肿瘤杀伤的化疗 药物构成，其中所述[FeFe]氢化酶和化疗药物包载于纳米胶束的疏水性内 核，所述纳米胶束的外壳为亲水性氟化壳聚糖。所述纳米胶束能够有效穿 透膀胱粘膜层，到达膀胱癌病灶区域，在近红外激光的刺激下纳米胶束稳 定产生氢气分子。该纳米胶束可应用于肿瘤细胞的光氢治疗中，其产生的 氢气联合负载药物能有效杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。附图说明
[0022] 图1是本发明实施例中原位产氢的纳米胶束作用机理示意图。
[0023] 图2是本发明实施例中[FeFe]氢化酶([FeFe]TPP)的合成反应示意图。
[0024] 图3是本发明实施例中原位产氢纳米胶束形态(a)及粒径分布(b) 与紫外吸收(c)图。
[0025] 图4是本发明实施例中原位产氢纳米胶束的体外产氢性能表征结果图， (a)在660nm激光照射下不同浓度的纳米胶束产氢含量变化，(b)未经激 光照射不同浓度的纳米胶束均不产氢，(c)相同浓度的纳米胶束在不同时 长的激光照射下产氢含量变化。
[0026] 图5是本发明实施例中原位产氢纳米胶束对膀胱癌细胞的杀伤效果， (a)和(b)为利用CCK8法检测24小时和48小时内原位产氢纳米胶束对 膀胱癌细胞T24的杀伤效果统计图，(c)为利用活死染色检测24小时内 原位产氢纳米胶束对膀胱癌细胞T24的杀伤效果。
[0027] 图6是本发明实施例中原位产氢纳米胶束对原位膀胱癌小鼠模型的治 疗效果，分组情况如下：1:生理盐水组；2:吉西他滨组；3:包载吉西他 滨和[FeFe]氢化酶纳米粒组；4:包载[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组； 5:包载吉西他滨和[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组。(a)小鼠活体成像 考察不同处理组小鼠体内肿瘤生长情况，(b)小鼠肿瘤部位的荧光统计值， (c)(d)小鼠在膀胱解剖下来肿瘤的照片和重量统计，(e)5组小鼠的 生存率统计。
具体实施方式
[0028] 本发明提供一种具有原位产氢的纳米胶束及其制备方法与应用，为使 本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详 细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0029] 本发明实施例提供一种具有原位产氢的纳米胶束，其中，所述纳米胶 束包括：氟化壳聚糖、[FeFe]氢化酶和化疗药物，所述[FeFe]氢化酶和化 疗药物包载于所述纳米胶束的内核中，所述氟化壳聚糖构成所述纳米胶束 的外壳。
[0030] 本实施例提供的一种具有原位产氢的纳米胶束，所述纳米胶束由以具 有细胞膜穿透特性的氟化壳聚糖聚合物、具有近红外光敏感特性的[FeFe] 氢化酶和具有肿瘤杀伤的化疗药物构成，其中所述[FeFe]氢化酶和化疗药 物包载于纳米胶束的疏水性内核，所述纳米胶束的外壳为亲水性氟化壳聚 糖。所述纳米胶束能够有效穿透膀胱粘膜层，到达膀胱癌病灶区域，在近 红外激光的刺激下纳米胶束稳定产生氢气分子。该纳米胶束可应用于肿瘤 细胞的光氢治疗中，其产生的氢气联合负载药物能有效杀死肿瘤细胞，抑 制肿瘤生长。
[0031] 本实施例中，所述近红外光敏感特性的[FeFe]氢化酶，其含有光照稳 定、光量子产量高的四苯基卟啉(TPP)。
[0032] 在一种优选的实施方式中，按质量百分比计，所述纳米胶束的载药量 为10-20％。
[0033] 在一种优选的实施方式中，所述纳米胶束中，[FeFe]氢化酶与化疗药 物的质量比为1:0.5-2:1
[0034] 在一种优选的实施方式中，所述纳米胶束的粒径为20-500nm。
[0035] 在一种优选的实施方式中，所述氟化壳聚糖的含氟功能基团为七氟丁 酸、全氟庚酸或19F癸酸。
[0036] 本实施例中，所述化疗药物为膀胱灌注用的小分子药物。在一种实施 方式中，所述化疗药物选自吉西他滨、阿霉素、柔红霉素、阿柔比星、伊 达比星、戊柔比星和紫杉醇等中的一种或多种。
[0037] 一种本发明实施例所述的具有原位产氢的纳米胶束的制备方法，其中， 包括步骤：
[0038] 将氟化壳聚糖、[FeFe]氢化酶和化疗药物共混后自组装制备得到所述 纳米胶束。
[0039] 本实施例使用一种具有穿透膀胱粘膜层特性的氟化壳聚糖，通过疏水 作用力将近红外光致产氢的[FeFe]氢化酶和膀胱癌灌注小分子化疗药物高 效的包载在氟化壳聚糖胶束的疏水性内核中，外壳的氟化壳聚糖赋予胶束 有效对膜穿透能力，增强肿瘤细胞对载体的摄取，经特定波长近红外激光 照射后，纳米胶束稳定释放分子氢，联合化疗药物有效提高肿瘤细胞药敏 性，实现对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0040] 在一种具体的实施方式中，上述具有原位产氢的纳米胶束的制备方法， 包括以下步骤：
[0041] (1)称取40mg已制备的氟化壳聚糖，加入20ml去离子水，采用细胞 破碎仪进行超声，功率选择90W，工作4s停歇4s，总工作40分钟，使其 组装成为聚合物纳米胶束；
[0042] (2)在5000r/min的搅拌速度下将0.5ml小分子化疗药物和 0.5ml[FeFe]氢化酶的乙醇溶液以2ml/min的速度匀速滴加入上步所得的 20ml聚合物纳米胶束中，避光搅拌2个小时；
[0043] (3)将上述得到的液体转移至5000kDa的透析袋中用去离子水作为透 析介质进行透析，4℃避光条件透析24小时，并且每4个小时换一次透析 液，以除去未能负载的化疗药物、[FeFe]氢化酶以及体系中存在的有机溶 剂乙醇。透析完毕后将透析袋内的液体避光冻干，即得负载有化疗药物和 [FeFe]氢化酶的氟化壳聚糖纳米胶束，冻干样品。
[0044] 在一种实施方式中，所述[FeFe]氢化酶的制备方法包括步骤：
[0045] (1)将双氯化合物(ClCH2S)2NC6H4CHO与化合物Fe2(SH)2(CO)6溶解在四 氢呋喃溶液中，在三乙胺的存在下进行搅拌处理，得到中间产物A；
[0046] (2)在惰性气氛保护下，将中间产物A、苯甲醛和吡咯溶于二氯甲烷 中，避光加入三氟乙酸，经搅拌处理后，加入四氯苯醌，加热回流后经Al2O3碱性柱分离，得到[FeFe]氢化酶。
[0047] 在一种具体的实施方式中，步骤(1)中，在三乙胺的存在下进行室温 搅拌12h。
[0048] 在一种具体的实施方式中，步骤(2)中，将中间产物A、苯甲醛和吡 咯按照1:3:4的摩尔比溶于二氯甲烷中。
[0049] 在一种具体的实施方式中，步骤(2)中，搅拌处理的时间为15h，搅 拌处理的温度为室温。
[0050] 在一种具体的实施方式中，步骤(2)中，加热回流的时间为1h。
[0051] 一种本发明实施例所述的具有原位产氢的纳米胶束在制备治疗膀胱癌 药物中的应用。
[0052] 本实施例中，所述的具有原位产氢的纳米胶束可用于膀胱癌的光氢灌 注治疗中，具体为将制得的具有原位产氢的纳米胶束透过膀胱黏膜递送到 肿瘤部位后，在特定波长激光的照射下，纳米胶束可以利用光能稳定产生 分子氢，通过分子氢联合化疗药物，提高膀胱癌细胞药敏性，从而有效杀 死肿瘤细胞。
[0053] 本实施例利用含有[FeFe]氢化酶的纳米胶束包载膀胱癌灌注药物，在 近红外光照下[FeFe]氢化酶快速将光能转化，进而发生反应生成分子氢， 可实现分子氢在原位肿瘤内部释放的稳定性和长效性，进而提高膀胱癌灌 注治疗效果。这种材料有望降低全身系统毒性，具有低创伤性和易操作等 优点，还可以进行载体修饰靶向治疗，具有较好的应用前景。
[0054] 本实施例中，所述纳米胶束的特定吸收波长范围为350～700nm。
[0055] 本实施例中，所述纳米胶束在特定波长近红外激光照射下，可稳定释 放分子氢，浓度为0.2～0.8ppm。
[0056] 本实施例中，近红外激光照射时，波长为650～670nm，照射强度为1～ 2W/cm2，照射时间为10～120分钟。
[0057] 下面通过具体的实施例对本发明进一步地说明。
[0058] 1、基于氟化壳聚糖载体制备具有原位产氢的纳米胶束
[0059] 如图1所示，首先将壳聚糖(CS)与全氟庚酸通过NHS/EDC反应共价 连接得到可以有细胞膜穿透特性的氟化壳聚糖聚合物(FCS)。然后氟化壳 聚糖聚合物通过亲氟效应，与近红外光敏感特性的[FeFe]氢化酶和化疗药 物吉西他滨自组装形成纳米体系[FeFe]TPP/GEM@FCS NPs，以膀胱灌注的形 式进入病灶组织。由于FCS的打开膀胱上皮细胞紧密连接，增加药物细胞 旁路运输的作用，可使灌注的复合光敏剂有效进入肿瘤组织；在近红外激 光的照射下，催化肿瘤中的[FeFe]氢化酶产生氢气，稳定线粒体跨膜电位 和清除细胞内ROS，联合化疗药物有效提高肿瘤细胞药敏性，实现对肿瘤细 胞的杀伤。
[0060] 2、[FeFe]氢化酶([FeFe]TPP)的合成与表征
[0061] (1)将双氯化合物(ClCH2S)2NC6H4CHO(0.34g，1mmol)与化合物 Fe2(SH)2(CO)6(0.22g，1mmol)溶解在四氢呋喃溶液中，搅拌加入三乙胺， 在-78℃下先反应0.5h，随后室温搅拌继续反应12h。反应结束真空旋蒸， 除去溶剂，以二氯甲烷/石油醚(2:1，v/v)为洗脱剂，用硅胶柱分离得到 中间产物A(红色固体，0.2g，产率41％)(如图2)。1H NMR(400MHz，CDCl3)， δ(ppm)：4.36(s,4H),6.83,7.85(2d,J＝8.4Hz,4H),9.86(s,1H)； MS(ESI)Calc’d for C15H9Fe2NO7S2[M+H]+，490.85；found，491.74。(其 结构如图2中化合物A所示)[0062] (2)将苯甲醛(0.091g，0.9mmol)、中间产物A(0.15g，0.3mmol)、 吡咯(0.086g，1.2mmol)、CF3CO2H(0.092g，1.2mmol)和二氯甲烷(100 ml)的混合物在室温下在黑暗中搅拌
15小时，得到紫红色溶液。随后向该 溶液中加入2,3,5,6-四氯苯并醌(0.22g，0.9mmol)，继续搅拌回流1h， 反应结束后，真空旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，用Al2O3碱性柱分 离得到最终化合物[FeFe]氢化酶。(紫红色固体，0.1g，产率33％)(如图2)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：4.60(s,4H；),7.14,7.17(2s,2H), 7.75,7.77(2s,9H),8.15,
8.18(2s,2H),8.25,8.28(2s,6H),8.86, 8.87(2s,8H)；MS(ESI)Calc’d for C15H9Fe2NO7S2[M]+，999.06；found， 999.78。(其结构如图2中化合物[FeFe]TPP所示)
15小时，得到紫红色溶液。随后向该 溶液中加入2,3,5,6-四氯苯并醌(0.22g，0.9mmol)，继续搅拌回流1h， 反应结束后，真空旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，用Al2O3碱性柱分 离得到最终化合物[FeFe]氢化酶。(紫红色固体，0.1g，产率33％)(如图2)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：4.60(s,4H；),7.14,7.17(2s,2H), 7.75,7.77(2s,9H),8.15,
8.18(2s,2H),8.25,8.28(2s,6H),8.86, 8.87(2s,8H)；MS(ESI)Calc’d for C15H9Fe2NO7S2[M]+，999.06；found， 999.78。(其结构如图2中化合物[FeFe]TPP所示)
[0063] 3、纳米胶束的制备及其粒径分布和紫外吸收情况
[0064] 称取包载有吉西他滨和[FeFe]氢化酶的氟化壳聚糖聚合物固体粉末2 mg，加入1ml去离子水，采用细胞破碎仪进行超声，功率选择90W，工作 4s停歇4s，总工作20分钟，使其组装成为纳米胶束母液。取纳米胶束母 液100μl用去离子水稀释至2ml，测试其粒径分布(DLS)和紫外吸收情 况，利用TEM观察胶束的尺寸。
[0065] 如图3a所示，纳米胶束的尺寸为80.1±14.6nm，与纳米粒度仪检测 出来的粒径分布情况相吻合(图3b)；通过紫外吸收光谱发现(图3c)，纳 米胶束在350～700nm有五个吸收峰，但在近红外光谱区间内，存在一个 660nm的最大吸收，此吸收即为[FeFe]氢化酶的近红外特征吸收，表明纳 米胶束能够在特征波长近红外光的激发下，将光能转化，产生氢分子。
[0066] 4、纳米胶束的体外产氢性能表征
[0067] 将上述3中制得的纳米胶束母液，分别稀释至浓度0、1、2、4、8、16 和32μg/ml(以[FeFe]氢化酶的浓度计算)。使用亚甲基蓝探针(MB)来 检测不同浓度纳米胶束在近红外光照射下产生氢的量。将MB探针和待测胶 束分散到比色皿中(MB探针的浓度为10μg/ml)，氢气释放实验分为两组， 一组为近红外660nm激光照射30min，另一组为无近红外光照射，随后分 别用紫外分光光度计测量比色皿中MB探针的吸收，通过比较探针在664nm 的吸收变化来分析纳米胶束产生的氢气量。
[0068] 如图4a所示，在660nm激光照射的纳米胶束溶液中，MB探针在664nm 位置的吸收明显降低，说明溶液产生了氢气，并与MB探针发生反应，使其 在664nm的吸收减弱。而且随着纳米胶束浓度的增加，MB探针的吸收在不 断降低，说明纳米胶束产生氢气的浓度在不断地升高。在未照射660nm激 光的纳米胶束溶液，如图4b所示，即使纳米胶束浓度增加，其MB探针的 紫外吸收并没法发生明显的变化。
[0069] 另外，在同一纳米胶束浓度的情况下，照射不同时间(0、10、20、30、 60和120min)的660nm激光，产生的氢气量也随时间的增加而增加(图 4c)。这些都证明了纳米胶束的产生氢气的量是随其浓度和光照时间可控 的。
[0070] 5、纳米胶束对膀胱癌细胞的杀伤效果
[0071] (1)CCK-8实验
[0072] 上述证明纳米胶束可以在近红外激光的照射下产生氢分子，为了进一 步验证纳米胶束产生的氢分子对化疗药的增敏效果，接下来进行了细胞水 平的治疗研究。取对数生长期T24细胞，消化、离心细胞，弃去上清，加 入适量的新鲜培养基吹打成单细胞悬液，之后用细胞计数板进行计数，然 后将细胞按5×103个/孔的密度铺在96孔板中，放置培养箱孵育过夜。随 后将制备的纳米胶束用细胞培养基稀释至0、0.5、1、2.5、5、10、25和 50μg/mL，加入96孔板中，之后孵育24h。然后细胞用660nm激光(1～2 w/cm2)照射10min，照射结束之后分别继续在培养箱培养24h和48h。其 他对照组分别为单独药物组(GEM)、单独纳米胶束组([FeFe]TPP/GEM@FCS)、 [FeFe]TPP@FCS+Laser组以及不做任何处理的空白对照组，随后按CCK-8试 剂盒操作步骤进行细胞存活率检测。
[0073] (2)细胞增殖实验
[0074] 当T24细胞生长至对数生长期时，消化、离心细胞，弃去上清，加入 适量的新鲜培养基吹打成单细胞悬液，之后用细胞计数板进行计数，然后 将细胞按1.5×105个/孔的密度铺在6孔板中，放置培养箱孵育过夜。随后 将制备的纳米胶束用细胞培养基稀释至50μg/2
mL，加入6孔板中，之后孵 育24h。然后细胞用660nm激光(1～2w/cm)照射10min，照射结束之 后分别继续在培养箱培养24h。其他对照组分别为单独药物组(GEM)、单独 纳米胶束组([FeFe]TPP/GEM@FCS)、[FeFe]TPP@FCS+激光照射组以及不做 任何处理的空白对照组。随后用PBS洗两遍，按照操作说明书加入活死细 胞染色液染色30min后，用PBS洗三遍后在荧光显微镜进行拍照观察。
mL，加入6孔板中，之后孵 育24h。然后细胞用660nm激光(1～2w/cm)照射10min，照射结束之 后分别继续在培养箱培养24h。其他对照组分别为单独药物组(GEM)、单独 纳米胶束组([FeFe]TPP/GEM@FCS)、[FeFe]TPP@FCS+激光照射组以及不做 任何处理的空白对照组。随后用PBS洗两遍，按照操作说明书加入活死细 胞染色液染色30min后，用PBS洗三遍后在荧光显微镜进行拍照观察。
[0075] 由图5a，b的CCK-8实验结果，可以看出[FeFe]TPP/GEM@FCS+激光照 射组的细胞存活率最低，并且随着胶束浓度的增加，T24细胞的存活率不断 降低，在浓度为50μg/mL的时候只有25％不到存活率，而其他处理组的细 胞存活率基本都仍在70％以上。这也就说明，其他处理方式都对细胞不会造 成较大的损伤，而[FeFe]TPP/GEM@FCS+激光照射组氢气增敏化疗组可以对 肿瘤细胞的增值能力造成较大的损伤。
[0076] 由图5c可以看出，所有组中，只有[FeFe]TPP/GEM@FCS+激光照射组中 红色荧光细胞最多，即死细胞增多，并且绿色荧光的活细胞形态变圆，表 明细胞状态变差。而其他组中，红色荧光死细胞非常少。这进一步验证了 纳米胶束与细胞共孵育之后，经过660nm激光刺激，可以催化纳米胶束中 [FeFe]氢化酶在细胞中产生氢气，而氢气稳定线粒体跨膜电位和清除细胞 内ROS，从而增强化疗药对肿瘤细胞的杀伤。
[0077] (3)动物实验
[0078] 膀胱癌原位模型的建立：用慢病毒转染法对膀胱癌细胞株T24进行荧 光素酶标记，对健康雌性BALB/c裸鼠麻醉，解剖暴露膀胱，以胰岛素针 将细胞溶液注入到小鼠膀胱壁内，缝合伤口继续饲养，采用小动物活体成 像系统对肿瘤的生长情况进行监测。
[0079] 给药方式：选取体重16～18g的雌性BALB/c裸鼠作为实验对象，随机 分成5组(生理盐水组；吉西他滨组；包载吉西他滨和[FeFe]氢化酶纳米 粒组；包载[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组；包载吉西他滨和[FeFe]氢 化酶纳米粒+激光照射组)，室温22～26℃下饲养，自由进食进水，12小时 光照/黑暗，每天按测得体重给药。其中，生理盐水组原位膀胱癌BALB/c 裸鼠，持续4周膀胱灌注生理盐水(100μL/只/周)。吉西他滨组原位膀胱 癌BALB/c裸鼠，持续4周膀胱灌注化疗药(5mg/kg/周)。包载吉西他滨和 [FeFe]氢化酶纳米粒组原位膀胱癌BALB/c裸鼠，持续膀胱灌注4周 (100μL/只/周)。包载[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组，经尿道膀胱灌 注4周(100μL/只/周)，灌注时间1h，之后照射近红外650nm激光10-30 分钟，每周一次。包载吉西他滨和[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组，经尿 道膀胱灌注4周(100μL/只/周)，灌注时间1h，之后照射近红外650nm 激光10-30分钟，每周一次。
[0080] 肿瘤监测：实验前(5组原位膀胱癌BALB/c裸鼠)和实验中(5组原位膀 胱癌BALB/c裸鼠)采用小动物活体成像系统对肿瘤的生长情况进行监测， 拍照。使用IVIS活体成像专业分析软件对其肿瘤部位的荧光进行定量，比 较5组间BALB/c裸鼠肿瘤生长大小。
[0081] 肿瘤重量：实验终点(四周后5组原位膀胱癌BALB/c裸鼠)对小鼠进行 解剖，取出膀胱部位肿瘤，用电子天平进行称重并拍照，比较5组间BALB/c 裸鼠肿瘤生长大小。
[0082] 由图6a的小鼠活体成像照片可以观察到仅灌注生理盐水的对照组小鼠 肿瘤生长非常明显；吉西他滨组小鼠肿瘤生长得到一定的抑制，但仍保持 较高增长趋势；包载吉西他滨和[FeFe]氢化酶纳米粒组相比于单独灌注吉 西他滨组有更好的抑制效果；而仅包载[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组， 基本上对肿瘤没有产生抑制，说明在肿瘤部位产生的氢气并不能直接杀伤 肿瘤细胞；而包载吉西他滨和[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组小鼠肿瘤得 到最为明显的抑制，在5组中肿瘤生长也最为缓慢。从而证明了氢气具有 提高化疗药治疗膀胱癌的效果。
[0083] 图6b为小鼠肿瘤部位的荧光统计值，从五组荧光值的统计曲线来看， 包载吉西他滨和[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组小鼠肿瘤荧光值最小，说 明其对肿瘤的抑制效果最好。
[0084] 图6c,d为5组小鼠在膀胱解剖下来肿瘤的照片和重量统计，从图6c,d 上看包载吉西他滨和[FeFe]氢化酶纳米粒+激光照射组小鼠肿瘤体积最小。
[0085] 图6e为5组小鼠的生存率统计，从图6e上看包载吉西他滨和[FeFe] 氢化酶纳米粒+激光照射组小鼠的生存率最好，在四周的时间内未有小鼠死 亡，而其他四组均出现小鼠死亡。
[0086] 综上所述，本发明提供的一种具有原位产氢的纳米胶束，所述纳米胶 束由以具有细胞膜穿透特性的氟化壳聚糖聚合物、具有近红外光敏感特性 的[FeFe]氢化酶和具有肿瘤杀伤的化疗药物构成，其中所述[FeFe]氢化酶 和化疗药物包载于纳米胶束的疏水性内核，所述纳米胶束的外壳为亲水性 氟化壳聚糖。所述纳米胶束能够有效穿透膀胱粘膜层，到达膀胱癌病灶区 域，在近红外激光的刺激下纳米胶束稳定产生氢气分子。该纳米胶束可应 用于肿瘤细胞的光氢治疗中，其产生的氢气联合负载药物能有效杀死肿瘤 细胞，抑制肿瘤生长。
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