太子参不定根的诱导及组织培养方法
专利汇可以提供太子参不定根的诱导及组织培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是一种药物技术领域的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，包括：(1)取消毒好的太子参外植体，无菌条件下切割后接种在愈伤组织诱导培养基上，于无菌避光条件下诱导愈伤组织；(2)取生长快速、色泽淡黄的愈伤组织，置于含吲哚丁酸、 萘 乙酸、激动素中的一种或一种以上 植物 激素 的1/2MS固体培养基上无菌避光诱导形成不定根；(3)太子参不定根液体培养：取获得的不定根置含吲哚丁酸、萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基中培养。本发明方法简单、效率高，其中太子参的茎和 叶片 外植体的不定根诱导率均在90％以上，不定根生长快、接种量少，摇瓶培养18天增长率达46倍以上。，下面是太子参不定根的诱导及组织培养方法专利的具体信息内容。
1.一种太子参不定根的诱导及其组织培养方法，其特征在于，包括以下具 体步骤：
(1)太子参愈伤组织的诱导与培养：取太子参不同部位外植体，经消毒洗 涤后，无菌条件下将外植体切割，置愈伤组织诱导培养基上，于无菌避光条件下 诱导愈伤组织，小心剥离愈伤组织，置相同培养基上扩增培养，扩增的愈伤组织 用于诱导不定根；
(2)太子参不定根的诱导与培养：取来自不同部位的愈伤组织，置于含吲 哚丁酸、萘乙酸、激动素中的一种或一种以上植物激素的1/2MS固体培养基上， 于无菌避光条件下诱导不定根；
(3)太子参不定根液体培养：取步骤(2)获得的不定根，置含有吲哚丁 酸、萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基中培养。
2.根据权利要求1所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征 是，步骤(1)中，所述的外植体是指：野生太子参的茎、叶片、块根和须根中 的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其 特征是，步骤(1)中，所述的消毒洗涤是指：用75％乙醇浸泡消毒30秒和1％ 次氯酸钠浸泡消毒15～30分钟，无菌水洗涤5次。
4.根据权利要求1或2所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其 特征是，步骤(1)中，所述的将外植体切割是指：将茎和须根切1cm的段、叶 片切1cm×1cm的片和块根切0.5cm×0.5cm×0.3cm的块。
5.根据权利要求1或2所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其 特征是，步骤(1)中，所述的愈伤组织诱导培养基是指：含1.0mg/L～3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.1mg/L～0.5mg/L激动素的MS固体培养基，所述MS固体 培养基由MS液体培养基添加5g/L琼脂制成，pH5.8。
6.根据权利要求1或2所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其 特征是，步骤(1)中，所述的无菌避光条件下诱导愈伤组织是指：于20℃～25℃ 无菌避光条件下培养18天-28天诱导愈伤组织。
7.根据权利要求1所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征 是，步骤(2)中，所述的1/2MS固体培养基是指：含0.1mg/L～5mg/L吲哚丁 酸、0.1mg/L～3mg/L萘乙酸、0.1mg/L～0.5mg/L激动素中的一种或一种以上植 物激素的培养基。
8.根据权利要求1或7所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其 特征是，步骤(2)中，所述的无菌避光条件下诱导不定根是指：于20℃～25℃ 无菌避光条件下培养25天-35天诱导不定根。
9.根据权利要求1所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征 是，步骤(3)中，所述的培养基，是指含有0.1mg/L～5mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L～ 3mg/L萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基。
10.根据权利要求1或9所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其 特征是，步骤(3)中，所述的培养，是指在摇床转速为80r/min～120r/min、 温度20℃～25℃条件下培养15天～21天。
技术领域
本发明涉及一种植物技术领域的培养方法，特别是一种太子参不定根的诱导 及组织培养方法。
背景技术
不定根是由植物愈伤组织诱导分化产生的离体植物器官，不定根培养是近 年来发展起来的一项组织培养新技术。与药用植物的悬浮培养细胞相比，不定根 有效成分含量稳定；和大田栽培的植物相比，不仅有效成分含量高且稳定、生长 速度快，而且节省土地资源，因此不定根培养适合于药用植物尤其是根类药材如 太子参的组织培养，以获得组织培养物或其有效成分。
经对现有技术的查新，目前尚无有关太子参不定根的组织培养及其有效成 分生产方法的文献报道和应用，而仅有的太子参悬浮细胞培养体系30天仅增长 5倍。
发明内容
本发明是通过下述技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
(1)太子参愈伤组织的诱导与培养：取太子参不同部位外植体，经消毒洗 涤后，无菌条件下将外植体切割，置愈伤组织诱导培养基上，于无菌避光条件下 诱导愈伤组织。小心剥离生长快速、色泽淡黄的愈伤组织，置相同培养基上扩增 培养，扩增的愈伤组织用于诱导不定根；
(2)太子参不定根的诱导与培养：取来自不同部位生长快速、色泽淡黄的 愈伤组织，置于含吲哚丁酸、萘乙酸、激动素中的一种或一种以上植物激素的 1/2 MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导不定根；
(3)太子参不定根液体培养：取步骤(2)获得的不定根，置含有吲哚丁 酸、萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基中培养。
步骤(1)中所述的外植体是指野生太子参的茎、叶片、块根和须根中的任 一种。
步骤(1)中所述的消毒洗涤是指经75％(v/v，下同)乙醇浸泡消毒30秒和 1％(w/v，下同)次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15～30分钟，无菌水洗涤5 次。
步骤(1)中所述的将外植体切割是指将茎和须根切段(1cm)、叶片切片(1 cm×1 cm)和块根切块(0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm)。
步骤(1)中所述的愈伤组织诱导培养基是指：含1.0mg/L～3.0 mg/L2，4- 二氯苯氧乙酸和0.1mg/L～0.5 mg/L激动素的MS固体培养基，所述MS固体培养 基由MS液体培养基添加5g/L琼脂制成，pH 5.8。
步骤(1)中所述的无菌避光条件下诱导愈伤组织，是指于20℃～25℃无菌 避光条件下培养18天-28天诱导愈伤组织。
步骤(2)中所述的1/2 MS固体培养基(MS固体培养基中硝酸铵浓度减半 的培养基，下同)，是指含0.1mg/L～5mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L～3 mg/L萘乙酸、 0.1mg/L～0.5mg/L激动素中的一种或一种以上植物激素的培养基。
步骤(2)中所述的无菌避光条件下诱导不定根，是指于20℃～25℃无菌避 光条件下培养25天-35天诱导不定根。
步骤(3)中所述的培养基，是指含有0.1mg/L～5 mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L～ 3 mg/L萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基(MS液体培养 基中硝酸铵浓度减半的培养基，下同)。
步骤(3)中所述的培养，是指在摇床转速为80 r/min～120 r/min、温度 20℃～25℃条件下培养15天～21天。
本发明诱导与培养方法简单、效率高，其中野生太子参的茎和叶片外植体的 不定根诱导率均在90％以上；本发明诱导的不定根生长速度快，液体摇瓶18天 增长率达46倍以上；不定根产物的收获简单，只需经过简单过滤冲洗即可。
具体实施方式
本发明实施条件为：诱导愈伤组织的较优外植体为茎和叶片，经75％乙醇消 毒30秒后再经1％次氯酸钠消毒15分钟～20分钟，置含1.5mg/L～2.0 mg/L2，4- 二氯苯氧乙酸和0.2mg/L～0.5 mg/L激动素的1/2 MS固体培养基(pH 5.8)上无 菌避光培养25天；所获得的愈伤组织置含1mg/L～3 mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L～ 0.3mg/L激动素的1/2 MS固体培养基上培养25天～28天诱导形成不定根；选取 诱导的不定根置含1mg/L～3 mg/L吲哚丁酸和1 mg/L萘乙酸的1/2 MS液体培养 基中无菌避光震荡培养，摇床转速120 r/min，温度22～24℃，培养时间为18 天。
实施例1：
取太子参须根外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经 1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒20分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下 将须根外植体切段(1cm)，置于含1.0 mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和0.1mg/L激动 素MS固体培养基上(pH 5.8)，于20℃无菌避光诱导28天获得生长快速、色泽 淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组 织置添加5 mg/L吲哚丁酸、0.1 mg/L萘乙酸和0.1 mg/L激动素的1/2 MS固体 培养基上，于20℃无菌避光条件下诱导28天生成不定根。取上述诱导的不定根， 转入含5mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L萘乙酸的1/2 MS液体培养基中，80 r/min、 20℃无菌避光培养21天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。
实施效果：愈伤组织诱导率达61％，不定根诱导率达90％，不定根短且多分 支，无愈伤化现象。
实施例2：
取太子参茎外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经1％ 次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将 茎外植体切段(1cm)，置于含2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.2mg/L激动素的 MS固体培养基上(pH 5.8)，于22℃无菌避光诱导25天获得生长快速、色泽淡 黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组织 置添加3 mg/L吲哚丁酸和0.3 mg/L激动素的1/2 MS固体培养基上，于22℃无 菌避光条件下诱导25天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含3mg/L吲哚 丁酸和1mg/L萘乙酸的1/2MS液体培养基中，120r/min、22℃无菌避光培养18 天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。
实施效果：愈伤组织诱导率达80％，不定根诱导率达100％，不定根呈米白色、 较长且多分支，无愈伤化现象。
实施例3：
取太子参茎外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经1％ 次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将 茎外植体切段(1cm)，置于含1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.1 mg/L激动素 的MS固体培养基上(pH 5.8)，于25℃无菌避光诱导18天获得生长快速、色泽 淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组 织置添加2 mg/L吲哚丁酸和0.1 mg/L激动素的1/2 MS固体培养基上，于25℃ 无菌避光条件下诱导25天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含2 mg/L 吲哚丁酸和1 mg/L萘乙酸的1/2 MS液体培养基中，120 r/min、25℃无菌避光 培养15天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。
实施效果：愈伤组织诱导率达75％，不定根诱导率达90％，不定根呈米白色、 长且多分支，无愈伤化现象。
实施例4：
取太子参块根外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经 1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒30分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下 将块根外植体切段(1cm)，接种在含3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.5 mg/L 激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于20℃无菌避光诱导28天获得生长快速、 色泽米黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈 伤组织置添加0.1 mg/L吲哚丁酸、3 mg/L萘乙酸和0.5 mg/L激动素的1/2 MS 固体培养基上，于20℃无菌避光条件下诱导35天生成不定根。取上述诱导的不 定根，转入含0.1 mg/L吲哚丁酸和3 mg/L萘乙酸的1/2 MS液体培养基中， 100r/min、20℃无菌避光培养18天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养 体系。
实施效果：愈伤组织诱导率达45％，不定根诱导率达80％，不定根色泽淡黄、 较长且分支较少，无愈伤化现象。
实施例5：
取太子参叶片外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经 1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下 将叶片外植体用打孔器切圆片(1cm×1cm)，置于含1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙 酸和0.2 mg/L激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于25℃无菌避光诱导25 天获得生长快速、色泽淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继 续培养，扩增的愈伤组织置添加3 mg/L吲哚丁酸，1mg/L萘乙酸和0.1mg/L激 动素的1/2MS固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导25天生成不定根。取 上述诱导的不定根，转入含3mg/L吲哚丁酸的1/2MS液体培养基中，120r/min、 25℃无菌避光培养15天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。
实施效果：愈伤组织诱导率达90％，不定根诱导率达90％，不定根呈白色、 较长且多分支，无愈伤化现象。
实施例6：
取太子参叶片外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次后，再 经1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件 下将叶片外植体用打孔器切圆片(1cm×1cm)，置于含2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙 酸和0.1mg/L激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于22℃无菌避光诱导21天 获得生长快速、色泽淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续 培养，扩增的愈伤组织置添加3 mg/L吲哚丁酸和0.2 mg/L激动素的1/2MS固体 培养基上，于22℃无菌避光条件下诱导28天生成不定根。取上述诱导的不定根， 转入含3 mg/L吲哚丁酸和3 mg/L萘乙酸的1/2MS液体培养基中，100 r/min、 22℃无菌避光培养18天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。
实施效果：愈伤组织诱导率达80％，不定根诱导率达100％，不定根呈白色、 长且多分支，无愈伤化现象。
实施例7：
取实施例2获得的摇瓶震荡培养14天的太子参不定根，以每250mL容量锥 形瓶装75mL液体培养基计算，分别按0.2％(即0.2g新鲜不定根/100mL培养液， 下同)、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.5％和2％接种新鲜不定根，按实施例2中的 培养条件培养18天，结果发现：(1)随着接种量的增加，不定根的收获量也增 加，但是当接种量超过1％(1g新鲜不定根/100 mL)后，不定根的收获量反而降低， 因此1％接种量获得不定根的最大收获量；(2)随着接种量的增加生长指数(收 获量/接种量)逐渐下降，最低接种量即0.2％获得最高的生长指数。综合考虑， 选择0.2％接种量为最佳接种量。
取实施例2获得的液体培养的生长14天的太子参不定根，以1/2MS液体培 养基(pH 5.8)为基本培养基研究吲哚丁酸和萘乙酸两种激素对太子参不定根生 长的影响，两种激素的浓度均设定0.1、1、3和5 mg/L以及空白对照，接种量 均为0.2％，其它条件同实施例2，培养14天后进行统计，结果发现不定根生长 对萘乙酸更为敏感，1 mg/L的萘乙酸使太子参不定根在14天内增长33.7倍， 比5 mg/L吲哚丁酸所引起的32.1倍增长率还高。因此选择1 mg/L萘乙酸为基 本激素，并进一步研究组合添加0.1、1、3和5 mg/L吲哚丁酸及空白对照(不 含吲哚丁酸)对太子参不定根生长的影响，结果发现1mg/L萘乙酸与1～3 mg/L 吲哚丁酸的结合在14天内获得38.3倍增长率，18天得到46.1倍的最高增长率。
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